JP6556625B2 - 発現配列 - Google Patents
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Description
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアントであって、好ましくは配列番号2以外であるもの、並びに
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、好ましくは配列番号2以外のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードする、単離された核酸を提供する。
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアントであって、好ましくは配列番号2以外であるもの、並びに
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される好ましくは配列番号2以外のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーを提供する。
3位のXは、F又はLのどちらかであり、
16位のXは、A又はTのどちらかである。
配列番号3:MKFSTNLILAIAAASAVVSA
配列番号4:MKFSTNLILAIAAASTVVSA
配列番号5:MKLSTNLILAIAAASTVVSA
3位及び16位におけるアミノ酸置換は、太字及び下線によって表される。
MKXSTNLILAIAAASXVVSAAPVAPAEEAANHLHKR、ここで、
3位のXは、F又はLのどちらかであり、
16位のXは、A又はTのどちらかである。
配列番号12:MKFSTNLILAIAAASAVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
配列番号13:MKFSTNLILAIAAASTVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
配列番号14:MKLSTNLILAIAAASTVVSAAPVAPAEEAANHLHKR
3位及び16位におけるアミノ酸置換は、太字及び下線によって表される。
a)配列番号3のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、ここで、コード核酸は、配列番号16のヌクレオチド配列、又は配列番号16のコドン最適化バリアントからなる;又は
b)配列番号12のアミノ酸配列を有するか、含むか、又はこれからなるリーダーペプチド、好ましくはここで、コード核酸は、配列番号19のヌクレオチド配列、又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる、
である。
a)シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択される、好ましくは、配列番号15以外であるヌクレオチド配列、又は
b)リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
c)配列番号15、16、17、18、19若しくは20のコドン最適化バリアントであるヌクレオチド配列
を有する。
ATGAAGCTCTCCACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCT
配列番号16:P.パストリスCBS7435株から実施例9に記載されるプライマーを用いたPCR増幅によって得られる、実施例9において使用されるヌクレオチド配列。
配列番号17:P.パストリス、DSMZ70382株(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から得られたヌクレオチド配列
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATCTTAGCTATTGCAGCAGCATCCACTGTTGTCTCAGCT
上の配列において変わっているヌクレオチドは、下線で示されている。
ATGAAGCTCTCCACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
配列番号19:P.パストリスCBS7435株から実施例1及び5に記載されるプライマーを用いたPCR増幅によって得られる、実施例5において使用されるヌクレオチド配列
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
配列番号20:P.パストリス、DSMZ70382株(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から得られるヌクレオチド配列
ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATCTTAGCTATTGCAGCAGCATCCACTGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTTGCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
具体的には、本発明に従う核酸は、DNAである。
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されることを特徴とし、好ましくは、ここで、配列番号2のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドの、1以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又はこれらからなるポリペプチド、例えばナノボディとの融合は、除外される。
a)シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
b)リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
c)配列番号15、16、17、18、19若しくは20のコドン最適化バリアントであるヌクレオチド配列、
を含む発現カセットをさらに提供し、好ましくは、ここで、配列番号15のヌクレオチド配列が1以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディをコードするヌクレオチド配列に融合した融合構築物は、除外される。
MKFSTNLILAIAAASTVVSAAPVAPAEEAANHLHKRAYYTDTTKTHTFTEVVTVYRT
の57のアミノ酸配列のアミノ酸21〜36と同一の16のアミノ酸配列である。
本発明の宿主細胞を準備すること、
上記宿主細胞を培養し、上記POIを発現させること、及び
上記POIを精製し、精製POIの調製を得ること
を含む。
「中性」のアミノ酸は、そのそれぞれの3文字及び1文字のコード並びに極性と共に、以下に示される:
アラニン:(Ala、A)非極性、中性;
アスパラギン:(Asn、N)極性、中性;
システイン:(Cys、C)非極性、中性;
グルタミン:(Gln、Q)極性、中性;
グリシン:(Gly、G)非極性、中性;
イソロイシン:(Ile、I)非極性、中性;
ロイシン:(Leu、L)非極性、中性;
メチオニン:(Met、M)非極性、中性;
フェニルアラニン:(Phe、F)非極性、中性;
プロリン:(Pro、P)非極性、中性;
セリン:(Ser、S)極性、中性;
トレオニン:(Thr、T)極性、中性;
トリプトファン:(Trp、W)非極性、中性;
チロシン:(Tyr、Y)極性、中性;
バリン:(Val、V)非極性、中性;及び
ヒスチジン:(His、H)極性、正(10%)中性(90%)。
アルギニン:(Arg、R)極性、正;及び
リシン:(Lys、K)極性、正である。
アスパラギン酸:(Asp、D)極性、負;及び
グルタミン酸:(Glu、E)極性、負である。
配列番号7:APVAPAEEAANHLHKR
すなわち、切断型プロ配列:配列番号10の切断型リーダー配列のアミノ酸21〜36である。
例1:P.パストリスEpx1ネイティブのリーダー(配列番号8)を分泌のために用いる、組換えタンパク質の発現のためのP.パストリス宿主細胞株の構築
1a):P.パストリスEpx1ネイティブのリーダー(シグナル配列及びプロ配列;配列番号8、EpxL−RT、「前駆配列」)を含む発現ベクターの構築
P.パストリスにおいてネイティブに分泌されたタンパク質Epx1の同定及び推定分泌リーダー配列EpxL−RT(Epx1シグナル配列及びプロ配列、実験的に決定した成熟Epx1タンパク質のN末端までからなる)の同定は、EP2258855に記載されている。成熟Epx1の実験的に証明されたN末端に先行する最後のアミノ酸は、Arg−Thr(RT)であったので、推定分泌リーダー配列は、EpxL−RTと呼ばれた。
組換えブタトリプシノゲン(rpTRP)の発現のために、コドン最適化人工遺伝子を合成した(Geneart、Germany)。オープンリーディングフレーム側方の制限酵素Pfl23II及びSfiIのための部位を、運ばれたプラスミドをテンプレートとして用いるPCR増幅の間に付加した。プライマーを、表2.1に示す。PCR産物を、Pfl23II及びSfiIで消化し、そしてPfl23II、SfiI及びCIP処理プラスミドpPM2_pGAPxLRT(例1a)内にクローニングした。ライゲーションしたプラスミドを、大腸菌(E.coli)TOP10(Invitrogen)に形質転換し、そしてゼオシン被膜したLBアガー上でプレート培養した。制限エンドヌクレアーゼ分析を実施し、プラスミドpPM2_pGAPxLRT_rpTRPの正しいアイデンティティを確認した。
ヒト血清アルブミン(HSA)又は高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)をコードする遺伝子を、Stadlmayrら(2010、J Biotechnol.150:519−529)に記載されるベクターから、表2.2に示されるプライマーを用いるPCRによって増幅した。PCR産物を、AccI及びSfiIで消化し、そしてAccI及びSfiI処理プラスミドpPM2_pGAPxLRT(例1a)内にクローニングした。ライゲーションしたプラスミドを、大腸菌TOP10(Invitrogen)に形質転換し、そしてゼオシン被膜したLBアガー上でプレート培養した。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLRT−HSA及びpPM2_pGAPxLRT−eGFPを、プロモーター領域において直鎖化し、そしてP.パストリスに形質転換した。HSAについては、Stadlmayrら、2010に記載されるネイティブのHSAリーダーを用いる構築物を参照として用い、他方、eGFPを、対照としてS.セレビシエMFαリーダーの後にクローニングした。
全てのプラスミドを、P.パストリスへの電気的形質転換の前に、それぞれのプロモーター領域又はAOX−TT組み込み領域において直鎖化した。陽性の形質転換体を、酵母抽出物(10g/L)、ペプトン(20g/L)、グルコース(20g/L)及びゼオシンを含むYPDアガープレート上で選別した。
10g/Lグリセロールを含む5mLのYP培地(10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン)を、例1b、5、7、又は9からのP.パストリス株のシングルコロニーによって植菌し、28℃で一晩増殖させた。これらの培養物のアリコート(0.1の最終OD600に相当する)を、20g/Lグルコースで補った10mLの発現培養培地(培地組成は、各組換えタンパク質について下で示す)に移し、28℃にて48時間にわたり、100mLエルレンマイヤーフラスコ内で170rpmでインキュベートした。或いは、2mLの発現培養培地を、24ディープウェルプレート内での培養のために使用した。グルコース(10g/L)を、12時間毎に繰り返し加え、その後、細胞を、2500×gにて10分間室温での遠心分離により回収し、分析のために調製した。pG1駆動発現のために、グルコース制限増殖条件を、グルコースフィードビーズを用いることによって達成した(Kuhner、CH)。これは、グルコース補充の代わりに、(グルコース)=1.63*t0.74[mg/Disc]の等式に従って長時間にわたりグルコースを放出する。10mLの主培養のために2フィードビーズを使用した。バイオマスを、1mLの細胞浮遊液の遠心分離後、細胞重量を測定することによって決定した。他方、上清における組換え分泌タンパク質の決定を、以下の例2b〜2eで記載する。
ブタトリプシノゲンについて:1リットルあたり:10g酵母抽出物、10gのエンドウ豆ペプトン、10.2g (NH4)2PO4、1.24g KCl、0.1g CaCl2、HClにてpH5.0に調整。
2b)トリプシンの定量
P.パストリス培養上清を、小プレパック型サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Disposable PD−10 Desalting Columns 17−0851−01;GEHealthcare)を用いて脱塩した。2.5mLの上清をカラムに適用し、3.5mLの溶出緩衝液(1mM HCl)で溶出した。溶出後、70μLの2M CaCl2溶液を、加えた。
P.パストリス上清におけるHSAの定量のために、ヒトアルブミンELISA Quantitation Set(Cat.No.E80−129、Bethyl Laboratories、TX、USA)を使用した。HSA標準を、400ng/mLの開始濃度で使用した。上清サンプルを、適宜希釈した。
タンパク質ゲル分析のために、NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis−Tris系を、12% Bis−Tris又は4〜12% Bis−Trisゲル及びMOPS泳動緩衝液(全てInvitrogen)を用いて使用した。電気泳動後、タンパク質を、銀染色によって可視化したか、又はウェスタンブロット分析のためにニトロセスロース膜へ移行させた。従って、タンパク質を、湿(タンク)移行(Invitrogen)のためのXCell II(商標)Blot Moduleを製造業者の指示に従って用いて、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。ブロッキングの後、ウェスタンブロットを、以下の抗体でプローブ探索した:HSAについて:抗ヒト血清アルブミン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体、Bethyl A80−129P(1:50000);IgGについて軽鎖:抗ヒトカッパ軽鎖(結合及び遊離)−アルカリホスファターゼ(AP)結合体化抗体、Sigma A3813(1:5000);IgG重鎖について:ヤギにおいて産生させた抗ヒト−IgG(γ−鎖特異的)−抗体、Sigma I3382(1:5000)及び抗ヤギAP結合体(1:20000)。
インタクトなFabの定量を、被膜抗体(1:1000)としての抗ヒトIgG抗体(Abcam ab7497)及び検出抗体としてヤギ抗ヒトカッパ軽鎖(結合及び遊離)−アルカリホスファターゼ結合体化抗体(Sigma A3813)(1:1000)を用いたELISAによって行った。ヒトFab/カッパ、IgG断片(BethylP80−115)を、50ng/mLの開始濃度を有する標準として使用した。上清サンプルを、適宜希釈した。検出を、pNPP基質(Sigma S0942)によって行った。被膜、希釈、及び洗浄の緩衝液は、PBS(2mM KH2PO4、10mM Na2HPO4.2H2O、2.7mM g KCl、8mM NaCl、pH7.4)に基づき、適宜、BSA(1%(w/v))及び/又はTween20(0.1%(v/v))によって仕上げられた。
3a)分泌のためにEpxL−RTを用いる、組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−RT配列を用いるpTRPを発現するP.パストリスを、例2aに記載されるように培養し、例2bに記載されるようにトリプシン活性アッセイを用いて、そして例2dに記載されるSDS−PAGEを用いて分析した。分泌のためにMFαを用いるpTRPを発現するP.パストリスを、参照として使用した。
分泌のためにEpxL−RT配列を用いるeGFPを発現するP.パストリスを、例2aに記載するように培養し、SDS−PAGE及びウェスタンブロットを用いて分析した(例2d)。明らかに、ネイティブのEpxL−RTは、MFα(図2.2、右側)とは対照的に、eGFPを完全には分泌できなかった(図2.2、左側)。細胞内で、EpxL−RT配列の一部に未だ結合しているeGFPが観察され、そのようにしてタンパク質発現の欠陥を排除した(示さず)。
分泌のためにEpxL−RT配列を用いるHSAを発現するP.パストリスを、例2aに記載されるように培養し、そしてHSA ELISA(例2c)及びウェスタンブロット(例2d)を用いて分析した。分泌のためにネイティブのHSAリーダーを用いるHSAを発現するP.パストリスを、参照として使用した(Kobayashi.2006.Biologicals.34(1):55−9)。
次いで、上の例3c)で記載したようにEpxL−RTを用いて発現させたHSAのN末端を、N末端配列決定によってさらに分析した。
EpxL−RTにおけるKR配列が本当にプロテアーゼ切断部位であるかどうかを試験するために、分泌のためにEpxL−KR配列を用いる組換えタンパク質の発現のためのベクターを、構築した。
HSAを、表4.1のプライマーを用いて増幅し、そしてBglI及びSbfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLKR−HSAをプロモーター領域にて直鎖化し、P.パストリス内に形質転換した。
pTRPを、表4.2のプライマーを用いて増幅し、そしてPvuII及びSbfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。発現ベクターpPM2_pGAPxLKR−eGFPを、同じように作製した。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLKR−pTRP及びpPM2_pGAPxLKR−eGFPを、プロモーター領域で直鎖化し、P.パストリス内に形質転換した。
抗体HyHELの軽鎖(LC)及び重鎖(HC)を、表4.3のプライマーを用いて増幅し、BglII及びSbfiIで消化したベクターpPM2_pGAPxLRT内にライゲーションした。配列確認後、ベクターpPM2_pGAPxLKR−LC及びpPM2_pGAPxLKR−HCをプロモーター領域において直鎖化し、そしてP.パストリス内に形質転換した。
6a)分泌のためにEpxL−KRを用いる組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−KR配列を用いるpTRPを発現するP.パストリス(例5b)を、例2aで記載したように培養し、例3aのように分析した。
分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、HSAを発現するP.パストリス(例5a)を、例2aに記載されるように培養し、ウェスタンブロットを用いて分析した(例2d)。
分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、eGFPを発現するP.パストリス(例5b)を、例2aに記載されるように培養し、例3bのように分析した。
分泌のためにEpxL−KR配列を用いる、HyHEL LC又はHyHEL HCのどちらかを発現するP.パストリス(例5c)を、例2aに記載されるように培養し、例2dのように分析した。
WO2010/135678及びUS20110021378は、MKLSTNLILAIAAASAVVSAA(配列番号21)のアミノ酸配列、すなわち、配列番号8のアミノ酸1〜21を記載し、これは、完全長Epx1リーダーの最初の21アミノ酸に相当する。しかし、この配列が実際に組換えタンパク質の分泌のために好適であることを示す実験データは、WO2010/135678及びUS20110021378において提供されていない。以後EpxL−AAと呼ぶこの断片が、正しくプロセシングされた組換えタンパク質の分泌を可能にするために十分であるかどうかを試験するために、我々は、分泌のためにEpxL−AA配列を用いる組換えタンパク質の発現のためのベクターを構築した。
8a)分泌のためにEpxL−AAを用いる、eGFPを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−AA配列を用いる、eGFPを発現するP.パストリス(例7)を、例2aに記載されるように培養し、例3bのように分析した。
分泌のためにEpxL−AA配列を用いる、pTRPを発現するP.パストリス(例7)を、例2aに記載されるように培養し、例3aのように分析した。
分泌のためにEpxL−AA配列を用いる、HyHEL LCを発現するP.パストリス(例7)を、例2aに記載されるように培養し、例2dのように分析した。LCについて、EpxL−AAによる分泌レベルは、EpxL−KR又はMFアルファと比較して低かった(図5.2)。pTRPについて、EpxL−AAによって分泌されたLCのN末端配列決定は、組換え分泌タンパク質のN末端が、EpxL−AA配列が残した付加アミノ酸、Alaを含んだことを示した。
従って、我々は、ネイティブのEpx1リーダー(EpxL−Aと呼ぶ)の最初の20アミノ酸のみからなるシグナル配列によって、組換えタンパク質を分泌するP.パストリス株を構築した。Alaは、予測されたシグナルペプチダーゼ切断部位(のC末端)の前の最後のアミノ酸を表し、ここで、SP切断部位のN末端側において、組換えタンパク質が直ちに開始する。このN末端アミノ酸の性質がSPの切断に影響を与えないことを確認するために、我々は、3つの異なる組換えタンパク質:eGFP(疎水性アミノ酸Valで開始する)、並びに抗体LC及びHC(負に荷電したアミノ酸Aspで開始する)の分泌を試験した。
10a)分泌のためにEpxL−Aを用いる、eGFPを過剰発現するP.パストリスの分析
分泌のためにEpxL−A配列を用いてeGFPを発現するP.パストリス(例9)を、例2aに記載されるように培養し、例3bのように分析した。
分泌のためにEpxL−A配列を用いてHyHEL LCを発現するP.パストリス(例9)を、例2aに記載されるように培養し、例6dのように分析した。
両鎖の分泌のためにEpxL−A配列を用いてHyHEL抗体のFab断片(軽鎖(vL及びcL)並びに重鎖断片(vH及びcH1)からなる)を発現するP.パストリス(例9に記載する株)を、例2aに記載されるように培養し、例2d及び2eのように分析した。
EpxL−A(配列番号3)を用いることによるP.パストリスからの8種のタンパク質の分泌を、試験した:ヒト成長ホルモン(HGH)、ソマトトロピン、インターフェロンアルファ2a(IFN−α2a)、2つの異なるhis−タグ化scFv(scFv1及びscFv2)並びに3つの異なるFab(Fab1、Fab2及びFab3)。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、及び
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
[2]
配列番号12のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号19のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる、[1]に記載の核酸。
[3]
a)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、及び
b)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
[4]
配列番号3のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号16のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号16のコドン最適化バリアントからなる、[3]に記載の核酸。
[5]
DNAである、[1]〜[4]のいずれか1に記載の核酸。
[6]
[1]〜[5]のいずれか1に記載の核酸によってコードされ、好ましくは、配列番号1、2、3、4、5、10、11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたリーダー。
[7]
配列番号3又は配列番号12のアミノ酸配列からなるペプチドである、[6]のリーダー。
[8]
POIをコードする核酸配列に作動可能に連結したリーダーをコードする核酸を含む発現カセットであって、前記リーダーが、
a)配列番号10のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアント、
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は1若しくは2の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、アミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16、若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアント、
からなる群から選択されることによって特徴付けられる、発現カセット。
[9]
前記POIが、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、[8]に記載の発現カセット。
[10]
前記POIが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記POIが、好ましくは抗体又はその断片、成長因子、ホルモン及びサイトカインからなる群から選択される、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、[8]又は[9]に記載の発現カセット。
[11]
前記POIが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、[10]に記載の発現カセット。
[12]
前記リーダーをコードする前記核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、[8]〜[11]のいずれか1に記載の発現カセット。
[13]
[8]〜[12]のいずれか1に記載の発現カセットを含む、組換え酵母宿主細胞又はベクター。
[14]
前記酵母が、ピキア属、カンジダ属、トルロプシス属、アークスラ属、ハンゼヌラ属、オガテア属、ヤロウイア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属及びコマガタエラ属からなる群の属から選択される、[13]に記載の宿主細胞。
[15]
[13]又は[14]に記載の宿主細胞を準備すること、
前記宿主細胞を培養して、前記POIを発現させること、及び
前記POIを精製して、精製POIの調製物を得ること
を含む、酵母宿主細胞においてPOIを産生する方法。
[16]
前記POIが、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、[15]に記載の方法。
[17]
前記POIが、N末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まないアミノ酸配列を含む、[15]又は[16]に記載の方法。
[18]
前記POIが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記POIが、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、[15]〜[16]のいずれか1に記載の方法。
[19]
前記POIが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、[18]に記載の方法。
[20]
宿主細胞からのPOIの分泌のための、及び/又は宿主細胞からのPOIの分泌を増大するための、[1]〜[5]のいずれか1に記載の核酸、又は[6]若しくは[7]に記載のリーダーの使用。
[21]
分泌POIの少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、98、又は100%が、ネイティブのN末端アミノ酸配列を含む、[20]に記載の使用。
Claims (31)
- a)配列番号10のアミノ酸配列からなるリーダーペプチド、及び
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるリーダーペプチド
からなる群から選択されるリーダーペプチドをコードする、単離された核酸。 - リーダーペプチドをコードする、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアントである、請求項1に記載の核酸。
- 配列番号12のアミノ酸配列からなるリーダーペプチドをコードする、請求項1又は請求項2に記載の核酸。
- 配列番号19のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号19のコドン最適化バリアントからなる、請求項3に記載の核酸。
- a)配列番号1のアミノ酸配列からなるシグナルペプチド、及びb)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーペプチドをコードする、単離された核酸であって、
リーダーペプチドをコードする前記核酸は配列番号6として同定されたシグナルペプチダーゼ切断部位を含まない、単離された核酸。 - シグナルペプチドをコードする、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアントである、請求項5に記載の核酸。
- 配列番号3のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドであるリーダーペプチドをコードする、請求項5又は請求項6に記載の核酸。
- 配列番号16のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号16のコドン最適化バリアントからなる、請求項7に記載の核酸。
- DNAである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸によってコードされる、単離されたリーダーペプチド。
- 配列番号1、2、3、4、5、10、11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項10に記載のリーダーペプチド。
- 配列番号3又は配列番号12のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項10又は請求項11のリーダーペプチド。
- 目的のタンパク質(POI)をコードする核酸配列に作動可能に連結したリーダーペプチドをコードする核酸を含む発現カセットであって、前記リーダーペプチドが、
a)配列番号10のアミノ酸配列からなるリーダーペプチド、
b)配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるリーダーペプチド、
c)配列番号1のアミノ酸配列からなるシグナルペプチド、または
d)配列番号2、3、4及び5からなる群から選択される、アミノ酸配列からなるシグナルペプチド、
からなる群から選択されることによって特徴付けられる、発現カセットであって、
リーダーペプチドc)とd)をコードする前記核酸は配列番号6として同定されたシグナルペプチダーゼ切断部位を含まない、発現カセット。 - 前記リーダーペプチドをコードする核酸が、配列番号18、19及び20からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号18、19、若しくは20のいずれかのコドン最適化バリアントからなる、請求項13に記載の発現カセット。
- 前記シグナルペプチドをコードする核酸が、配列番号15、16及び17からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号15、16、若しくは17のいずれかのコドン最適化バリアントからなる、請求項13に記載の発現カセット。
- 前記目的のタンパク質(POI)が、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項13〜15の何れか1項に記載の発現カセット。
- 前記目的のタンパク質(POI)が、抗体若しくはその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記目的のタンパク質(POI)が宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、請求項13〜16の何れか1項に記載の発現カセット。
- 宿主細胞代謝産物が、抗体又はその断片、成長因子、ホルモン及びサイトカインからなる群から選択される、請求項17に記載の発現カセット。
- 前記目的のタンパク質(POI)が、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択される、請求項18に記載の発現カセット。
- 前記抗体及び抗体断片が、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、請求項19に記載の発現カセット。
- 前記リーダーペプチドをコードする前記核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項13〜20のいずれか1項に記載の発現カセット。
- 請求項13〜21のいずれか1項に記載の発現カセットを含む、組換え酵母宿主細胞又はベクター。
- 前記酵母が、ピキア属、カンジダ属、トルロプシス属、アークスラ属、ハンゼヌラ属、オガテア属、ヤロウイア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属及びコマガタエラ属からなる群の属から選択される、請求項22に記載の宿主細胞。
- 請求項22又は23に記載の宿主細胞を準備すること、
前記宿主細胞を培養して、前記目的のタンパク質(POI)を発現させること、及び
前記目的のタンパク質(POI)を精製して、精製された目的のタンパク質(POI)の調製物を得ること
を含む、酵母宿主細胞において目的のタンパク質(POI)を産生する方法。 - 前記目的のタンパク質(POI)が、ネイティブのN末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質(POI)が、N末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まないアミノ酸配列を含む、請求項24又は25に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質(POI)が、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記目的のタンパク質(POI)が、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、請求項24〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質(POI)が、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 抗体及び抗体断片が、完全長抗体、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Fab及びFc融合タンパク質からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
- 宿主細胞からの目的のタンパク質(POI)の分泌のための、及び/又は宿主細胞からの目的のタンパク質(POI)の分泌を増大するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸、又は請求項10〜12のいずれか1項に記載のリーダーペプチドの使用。
- 分泌した目的のタンパク質(POI)の少なくとも60%が、ネイティブのN末端アミノ酸配列を含む、請求項30に記載の使用。
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