BR112020016258A2 - Uma célula hospedeira eucariótica modificada geneticamente projetada para reduzir a produção de proteínas da célula hospedeira, método de produzir uma proteína de interesse usando a célula hospedeira, método para reduzir a contaminação por proteína da célula hospedeira - Google Patents

Abstract

uma célula hospedeira eucariótica modificada geneticamente projetada para reduzir a produção de proteínas da célula hospedeira, método de produzir uma proteína de interesse usando a célula hospedeira, método para reduzir a contaminação por proteína da célula hospedeira. a presente invenção se refere a uma célula hospedeira eucariótica projetada para produzir uma proteína heteróloga de interesse (poi), cuja célula é geneticamente modificada para reduzir a produção de pelo menos uma das três proteínas diferentes da célula hospedeira endógena (hcp) e seu uso em um método de produção da poi.

Description

1 / 77 “UMA CÉLULA HOSPEDEIRA EUCARIÓTICA MODIFICADA GENETICAMENTE

PROJETADA PARA REDUZIR A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS DA CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUZIR UMA PROTEÍNA DE INTERESSE USANDO A CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA REDUZIR A CONTAMINAÇÃO POR PROTEÍNA DA CÉLULA HOSPEDEIRA” CAMPO TÉCNICO

[001] A invenção se refere à produção de proteínas em uma célula hospedeira eucariótica, cuja célula hospedeira é manipulada para reduzir impurezas na cultura de células hospedeiras.

HISTÓRICO

[002] As proteínas produzidas na cultura de células eucarióticas tornaram-se cada vez mais importantes como agentes terapêuticos e de diagnóstico. Para este fim, as células são manipuladas e/ou selecionadas para produzir níveis incomumente altos de uma proteína recombinante ou heteróloga de interesse. A otimização das condições de cultura de células é importante para a produção comercial bem-sucedida de proteínas recombinantes ou heterólogas. Os subprodutos liberados da célula hospedeira como proteína da célula hospedeira (HCP) e acumulados na cultura representam dificuldades para a purificação de proteínas recombinantes ou heterólogas ou podem representar riscos à eficácia do produto ou à segurança do paciente.

[003] Além de células hospedeiras de mamíferos, leveduras e fungos filamentosos são comumente usados como hospedeiros de produção de proteínas biofarmacêuticas, bem como de produtos químicos a granel. A levedura metilotrófica, como Pichia pastoris, tem boa reputação pela secreção eficiente de proteínas heterólogas. P. pastoris foi reclassificado para um novo gênero, Komagataella, e dividido em três espécies, K. pastoris, K. phaffii e K. pseudopastoris. As cepas comumente usadas para aplicações biotecnológicas pertencem a duas espécies

2 / 77 propostas, K. pastoris e K. phaffii. As cepas GS115, X-33, CBS2612 e CBS7435 são K. phaffii, enquanto a série SMD de cepas deficientes em protease (por exemplo, SMD1168) é classificada na espécie de tipo, K. pastoris, que é a cepa de referência para todos as cepas de P. pastoris disponíveis. (Mattanovich et al. 2009, Microb Cell Fact. 8: 29; Kurtzman 2009, J Ind Microbiol Biotechnol. 36(11):1435-8).

[004] As cepas biotecnológicas de Komagataella (Pichia) pastoris são Komagataella phaffii, conforme determinado a partir da análise de sequência multigênica.

[005] Mattanovich et al. (Microbial Cell Factories 2009, 8:29 doi: 10.1186/1475- 2859-8-29) descrevem o sequenciamento do genoma da cepa do tipo DSMZ 70382 de K. pastoris e analisaram seus transportadores de secretoma e açúcar.

[006] Huang et al. (Appl Microbiol Biotechnol. 2011 Apr;90(1):235-47. doi:

10.1007/s00253-011-3118-5. Epub 2011 Feb 9.) descrevem a análise proteômica do secretoma de Pichia pastoris em culturas induzidas por metanol, identificando proteínas secretadas ou liberadas no meio de cultura nas culturas de fermentação induzida por metanol de P. pastoris X-33.

[007] Heiss et al. (Appl Microbiol Biotechnol. 2013 Feb;97(3):1241-9. doi:

10.1007/s00253-012-4260-4. Epub 2012 Jul 17) identificaram uma proteína extracelular X 1 (Epx1) como a principal proteína de célula hospedeira contaminante de Pichia pastoris, produzindo um fragmento Fab de anticorpo. Verificou-se que o EPX1 não era geralmente regulado em excesso, mas apenas em diferentes situações de estresse. Uma cepa de deleção respectiva (Δepx1) foi produzida e encontrada mais suscetível do que o tipo selvagem aos agentes prejudiciais da parede celular, Calcofluor branco e vermelho do Congo, indicando que Epx1 pode ter um papel protetor para a parede celular. Não foi observada diferença significativa no

3 / 77 crescimento e na formação do produto entre o tipo selvagem e a cepa Δepx1.

[008] No entanto, descobrimos que Epx1p não é uma proteína altamente abundante, atingindo menos de cerca de 3% (mol/mol) da HCP total em uma cultura de células de P. pastoris.

[009] As HCPs são proteínas produzidas ou codificadas por células ou organismos utilizados no processo de produção e não relacionados ao produto pretendido. Alguns são necessários para o crescimento, sobrevivência e processamento celular normal, enquanto outros podem não ser essenciais.

Independentemente da utilidade, ou da falta dela, as HCPs são geralmente indesejáveis em uma substância medicamentosa final. Embora comumente presente em pequenas quantidades (ppm, expressas em nanogramas por miligrama da proteína pretendida), muito esforço e custo são gastos pela indústria para removê-los.

[010] É necessário o desenvolvimento de células hospedeiras melhoradas adequadas para produção e/ou purificação de proteínas heterólogas e/ou recombinantes.

RESUMO DA INVENÇÃO

[011] O objeto da invenção é proporcionar células hospedeiras que são modificadas para dar origem a um nível reduzido de impurezas HCP ao produzir uma proteína recombinante ou heteróloga. Outro objetivo da invenção é fornecer um método para a produção de uma proteína recombinante ou heteróloga em uma célula hospedeira, em que o risco de contaminação da proteína recombinante ou heteróloga com impurezas HCP é reduzido.

[012] O objeto é resolvido pelo assunto, conforme reivindicado.

[013] De acordo com a invenção, é fornecida uma célula hospedeira eucariótica projetada para produzir uma proteína heteróloga de interesse (POI), cuja

4 / 77 célula é geneticamente modificada para reduzir a produção de pelo menos uma proteína da célula hospedeira endógena (HCP) selecionada do grupo que consiste em uma primeira HCP (HCP1), uma segunda HCP (HCP2) e uma terceira HCP (HCP3), em que a) HCP1 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 1, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie; b) HCP2 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 3, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie; e c) HCP3 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 5, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie.

De acordo com um aspecto específico, a célula é ainda geneticamente modificada para reduzir a produção de uma outra HCP que é a HCP4, em que d) HCP4 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 7, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie.

[014] Especificamente, a referida pelo menos uma HCP inclui qualquer uma, duas ou três de HCP1, HCP2, HCP3. Além disso, a referida pelo menos uma HCP inclui especificamente a HCP4.

[015] Especificamente, a referida pelo menos uma HCP é HCP1 e, opcional ou adicionalmente, HCP2 e/ou HCP3 e/ou HCP4. Incorporações específicas se referem à redução de duas ou mais HCPs, incluindo a HCP1. Especificamente, a referida pelo menos uma HCP inclui HCP1 e qualquer um, dois ou três de HCP2,

5 / 77 HCP3 ou HCP4.

[016] Ainda especificamente, a referida pelo menos uma HCP é HCP2 e, opcionalmente, HCP1 e/ou HCP3 e/ou HCP4.

[017] Ainda especificamente, a referida pelo menos uma HCP é HCP3 e, opcionalmente, HCP1 e/ou HCP2 e/ou HCP4.

[018] Incorporações específicas se referem à redução de duas ou mais HCPs, por exemplo, HCP1 e HCP2, ou HCP1 e HCP3, ou HCP2 e HCP3.

[019] Incorporações específicas se referem à redução de duas ou mais HCPs, incluindo a redução de qualquer uma de: HCP1 e HCP4, ou HCP2 e HCP4, ou HCP3 e HCP4.

[020] Especificamente, as SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7 são cada uma das sequências endógenas do tipo selvagem (nativas) de K. phaffii.

[021] Especificamente, a respectiva sequência homóloga é de uma espécie diferente de K. phaffii, por exemplo, de uma levedura ou célula fúngica filamentosa, de preferência levedura do gênero Komagataella ou Pichia, ou do gênero Saccharomyces ou qualquer levedura metilotrófica.

[022] De acordo com um aspecto específico, a célula hospedeira é a) uma célula de levedura de um gênero selecionado do grupo que consiste em Pichia, Hansenula, Komagataella, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Ogataea, Yarrowia e Geotrichum, tais como Pichia pastoris, Komagataella phaffii, Komagataella pastoris, Komagataella pseudopastoris, Komagataella pseudopastoris, Ogataea minuta, Kluyveromces lactis, Kluyveromes marxianus, Yarrowia lipolytica ou Hansenula polymorpha; ou b) uma célula de fungos filamentosos, como Aspergillus awamori ou Trichoderma reesei.

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[023] No entanto, para os fins aqui descritos, as respectivas HCPs podem ser reduzidas em uma célula hospedeira que é qualquer uma de uma célula animal, uma célula de vertebrado, uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula vegetal, uma célula nematóide, uma célula invertebrada tal como uma célula de inseto ou uma célula de molusco, ou uma célula-tronco derivada de qualquer um dos anteriores, em particular qualquer célula de fungo ou uma célula de levedura.

[024] A respectiva sequência homóloga é entendida como endógena da célula hospedeira que é usada como célula hospedeira que produz a POI, como descrito aqui mais adiante.

[025] Por exemplo, se a célula hospedeira for K. phaffii, a HCP1 será caracterizado pela SEQ ID NO:1. No entanto, se a célula hospedeira for de uma espécie diferente (que não seja K. phaffii), a sequência HCP1 que é endógena à célula hospedeira é homóloga à SEQ ID NO:1, por exemplo, a sequência ortóloga da SEQ ID NO:1.

[026] Da mesma forma, se a célula hospedeira for K. phaffii, a HCP2 é caracterizado pela SEQ ID NO:3. No entanto, se a célula hospedeira for de uma espécie diferente (que não seja K. phaffii), a sequência HCP2 que é endógena à célula hospedeira é homóloga à SEQ ID NO:3, por exemplo, a sequência ortóloga da SEQ ID NO:3.

[027] Da mesma forma, se a célula hospedeira for K. phaffii, a HCP3 é caracterizado pela SEQ ID NO:5. No entanto, se a célula hospedeira for de uma espécie diferente (que não seja K. phaffii), a sequência HCP3 que é endógena à célula hospedeira é homóloga à SEQ ID NO:5, por exemplo, a sequência ortóloga da SEQ ID NO:5.

[028] Da mesma forma, se a célula hospedeira for K. phaffii, a HCP4 é

7 / 77 caracterizada pela SEQ ID NO:7. No entanto, se a célula hospedeira for de uma espécie diferente (que não seja K. phaffii), a sequência HCP4 que é endógena à célula hospedeira é homóloga à SEQ ID NO:7, por exemplo, a sequência ortóloga da SEQ ID NO:7.

[029] Especificamente, qualquer uma ou cada uma das sequências homólogas é caracterizada por pelo menos 50% de identidade de sequência com a respectiva sequência de aminoácidos em K. phaffii, especificamente pelo menos qualquer uma de pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90 % ou 95% de identidade de sequência.

[030] Especificamente, qualquer uma ou cada uma das sequências homólogas é caracterizada pela mesma função qualitativa, por exemplo, como proteína estrutural ou como enzima, embora sua atividade quantitativa possa ser diferente em comparação com a respectiva sequência de aminoácidos em K. phaffii.

[031] Especificamente, a célula hospedeira é geneticamente modificada por uma ou mais modificações genéticas compreendendo mutação(s) genômica(s) que reduzem a expressão do(s) polinucleotídeo(s) que codificam a referida pelo menos uma HCP.

[032] Especificamente, as uma ou mais modificações genéticas compreendem mutações genômicas que reduzem a expressão de um primeiro e/ou um segundo e/ou um terceiro polinucleotídeo endógeno, em que - o primeiro polinucleotídeo endógeno codifica HCP1; - o segundo polinucleotídeo endógeno codifica HCP2; e - o terceiro polinucleotídeo endógeno codifica HCP3.

[033] Opcionalmente, além disso, a célula hospedeira é ainda modificada para introduzir mutação(ões) genômica(s) que reduzem a expressão de um polinucleotídeo

8 / 77 endógeno adicional, em que - o referido polinucleotídeo endógeno adicional codifica HCP4.

[034] Especificamente, cada um dos polinucleotídeos endógenos que codificam a respectiva HCP é um polinucleotídeo endógeno do tipo selvagem (nativo) com uma sequência que ocorre naturalmente na célula hospedeira.

[035] Especificamente, o polinucleotídeo endógeno que codifica HCP1 em K.

phaffii compreende a SEQ ID NO:2. No entanto, se a célula hospedeira for de uma espécie diferente (diferente de K. phaffii), a sequência de codificação de HCP1 que é endógena à célula hospedeira é homóloga à SEQ ID NO:2, por exemplo, a sequência ortóloga da SEQ ID NO:2.

[036] Especificamente, o polinucleotídeo endógeno que codifica HCP2 em K.

phaffii compreende a SEQ ID NO:4. No entanto, se a célula hospedeira for de uma espécie diferente (diferente de K. phaffii), a sequência de codificação de HCP2 que é endógena à célula hospedeira é homóloga à SEQ ID NO:4, por exemplo, a sequência ortóloga da SEQ ID NO:4.

[037] Especificamente, o polinucleotídeo endógeno que codifica HCP3 em K.

phaffii compreende a SEQ ID NO:6. No entanto, se a célula hospedeira for de uma espécie diferente (diferente de K. phaffii), a sequência de codificação de HCP3 que é endógena à célula hospedeira é homóloga à SEQ ID NO:6, por exemplo, a sequência ortóloga da SEQ ID NO:6.

[038] Especificamente, o polinucleotídeo endógeno que codifica HCP4 em K.

phaffii compreende a SEQ ID NO:8. No entanto, se a célula hospedeira for de uma espécie diferente (diferente de K. phaffii), a sequência de codificação de HCP4 que é endógena à célula hospedeira é homóloga à SEQ ID NO:8, por exemplo, a sequência ortóloga da SEQ ID NO:8.

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[039] Especificamente, a célula hospedeira é geneticamente modificada por uma ou mais modificações genéticas do genoma da célula hospedeira compreendendo uma interrupção, substituição, exclusão (ou deleção) ou nocaute (ou knockout) de (i) um ou mais polinucleotídeos endógenos, ou uma parte dele; ou (ii) uma sequência de controle de expressão dos referidos um ou mais polinucleotídeos endógenos, de preferência em que a referida sequência de controle de expressão for selecionada a partir do grupo que consiste em um promotor, um local de ligação ribossômica, sequências de início e parada da transcrição ou da tradução, uma sequência intensificadora e ativadora.

[040] Especificamente, a modificação genética ou de nocaute inclui uma ou mais mutações genômicas, incluindo exclusão ou inativação de um gene ou sequência genômica que reduz a expressão de um gene ou parte de um gene em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, ou 95%, ou mesmo abole sua expressão, em comparação com o respectivo hospedeiro sem essa modificação genética.

[041] Especificamente, a modificação genética inclui pelo menos uma modificação das sequências de controle de expressão, como uma exclusão ou inativação de um promotor, intensificador, sinal, líder ou qualquer outra sequência reguladora, em particular aquelas que controlam a expressão e/ou secreção de uma proteína. Especificamente, as sequências de controle de expressão estão operacionalmente ligadas ao gene codificador da proteína relevante.

[042] Especificamente, as uma ou mais modificações genéticas compreendem mutações genômicas que constitutivamente prejudicam ou reduzem a expressão de um ou mais polinucleotídeos endógenos.

[043] Especificamente, as uma ou mais modificações genéticas compreendem mutações genômicas que introduzem uma ou mais sequências reguladoras induzíveis

10 / 77 ou repressíveis que condicionam condicionalmente ou reduzem a expressão de um ou mais polinucleotídeos endógenos. Tais modificações condicionalmente ativas têm como alvo particular os elementos reguladores e genes que são ativos e/ou expressos dependendo das condições da cultura de células.

[044] Especificamente, um gene que codifica qualquer uma das referidas pelo menos uma HCP é eliminada pelas referidas uma ou mais modificações genéticas.

[045] Especificamente, a expressão dos referidos um ou mais polinucleotídeos endógenos é reduzida ao produzir a POI. Especificamente, após modificação genética, a expressão dos referidos um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam a pelo menos uma HCP é reduzida em condições da cultura de células hospedeiras durante a qual a POI é produzida.

[046] Especificamente, a célula hospedeira é geneticamente modificada para reduzir a quantidade de um ou de cada uma das referidas pelo menos uma HCP em pelo menos qualquer um de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% (mol/mol) em comparação com a célula hospedeira sem a referida modificação, ou mesmo em 100%, abolindo assim a produção da respectiva HCP. Especificamente, a quantidade de cada um dos HCP1 e qualquer um, dois ou três de HCP2, HCP3 ou HCP4 é reduzida em pelo menos qualquer um de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100% (mol/mol) em comparação com a célula hospedeira sem a referida modificação. De acordo com uma incorporação específica, essa redução é alcançada por um nocaute de um gene que codifica qualquer um das referidas pelo menos uma HCP.

[047] Portanto, de acordo com uma incorporação específica, uma vez que a célula hospedeira descrita aqui é cultivada em uma cultura celular, a quantidade de HCP total no sobrenadante da cultura celular é reduzida em pelo menos 5% ou 10% ou mesmo pelo menos 15% (mol/mol), em comparação com a quantidade de HCP

11 / 77 total no sobrenadante da cultura ao cultivar a célula hospedeira comparável sem a referida modificação genética.

[048] A proteína total da célula hospedeira (HCP) em uma cultura de células refere-se à soma de todas as proteínas individuais derivadas das células que expressam a POI, mas excluindo a POI, e presentes no sobrenadante da cultura de células quando as células são separadas do meio de cultura de células, por exemplo, centrifugação.

[049] Especificamente, a célula hospedeira é geneticamente modificada para reduzir a quantidade da referida pelo menos uma HCP para menos do que qualquer um de 10%, ou 5% ou 3% (mol/mol) de HCP total no sobrenadante da cultura de células.

[050] Especificamente, a quantidade de cada uma das referidas pelo menos uma HCP aqui descrita é reduzida para menos de 1% (mol/mol) de HCP total no sobrenadante da cultura de células, ou abolida, por exemplo, conforme determinado por análise por espectrometria de massa.

[051] Especificamente, a quantidade de HCP total no sobrenadante da cultura de células é reduzida em pelo menos 5% ou pelo menos 10% (mol/mol) em comparação com a cultura de células da célula hospedeira comparável sem a referida modificação genética.

[052] Ao reduzir a produção da referida pelo menos uma HCP, a quantidade (por exemplo, o nível ou concentração, em particular a quantidade relativa a uma HCP de referência ou total) da referida pelo menos uma HCP obtida no sobrenadante da cultura de células é reduzida.

[053] Ao comparar a célula hospedeira aqui descrita para o efeito da referida modificação genética para reduzir a produção da referida pelo menos uma HCP, ela

12 / 77 é tipicamente comparada à célula hospedeira comparável sem essa modificação genética. A comparação é tipicamente feita com o mesmo tipo de célula hospedeira sem essa modificação genética, que é projetada para produzir a POI recombinante ou heterólogo, em particular quando cultivada sob condições para produzir a referida POI.

Alternativamente, a comparação é feita com o mesmo tipo de célula hospedeira que não é mais manipulado para produzir a POI recombinante ou heterólogo.

[054] De acordo com um aspecto específico, a redução da referida pelo menos uma HCP é determinada pela redução da quantidade (por exemplo, o nível ou concentração, ou a quantidade relativa a uma referência ou à HCP total) da referida pelo menos uma HCP no sobrenadante da cultura celular. Especificamente, a quantidade de cada HCP individual ou a quantidade de HCP total é determinada por um método adequado, como o emprego de um ensaio ELISA, HPLC, eletroforese capilar como SDS-PAGE ou espectrometria de massa, em particular onde a espectrometria de massa é cromatografia líquida –Espectrometria de massa (LC-MS) ou espectrometria de massa tandem de cromatografia líquida (LC-MS/MS), por exemplo, conforme descrito por Doneanu et al. (MAbs. 2012; 4(1): 24–44).

[055] Especificamente, é fornecida a célula hospedeira que é capaz de produzir uma quantidade reduzida de HCPs como subproduto além da POI. As HCPs incluem proteínas endógenas presentes independentemente de um processo de produção de POI específica ou proteínas específicas do processo, que são impurezas ou contaminantes em uma preparação de POI, como uma preparação do sobrenadante da cultura de células compreendendo a POI ou uma preparação obtida após a purificação da POI de um sobrenadante da cultura de células.

[056] De acordo com uma incorporação específica, a célula hospedeira é geneticamente modificada para compreender uma ou mais deleções de (uma ou mais)

13 / 77 sequências genômicas. Essa célula hospedeira é tipicamente fornecida como uma cepa de deleção.

[057] De acordo com um aspecto específico, a célula hospedeira aqui descrita compreende um cassete de expressão compreendendo uma ou mais sequências reguladoras de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas a uma sequência nucleotídica que codifica a POI, em particular em que as referidas uma ou mais sequências ligadas operacionalmente não estão naturalmente associadas à sequência de codificação da POI.

[058] Especificamente, o cassete de expressão compreende um promotor operacionalmente ligado ao gene codificador de POI e, opcionalmente, sequências de sinal e líder, conforme necessário para expressar e produzir a POI como uma proteína secretada.

[059] Especificamente, o cassete de expressão compreende um promotor constitutivo ou induzível ou repressível.

[060] Exemplos específicos de promotor constitutivo incluem, por exemplo, o pGAP e suas variantes funcionais, qualquer um dos promotores constitutivos, como pCS1, publicado em WO2014139608.

[061] Exemplos específicos de promotor induzível ou repressível incluem, por exemplo, o pAOX1 nativo ou pAOX2 e suas variantes funcionais, qualquer um dos promotores reguladores, como pG1-pG8, e seus fragmentos, publicados em WO2013050551; qualquer promotor regulador, como pG1 e pG1-x, publicado em WO2017021541 A1.

[062] Sequências promotoras adequadas para uso com células hospedeiras de levedura são descritas em Mattanovich et al. (Methods Mol. Biol. (2012) 824:329- 58) e incluem enzimas glicolíticas como triosefosfato isomerase (TPI), fosfoglicerato

14 / 77 cinase (PGK), gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH ou GAP) e suas variantes, lactase (LAC) e galactosidase (GAL), P. pastoris glicose-6-fosfato promotor de isomerase (PPGI), promotor de 3-fosfoglicerato cinase (PPGK), promotor de glicerol aldeído fosfato desidrogenase (pGAP), promotor do fator de alongamento da tradução (PTEF) e promotores da P. pastoris enolase 1 (PEN01), isomerase de triose fosfato (PTPI), proteínas da subunidade ribossômica (PRPS2, PRPS7, PRPS31, PRPL1), promotor de álcool oxidase (PAOX1, PAOX2) ou variantes dos mesmos com características modificadas, o promotor de formaldeído desidrogenase (PFLD), promotor de isocitrato-liase (PICL), promotor de alfa-cetoisocaproato descarboxilase (PTHI), os promotores dos membros da família das proteínas de choque térmico (PSSA1, PHSP90, PKAR2), 6-fosfogluconato desidrogenase (PGND1), fosfoglicerato desidrogenase (PGND1), fosfoglicerato mutase (PGPM1), transketolase (PTKL1), fosfatidilite, ferro-02-oxidoredutase (PFET3), permease de ferro de alta afinidade (PFTR1), fosfatase alcalina repressível (PPH08), N-miristoil transferase (PNMT1), fator de transcrição de resposta a feromônios (PMCM1), ubiquitina (PUBI4), endonuclease de DNA de fita simples (PRAD2), o promotor do principal portador de ADP/ATP da membrana interna mitocondrial (PPET9) (WO2008/128701) e o promotor de formato desidrogenase (FMD). O promotor GAP, o promotor AOX1 ou AOX2 ou um promotor derivado do promotor GAP ou AOX1 ou AOX2 é particularmente preferido. Os promotores de AOX podem ser induzidos pelo metanol e reprimidos pela glicose.

[063] Outros exemplos de promotores adequados incluem Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galactoquinase (GAL1), álcool Saccharomyces cerevisiae desidrogenase / gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP), álcool Saccharomyces cerevisiae triose fosfato

15 / 77 isomerase (TPI), Saccharomyces cerevisiae metalotioneína (CUP1) e Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato quinase (PGK) e Saccharomyces cerevisiae 3- fosfoglicerato quinase (PGK) e o promotor do gene da maltase (MAL).

[064] De acordo com um aspecto específico, o cassete de expressão é integrado dentro de um cromossomo da célula hospedeira ou dentro de um plasmídeo.

[065] O cassete de expressão pode ser introduzido na célula hospedeira e integrada no genoma da célula hospedeira como elemento intracromossômico, por exemplo, em um local específico de integração ou aleatoriamente integrado, quando uma linha celular hospedeira de alto produtor é selecionada. Alternativamente, o cassete de expressão pode ser integrado dentro de um elemento genético extracromossômico, como um plasmídeo ou YAC. De acordo com um exemplo específico, o cassete de expressão é introduzido na célula hospedeira por um vetor, em particular um vetor de expressão, que é introduzido na célula hospedeira por uma técnica de transecção adequada. Para este fim, a POI que codifica o polinucleotídeo pode ser ligado a um vetor de expressão.

[066] Um vetor de expressão de levedura preferido (que é preferencialmente usado para expressão em levedura) é selecionado do grupo que consiste em plasmídeos derivados de pPICZ, pGAPZ, pPIC9, pPICZalfa, pGAPZalfa, pPIC9K, pGAPHis ou pPUZZLE.

[067] Técnicas para transfectar ou transformar células eucarióticas que introduzem um vetor ou plasmídeo são bem conhecidas na técnica. Estes podem incluir captação mediada por vesícula lipídica, captação mediada por choque térmico, transfecção mediada por fosfato de cálcio (co-precipitação de fosfato de cálcio/DNA), infecção viral e, particularmente, usando vírus modificados, como, por exemplo, adenovírus modificados, microinjeção e eletroporação.

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[068] De acordo com um aspecto específico, a célula hospedeira aqui descrita pode sofrer uma ou mais modificações genéticas adicionais, por exemplo, para melhorar a produção de proteínas.

[069] Especificamente, a célula hospedeira é ainda modificada por engenharia para modificar um ou mais genes que influenciam a atividade proteolítica usada para gerar cepas deficientes em protease, em particular uma cepa deficiente na atividade Y da carboxipeptidase. Exemplos particulares são descritos em WO1992017595A1.

Exemplos adicionais de uma cepa de Pichia deficiente em protease com uma deficiência funcional em uma protease vacuolar, como proteinase A ou proteinase B, são descritos em US6153424A. Outros exemplos são as estirpes de Pichia que têm uma deleção ade2 e/ou deleções de um ou de ambos os genes da protease, PEP4 e PRB1, são fornecidas por, por exemplo, ThermoFisher Scientific.

[070] Especificamente, a célula hospedeira é projetada para modificar pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto genético funcional, em particular uma protease, selecionada do grupo que consiste em PEP4, PRB1, YPS1, YPS2, YMP1, YMP2, YMP1, DAP2, GRHl, PRD1, YSP3 e PRB3, conforme divulgado em WO2010099195A1.

[071] A POI pode ser qualquer um de peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou metabolitos eucarióticos, procarióticos ou sintéticos de uma célula hospedeira.

[072] Especificamente, a POI é heteróloga às espécies de células hospedeiras.

[073] Especificamente, a POI é um peptídeo, polipeptídeo ou proteína segregado, isto é, segregado da célula hospedeira para o sobrenadante da cultura celular.

[074] Especificamente, a POI é uma proteína eucariótica, preferencialmente

17 / 77 uma proteína derivada ou relacionada a mamíferos, como uma proteína humana ou uma proteína compreendendo uma sequência de proteína humana, ou uma proteína bacteriana ou proteína derivada de bactérias.

[075] De preferência, a POI é uma proteína terapêutica que funciona em mamíferos.

[076] Em casos específicos, a POI é uma proteína multimérica, especificamente um dímero ou tetrâmero.

[077] De acordo com um aspecto específico, a POI é um peptídeo ou proteína selecionado do grupo que consiste em uma proteína de ligação ao antígeno, uma proteína terapêutica, uma enzima, um peptídeo, um antibiótico proteico, uma proteína de fusão de toxinas, um conjugado carboidrato - proteína, uma proteína estrutural, uma proteína reguladora, um antígeno de vacina, um fator de crescimento, um hormônio, uma citocina, uma enzima de processo e uma enzima metabólica.

[078] Uma POI específica é uma molécula de ligação ao antígeno, como um anticorpo, ou um fragmento dele, em particular um fragmento de anticorpo que compreende um domínio de ligação ao antígeno. Entre as POIs específicas estão os anticorpos como anticorpos monoclonais (mAbs), imunoglobulina (Ig) ou imunoglobulina classe G (IgG), anticorpos de cadeia pesada (HcAbs) ou fragmentos dos mesmos, como a ligação fragmento-antígeno (Fab), Fd, fragmento variável de cadeia simples (scFv) ou variantes manipuladas dos mesmos, como por exemplo, dímeros de Fv (diabéticos), trimeros de Fv (triabodies), tetrâmeros de Fv ou minicorpos e anticorpos de domínio único como VH, VHH, IgNARs ou V-NAR, ou qualquer proteína compreendendo um domínio dobrado de imunoglobulina. Moléculas de ligação a antígeno adicionais podem ser selecionadas a partir de miméticos de anticorpos ou proteínas de andaime (alternativas), tais como, por exemplo, domínios

18 / 77 de Kunitz manipulados, Adnectinas, Affibodies, Affiline, Anticalins ou DARPins.

[079] De acordo com um aspecto específico, a POI é, por exemplo, BOTOX, Myobloc, Neurobloc, Dysport (ou outros sorotipos de neurotoxinas botulínicas), alglucosidase alfa, daptomicina, YH-16, coriogonadotropina alfa, filgrastim, cetrorelix, interleucina-2, aldesleucina, teclina , denileucina diftitox, interferon alfa-n3 (injeção), interferon alfa-nl, DL-8234, interferon, Suntory (gama-1a), interferon gama, timosina alfa 1, tasonermina, DigiFab, ViperaTAb, EchiTAb, CroFab, nesiritide, abatacept, alefacept, Rebif, eptoterminalfa, teriparatida (osteoporose), calcitonina injetável (doença óssea), calcitonina osteoporose), etanercept, hemoglobina glutâmero 250 (bovino), drotrecogina alfa, colagenase, carperitida, fator de crescimento epidérmico humano recombinante (gel tópico, cicatrização), DWP401, darbepoetina alfa, epoetina ômega, epoetina beta, epoetina alfa, desirudina, lepirudina, bivalirudina, alfa não acog, alfa ativada (mononina) eptacog, Fator VIII recombinante + VWF, Recombinar, Fator VIII recombinante, Fator VIII (recombinante), Alphnmate, octocog alfa, Fator VIII, palifermina, indikinase, tenecteplase, alteplase, pamiteplase, reteplase, nateplase, monteplase, folitropina alfa, rFSH, hpFSH, micafungina, pegfilgrastim, lenograstim, nartograstim, lenograstim, narto pramlintida, iniglucerase, galsulfase, leucotropina, molgramostirn, acetato de triptorelina, histrelina (implante subcutâneo, Hydron), deslorelina, histrelina, nafarelina, depósito de liberação sustentada de leuprolide (ATRIGEL), implante de leuprolide (DUROS), goserelina, Eutropin, programa KP-102, somatropina, mecasermina (falha no crescimento), enlfavirtida, Org-33408, insulina glargina, insulina glulisina, insulina (inalada) insulina lispro, insulina deternir, insulina (bucal, RapidMist), mecasermin rinfabate, anakinra, celmoleukin, injeção de 99 mTc- apcitide, mielopídeo, Betaseron, acetato de glatiramer, Gepon, sargramostim, oprelvekin, interferons alfa derivados de leucócitos humanos, Bilive, insulina

19 / 77

(recombinante), insulina humana recombinante, insulina aspártico, mecasenina,

Roferon-A, interferon alfa 2, Alfaferona, interferon alfacon-1, interferon alfa, hormona luteinizante humana recombinante da Avonex, dornase alfa, trafermina, ziconotida,

taltirelina, diboterminalfa, atosiban, becaplermin, eptifibatida, Zemaira, CTC-111,

Shanvac-B, vacina contra HPV (quadrivalente), octreotida, lanreotida, ancestral,

agalsidase beta, agalsidase alfa, laronidase, preon gel tópico), rasburicase,

ranibizumabe, Actimmune, PEG-Intron, Tricomin, injeção de dessensibilização por alergia a ácaros do pó doméstico recombinante, hormônio da paratireóide recombinante humano (PTH) 1-84 (sc, osteoporose), delta de epoetina, antitrombina

III transgênica, Granditropina, Vitrase, insulina recombinante, interferon-alfa (pastilha oral), GEM-21S, vapreotida, idursulfase, omnapatrilat, albumina sérica recombinante,

certolizumab pegol, glucarpidase, inibidor recombinante de C1 esterase humana recombinante (angioedema), lanoteplase, hormônio do crescimento humano recombinante, enfuvirtida (injeção sem agulha, Biojector 2000), VGV-1, interferon

(alfa), lucinactante, aviptadil (inalado, doença pulmonar), icatibant, ecallantide,

omiganan, Aurograb, acetato de pexigan, ADI-PEG-20, LDI-200, degarrelix,

cintredelinbesudotox, Favld, MDX-1379, ISAtx-247, liraglutido, teriparatida

(osteoporose), tifacogina, AA4500, loção lipossômica T4N5, cartuxomab, DWP413,

ART-123 Chrysalin, desmoteplase, amediplase, corifollitropinalpha, TH-9507,

teduglutido, Diamyd, DWP-412, hormônio do crescimento (injeção de liberação sustentada), G-CSF recombinante, insulina (inalada, AR), insulina (inalada, AR),

insulina (inalada, tecnosfera), insulina ( inalado, AERx), RGN-303, DiaPep277,

interferon beta (infecção viral da hepatite C (HCV)), interferon alfa-n3 (oral),

belatacept, adesivos transdérmicos de insulina, AMG-531, MBP-8298, Xerecept,

opebacan, AIDSVAX, GV-1001, LymphoScan, ranpirnase, Lipoxysan, lusupultida,

20 / 77

MP52 (transportador de fosfato tricálcico tricíclico, regeneração óssea), vacina contra melanoma, sipuleucel-T, CTP-37, Insegia, vitespen, trombina humana (congelada,

sangramento cirúrgico), trombina , TransMID, alfimeprase, Puricase, terlipressina

(síndrome intravenosa, hepato-renal), EUR-1008M, FGF-I recombinante (doença vascular e injetável), BDM-E, rotigaptida, ETC-216, P-113, MBI-594AN, duramicina (

fibrose cística inalada), SCV-07, OPI-45, Endostatina, Angiostatina, ABT-510,

Bowman Birk Inhibitor Concentrate, XMP-629, 99 mTc-Hynic-Annexin V, kahalalide F,

CTCE-9908, teverelix (liberação prolongada), ozarelix, rornidepsina, BAY-504798,

interleucina4, PRX-321, Pepscan, iboctadekin, rhlactoferrin, TRU-015, IL-21, ATN-

161, cilengitide, Albuferon, Bifásix, IRX-2, interferon ômega, PCK-3145, CAP-232,

pasireotida, huN901-DMI, vacina imunoterapêutica para câncer de ovário, SB-249553,

Oncovax-CL, OncoVax-P, BLP-25, CerVax-16, vacina contra melanoma de peptídeo multi-epítopo (MART-1, gp100, tirosinase), nemifitide, rAAT (inalado), rAAT

(dermatológico), CGRP (inalado, asma), pegsunercept, thymosinbeta4, plitidepsina,

GTP-200, ramoplanina, GRASPA, OBI-1, AC-100, calcitonina de salmão (oral, eligen),

calcitonina (oral, osteoporose), examorelina, capromorelina, Cardeva, velafermin,

131I-TM-601, KK-220, T-10, ularitida, despelestat, hematida, crisálida (tópica),

rNAPc2, fator recombinante V111 (lipossomal PEGuilado), bFGF, variante de estafilocinase recombinante PEGuilada, V-10153, SonoLysis Prolyse, NeuroVax,

CZEN-002, terapia de neogênese de células de ilhotas, rGLP-1, BIM-51077, liberação de LY-548806, Medisorb), AVE-0010, GA-GCB, avorelina, ACM-9604, eacetato de linaclotídeo, CETi-1, Hemospan, VAL (injetável), insulina de ação rápida (injetável,

Viadel), insulina intranasal, insulina (inalada), insulina (oral, elígeno), leptina humana metionil recombinante, injeção subcutânea pitrakinra, eczema), pitrakinra (pó seco inalado, asma), Multikine, RG-1068, MM-093, NBI -6024, AT-001, PI-0824, Org-

21 / 77

39141, Cpn10 (doenças auto-imunes / inflamação), talactoferrina (tópica), rEV-131

(oftalmológico), rEV-131 (doença respiratória), insulina humana recombinante oral

(diabetes), RPI-78M, oprelvekin (oral), CYT-99007 CTLA4-Ig, DTY-001, valategrast,

interferon alfa-n3 (tópico), IRX-3, RDP-58, Tauferon, lipase estimulada por sal biliar,

Merispase, fosfatase alalina, EP-2104R, Melanotan-II, bremelanotide, ATL-104,

microplasmina humana recombinante, AX-200, SEMAX, ACV-1, Xen-2174, CJC-

1008, dinorfina A, SI-6603, LAB GHRH, AER-002, BGC-728, vacina contra malária

(virossomas, PeviPRO), ALTU-135, vacina contra parvovírus B19, vacina contra influenza (recombinante) neuraminidase), vacina contra malária / HBV, vacina contra antraz, Vacc-5q, Vacc-4x, vacina contra HIV (oral), vacina contra HPV, Toxóide Tat,

YSPSL, CHS-13340, creme lipossômico de PTH (1-34) (Novasome), Ostabolin -C,

análogo de PTH (tópico, psoríase), MBRI-93.02, vacina MTB72F (tuberculose), vacina

MVA-Ag85A (tuberculose), FARA04, BA-210, vacina FIV de peste recombinante, AG-

702, OxSODrol, rBetV1, Vacina dirigida a alérgenos Der-p1 / Der-p2 / Der-p7 (alergia a ácaros), antígeno peptídico PR1 (leucemia), vacina mutante ras, vacina contra lipopeptídeo HPV-16 E7, vacina contra labirintina (adenocarcinoma), vacina CML,

WT1- vacina peptídica (câncer), IDD-5, CDX-110, Pentrys, Norelin, CytoFab, P-9808,

VT-111, icrocaptide, telbermin (dermatológica, úlcera diabética do pé), rupintrivir,

reticulose, rGRF, HA, alfa-galactosidase A, ACE-011, ALTU-140, CGX-1160, vacina terapêutica de angiotensina, D-4F, ETC-642, APP-018, rhMBL, SCV-07 (oral,

tuberculose), DRF-7295, ABT-828, imunotoxina específica para ErbB2 (anticâncer),

DT3SSIL-3, TST-10088, PRO-1762, Combotox, peptídeos de ligação ao receptor de colecistocinina-B / gastrina, 111In-hEGF, AE-37, trasnizumab-DM1, Antagonista G, IL-

12 (recombinante), PM-02734, IMP-321, rhIGF-BP3, BLX-883, CUV-1647 (tópico),

radioimunoterapêuticos à base de L-19 (câncer), Re-188-P-2045, AMG-386, vacina

22 / 77

DC / 1540 / KLH (câncer), VX-001, AVE-9633, AC-9301, vacina NY-ESO-1

(peptídeos), peptídeos NA17.A2, melanoma vacina (terapêutica com antígeno pulsado), vacina contra o câncer de próstata, CBP-501, lactoferrina humana recombinante (olho seco), FX-06, AP-214, WAP-8294A (injetável), ACP-HIP, SUN-

11031, peptídeo YY [3-36] (obesidade intranasal), FGLL, atacicept, BR3-Fc, BN-003,

BA-058, hormônio da paratireóide humano 1-34 (nasal, osteoporose), F -18-CCR1,

AT-1100 (doença celíaca / diabetes), JPD-003, PTH (7-34) creme lipossômico

(Novasome), duramicina (oftálmica, olho seco), CAB-2, CTCE-0214, eritropoietina glico-PEGilada, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, JR-013, Fator XIII, aminocandin, PN-

951, 716155, SUN-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, teverelix (liberação imediata), EP-

51216, hGH (liberação controlada, Biosfera), OGP-I, sifuvirtida, TV4710, ALG-889,

Org-41259, rhCC10, F-991, timopentina (doenças pulmonares), r (m) PCR, insulina hepato-seletiva, subalin, L19-IL -2 proteína de fusão, elafin, NMK-150, ALTU-139, EN-

122004, rhTPO, agonista do receptor de trombopoietina (distúrbios trombocitopênicos), AL-108, AL-208, antagonistas do fator de crescimento nervoso

(dor), SLV-317, CGX -1007, INNO-105, teriparatida oral (eligen), GEM-OS1, AC-

162352, PRX-302, vacina de fusão LFn-p24 (Therapore), EP-1043, vacina pediátrica

S pneumoniae, vacina contra malária, Neisseria meningitidis Group B vacina, vacina estreptocócica do grupo B neonatal, vacina contra antraz, vacina contra HCV (gpE1 + gpE2 + MF-59), terapia para otite média, vacina contra HCV (antígeno central +

ISCOMATRIX), hPTH (1-34) (transdérmico, ViaDerm), 768974, SYN-101, PGN-0052,

aviscumnina, BIM-23190, vacina contra tuberculose, peptídeo tirosinase multi-

epítopo, vacina contra câncer, enkastim, APC-8024, GI-5005, ACC-001, TTS- CD3,

TNF de alvo vascular (tumores sólidos), desmopressina (liberação controlada bucal),

onercept ou TP-9201, adalimumabe (HUMIRA), infliximabe (REMICADE™),

23 / 77 rituximabe (RITUXAN™ / MAB THERA™), etanercept (ENBREL™), bevacizumab (AVASTIN™), trastuzumab (HERCEPTIN™), pegrilgrastim (NEULASTA™) ou qualquer outra POI adequado, incluindo biossimilares e biossuperiores.

[080] De acordo com um aspecto específico, a célula hospedeira pode ser qualquer célula animal, uma célula vertebrada, uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula vegetal, uma célula nematóide, uma célula de invertebrado, como uma célula de inseto ou uma célula de molusco, um tronco célula derivada de qualquer um dos anteriores, ou uma célula fúngica ou uma célula de levedura. Especificamente, a célula hospedeira é uma célula de um gênero selecionado do grupo que consiste em Pichia, Hansenula, Komagataella, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Ogataea, Yarrowia e Geotrichum, especificamente Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Ogataea minuta ou Hansenula polymorpha ou fungos filamentosos como Aspergillus awamori ou Trichoderma reesei. De preferência, a célula hospedeira é uma levedura metilotrófica, de preferência Pichia pastoris. Aqui Pichia pastoris é usado como sinônimo para todos, Komagataella pastoris, Komagataella phaffii e Komagataella pseudopastoris.

[081] De acordo com um aspecto específico, a célula hospedeira é uma levedura ou célula fúngica filamentosa selecionada do grupo que consiste em Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella phaffii pastoris e Schizosaccharomyces pombe.

[082] De acordo com um aspecto específico, a célula hospedeira é uma célula eucariótica inferior, como por exemplo uma célula de levedura (por exemplo, gênero Pichia (por exemplo, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri e Pichia angusta), gênero Komagataella (por exemplo, Komagataella pastoris, Komagataella

24 / 77 pseudopastoris ou Komagataella phaffii), gênero Saccharomromces (por exemplo, Saccharomyces, Saccharomyces), O gênero Kluyveromyces (por exemplo, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus), o gênero Candida (por exemplo, Candida utilis, Candida cacaoi, Candida boidinii), o gênero Geotrichum (por exemplo, Geotrichum fermentans), Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolyces ou Schizosaccharomyces pombe. Preferida é a espécie Pichia pastoris. Exemplos de cepas de Pichia pastoris são X33, GS115, KM71, KM71H; CBS 2612 e CBS7435.

[083] Especificamente, a célula hospedeira é uma cepa de Pichia pastoris selecionada do grupo que consiste em CBS 704, CBS 2612, CBS 7435, CBS 9173- 9189, DSMZ 70877, X-33, GS115, KM71, KM71H e SMD1168.

[084] Fontes: CBS 704 (=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382), CBS 2612 (=NRRL Y-7556), CBS 7435 (=NRRL Y-11430), CBS 9173-9189 (cepas CBS: Centro de Biodiversidade Fúngica CBS-KNAW, Centraalbureau voor Schimmelculturen, Utrecht, Países Baixos) e DSMZ 70877 (Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas de Células); cepas da Invitrogen, como X-33, GS115, KM71, KM71H e SMD1168.

Exemplos de cepas de S. cerevisiae incluem W303, CEN.PK e a série BY (coleção EUROSCARF). Todas as cepas descritas acima foram utilizadas com sucesso para produzir transformantes e expressar genes heterólogos.

[085] A célula hospedeira eucariótica pode ser uma célula fúngica (por exemplo, Aspergillus (como A. niger, A. fumigatus, A. oryzae, A. nidulans), Acremonium (como A. thermophilum), Chaetomium (como C. thermophilum), Chrysosporium (como C. thermophile), Cordyceps (como C. militaris), Corynascus, Ctenomyces, Fusarium (como F. oxysporum), Glomerella (como G. graminicola), Hipocrea (como H. jecorina), Magnaporthe (como M. oryzae), Myceliophthora (como M. thermophile), Nectria (como N. haematococca), Neurospora (como N. crassa),

25 / 77 Penicillium, Sporotrichum (como S. thermophile), Thielavia (como T. terrestris, T.

heterothallica), Trichoderma (como T. reesei) ou Verticillium (como V. dahlia)).

[086] De acordo com um aspecto específico, a célula de mamífero é uma célula humana, de roedor ou de bovino, de uma linhagem celular ou de uma cepa celular. Exemplos de células de mamífero específicas adequadas como células hospedeiras aqui descritas são linhas de células de mieloma de camundongo (NSO), linhas de células de ovário de hamster chinês (CHO), HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, MDCK, NIH3T3, PC12, BHK ( célula renal de hamster bebê), VERO, SP2/0, YB2/0, Y0, C127, célula L, COS, por exemplo, COS1 e COS7, QC1-3, HEK- 293, VERO, PER.C6, HeLA, EBl, EB2, EB3, linhas de células oncolíticas ou de hibridoma. Preferencialmente, as células de mamífero são linhas de células CHO.

Numa incorporação, a célula é uma célula CHO. Em uma incorporação, a célula é uma célula CHO-K1, uma célula CHO-K1 SV, uma célula DG44 CHO, uma célula DUXB11 CHO, uma célula DUKX CHO, uma célula DUKX CHO, uma célula CHO-S, uma CHO GS nocaute de CHO FUT8 celular, uma célula nocaute para CHO FUT8 GS, uma célula derivada de CHOZN ou CHO. A célula nocaute CHO GS (por exemplo, célula GSKO) é, por exemplo, uma célula nocaute CHO-K1 SV GS. A célula nocaute do CHO FUT8 é, por exemplo, a Potelligent® CHOK1 SV (Lonza Biologics, Inc.). As células eucarióticas também incluem células aviárias, linhas celulares ou cepas celulares, como por exemplo, células EBx®, EB14, EB24, EB26, EB66 ou EBvl3.

[087] De acordo com outro aspecto específico, a célula eucariótica é uma célula de inseto (por exemplo, células Sf9, Mimic ™ Sf9, Sf21, High FiveTM (BT1-TN- 5B1-4) ou BT1-Ea88), uma célula de algas (por exemplo, de o gênero Amphora, Bacillariophyceae, Dunaliella, Chlorella, Chlamydomonas, Cyanophyta (cyanobacteria), Nannochloropsis, Spirulina ou Ochromonas) ou uma célula vegetal

26 / 77 (por exemplo, células de plantas monocotiledôneas (por exemplo, milho, arroz, trigo ou Setaria) ou de plantas dicotiledôneas (por exemplo, mandioca, batata, soja, tomate, tabaco, alfafa, Physcomitrella patens ou Arabidopsis).

[088] Células hospedeiras adequadas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, em coleções de culturas como DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemanha) ou American Type Culture Collection (ATCC).

[089] De acordo com uma incorporação específica, a invenção fornece um método para a produção de uma proteína de interesse (POI) em uma célula hospedeira eucariótica, compreendendo as etapas: i) modificar geneticamente a célula hospedeira para reduzir a produção de pelo menos uma proteína da célula hospedeira endógena (HCP) selecionada do grupo que consiste em uma primeira HCP (HCP1), uma segunda HCP (HCP2) e uma terceira HCP (HCP3), em que a) HCP1 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 1, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie; b) HCP2 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 3, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie; e c) HCP3 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 5, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie.

ii) introduzir na célula hospedeira um cassete de expressão compreendendo uma ou mais sequências reguladoras de ácidos nucleicos

27 / 77 operacionalmente ligadas a uma sequência nucleotídica que codifica a POI; iii) cultivar a referida célula hospedeira sob condições para produzir a referida POI; e opcionalmente; iv) isolar a referida POI da cultura de células, em particular do sobrenadante da cultura de células; e opcionalmente v) purificar a referida POI.

[090] Especificamente, a POI de interesse pode ser produzida cultivando a célula hospedeira em um meio apropriado, isolando a POI expressa da cultura, em particular o sobrenadante da cultura de células e purificando-o por um método apropriado para o produto expresso, em particular para separar a POI da célula. Deste modo, pode ser produzida uma preparação de POI purificada.

[091] De acordo com uma outra incorporação específica, a invenção fornece um método para produzir uma célula hospedeira eucariótica capaz de produzir uma proteína de interesse (POI) em uma cultura de células hospedeiras, introduzindo

[092] Especificamente, a etapa i) do método aqui descrito é realizada antes, ou depois ou concomitantemente com a etapa ii).

[093] De acordo com um aspecto específico, a célula hospedeira é primeiro geneticamente modificada para reduzir, digamos, pelo menos uma HCP antes de ser projetada para produzir a POI heteróloga ou recombinante. De acordo com um exemplo específico, uma célula hospedeira do tipo selvagem é geneticamente modificada de acordo com a etapa i) do método aqui descrito. Especificamente, a célula hospedeira é fornecida após a introdução das referidas uma ou mais modificações genéticas para redução de HCP em uma cepa de célula hospedeira do tipo selvagem.

[094] De acordo com um aspecto adicional, a célula hospedeira é primeiro

28 / 77 manipulada para produzir a POI heteróloga ou recombinante, antes de ser posteriormente geneticamente modificada para reduzir, digamos, pelo menos uma HCP. De acordo com um exemplo específico, uma célula hospedeira do tipo selvagem pode primeiro ser manipulada para compreender o cassete de expressão para produção de POI. Essa célula hospedeira manipulada pode então ser modificada ainda mais para reduzir a HCP, como descrito aqui mais adiante.

[095] De acordo com um aspecto adicional, a célula hospedeira está passando por ambos, a manipulação para produção de POI e a modificação genética para redução de HCP em uma etapa do método, por exemplo, empregando o respectivo cassete de expressão, reagentes e ferramentas em uma ou mais misturas de reação.

[096] Especificamente, a célula hospedeira é uma linha celular cultivada em uma cultura celular, em particular uma linha celular hospedeira de produção.

[097] De acordo com uma outra incorporação específica, a invenção fornece um método para produzir uma proteína de interesse (POI) cultivando a célula hospedeira aqui descrita, ou obtenível por um método aqui descrito, sob condições para produzir a referida POI.

[098] De acordo com uma outra incorporação específica, a invenção fornece o uso da célula hospedeira aqui descrita para a produção de uma POI.

[099] De acordo com uma incorporação específica, a linha celular é cultivada sob condições de batelada, batelada alimentado ou cultura contínua. A cultura pode ser realizada em placas de microtitulação, frascos de agitação ou um biorreator começando com uma fase de batelada como o primeiro passo, seguida por uma fase de batelada alimentada ou por uma fase de cultura contínua como segundo passo.

[100] Especificamente, o método aqui descrito compreende pelo menos uma modificação genética da célula hospedeira para reduzir a quantidade de pelo menos

29 / 77 uma da referida HCP, como aqui descrito. Em particular, a pelo menos uma modificação genética introduz qualquer um ou mais dos seguintes recursos de redução de HCP na célula hospedeira em comparação com a célula hospedeira sem a referida modificação genética para redução de HCP, em particular em culturas sob condições para expressar a referida POI: • a quantidade de pelo menos uma da referida HCP produzido pela célula hospedeira é reduzida para menos do que qualquer um dos 10%, 5% ou 3% (mol / mol) da HCP total; • a quantidade de pelo menos uma da referida HCP produzida pela célula hospedeira é reduzida em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% (mol / mol) ou mesmo 100%, abolindo assim a produção da respectiva HCP; • a quantidade de cada uma da referida HCP produzida pela célula hospedeira, em particular cada uma das HCP1 e qualquer um, duas ou três de HCP2, HCP3 ou HCP4, é reduzida em pelo menos qualquer um de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% (mol / mol); • a quantidade de cada uma das referidas HCP produzida pela célula hospedeira, em particular cada uma das HCP1 e qualquer um, duas ou três de HCP2, HCP3 ou HCP4, é reduzida para menos de 1% mol / mol) do total HCP; • a quantidade de HCP total no sobrenadante da cultura de células é reduzida em pelo menos 5%, 10% ou 15% (mol / mol).

[101] De acordo com uma outra incorporação específica, a invenção fornece um método para reduzir o risco de contaminação por proteína de célula hospedeira endógena (HCP) de uma proteína de interesse (POI) produzida em uma cultura de célula hospedeira, cultivando a célula hospedeira aqui descrita sob condições para produzir a referida POI e isolar a POI da referida cultura de células. Ao reduzir a

30 / 77 quantidade de HCP, a pureza da POI na cultura de células hospedeiras, ou uma fração dela, pode ser efetivamente aumentada.

FIGURAS

[102] Figura 1: Sequências HCP aqui descritas HCP1 de Komagataella phaffii

[103] SEQ ID NO: 1: sequência de aminoácidos de F2QXM5 (número de acesso NCBI): Proteína não caracterizada, PP7435_Chr3-1213, PAS_Chr3_0030, gi l 254570259, gi l 328353755, PIPA05357, CCA40153;

[104] SEQ ID NO: 2: sequência de nucleotídeos correspondente a F2QXM5 (número de acesso NCBI): Proteína não caracterizada, PP7435_Chr3-1213, PAS_Chr3_0030, gi l 254570259, gi l 328353755, PIPA05357, CCA40153; HCP2 de Komagataella phaffii

[105] SEQ ID NO: 3: sequência de aminoácidos de F2QNG1 (número de acesso NCBI): Proteína da parede celular com similaridade às glucanases, PP7435_Chr1-0232, PAS_Chr1-3_0229, gi l 25456492, gi l 328349994, PIPA04722;

[106] SEQ ID NO: 4: sequência de nucleotídeos correspondente a F2QNG1 (número de acesso NCBI): Proteína da parede celular com similaridade às glucanases, PP7435_Chr1-0232, PAS_Chr1-3_0229, gi l 25456492, gi l 328349994, PIPA04722; HCP3 de Komagataella phaffii

[107] SEQ ID NO: 5: sequência de aminoácidos de F2QQT7 (número de acesso NCBI): Proteína da família SUN (Sim1p, Uth1p, Nca3p, Sun4p), PAS_chr2- 2_0064;

[108] SEQ ID NO:6: sequência nucleotídica correspondente a F2QQT7: Proteína da família SUN (Sim1p, Uth1p, Nca3p, Sun4p), PAS_chr2-2_0064;

31 / 77 HCP4 de Komagataella phaffii

[109] SEQ ID NO: 7: sequência de aminoácidos de F2QXH5 (número de acesso NCBI): EPX1; Proteína extracelular X1, PAS_chr3_0076, PIPA00934, PP7435_Chr3-1160;

[110] SEQ ID NO: 8: sequência de nucleotídeos correspondente a F2QXH5 (número de acesso NCBI): EPX1; Proteína extracelular X1, PAS_chr3_0076, PIPA00934, PP7435_Chr3-1160; HCP1 Homólogo de Komagataella pastoris

[111] SEQ ID NO:20: sequência de aminoácidos do número de acesso do NCBI: BA75_00021T0 [Komagataella pastoris], GenBank: ANZ74151.1; HCP2 Homólogo de Komagataella pastoris

[112] SEQ ID NO:21: sequência de aminoácidos do número de acesso do NCBI: BA75_01624T0 [Komagataella pastoris], GenBank: ANZ73790.1; HCP3 Homólogo de Komagataella pastoris

[113] SEQ ID NO:22: sequência de aminoácidos do número de acesso do NCBI: BA75_01931T0 [Komagataella pastoris], GenBank: ANZ76017.1; HCP4 Homólogo de Komagataella pastoris

[114] SEQ ID NO:23: sequência de aminoácidos do número de acesso do NCBI: BA75_00070T0 [Komagataella pastoris], GenBank: ANZ73364.1; HCP2 Homólogo de S. cerevisiae

[115] SEQ ID NO:24: sequência de aminoácidos do número de acesso do NCBI: SCW10 [Saccharomyces cerevisiae], GenBank: KZV09161.1; >SCW10 YMR305C SGDID:S000004921; HCP2 Homólogo de S. cerevisiae

[116] SEQ ID NO:25: sequência de aminoácidos do número de acesso do

32 / 77 NCBI: SCW4 [Saccharomyces cerevisiae], GenBank: KZV11513.1; >SCW4 YGR279C SGDID:S000003511; HCP3 Homólogo de S. cerevisiae

[117] SEQ ID NO:26: sequência de aminoácidos do número de acesso do NCBI: SUN4 [Saccharomyces cerevisiae], GenBank: CAA95939.1; >SUN4 YNL066W SGDID:S000005010;

[118] Figura 2: Verificação baseada em PCR das cepas nocaute da HCP1. O gene que codifica para HCP1 foi parcialmente excluído usando o sistema de cassetes com marcador de divisão na cepa do tipo selvagem CBS2612, bem como em três cepas que expressam cada uma das três proteínas de interesse (POI1-3). Uma PCR de verificação usando o par de primers Control_Forward e Control_Reverse fornece um produto de PCR de 4602pb em caso de nocaute da HCP1, comparado a 3699pb quando o locus genômico ainda está intacto. Duas digestões de restrição nos produtos de PCR foram realizadas com EcoRI ou Ncol para verificar adicionalmente o amplicon de PCR. O produto de PCR das cepas de nocaute positivas não é clivado pelo EcoRI (fragmento de 4602 pb); enquanto é digerido por NcoI (fragmentos de 1955bp e 2647bp). Para todas as cepas nocaute, a exclusão bem-sucedida pode ser confirmada.

[119] Figura 3: Verificação baseada em PCR da cepa de fundo HCP1 NC.

[120] Figura 4: Representação gráfica da abundância de HCP1 em comparação com todas as outras HCP em cepas de Pichia do tipo selvagem (CBS2612) e Pichia do tipo selvagem que expressam qualquer uma das três POIs. A HCP1 é responsável por surpreendentes 43 - 70% do conteúdo total de HCP no final das amostras de fermentação.

[121] Figura 5: Redução de 20 - 79% da HCP total em cepas de HCP1 NC em

33 / 77 comparação com cepas do tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[122] Termos específicos usados em toda a especificação têm o seguinte significado.

[123] O termo “célula hospedeira”, conforme aqui utilizado, deve se referir a uma única célula, a um único clone de célula ou a uma linha celular de uma célula hospedeira.

[124] O termo “linha celular”, conforme aqui utilizado, refere-se a um clone estabelecido de um tipo de célula específico que adquiriu a capacidade de proliferar por um período prolongado. Uma linha celular é tipicamente usada para expressar um gene endógeno ou recombinante, ou produtos de uma via metabólica para produzir polipeptídeos ou metabólitos celulares mediados por esses polipeptídeos. Uma “linha de células hospedeiras de produção” ou “linha de células de produção” é comumente entendida como uma linha de células pronta para uso para cultura de células em um biorreator para obter o produto de um processo de produção, como uma POI.

[125] A célula hospedeira que produz a POI, como descrito aqui, também é referida como “célula hospedeira de produção” e uma respectiva linha celular, uma “linha celular de produção”.

[126] Incorporações específicas aqui descritas referem-se a uma linha de células hospedeiras de produção que é caracterizada por uma baixa expressão de HCP.

[127] O termo “célula hospedeira eucariótica” significa qualquer célula ou organismo eucariótico que possa ser cultivado para produzir uma POI ou um metabólito da célula hospedeira. É sabido que o termo não inclui seres humanos.

[128] O termo “cultura de células”, conforme usado aqui em relação a uma

34 / 77 célula hospedeira, refere-se à manutenção de células em um ambiente artificial, por exemplo, em ambiente in vitro, sob condições que favorecem o crescimento, a diferenciação ou a viabilidade contínua, em um estado ativo ou inativo, de as células, especificamente em um biorreator controlado, de acordo com métodos conhecidos na indústria.

[129] Ao cultivar uma cultura de células utilizando meio de cultura apropriado, as células são colocadas em contato com o meio em um vaso de cultura ou com substrato em condições adequadas para apoiar a cultura das células na cultura de células. Como aqui descrito, é fornecido um meio de cultura que pode ser usado para o crescimento de células eucarióticas, especificamente leveduras ou fungos filamentosos. As técnicas padrão de cultura de células são bem conhecidas na arte.

[130] As culturas celulares descritas aqui empregam particularmente técnicas que fornecem a produção de uma POI secretada, como obter a POI no meio de cultura celular, que é separável da biomassa celular, aqui referido como “sobrenadante da cultura celular”, e pode ser purificado para obter a POI com um grau de pureza mais alto. Quando uma proteína (como, por exemplo, uma HCP ou uma POI) é produzida e secretada pela célula hospedeira em uma cultura celular, é entendido aqui que essas proteínas são secretadas no sobrenadante da cultura celular e podem ser obtidas separando a célula sobrenadante de cultura da biomassa da célula hospedeira e, opcionalmente, purificando ainda mais a proteína para produzir uma preparação de proteína purificada.

[131] O meio de cultura celular fornece os nutrientes necessários para manter e cultivar células em um ambiente controlado, artificial e in vitro. As características e composições dos meios de cultura de células variam de acordo com os requisitos celulares específicos. Parâmetros importantes incluem formulações de osmolaridade,

35 / 77 pH e nutrientes. A alimentação de nutrientes pode ser feita de modo contínuo ou descontínuo, de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[132] Considerando que um processo de batelada é um modo de cultura de células no qual todos os nutrientes necessários para a cultura das células estão contidos no meio de cultura inicial, sem fornecimento adicional de nutrientes adicionais durante a fermentação, em um processo de batelada alimentada, após uma fase de batelada, ocorre uma fase de alimentação na qual um ou mais nutrientes são fornecidos à cultura pela alimentação. Embora na maioria dos processos o modo de alimentação seja crítico e importante, a célula hospedeira e os métodos aqui descritos não são restritos em relação a um determinado modo de cultura de células.

[133] Em certas incorporações, o processo de cultura de células é um processo de batelada alimentada. Especificamente, uma célula hospedeira transformada com uma construção de ácido nucleico que codifica uma POI recombinante desejada, é cultivada em uma fase de crescimento e transferida para uma fase de produção, a fim de produzir uma POI recombinante desejada.

[134] Em outra incorporação, as células hospedeiras aqui descritas são cultivadas em um modo contínuo, por exemplo, um quimiostato. Um processo de fermentação contínua é caracterizado por uma taxa definida, constante e contínua de alimentação do meio de cultura fresco em um biorreator, pelo qual o caldo de cultura é ao mesmo tempo removido do biorreator na mesma taxa de remoção definida, constante e contínua. Mantendo o meio de cultura, a taxa de alimentação e a taxa de remoção no mesmo nível constante, os parâmetros e condições de cultura de células no biorreator permanecem constantes.

[135] Uma POI recombinante pode ser produzida usando a célula hospedeira e a respectiva linha celular aqui descrita, cultivando em um meio apropriado, isolando

36 / 77 o produto ou metabólito expresso da cultura e, opcionalmente, purificando-o por um método adequado.

[136] Várias abordagens diferentes para a produção da POI, como aqui descrito, são preferidas. Uma POI pode ser expresso, processado e opcionalmente secretado através da transformação de uma célula hospedeira eucariótica com um vetor de expressão que hospeda DNA recombinante que codifica a proteína relevante, preparando uma cultura da célula transformada, crescendo a cultura, induzindo a transcrição e produção da POI e recuperando a POI.

[137] O termo “proteína da célula hospedeira”, abreviado “HCP”, como usado aqui refere-se a proteínas segregadas individuais produzidas pelas células hospedeiras. Se as células hospedeiras estiverem expressando uma POI, a HCP é entendida como um subproduto da POI. Portanto, a POI não é entendida como uma HCP. A HCP está tipicamente presente no meio de cultura de células ou sobrenadante da cultura de células depois que as células são separadas do meio de cultura de células por exemplo, centrifugação. A soma de todos as HCPs é referida como “HCP total”. Existe o risco de as HCPs estarem contaminando uma preparação de produtos de células hospedeiras, por exemplo incluindo uma POI ou uma preparação da POI.

Os métodos analíticos atuais para testar a presença de HCPs contaminantes em produtos POI incluem ELISA, HPLC, eletroforese capilar, SDS-PAGE ou espectrometria de massa, em particular onde a espectrometria de massa é cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), ou, preferencialmente espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida (LC-MS / MS), por exemplo, como conhecido na técnica, e / ou descrito adicionalmente na seção Exemplos.

[138] A célula hospedeira aqui descrita é tipicamente testada quanto à sua

37 / 77 capacidade de expressão, conteúdo de HCP ou rendimento de POI por qualquer um dos seguintes testes: ELISA, ensaio de atividade, HPLC ou outros testes adequados, como SDS-PAGE e Western Blotting Techniques, ou espectrometria de massa.

[139] Para determinar o efeito de uma modificação genética na redução de HCP na cultura de células e, por exemplo, na quantidade de impurezas em uma POI assim produzida, a linha de células hospedeiras pode ser cultivada em placas de microtitulação, balão de agitação ou biorreator usando batelada alimentada ou fermentações quimostáticas em comparação com estirpes sem essa modificação genética na célula respectiva.

[140] O método de produção descrito aqui permite especificamente a fermentação em escala piloto ou industrial. A escala do processo industrial empregaria preferencialmente volumes de pelo menos 10 L, especificamente pelo menos 50 L, preferencialmente pelo menos 1 m3, preferencialmente pelo menos 10 m3, mais preferencialmente pelo menos 100 m3.

[141] São preferidas condições de produção em escala industrial, que se referem, por exemplo, a cultura de batelada alimentada em volumes de reator de 100 L a 10 m3 ou mais, empregando tempos de processo típicos de vários dias ou processos contínuos em volumes de fermentador de aproximadamente 50 a 1000 L ou mais, com taxas de diluição de aproximadamente 0.02 – 0.15 h-1.

[142] Os dispositivos, instalações e métodos utilizados para a finalidade aqui descrita são especificamente adequados para uso em e com a cultura de qualquer linha celular desejada, incluindo linhas celulares procarióticas e / ou eucarióticas. Além disso, em Incorporações, os dispositivos, instalações e métodos são adequados para cultivar qualquer tipo de célula, incluindo células de suspensão ou células dependentes de ancoragem (aderentes) e são adequados para operações de

38 / 77 produção configuradas para produção de produtos farmacêuticos e biofarmacêuticos - como produtos polipeptídicos (POI), produtos de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) ou células e / ou vírus, como aqueles usados em terapias celulares e / ou virais.

[143] Nas incorporações, as células expressam ou produzem um produto, como um produto terapêutico ou de diagnóstico recombinante. Como descrito em mais detalhes aqui, exemplos de produtos produzidos por células incluem, mas não estão limitados a, POIs, como aqui exemplificados, incluindo moléculas de anticorpo (por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos), miméticos de anticorpos (moléculas de polipeptídeo que se ligam especificamente a antígenos, mas que não estão estruturalmente relacionados a anticorpos, como, por exemplo, DARPinas, organismos afetados, adnectinas ou IgNARs), proteínas de fusão (por exemplo, proteínas de fusão Fc, citocinas quiméricas), outras proteínas recombinantes (por exemplo, proteínas glicosiladas, enzimas, hormônios) ou terapêuticas virais (por exemplo, vírus oncolíticos anticâncer, vetores virais para terapia genética e imunoterapia viral), terapêutica celular (por exemplo, células-tronco pluripotentes, células-tronco mesenquimais e células-tronco adultas), vacinas ou partículas encapsuladas em lipídios (por exemplo, exossomos, vírus- partículas semelhantes), RNA (como, por exemplo, siRNA) ou DNA (como, por exemplo, DNA plasmídico), antibióticos ou aminoácidos. Nas Incorporações, os dispositivos, instalações e métodos podem ser utilizados para a produção de biossimilares.

[144] Como mencionado, nas Incorporações, dispositivos, instalações e métodos permitem a produção de células eucarióticas, por exemplo, células de mamíferos ou células eucarióticas inferiores, como por exemplo, células de levedura ou células de fungos filamentosos ou células procarióticas, como Gram-positivas ou

39 / 77 Gram-negativas. células e / ou produtos das células eucarióticas ou procarióticas, por exemplo, POIs incluindo proteínas, peptídeos ou antibióticos, aminoácidos, ácidos nucleicos (como DNA ou RNA), sintetizados pelas referidas células de uma maneira em larga escala. A menos que indicado de outra forma neste documento, os dispositivos, instalações e métodos podem incluir qualquer volume ou capacidade de produção desejada, incluindo, entre outros, capacidades de escala de bancada, escala piloto e escala de produção total.

[145] Além disso, e a menos que indicado de outra forma neste documento, os dispositivos, instalações e métodos podem incluir qualquer reator (es) adequado (s) incluindo, entre outros, tanque agitado, transporte aéreo, fibra, microfibra, fibra oca, matriz cerâmica, leito fluidizado, leito fixo e / ou biorreatores com leito jorrado. Como usado neste documento, “reator” pode incluir um fermentador e uma unidade de fermentação, ou qualquer outro vaso de reação, e o termo “reator” é usado de forma intercambiável com “fermentador”. Por exemplo, em alguns aspectos, uma unidade de biorreator de exemplo pode executar um ou mais, ou todos os seguintes: alimentação de nutrientes e / ou fontes de carbono, injeção de gás adequado (por exemplo, oxigênio), fluxo de entrada e saída de fermentação ou meio de cultura de células, separação das fases gasosa e líquida, manutenção da temperatura, manutenção dos níveis de oxigênio e CO2, manutenção do nível de pH, agitação (por exemplo, agitação) e / ou limpeza / esterilização. Unidades de reator de exemplo, como uma unidade de fermentação, podem conter vários reatores dentro da unidade, por exemplo, a unidade pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 ou mais biorreatores em cada unidade e / ou uma instalação podem conter várias unidades com um ou vários reatores dentro da instalação. Em várias Incorporações, o biorreator pode ser adequado para processos em batelada, batelada

40 / 77 semi-alimentada, batelada alimentada, perfusão e / ou processos de fermentação contínua. Qualquer diâmetro adequado do reator pode ser usado. Nas Incorporações, o biorreator pode ter um volume entre cerca de 100 mL e cerca de 50.000 L. Os exemplos não limitativos incluem um volume de 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 litro, 2 litros, 3 litros, 4 litros, 5 litros, 6 litros, 7 litros, 8 litros, 9 litros, 10 litros, 15 litros, 20 litros, 25 litros, 30 litros, 30 litros, 40 litros, 50 litros, 60 litros, 70 litros, 70 litros, 80 litros, 90 litros, 100 litros, 150 litros, 200 litros, 250 litros, 300 litros, 350 litros, 400 litros, 450 litros, 500 litros, 550 litros, 600 litros, 650 litros, 700 litros, 750 litros, 750 litros, 800 litros, 850 litros, 900 litros, 950 litros, 1000 litros, 1500 litros, 2000 litros, 2500 litros, 3000 litros, 3500 litros, 4000 litros, 4500 litros, 5000 litros, 6000 litros, 7000 litros, 8000 litros, 9000 litros, 10.000 litros, 15.000 litros, 20.000 litros, e / ou 50.000 litros. Além disso, os reatores adequados podem ser multiuso, descartáveis ou não descartáveis e podem ser formados de qualquer material adequado, incluindo ligas metálicas como aço inoxidável (por exemplo, 316L ou qualquer outro aço inoxidável adequado) e Inconel, plásticos e / ou vidro.

[146] Nas incorporações e a menos que indicado de outra forma neste documento, os dispositivos, instalações e métodos descritos neste documento também podem incluir qualquer operação de unidade e / ou equipamento adequado não mencionado de outra forma, como operações e / ou equipamentos para separação, purificação e isolamento de tais produtos. Qualquer instalação e ambiente adequados podem ser utilizados, como instalações tradicionais montadas em palitos, instalações modulares, móveis e temporárias ou qualquer outra construção, instalação e / ou layout adequados. Por exemplo, em algumas Incorporações salas limpas modulares podem ser usadas. Além disso, e salvo indicação em contrário, os dispositivos, sistemas e métodos descritos aqui podem ser alojados e / ou realizados

41 / 77 em um único local ou instalação ou, alternativamente, ser alojados e / ou realizados em locais e / ou instalações separadas ou múltiplas.

[147] Técnicas adequadas podem abranger a cultura em um biorreator começando com uma fase de batelada, seguida por uma fase de batelada alimentada exponencial curta a uma alta taxa de crescimento específica, seguida ainda por uma fase batelada alimentada a uma taxa de crescimento específica baixa. Outra técnica de cultura adequada pode abranger uma fase de batelada seguida por uma fase de batelada alimentada qualquer taxa de crescimento específica adequada ou combinações de taxa de crescimento específica, como passar de alta para baixa taxa de crescimento ao longo do tempo de produção de POI ou de baixa a alta taxa de crescimento ao longo de POI tempo de produção. Outra técnica de cultura adequada pode abranger uma fase de batelada seguida por uma fase de cultura contínua a uma baixa taxa de diluição.

[148] Uma incorporação preferida inclui uma cultura de batelada para fornecer biomassa seguida por uma cultura de batelada alimentada para produção de POI de alto rendimento.

[149] É preferível cultivar uma célula hospedeira como aqui descrito em um biorreator em condições de crescimento para obter uma densidade celular de pelo menos 1 g / L de peso seco de célula, mais preferencialmente de pelo menos 10 g / L de peso seco de célula, preferencialmente de pelo menos 20 g / L peso seco de célula, de preferência pelo menos qualquer um de 30, 40, 50, 60, 70 ou 80 g / L de peso seco de célula. É vantajoso prever tais rendimentos da produção de biomassa em escala piloto ou industrial.

[150] Um meio de crescimento que permite o acúmulo de biomassa, especificamente um meio de crescimento basal, compreende tipicamente uma fonte

42 / 77 de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de enxofre e uma fonte de fosfato.

Tipicamente, esse meio compreende ainda oligoelementos e vitaminas e pode ainda compreender aminoácidos, peptona ou extrato de levedura.

[151] As fontes de nitrogênio preferidas incluem NH4H2PO4, ou NH3 ou (NH4)2SO4;

[152] As fontes de enxofre preferidas incluem MgSO4 ou (NH4)2SO4 ou K2SO4;

[153] As fontes de fosfato preferidas incluem NH4H2PO4, ou H3PO4 ou NaH2PO4, KH2PO4, Na2HPO4 ou K2HPO4;

[154] Outros componentes médios típicos incluem KCl, CaCl2, e oligoelementos, tais como: Fe, Co, Cu, Ni, Zn, Mo, Mn, I, B;

[155] De preferência, o meio é suplementado com vitamina B7;

[156] Um meio de crescimento típico para P. pastoris compreende glicerol, sorbitol ou glicose, NH4H2PO4, MgSO4, KCl, CaCl2, biotina e oligoelementos.

[157] Na fase de produção, um meio de produção é usado especificamente com apenas uma quantidade limitada de uma fonte suplementar de carbono.

[158] De preferência, a linha celular hospedeira é cultivada em um meio mineral com uma fonte de carbono adequada, simplificando assim significativamente o processo de isolamento. Um exemplo de um meio mineral preferido é aquele que contém uma fonte de carbono utilizável (por exemplo, glicose, glicerol, sorbitol ou metanol), sais que contêm os macroelementos (potássio, magnésio, cálcio, amônio, cloreto, sulfato, fosfato) e oligoelementos ( cobre, iodeto, manganês, molibdato, cobalto, zinco e sais de ferro e ácido bórico) e opcionalmente vitaminas ou aminoácidos, por exemplo, para complementar as auxotrofias.

[159] Especificamente, as células são cultivadas sob condições adequadas para efetuar a expressão da POI desejado, que pode ser purificado a partir das células

43 / 77 ou do meio de cultura, dependendo da natureza do sistema de expressão e da proteína expressa, por exemplo, se a proteína está fundida a um peptídeo sinal e se a proteína é solúvel ou ligada à membrana. Como será entendido pelo especialista na técnica, as condições de cultura variarão de acordo com fatores que incluem o tipo de célula hospedeira e o vetor de expressão particular empregado.

[160] Um meio de produção típico compreende uma fonte suplementar de carbono e mais NH4H2PO4, MgSO4, KCl, CaCl2, biotina e oligoelementos.

[161] Por exemplo, a alimentação da fonte de carbono suplementar adicionada à fermentação pode compreender uma fonte de carbono com até 50% em peso de açúcares utilizáveis.

[162] A fermentação é preferencialmente realizada a um pH variando de 3 a

8.

[163] Os tempos de fermentação típicos são de cerca de 24 a 120 horas com temperaturas na faixa de 20° C a 35° C, preferencialmente 22 - 30° C.

[164] A POI é expressa de preferência empregando condições para produzir rendimentos de pelo menos 1 mg / L, preferencialmente pelo menos 10 mg / L, preferencialmente pelo menos 100 mg / L, mais preferencialmente pelo menos 1 g / L.

[165] O termo “expressão” ou “cassete de expressão”, conforme aqui utilizado, refere-se a moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência de codificação desejada e sequências de controle em ligação operável, de modo que os hospedeiros transformados ou transfectados com essas sequências sejam capazes de produzir as proteínas codificadas ou os metabólitos das células hospedeiras. Para efetuar a transformação, o sistema de expressão pode ser incluído em um vetor; no entanto, o DNA relevante também pode ser integrado a um cromossomo hospedeiro. A

44 / 77 expressão pode se referir a produtos de expressão segregados ou não segregados, incluindo polipeptídeos ou metabólitos.

[166] Os cassetes de expressão são convenientemente fornecidos como construções de expressão, por exemplo, na forma de “vetores” ou “plasmídeos”, que são tipicamente sequências de DNA necessárias para a transcrição de sequências nucleotídicas recombinantes clonadas, ou seja, de genes recombinantes e a tradução de seu mRNA em um organismo hospedeiro adequado. Os vetores de expressão ou plasmídeos geralmente compreendem uma origem para replicação autônoma nas células hospedeiras, marcadores selecionáveis (por exemplo, um gene de síntese de aminoácidos ou um gene que confere resistência a antibióticos, como zeocina, canamicina, G418 ou higromicina, nourseotricina), várias restrições locais de clivagem enzimática, uma sequência promotora adequada e um terminador de transcrição, cujos componentes estão operacionalmente ligados entre si. Os termos “plasmídeo” e “vetor”, conforme aqui utilizados, incluem sequências nucleotídicas replicantes autonomamente, bem como sequências nucleotídicas integradoras de genoma, como cromossomos artificiais, por exemplo, um cromossomo artificial de levedura (YAC).

[167] Os vetores de expressão podem incluir, mas não estão limitados a, vetores de clonagem, vetores de clonagem modificados e plasmídeos especificamente projetados. Os vetores de expressão preferidos aqui descritos são vetores de expressão adequados para expressar um gene recombinante em uma célula hospedeira eucariótica e são selecionados dependendo do organismo hospedeiro. Os vectores de expressão apropriados compreendem tipicamente sequências reguladoras adequadas para expressar o ADN que codifica uma POI numa célula hospedeira eucariótica. Exemplos de sequências reguladoras incluem operadores, intensificadores, locais de ligação ribossômica e sequências que

45 / 77 controlam a iniciação e terminação da transcrição e tradução. As sequências reguladoras podem estar operacionalmente ligadas à sequência de DNA a ser expressa.

[168] Para permitir a expressão de uma sequência nucleotídica recombinante em uma célula hospedeira, o vetor de expressão pode fornecer um promotor adjacente à extremidade 5’ da sequência de codificação, por exemplo, a montante de um gene de interesse (GOI) ou um gene de peptídeo sinal, permitindo a secreção da POI. A transcrição é assim regulada e iniciada por esta sequência promotora.

[169] A construção de expressão aqui descrita especificamente compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequência nucleotídica que codifica uma POI sob o controle transcricional do referido promotor. Especificamente, o promotor não está associado nativamente à sequência de codificação da POI.

[170] Também vetores de multiclonagem, que são vetores com um local de multiclonagem, podem ser usados como aqui descrito, em que um gene heterólogo desejado pode ser incorporado em um local de multiclonagem, para fornecer um vetor de expressão. No caso de vetores de multiclonagem, porque o gene da POI é introduzido no local de multiclonagem, um promotor é tipicamente colocado a montante do site de multiclonagem.

[171] O termo “endógeno”, conforme aqui utilizado, pretende incluir aquelas moléculas e sequências, em particular proteínas endógenas, que estão presentes na célula hospedeira do tipo selvagem (nativa), antes de sua modificação para reduzir as proteínas endógenas. Em particular, uma molécula de ácido nucleico endógena (por exemplo, um gene) ou proteína que ocorre (e pode ser obtida de) uma célula hospedeira específica, como é encontrada na natureza, é entendida como “célula hospedeira endógena” ou “endógena para a célula hospedeira”. Além disso, uma

46 / 77 célula “expressando endogenamente” um ácido nucleico ou proteína expressa esse ácido nucleico ou proteína como um hospedeiro do mesmo tipo particular que é encontrado na natureza. Além disso, uma célula hospedeira “produzindo endogenamente” ou que “produz endogenamente” um ácido nucleico, proteína ou outro composto produz esse ácido nucleico, proteína ou composto como faz uma célula hospedeira do mesmo tipo particular que é encontrado na natureza.

[172] Assim, mesmo que uma proteína endógena não seja mais produzida por uma célula hospedeira, como em um mutante nocaute da célula hospedeira, onde o gene que codifica a proteína é inativado ou excluído, a proteína ainda é referida como “endógena”.

[173] O termo “heterólogo”, como aqui utilizado, com relação a uma sequência ou proteína de nucleotídeo ou aminoácido, refere-se a um composto que é estranho, isto é, “exógeno”, como não encontrado na natureza, a uma determinada célula hospedeira; ou que é encontrado naturalmente em uma determinada célula hospedeira, por exemplo, é “endógeno”, no entanto, no contexto de uma construção heteróloga, por exemplo, empregando um ácido nucleico heterólogo. A sequência nucleotídica heteróloga, como encontrada endogenamente, também pode ser produzida em uma quantidade não natural, por exemplo, maior que o esperado ou maior que o encontrado naturalmente na célula. A sequência nucleotídica heteróloga, ou um ácido nucleico compreendendo a sequência nucleotídica heteróloga, possivelmente difere em sequência da sequência nucleotídica endógena, mas codifica a mesma proteína encontrada endogenamente. Especificamente, sequências nucleotídicas heterólogas são aquelas não encontradas na mesma relação com uma célula hospedeira na natureza. Qualquer sequência nucleotídica recombinante ou artificial é entendida como heteróloga. Um exemplo de um polinucleotídeo heterólogo

47 / 77 é uma sequência de nucleotídeos não associada nativamente a um promotor, por exemplo, para obter um promotor híbrido ou operacionalmente ligado a uma sequência de codificação, como aqui descrito. Como resultado, um polinucleotídeo híbrido ou quimérico pode ser obtido. Um outro exemplo de um composto heterólogo é um polinucleotídeo codificador de POI operacionalmente ligado a um elemento de controle transcricional, por exemplo, um promotor, ao qual uma sequência de codificação de POI endógena e de ocorrência natural não está normalmente operacionalmente ligada.

[174] O termo “célula hospedeira”, como descrito aqui, refere-se especificamente a um organismo artificial e a um derivado de uma célula hospedeira nativa (do tipo selvagem). É bem entendido que as células hospedeiras, métodos e usos aqui descritos, por exemplo, referindo-se especificamente a uma ou mais modificações genéticas, construções de expressão, células hospedeiras transformadas e proteínas recombinantes, são de ocorrência não natural, “sintéticas ou artificiais”, e, portanto, não são considerados como resultado da “lei da natureza”.

[175] A célula hospedeira é especificamente uma célula hospedeira recombinante projetada para reduzir a quantidade de HCP endógeno da célula hospedeira que é produzido pela célula e obtido no sobrenadante da cultura de células. Especificamente, uma ou mais proteínas que são abundantes na cultura da célula hospedeira do tipo selvagem são alvo de modificação genética para reduzir sua expressão. Uma proteína é especificamente considerada abundante, se estiver presente no sobrenadante da cultura de células em um nível alto, por exemplo, se atingir pelo menos 10% ou pelo menos 5% (mol / mol) da HCP total. De acordo com Incorporações específicas, a célula hospedeira é projetada para eliminar ou nocautear (para inativação ou exclusão de um gene ou parte dele) os genes da célula hospedeira

48 / 77 que codificam pelo menos uma, duas ou três das proteínas endógenas mais abundantemente secretadas.

[176] Especificamente, é fornecida uma cepa de deleção, em que um gene é interrompido.

[177] O termo “interromper”, como aqui utilizado, refere-se à redução significativa para concluir a remoção da expressão de uma ou mais proteínas endógenas em uma célula hospedeira, tal como ser eliminada ou nocauteada. Isso pode ser medido como a presença desta ou mais proteínas endógenas em um meio de cultura da célula hospedeira, como por espectrometria de massa, em que o conteúdo total de uma proteína endógena pode ser menor que um limiar ou não detectável.

[178] O termo “interrompido” refere-se especificamente a um resultado da engenharia genética por pelo menos uma etapa selecionada do grupo que consiste em silenciamento de genes, eliminar genes, nocaute de genes, entrega de uma construção negativa dominante, nocaute de genes condicional e / ou por alteração genética em relação a um gene específico.

[179] O termo “eliminação” (knock-down), “redução” ou “depleção” no contexto da expressão gênica, conforme aqui utilizado, refere-se a abordagens experimentais que levam à expressão reduzida de um determinado gene em comparação com a expressão em uma célula de controle. A eliminação de um gene pode ser alcançada por vários meios experimentais, como a introdução de moléculas de ácido nucleico na célula que hibridam com partes do mRNA do gene levando à sua degradação (por exemplo, shRNAs, RNAi, miRNAs) ou alterando a sequência do gene de uma maneira que leve à transcrição reduzida, estabilidade reduzida do mRNA ou tradução diminuída do mRNA.

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[180] Uma inibição completa da expressão de um determinado gene é denominada “nocaute” (knockout). Nocaute de um gene significa que nenhum transcrito funcional é sintetizado a partir do referido gene, levando a uma perda de função normalmente fornecida por esse gene. O nocaute genético é alcançado alterando a sequência de DNA que leva à interrupção ou exclusão do gene ou de suas sequências reguladoras, ou parte desse gene ou sequências reguladoras. As tecnologias nocaute incluem o uso de técnicas de recombinação homóloga para substituir, interromper ou excluir partes cruciais ou toda a sequência gênica ou o uso de enzimas modificadoras de DNA, como dedo de zinco ou mega-nucleases, para introduzir quebras de fita dupla no DNA do gene alvo por exemplo, descrito por Gaj et al. (Trends Biotechnol. 2013;31(7):397-405).

[181] Incorporações específicas empregam um ou mais plasmídeos nocaute que são transfectados para as células hospedeiras. Por recombinação homóloga, o gene alvo nas células hospedeiras pode ser interrompido. Este procedimento é tipicamente repetido até que todos os alelos do gene alvo sejam removidos de forma estável.

[182] Um método específico para nocautear um gene específico, como descrito aqui, é o método CRISPR-Cas9, como descrito em, por exemplo, Weninger et al. (J. Biotechnol. 2016, 235:139-49).

[183] Outra incorporação refere-se à degradação do mRNA alvo, usando pequeno RNA interferente (siRNA) para transfectar a célula hospedeira e alvejando um mRNA que codifica o contaminante da proteína alvo expresso endogenamente pela referida célula hospedeira.

[184] O termo “expressão gênica”, como aqui utilizado, deve abranger pelo menos uma etapa selecionada do grupo que consiste em transcrição de DNA para

50 / 77 mRNA, processamento de mRNA, maturação de mRNA não codificante, exportação de mRNA, tradução, dobragem de proteínas e / ou transporte de proteína.

[185] A expressão gênica de um gene pode ser inibida ou reduzida por métodos que interferem diretamente na expressão gênica, abrangendo, mas não restritos a, inibição ou redução da transcrição do DNA, por exemplo, pelo uso de repressores específicos relacionados ao promotor, pela mutagênese específica de um local. determinado promotor, por troca de promotor ou inibição ou redução da tradução, por exemplo, pelo silenciamento de genes pós-transcricional induzido por RNAi. A expressão de um produto genético disfuncional ou inativo com atividade reduzida, pode, por exemplo, ser alcançada por mutagênese, inserções ou deleções específicas ou aleatórias, específicas do local, dentro do gene codificador.

[186] A inibição ou redução da atividade do produto gênico pode, por exemplo, ser alcançada por administração ou incubação com um inibidor da enzima respectiva, antes ou simultaneamente com a expressão da proteína. Exemplos para tais inibidores incluem, mas não estão limitados a, um peptídeo inibitório, um anticorpo, um aptâmero, uma proteína de fusão ou um anticorpo mimético contra a referida enzima, ou um ligante ou receptor do mesmo, ou um peptídeo inibidor ou ácido nucleico, ou um molécula pequena com atividade de ligação semelhante. Outras maneiras de inibir a enzima são a redução de cofatores específicos da enzima no meio, como o cobre, que é um cofator de íons específico para PAM (por exemplo, na forma de CuSO4), ascorbato, que atua como doador de elétrons para PAM, oxigênio molecular, catalase e outros conhecidos hoje pelo especialista, ou ainda a serem descobertos no futuro.

[187] Silenciamento de genes, eliminação de genes e nocaute de genes refere-se a técnicas pelas quais a expressão de um gene é reduzida, por modificação

51 / 77 genética ou por tratamento com um oligonucleotídeo com uma sequência complementar a um transcrito de mRNA ou um gene. Se a modificação genética do DNA for realizada, o resultado será um organismo eliminado ou nocauteado. Se a mudança na expressão gênica é causada por uma ligação de oligonucleotídeo a um mRNA ou a uma ligação temporária a um gene, isso resulta em uma mudança temporária na expressão gênica sem modificação do DNA cromossômico e é referido como uma eliminação transitória.

[188] Em uma eliminação transitória, que também é abrangida pelo termo acima, a ligação deste oligonucleotídeo ao gene ativo ou seus transcritos causa diminuição da expressão através do bloqueio da transcrição (no caso de ligação de genes), degradação do transcrito de mRNA (por exemplo, por RNA interferente pequeno (siRNA) ou anti-sentido dependente de RNase-H) ou bloqueando a tradução de mRNA, os locais de emenda de pré-mRNA ou os locais de clivagem de nucleases usados para a maturação de outros RNAs funcionais, como miRNA (por exemplo, por Morpholino oligos ou outros Anti-sentido independente da RNase-H). Outras abordagens envolvem o uso de shRNA (RNA em grampo de cabelo pequeno, que é uma sequência de RNA que faz uma curva em grampo de cabelo que pode ser usada para silenciar a expressão gênica por interferência de RNA), esiRNA (siRNAs preparados por endoribonuclease, que são uma mistura de siRNA oligos resultantes da clivagem de RNA longo de fita dupla (dsRNA) com uma endoribonuclease) ou a ativação do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC).

[189] Outras abordagens para realizar silenciamento gênico, eliminação ou nocaute são conhecidas do especialista na literatura respectiva, e sua aplicação no contexto da presente invenção é considerada rotineira. Nocaute genético refere-se a técnicas pelas quais a expressão de um gene é totalmente bloqueada, isto é, o

52 / 77 respectivo gene é inoperante ou mesmo removido. As abordagens metodológicas para atingir esse objetivo são múltiplas e conhecidas pelo especialista. Exemplos são a produção de um mutante que é predominantemente negativo para o gene em questão. Esse mutante pode ser produzido por mutagênese dirigida ao local (por exemplo, deleção, deleção parcial, inserção ou substituição de ácido nucleico), pelo uso de transposons adequados ou por outras abordagens conhecidas pelo especialista na literatura respectiva, cuja aplicação no contexto da presente invenção é assim considerado como rotina. Um exemplo é o nocaute pelo uso de nucleases de dedo de zinco direcionadas. Um respectivo kit é fornecido pela Sigma Aldrich como “CompoZR knockout ZFN”. Outra abordagem abrange o uso de nucleases efetoras do tipo ativador da transcrição (TALENs).

[190] A entrega de uma construção negativa dominante envolve a introdução de uma sequência que codifica uma enzima disfuncional, por exemplo, por transfecção. A referida sequência de codificação é funcionalmente acoplada a um promotor forte, de tal modo que a expressão gênica da enzima disfuncional anula a expressão natural da enzima do tipo selvagem, que, por sua vez, leva a um defeito fisiológico eficaz da atividade enzimática respectiva.

[191] Um nocaute genético condicional permite bloquear a expressão gênica de maneira específica de tecido ou tempo. Isso é feito, por exemplo, através da introdução de sequências curtas chamadas locais loxP em torno do gene de interesse.

Novamente, outras abordagens são conhecidas do especialista na literatura respectiva, e sua aplicação no contexto da presente invenção é considerada rotineira.

[192] Uma outra abordagem é a alteração genética que pode levar a um produto genético disfuncional ou a um produto genético com atividade reduzida. Essa abordagem envolve a introdução de mutações de deslocamento de quadro, mutações

53 / 77 sem sentido (isto é, introdução de um códon de parada prematuro) ou mutações que levam a uma substituição de aminoácidos que torna todo o produto do gene disfuncional ou causando uma atividade reduzida. Essa alteração genética pode, por exemplo, ser produzida por mutagênese (por exemplo, deleção, deleção parcial, inserção ou substituição de ácido nucleico), mutagênese inespecífica (aleatória) ou mutagênese direcionada ao local. Protocolos que descrevem a aplicação prática de silenciamento de genes, eliminação de genes, nocaute de genes, entrega de um construto negativo dominante, nocaute de genes condicional e / ou alteração de genes estão geralmente disponíveis para o especialista, e estão dentro de sua rotina. O ensino técnico aqui fornecido é, portanto, totalmente ativado em relação a todos os métodos concebíveis que levam a uma inibição ou redução da expressão gênica de um produto genético, ou à expressão de um produto genético disfuncional ou inativo ou com atividade reduzida.

[193] As modificações genéticas descritas aqui podem empregar ferramentas, métodos e técnicas conhecidas na técnica, como descrito por J. Sambrook et al., Clonagem Molecular: Um Manual de Laboratório (3a. edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (2001).

[194] O termo “operacionalmente ligado”, conforme aqui utilizado, refere-se à associação de sequências de nucleotídeos em uma única molécula de ácido nucleico, por exemplo, um vetor ou um cassete de expressão, de modo que a função de uma ou mais sequências de nucleotídeos seja afetada por pelo menos uma outra sequência de nucleotídeos presente na referida molécula de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de um gene recombinante, quando é capaz de efetuar a expressão dessa sequência de codificação. Como outro exemplo, um ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal

54 / 77 está operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma POI, quando é capaz de expressar uma proteína na forma secretada, como uma pré- forma de uma proteína madura ou da proteína madura. Especificamente, esses ácidos nucleicos operacionalmente ligados entre si podem ser imediatamente ligados, isto é, sem outros elementos ou sequências de ácidos nucleicos entre o ácido nucleico que codifica o peptídeo sinal e a sequência de ácido nucleico que codifica uma POI.

[195] Uma sequência do promotor é tipicamente entendida como operacionalmente ligada a uma sequência de codificação, se o promotor controlar a transcrição da sequência de codificação. Se uma sequência do promotor não estiver associada nativamente à sequência de codificação, a sua transcrição não é controlada pelo promotor em células nativas (tipo selvagem) ou as sequências são recombinadas com diferentes sequências contíguas.

[196] O termo “constitutivo” em relação ao elemento regulador, como um promotor, deve se referir a um elemento que é ativo em diferentes condições de cultura de células, usando diferentes meios ou substratos. Entre o promotor constitutivo de células de levedura, especialmente os promotores GAP e TEF foram descritos como fortes e úteis para a produção de proteínas recombinantes.

[197] Um promotor é especificamente entendido como um promotor constitutivo, se for capaz de controlar a expressão sem a necessidade de indução ou a possibilidade de repressão. Portanto, há expressão contínua e constante em um determinado nível. De preferência, possui uma força promotora elevada em todas as fases de crescimento ou taxas de crescimento da célula hospedeira.

[198] O termo “regulável” com relação a um elemento regulador induzível ou reprimível, como um promotor, deve se referir a um elemento que é reprimido em uma célula hospedeira na presença de uma quantidade excessiva de uma substância

55 / 77 (como um nutriente no meio da cultura celular) por exemplo, na fase de crescimento de uma cultura de batelada e de-reprimida para induzir uma atividade forte, por exemplo, na fase de produção (como na redução da quantidade de um nutriente ou na alimentação de um substrato suplementar), de acordo com uma estratégia de batelada alimentada. Um elemento regulador também pode ser projetado para ser regulável, de modo que o elemento seja inativo sem adição de um aditivo de cultura de células e ativo na presença de tal aditivo. Assim, a expressão de uma POI sob o controle de tal elemento regulador pode ser induzida após a adição desse aditivo.

[199] O termo “proteína de interesse (POI)” como aqui utilizado refere-se a um polipeptídeo ou uma proteína que é produzida por meio de tecnologia recombinante em uma célula hospedeira. Mais especificamente, a proteína pode ser um polipeptídeo que não ocorre naturalmente na célula hospedeira, ou seja, uma proteína heteróloga ou pode ser nativa da célula hospedeira, ou seja, uma proteína homóloga da célula hospedeira, mas é produzida, por exemplo, por transformação com um vetor auto- replicante contendo a sequência de ácido nucleico que codifica a POI ou mediante integração por técnicas recombinantes de uma ou mais cópias da sequência de ácido nucleico que codifica a POI no genoma da célula hospedeira ou por modificação recombinante de um ou mais sequências reguladoras que controlam a expressão do gene que codifica a POI, por exemplo, da sequência promotora. Em alguns casos, o termo POI, como aqui utilizado, também se refere a qualquer produto metabólico pela célula hospedeira, mediado pela proteína expressamente recombinante.

[200] O termo “andaime”, conforme usado aqui, descreve um grupo multifacetado de proteínas compactas e dobradas de maneira estável - com tamanho, estrutura e origem diferentes - que servem como ponto de partida para a geração de moléculas de ligação ao antígeno. Inspirado nas relações estrutura-função dos

56 / 77 anticorpos (imunoglobulinas), esse suporte de proteína alternativo fornece uma estrutura estrutural robusta e conservada que suporta um local de interação que pode ser remodelado para o reconhecimento rígido e específico de um determinado alvo (bio) molecular.

[201] O termo “identidade de sequência” de uma variante, homólogo ou ortólogo em comparação com uma sequência nucleotídica ou de aminoácidos pai indica o grau de identidade de duas ou mais sequências. Duas ou mais sequências de aminoácidos podem ter os mesmos resíduos ou resíduos de aminoácidos conservados em uma posição correspondente, até um certo grau, até 100%. Duas ou mais sequências nucleotídicas podem ter pares de bases iguais ou conservados em uma posição correspondente, até um certo grau, até 100%.

[202] A pesquisa de similaridade de sequência é uma estratégia eficaz e confiável para identificar homólogos com excesso de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 50%). As ferramentas de pesquisa de similaridade de sequência frequentemente usadas são, por exemplo, BLAST, FASTA e HMMER.

[203] As pesquisas de similaridade de sequência podem identificar essas proteínas ou genes homólogos detectando excesso de similaridade e similaridade estatisticamente significativa que reflete ancestralidade comum. Os homólogos podem abranger ortólogos, que são aqui entendidos como a mesma proteína em diferentes organismos, por exemplo, variantes dessa proteína em diferentes organismos ou espécies.

[204] Uma sequência homóloga ou ortóloga da mesma proteína em diferentes organismos ou espécies, especificamente do mesmo gênero, tem tipicamente pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos cerca de 60% de identidade, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70% de

57 / 77 identidade, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% de identidade, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de identidade, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de identidade.

[205] Cada um dos HCPs caracterizados pelas sequências identificadas como SEQ ID NO: 1-8 são de K. phaffii. É bem entendido que existem sequências homólogas presentes em outras células hospedeiras eucarióticas. Por exemplo, as células de levedura compreendem as respectivas sequências homólogas, em particular a levedura de Pichia pastoris, que foi reclassificada em um novo gênero, Komagataella, e dividida em três espécies, K. pastoris, K. phaffii e K. pseudopastoris.

Sequências homólogas adicionais são, por exemplo, encontradas em Saccharomyces cerevisiae ou Yarrowia lipolytica.

[206] HCP1 (K. phaffii): F2QXM5: De acordo com o NCBI, a proteína é a zonadhesin, pertencente à família das aglutininas, mas a análise por blastos também exibe homologia limitada à serina protease subtilisina semelhante a SUB2. Na maioria dos bancos de dados, a proteína ainda é designada como proteína não caracterizada.

63kDa, 587AAs.

[207] A respectiva sequência homóloga em K. pastoris é aqui denominada homóloga HCP1, caracterizada por uma sequência de aminoácidos compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 20 (número de acesso NCBI: BA75_00021T0 [Komagataella pastoris], GenBank: ANZ74151.1.

[208] HCP2 (K. phaffii): F2QNG1: SCW10, é uma proteína da parede celular com similaridade às glucanases. Está envolvido em processos metabólicos de carboidratos e possui atividade de hidrolase. O homólogo em Saccharomyces cerevisiae pode desempenhar um papel na conjugação durante o acasalamento.

[209] A respectiva sequência homóloga em K. pastoris é aqui denominada

58 / 77 homóloga HCP2, caracterizada por uma sequência de aminoácidos compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 21 (número de acesso NCBI: BA75_01624T0 [Komagataella pastoris], GenBank: ANZ73790.1.

[210] HCP3 (K. phaffii): F2QQT7: SUN4, é outra proteína com similaridade às glucanases. É uma proteína da família SUN (Sim1p,Uth1p,Nca3p, Sun4p) que pode participar da replicação do DNA e / ou da septação da parede celular, de acordo com dados do homólogo de S. cerevisiae. 45kDa, 431AAs.

[211] A respectiva sequência homóloga em K. pastoris é aqui denominada homóloga HCP3, caracterizada por uma sequência de aminoácidos compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 22 (número de acesso NCBI: BA75_01931T0 [Komagataella pastoris], GenBank: ANZ76017.1.

[212] HCP4 (K. phaffii): F2QXH5: EPX1, ou proteína extracelular 1. Nenhuma função clara foi atribuída a essa proteína, no entanto, a respectiva cepa de deleção (Δepx1) foi produzida e considerada mais suscetível do que o tipo selvagem aos agentes danosos da parede celular Calcofluor branco e vermelho do Congo, indicando que Epx1 pode ter um papel protetor para a parede celular.

[213] A respectiva sequência homóloga em K. pastoris é aqui denominada homóloga HCP4, caracterizada por uma sequência de aminoácidos compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 23 (número de acesso NCBI: BA75_00070T0 [Komagataella pastoris], GenBank: ANZ73364.1.

[214] Exemplos de sequências homólogas adicionais de uma HCP aqui descritas que são encontradas em leveduras diferentes de K. phaffii são as seguintes:

[215] Uma sequência homóloga de HCP2 em S. cerevisiae é aqui referida como homóloga de HCP2, caracterizada por uma sequência de aminoácidos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 24 (número de acesso NCBI: SCW10

59 / 77 [Saccharomyces cerevisiae], GenBank: KZV09161.1; >SCW10 YMR305C SGDID:S000004921).

[216] Uma sequência homóloga adicional de HCP2 em S. cerevisiae é aqui referida como homóloga de HCP2, caracterizada por uma sequência de aminoácidos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 25 (número de acesso NCBI: SCW4 [Saccharomyces cerevisiae], GenBank: KZV11513.1; >SCW4 YGR279C SGDID:S000003511).

[217] Uma sequência homóloga de HCP3 em S. cerevisiae é aqui referida como homóloga de HCP3, caracterizada por uma sequência de aminoácidos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 26 (número de acesso NCBI: SUN4 [Saccharomyces cerevisiae], GenBank: CAA95939.1; >SUN4 YNL066W SGDID:S000005010).

[218] “Porcentagem (%) de identidade da sequência de aminoácidos” em relação às sequências de anticorpos aqui descritas é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica específica, após o alinhamento da sequência e introduzir lacunas, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerar substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. Os especialistas na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas.

[219] Para os fins aqui descritos, a identidade da sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando a versão 2.2.29 do programa NCBI BLAST (06-Jan-2014) com blastp definido nos seguintes parâmetros exemplares:

60 / 77 Programa: blastp, Tamanho do Word: 6, Valor esperado: 10, Tamanho da lista de ocorrências: 100, Gapcosts: 11.1, Matriz: BLOSUM62, Sequência de filtros: F, Código Genético : 1, Tamanho da janela: 40, Limiar: 21, Estatísticas baseadas em composição: 2.

[220] “Percentual (%) de identidade” em relação a uma sequência de nucleotídeos, por exemplo, de um promotor ou de um gene, é definido como a porcentagem de nucleotídeos em uma sequência de DNA candidata que é idêntica aos nucleotídeos na sequência de DNA, depois de alinhar a sequência e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerar substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de nucleotídeos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível ao público. Os especialistas na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas.

[221] O termo “isolado” ou “isolamento”, conforme usado aqui em relação a uma POI, deve se referir a um composto que tenha sido suficientemente separado do ambiente ao qual seria naturalmente associado, em particular um sobrenadante da cultura de células, de modo a existir na forma “purificada” ou “substancialmente pura”.

No entanto, “isolado” não significa necessariamente a exclusão de misturas artificiais ou sintéticas com outros compostos ou materiais, ou a presença de impurezas que não interferem na atividade fundamental e que podem estar presentes, por exemplo, devido à purificação incompleta. Os compostos isolados podem ser ainda formulados

61 / 77 para produzir preparações dos mesmos e ainda para fins práticos serem isolados - por exemplo, uma POI pode ser misturado com veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis quando usado no diagnóstico ou terapia.

[222] O termo “purificado”, conforme usado aqui, deve se referir a uma preparação compreendendo pelo menos 50% (mol / mol), preferencialmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de um composto (por exemplo, uma POI). A pureza é medida por métodos apropriados para o composto (por exemplo, métodos cromatográficos, eletroforese em gel de poliacrilamida, análise por HPLC e similares).

Uma POI isolada e purificada como descrita aqui pode ser obtida por purificação dos sobrenadantes da cultura de células para reduzir as impurezas.

[223] Como métodos de isolamento e purificação para obter um produto polipeptídico ou de proteína recombinante, métodos como métodos que utilizam diferença de solubilidade, como salga e precipitação de solventes, métodos que utilizam diferença de peso molecular, como ultrafiltração e eletroforese em gel, métodos que utilizam diferença em carga elétrica, como cromatografia de troca iônica, métodos que utilizam afinidade específica, como cromatografia de afinidade, métodos que utilizam diferença de hidrofobicidade, como cromatografia líquida de alta performance em fase reversa, e métodos que utilizam diferença no ponto isoelétrico, como foco isoelétrico, podem ser usados.

[224] Os seguintes métodos padrão são preferidos: separação e lavagem de células (detritos) por Microfiltração ou Filtro de Fluxo Tangencial (TFF) ou centrifugação, purificação de POI por precipitação ou tratamento térmico, ativação de POI por digestão enzimática, purificação de POI por cromatografia, como troca iônica ( IEX), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de afinidade, exclusão por tamanho (SEC) ou cromatografia HPLC, precipitação de concentração

62 / 77 de POI e lavagem por etapas de ultrafiltração.

[225] Um produto altamente purificado é essencialmente livre de proteínas contaminantes, em particular de HCP contaminante, e preferencialmente possui uma pureza de pelo menos 90%, mais preferida de pelo menos 95% ou mesmo de 98% e até 100%. Os produtos purificados podem ser obtidos por purificação do sobrenadante da cultura de células ou então a partir de detritos celulares.

[226] Uma POI isolada e purificada pode ser identificado por métodos convencionais, como Western blot, HPLC, ensaio de atividade ou ELISA.

[227] O termo “recombinante”, conforme usado aqui, deverá significar “estar sendo preparado por ou resultante de engenharia genética”. Um hospedeiro recombinante pode ser modificado para excluir e / ou inativar um ou mais nucleotídeos ou sequências de nucleotídeos, e pode compreender especificamente um vetor de expressão ou vetor de clonagem que contém uma sequência de ácido nucleico recombinante, em particular empregando sequência de nucleotídeos estranha ao hospedeiro. Uma proteína recombinante é produzida expressando um respectivo ácido nucleico recombinante em um hospedeiro. O termo “recombinante” em relação a uma POI usado aqui, inclui uma POI que é preparada, expressa, criada ou isolada por meios recombinantes, como uma POI isolada de uma célula hospedeira transformada para expressar a POI. De acordo com a presente invenção, podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante dentro da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Veja, por exemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Clonagem Molecular: Um Manual de Laboratório, Cold Spring Harbor, (1982).

[228] A descrição anterior será mais bem compreendida com referência aos exemplos a seguir. Tais exemplos são, no entanto, meramente representativos dos

63 / 77 métodos de praticar uma ou mais Incorporações da presente invenção e não devem ser lidos como limitativos do escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação das impurezas proteicas das células hospedeiras de P. pastoris

[229] Para identificar as impurezas da proteína da célula hospedeira (HCP) derivadas de células P. pastoris (cepa CBS2612) que produzem uma proteína recombinante como a POI, as amostras de sobrenadante da cultura de células foram analisadas quanto à composição, conteúdo e identidade da HCP, conforme descrito abaixo. Três POIs diferentes foram expressas em culturas de batelada alimentada usando dois sistemas de expressão diferentes: pG1-3 (SEQ ID NO 38 em WO2017021541) e pAOX1 como por exemplo, descrito em Stratton et al., 1998 (High Cell-Density Fermentation). Em: Higgins D.R., Cregg J.M. (eds) Pichia Protocols.

Methods in Molecular Biology, vol 103. Humana Press); incluindo diferentes peptídeos de sinal (for POI1: SEQ ID NO 12 de WO2014067926A1, e para POI2 e POI3: o peptídeo sinal do fator de acasalamento alfa (por exemplo, SEQ ID NO 1 de US9534039) foi usado) e cada vez que diferentes condições de fermentação com pH e temperatura variados, como mostrado na Tabela 1, foram usadas. Cada amostra foi testada em triplicado quanto à composição, conteúdo e identidade da HCP.

[230] As proteínas repórter são três proteínas diferentes: POI1: proteína de ligação ao antígeno de origem bacteriana, POI2: proteína de ligação ao antígeno artificial; POI3: proteína de ligação ao antígeno de origem humana.

Tabela 1: Amostra Proteína Sistema de pH Temperatura Título repórter POI expressão (°C) (mg/L) 1 POI 1 pG1-3 5,0 30 250 2 POI 1 pG1-3 6,0 30 600 3 POI 1 pG1-3 6,8 30 700

64 / 77 4 POI 1 pG1-3 6,0 25 500 5 POI 2 pG1-3 4,0 25 1300 6 POI 2 pG1-3 6,0 30 1500 7 POI 3 pAOX1 5,0 25 3000 8 POI 3 pAOX1 5,0 25 3000 9 POI 3 pG1-3 5,0 25 6000 10 POI 3 pG1-3 5,0 25 4000 11 POI 3 pG1-3 5,0 25 6500 Preparação de amostras para LC-MS/MS

[231] As amostras foram desnaturadas em guanidina HCl 6,6M, reduzidas com TCEP e digeridas com tripsina antes da análise: Três réplicas foram preparadas para cada amostra. Volumes de 18,5μl de cada amostra foram transferidos para uma placa de 96 poços. 90μL de MES 0,5M (ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico) pH 5,5, guanidina HCl 6,6M, TCEP 10mM (Tris (2-carboxietil) fosfina) foi adicionado a cada réplica. A incubação foi realizada a 50 ° C por 30 minutos. Todas as amostras foram posteriormente trocadas por tampão usando a placa de dessalinização ZebaSpin (Thermo) em 0,1M de MOPS (ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico, ácido 4-morfolinopropanosulfônico) pH 7,3, uréia 2M, CaCl2 2mM, TCEP 1mM, de acordo com as instruções do fabricante. A digestão foi realizada com tripsina de grau espectrométrico de massa (Promega). Para alíquota de 75μl de cada amostra trocada de tampão, foram adicionados 25μl de solução de digestão com tripsina (4mg / ml de tripsina, 0,1M MOPS pH 7,3, 2M de uréia, 2mM de CaCl2 e 1mM de TCEP e misturados. As amostras foram incubadas a 30 ± 2°C durante a noite. A digestão foi extinta pela adição de 2% (final) de TFA (ácido trifluoroacético).

Aquisição de dados LC-MS / MS

[232] Os dados foram adquiridos usando um sistema Dionex RSSLnano nanoLC acoplado a um espectrômetro de massa Thermo Fusion Tribrid Q-OT-qIT (Quadrupole-Orbitrap-Linear Ion Trap). Um volume de 1 μl de peptídeos trípticos para cada amostra foi injetado em um Acclaim PepMap100 C18, 5 μm, 100 Å, 300 μm i.d.

65 / 77 Coluna Nano-Trap × 5 mm (Thermo) em um tampão de carga de 98:2 água: acetonitrila mais TFA a 0,05% a 12μl / min por 3 minutos. Após 3 minutos, o fluxo de nanoLC foi direcionado na direção reversa através da coluna de captura para a coluna analítica (EasySpray PepMap C18 2μm, 100Å, 75μm x 25cm (Thermo)). Um gradiente linear foi aplicado entre ácido fórmico a 0,1% em água e ácido fórmico a 0,08% em acetonitrila: água a 80:20.

[233] As configurações de ionização da fonte eram estáticas durante a aquisição com uma voltagem de spray de 2500 V e uma temperatura do tubo de transferência de 275 ° C. O espectrômetro de massa foi configurado no modo de ionização positiva para aquisição de dados MS1 na órbita a uma resolução nominal de 120.000 FWHM com uma faixa de varredura de 200-2000 m / z, uma meta AGC de 2.0e5 e um tempo máximo de injeção de 50 ms. Os dados foram corrigidos em massa usando um padrão interno baseado em uma massa de bloqueio de íon flouranteno gerada a partir de uma fonte de íon reagente separada. Somente estados de carga entre z = 2 e z = 8 foram selecionados para fragmentação do MS2.

[234] A fragmentação do MS2 foi realizada na armadilha de íons lineares usando um método de árvore de decisão dependente de dados, incluindo os métodos HCD e ETD. O HCD foi realizado com energia de colisão de 28%, uma meta de AGC de 1,0e4 e um tempo máximo de varredura de 100 ms na taxa de varredura de armadilha “Normal”. A ETD foi realizada com energia de colisão de ativação suplementar de 15%, uma meta de AGC de 1,0e4 e um tempo máximo de varredura de 100 ms na taxa de varredura de armadilha “Normal”.

Análise de Dados por Espectrometria de Massa

[235] As identificações de proteínas baseadas na fragmentação do MS2 foram realizadas usando o software PEAKS Studio. A identificação de proteínas foi realizada

66 / 77 apenas para CCCS (sobrenadante clarificado da cultura de células). A taxa de falsas descobertas no nível do peptídeo foi controlada em <0,5% usando a metodologia de fusão por armadilha (Zhang, J, et al., “PEAKS DB: sequenciação de novo, pesquisa assistida no banco de dados para identificação sensível e precisa do peptídeo”, Mol.Cell Proteomics 4 ( 11), 111 (2012)). Foram necessários pelo menos 2 peptídeos únicos para cada atribuição de proteína. As tolerâncias de massa foram especificadas em <5 ppm para íons progenitores e <0,3 Da para íons fragmentos.

[236] Os dados de LC-MSMS gerados foram analisados separadamente para cada uma das três POIs para permitir um melhor alinhamento dos dados durante o processamento. A pesquisa de banco de dados foi realizada contra o proteoma de Komagataella phaffii (cepa ATCC 76273 / CBS 7435 / CECT 11047 / NRRL Y-11430 / Wegner 21-1) (levedura) (Pichia pastoris) do banco de dados UniProt e usando o PEAKS studio 7 para identificar as proteínas presentes. Todas as amostras foram processadas usando Progenesis QI for Proteomics. As identificações do PEAKS foram importadas para o Progenesis para quantificação ao longo do experimento. Os dados para cada POI foram processados independentemente. A quantificação foi realizada usando a metodologia Hi5. As proteínas exibindo uma mudança significativa no perfil de expressão (valor q <0,01) e alteração de dobra> 2 foram avaliadas quanto à similaridade no perfil de expressão.

[237] A HCP total é determinada da seguinte forma: Para cada proteína identificada, as áreas de pico dos cinco sinais peptídicos mais intensos que derivam dessa proteína são determinadas e depois adicionadas. O número resultante permite a comparação da abundância de proteínas em uma base molar (Silva et al., 2006: “Quantificação absoluta de proteínas por LCMSE: uma virtude da aquisição paralela de MS”. Mol Cell Proteomics 5 (1):144-56.). Os valores obtidos dessa maneira para

67 / 77 todas as HCPs individuais em uma amostra de teste foram somados. O valor somado resultante é diretamente proporcional à quantidade (em mol) de todas as HCPs na amostra de teste. Portanto, é possível fazer uma comparação entre as amostras em termos de porcentagem ou diferença de variação de dobra na HCP.

Resultados

[238] As amostras em que o sistema de expressão pAOX1 foi usado mostraram um aumento significativo de proteínas específicas ao metabolismo do metanol (álcool oxidase, formato desidrogenase, álcool desidrogenase), bem como o metabolismo de espécies reativas de oxigênio que são geradas durante o metabolismo do metanol (superóxido dismutase, peroxiredoxina PMP, dissulfureto- isomerase proteica, tioredoxina). Alterações adicionais foram observadas nesse experimento, correlacionando-se com os títulos altos das amostras 9 e 11 em comparação às amostras 7, 8 e 10. Essas alterações incluíram proteínas como ATPases envolvidas no dobramento de proteínas, glicoproteína da superfície celular ancorada por GPI, peptidil-propil cis transisomerase e proteína não caracterizada F2QUJ0, que mostra homologia com o fator de alongamento da tradução gama EF-1 (Komagataella phaffii) (C4R6E8). As amostras nas quais o sistema de expressão pG1- 3 foi usado exibiram uma expressão aumentada de enzimas envolvidas no processamento de carboidratos (glucanase, glucosidase), bem como proteínas estruturais. Demonstrou-se que várias condições de fermentação (temperatura, pH) resultam em alterações nos perfis de expressão de HCP, p. foi observada uma quantidade aumentada para a proteína chaperona HSP90 para fermentações a temperaturas e pH aumentados.

[239] Surpreendentemente, verificou-se que apenas algumas HCPs diferentes constituem as proteínas mais abundantes presentes nos sobrenadantes de todas as

68 / 77 culturas de células de Pichia pastoris que expressam diferentes POIs sob diferentes condições de expressão (como descrito acima).

[240] As HCPs mais abundantes identificadas estão resumidas na Tabela 2 abaixo:

[241] A POI3 foi expressa sob controle do promotor AOX1 nas amostras 7 e 8 e sob controle do promotor G1.3 nas amostras 9, 10 e 11. Embora várias HCPs específicas para um dos dois sistemas de indução pudessem ser observadas, suas abundâncias eram insignificantes em comparação à HCP1 principal e, em menor extensão, às abundâncias das HCP 2 e 3.

Tabela 2: HCP Identificador de Porcentagem média de todas Amino DNA proteína as condições entre a Ácido SEQ ID NO quantidade molar da HCP SEQ especificada e a quantidade ID NO molar total de HCP, não levando em consideração a

POI HCP1 F2QXM5 50 1 2 HCP2 F2QNG1 19 3 4 HCP3 F2QQT7 6 5 6 HCP4 F2QXH5 3 7 8

[242] HCP1 e HCP2, representando juntas dependiam dos experimentos em torno de 56 e 81% do conteúdo total de HCP, em média cerca de 68% do conteúdo total de HCP. Curiosamente, a proteína Epx1 (F2QXH5) de Heiss et al. (Appl Microbiol Biotechnol. 2013 Feb;97(3):1241-9. doi: 10.1007/s00253-012-4260-4. Epub 2012 Jul 17) verificou-se ser muito menos abundante do que a HCP1, HCP2 ou HCP3 sozinha ou em combinação, ou seja, representando 3% do total de HCP P. pastoris.

Exemplo 2: Geração de uma cepa de nocaute da HCP1 em Pichia

69 / 77

[243] A HCP1 (F2QXM5: identificado pelas SEQ ID NOs: 1 e 2) foi identificada na análise de identificação de proteínas das células hospedeiras do Exemplo 1, representando entre 26-64%, em média, cerca de 50% da carga total de HCP em diferentes cepas de P. pastoris que expressam 3 POIs diferentes usando diferentes sistemas de expressão e condições de fermentação (Exemplo 1):

[244] Para a interrupção do gene que codifica HCP1 em P. pastoris (cepa CBS2612), uma abordagem de cassete de marcador dividido foi usada como descrito por Heiss et al. (Appl Microbiol Biotechnol. 2013;97(3):1241-9).

[245] Os primers (iniciadores) usados para a interrupção do gene codificador da HCP1 estão listados na Tabela 3 abaixo (dois cassetes marcadores divididos sobrepostos por alvo eliminável são usados): Tabela 3: Nome do Sequência SEQ ID NO: primer A_Forward GAGAGAACTAATGCCCAGATAAACTTGC 9 A_Reverse GTTGTCGACCTGCAGCGTACGATCAAGTGAGTGAGT 10

GACTGTTGGTG B_Forward CACTCACTTGATCGTACGCTGCAGGTCGACAAC 11 B_Reverse CGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATG 12 C_Forward AAGCCCGATGCGCCAGAGTTG 13 C_Reverse GGCTGAGATCTGAGTGGATCTGATATCACCTAATAA 14

C D_Forward TAGGTGATATCAGATCCACTCAGATCTCAGCCAATCA 15

AGCTG D_Reverse CGCTTGGTAATAGACAGTGTTATGTGG 16 Control CACAGGTTCATCCACCCCGC 17 Forward Control CCATCTTACAGATTCCAGTCTCTAAGCTGC 18 Reverse Control CGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGC 27 Forward 2 Control CGGGCGACAGTCACATCATGCCCCTG 28 Reverse 2 Control GGCCAGAATGTAAACAAATGCAGATAAGG 29 Forward 3 Control CGTCACTGCCAGCAGTG 30 Reverse 3 Control GCTGCCTTCCCTATATCTGATATCAC 31 Forward 4

70 / 77

[246] Os pares de primers A_Forward / A_Reverse, B_Forward / B_Reverse, C_Forward / C_Reverse, D_Forward / D_Reverse foram utilizados para amplificar os fragmentos A, B, C e D por PCR (Q5 High-Fidelity 2X Master Mix, New England Biolabs). O fragmento A para eliminação do gene codificador de HCP1 é amplificado a partir do DNA genômico de P. pastoris, iniciando 1500 pb em 5 direções principais do respectivo ATG (do gene que codifica HCP1) até 1 pb em 5 direções principais de ATG. O fragmento D para eliminação do gene codificador de HCP1 é amplificado a partir do DNA genômico de P. pastoris, iniciando 500 pb em 3 direções principais do respectivo ATG (do gene alvo) até 2000 pb em 3 direções principais de ATG. O fragmento B consiste nos dois primeiros terços do cassete de marcador de seleção KanMX e é amplificado a partir de um plasmídeo compreendendo o modelo de DNA do vetor de cassete KanMX. O fragmento C consiste nos dois últimos terços do cassete de marcador de seleção KanMX e é amplificado a partir de um plasmídeo compreendendo o modelo de DNA vetorial do cassete KanMX. Os fragmentos A e B são recozidos em conjunto (fragmento AB) por sobreposição de PCR usando os iniciadores A_Forward e B_Reverse. Os fragmentos C e D são emparelhados em conjunto (fragmento CD) por sobreposição de PCR usando os iniciadores C_Forward e D_Reverse.

[247] Para gerar cepas de nocaute, as quatro cepas hospedeiras (cepa NC 1: cepa CBS2612 compreendendo nocaute para HCP1 (CBS2612 NC HCP1); cepa NC 2: cepa CBS2612 compreendendo um gene heterólogo que codifica POI1 e compreendendo nocaute para HCP1 (CBS2612 NC HCP1 + POI1); cepa NC 3: cepa CBS2612 compreendendo um gene heterólogo que codifica POI2 e compreendendo nocaute para HCP1 (CBS2612 NC HCP1 + POI2); cepa NC 4: cepa CBS2612 compreendendo um gene heterólogo que codifica POI3 e compreendendo nocaute

71 / 77 para HCP1 (CBS2612 NC HCP1 + POI3)) foi transformada com um total de 0,5 µg de DNA dos fragmentos AB e CD. As células foram selecionadas em placas de agar YPD contendo 500 µg / mL de Geneticina. Os clones de nocautes positivos foram verificados por PCR usando o par de iniciadores Control_Forward (liga-se a montante do fragmento A) e Control_Reverse (liga-se a jusante do fragmento D). Devido à substituição de uma região ao redor do códon inicial pelo cassete KanMX, as bandas de produtos de PCR de cepas de nocaute positivas são maiores do que as de uma sequência do tipo selvagem (Figura 2). Os digeridos por restrição nos produtos de PCR foram realizados com EcoRI ou Ncol para verificar adicionalmente o amplificador de PCR. O produto de PCR de uma cepa de nocaute positiva não deve ser clivado por EcoRI (fragmento de 4602 pb); embora deva ser digerido por NcoI (fragmentos de 1955bp e 2647bp) (Figura 2).

[248] Para analisar e comparar o conteúdo total de proteína da célula hospedeira (HCP) de uma cepa de nocaute para HCP1 versus uma cepa compreendendo o locus HCP1 intacto, a cepa CBS2612 expressando POI3 (CBS2612 POI3) e uma cepa compreendendo também o nocaute para HCP1 ( CBS2612 KO HCP1 + POI3), foram cultivadas em cultivos alimentados em lotes alimentados e a HCP total dos respectivos sobrenadantes da cultura foi conforme descrito no Exemplo 1 usando o promotor pG1.3 e o peptídeo sinal aMF_EAEA (Saccharomyces cerevisiae a-peptídeo sinal de fator de acasalamento com o tetrapeptídeo EAEA, tetrapeptídeo EAEA identificado como SEQ ID NO: 19 para produção de POI3. Os resultados da análise são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4: CBS2612 NC CBS2612 POI3 HCP1+POI3 % concentração; 50% 100% quantidade total de HCPs

72 / 77

[249] Como pode ser visto na Tabela 4, uma cepa compreendendo um nocaute do gene que codifica HCP1 gerou cerca de 50% (mol / mol) menos quantidade total de HCPs, em comparação com a cepa respectiva que compreende o gene que codifica a proteína HCP1.

Exemplo 3: Geração de múltiplas linhagens que expressam proteínas recombinantes na linhagem nocaute de Pichia HCP1

[250] Para mostrar ainda mais a forte redução na quantidade total de HCPs ao eliminar a HCP1, foram geradas cepas adicionais. Em contraste com o Exemplo 2, primeiro foi gerada a cepa nocaute, sobre a qual a cepa foi então transformada com um dos três plasmídeos que expressam uma proteína de interesse.

[251] Para a interrupção do gene que codifica HCP1 em P. pastoris (cepa CBS2612) SEQ ID NO: 2, a mesma abordagem foi usada como descrito no Exemplo

2. A cepa HCP1 NC foi verificada por quatro diferentes reações de PCR (Figura 3). O PCR1 (usando o par de iniciadores Control Forward e Control Reverse 2, Tabela 3) é usado para verificar o lado 5’ da integração do cassete nocaute no local genômico correto e não deve dar um amplicon na cepa do tipo selvagem, enquanto um amplicon de 1687bp deve ser obtido para a cepa HCP1 NC. O PCR2 (usando o par de iniciadores Control Forward e Control Reverse 2) é usado para verificar o lado 3’ da integração do cassete nocaute no local genômico correto e não deve dar um amplicon na cepa do tipo selvagem, enquanto um amplicon de 1723bp deve ser obtido para a cepa HCP1 NC. O PCR3 (usando o par de iniciadores Control Forward e Control Reverse 3) é usado para verificar a localização genômica da HCP1 e deve dar um amplicon de 2172bp na cepa do tipo selvagem, enquanto nenhum amplicon deve ser obtido para a cepa HCP1 NC. O PCR4 (usando o par de iniciadores Control Forward 4 e Control Reverse 3) é usado para verificar se o fragmento nocauteado do gene

73 / 77 HCP1 não se reintegrou em outro lugar do genoma. Deve dar um amplicon de 115bp na cepa do tipo selvagem, enquanto nenhum amplicon deve ser obtido para a cepa HCP1 NC.

[252] Em uma segunda etapa, tanto a cepa do tipo selvagem (CBS2612) quanto a cepa HCP1 NC foram transformadas com 1-5 µg de um dos três plasmídeos que codificam respectivamente para POI1, POI2 ou POI3 sob controle do promotor G1-3 (SEQ ID NO 38 em WO2017021541). As células foram selecionadas em placas de agar YPD contendo 100-1000 µg / mL de Zeocina. Os clones positivos foram analisados quanto à expressão, como descrito em WO2017021541, com uma pequena adaptação, a saber, o meio de cultura foi alterado para o meio a partir do Media Development Kit (M-KIT-100, m2pLabs, DE). Além disso, o número de cópias de genes (GCN) foi analisado usando um método conhecido dos especialistas na técnica (por exemplo, Abad et al., 2010). Oito cepas foram selecionadas com base em títulos POI e GCN semelhantes no tipo selvagem e no fundo HCP1 NC.

Exemplo 4: Caracterização das impurezas da proteína da célula hospedeira no sobrenadante da cultura das cepas do Exemplo 3

[253] Para caracterizar as impurezas de HCPs derivadas das oito cepas selecionadas (Exemplo 3), as cepas foram cultivadas em fermentações em batelada alimentada, conforme descrito no Exemplo 1. As amostras de final de fermentação foram usadas para identificação da HCP.

[254] As amostras foram preparadas, os dados de MS foram adquiridos e os dados foram analisados usando um fluxo de trabalho semelhante ao descrito no Exemplo 1, com pequenas alterações. A análise foi executada da seguinte forma: Preparação de amostras para LC-MS/MS

[255] As amostras foram desnaturadas em guanidina HCl 6,6M, reduzidas

74 / 77 com TCEP e digeridas com tripsina antes da análise: Três réplicas foram preparadas para cada amostra. 60 µl de volumes de cada amostra foram transferidos para uma placa de 96 poços. 90μL de MES 0,5M (ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico) pH 5,5, guanidina HCl 6,6M, TCEP 10mM (Tris (2-5 carboxietil)fosfina) foi adicionado a cada réplica. A incubação foi realizada a 50 ° C por 30 minutos. Todas as amostras foram posteriormente trocadas por tampão usando a placa de dessalinização ZebaSpin (Thermo) em 0,1M de MOPS (ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico, ácido 4-morfolinopropanosulfônico) pH 7,3, uréia 2M, CaCl2 2mM, TCEP 1mM, de acordo com as instruções do fabricante. A digestão foi realizada com tripsina de grau espectrométrico de massa (Promega). Para alíquota de 50µl de cada amostra trocada de tampão, foram adicionados 16.6µl de solução de digestão com tripsina (4mg/ml de tripsina, 0,1M MOPS pH 7,3; 2M de uréia, 2mM de CaCl2 e 1mM de TCEP e misturados. As amostras foram incubadas a 30 ± 2°C durante a noite. A digestão foi extinta pela adição de 2% (final) de TFA (ácido trifluoroacético). As amostras foram diluídas 1:10 com tampão de digestão.

Aquisição de dados LC-MS / MS

[256] Os dados foram adquiridos usando um sistema Dionex RSSLnano nanoLC acoplado a um espectrômetro de massa Thermo Fusion Tribrid Q-OT-qIT (Quadrupole-Orbitrap-Linear Ion Trap). Um volume de 1 μl de peptídeos trípticos para cada amostra foi injetado em um Acclaim PepMap100 C18, 5 μm, 100 Å, 300 μm i.d.

Coluna Nano-Trap × 5 mm (Thermo) em um tampão de carga de 98:2 água: acetonitrila mais TFA a 0,05% a 12µl / min por 3 minutos. Após 3 minutos, o fluxo de nanoLC foi direcionado na direção reversa através da coluna de captura para a coluna analítica (EasySpray PepMap C18 2µm, 100Å, 75µm x 25cm (Thermo)). Um gradiente linear foi aplicado entre ácido fórmico a 0,1% em água e ácido fórmico a 0,08% em

75 / 77 acetonitrila: água a 80:20. As configurações de ionização da fonte eram estáticas durante a aquisição com uma voltagem de spray de 2500 V e uma temperatura do tubo de transferência de 275 ° C. O espectrômetro de massa foi configurado no modo de ionização positiva para aquisição de dados MS1 na órbita a uma resolução nominal de 120.000 FWHM com uma faixa de varredura de 350-1500 m / z, uma meta AGC de 5.0e5 e um tempo máximo de injeção de 150 ms. Os dados foram corrigidos em massa usando um padrão interno baseado em uma massa de bloqueio de íon flouranteno gerada a partir de uma fonte de íon reagente separada. Somente estados de carga entre z = 2 e z = 8 foram selecionados para fragmentação do MS2. A fragmentação do MS2 foi realizada na armadilha de íons linear, usando o modo dependente de dados mais intenso TopN com métodos HCD. O HCD foi realizado com energia de colisão de 28%, uma meta de AGC de 1,0e4 e um tempo máximo de varredura de 100 ms na taxa de varredura de armadilha “Rápida”.

Análise de Dados por Espectrometria de Massa

[257] As identificações de proteínas baseadas na fragmentação do MS2 foram realizadas usando o software PEAKS Studio. A identificação de proteínas foi realizada apenas para CCCS (sobrenadante clarificado da cultura de células). A taxa de falsas descobertas no nível do peptídeo foi controlada em <0,1% usando a metodologia de fusão por armadilha (Zhang, J, et al., “PEAKS DB: sequenciação de novo, pesquisa assistida no banco de dados para identificação sensível e precisa do peptídeo”, Mol.Cell Proteomics 4 ( 11), 111 (2012)). Foram necessários pelo menos 2 peptídeos únicos para cada atribuição de proteína. As tolerâncias de massa foram especificadas em <5 ppm para íons progenitores e <0,3 Da para íons fragmentos. Os dados de LC- MSMS gerados foram analisados separadamente para cada uma das três POIs para permitir um melhor alinhamento dos dados durante o processamento. A pesquisa de

76 / 77 banco de dados foi realizada contra o proteoma de Komagataella phaffii (cepa ATCC 76273 / CBS 7435 / CECT 11047 / NRRL Y-11430 / Wegner 21-1) (levedura) (Pichia pastoris) do banco de dados UniProt e usando o PEAKS studio 7 para identificar as proteínas presentes. Todas as amostras foram processadas usando Progenesis QI for Proteomics. As identificações do PEAKS foram importadas para o Progenesis para quantificação ao longo do experimento. Os dados para cada POI foram processados independentemente. A quantificação foi realizada usando a metodologia Hi3. As proteínas exibindo uma mudança significativa no perfil de expressão (valor q <0,05) e alteração de dobra >2 foram avaliadas quanto à similaridade no perfil de expressão.

A HCP total é determinada da seguinte forma: Para cada proteína identificada, as áreas de pico dos três sinais peptídicos mais intensos que derivam dessa proteína são determinadas e depois adicionadas. O número resultante permite a comparação da abundância de proteínas em uma base molar (Silva et al., 2006: “Quantificação absoluta de proteínas por LCMSE: uma virtude da aquisição paralela de MS”. Mol Cell Proteomics 5 (1):144-56.). Os valores obtidos dessa maneira para todas as HCPs individuais em uma amostra de teste foram somados. O valor somado resultante é diretamente proporcional à quantidade (em mol) de todas as HCPs na amostra de teste. Portanto, é possível fazer uma comparação entre as amostras em termos de porcentagem ou diferença de variação de dobra na HCP.

Resultados

[258] A abundância surpreendentemente alta de HCP1 no conjunto total de HCP de cepas não manipuladas, como visto no Exemplo 1, foi confirmada nesta experiência (Figura 4). A HCP1 constitui entre 43 e 70% da HCP total no sobrenadante de uma cepa do tipo selvagem com ou sem expressão de uma proteína recombinante.

[259] Ao comparar a quantidade total de HCP em cepas do tipo selvagem e

77 / 77 cepas de nocaute da HCP1, foi obtida uma redução na HCP total entre 20 e 79%

(Figura 5). Enquanto a cepa do tipo selvagem que expressa POI1 tinha um conteúdo de HCP1 acima de 40% do total de HCP, a quantidade total de HCPs caiu apenas

20%. Isso ocorre devido à leve regulação positiva de outras HCP nesse contexto de deformação.

No entanto, para todas as cepas, a eliminação da HCP1 tem um impacto positivo substancial no perfil de impureza de uma proteína produzida recombinante no meio sem células, o que foi inesperado.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. UMA CÉLULA HOSPEDEIRA EUCARIÓTICA projetada para produzir uma proteína heteróloga de interesse (POI), cuja célula é geneticamente modificada para reduzir a produção de pelo menos uma proteína da célula hospedeira endógena (HCP) selecionada do grupo que consiste em uma primeira HCP (HCP1), uma segunda HCP (HCP2) e uma terceira HCP (HCP3), caracterizada por a) HCP1 compreender a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 1, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie; b) HCP2 compreender a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 3, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie; e c) HCP3 compreender a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 5, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie.

2. A CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida pelo menos uma HCP é HCP1 e, opcionalmente, HCP2 e / ou HCP3.

3. A CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, célula que é geneticamente modificada para reduzir a produção de outra HCP que é HCP4, caracterizada por a) HCP4 compreender a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 7, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógena para a célula hospedeira, se de outra espécie.

4. A CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 3, caracterizada pelo fato de que cada uma das sequências homólogas é caracterizada por pelo menos 50% de identidade de sequência com a respectiva sequência de aminoácidos.

5. A CÉLULA HOSPEDEIRA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela célula hospedeira ser geneticamente modificada por uma ou mais modificações genéticas do genoma da célula hospedeira compreendendo uma interrupção, substituição, exclusão ou nocaute de (i) um ou mais polinucleotídeos endógenos, ou uma parte dele; ou (ii) uma sequência de controle de expressão, de preferência em que a referida sequência de controle de expressão for selecionada a partir do grupo que consiste em um promotor, um local de ligação ribossômica, sequências de início e parada da transcrição ou da tradução, uma sequência intensificadora e ativadora.

6. A CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que um gene que codifica qualquer uma das referidas, pelo menos uma HCP é nocauteada pelas referidas uma ou mais modificações genéticas.

7. A CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por ser geneticamente modificada para reduzir a quantidade de qualquer uma das referidas, pelo menos uma HCP em pelo menos 50% (mol / mol) em comparação com a célula hospedeira sem a referida modificação, preferencialmente por um nocaute de um gene que codifica qualquer uma das referidas, pelo menos uma HCP.

8. A CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende um cassete de expressão compreendendo uma ou mais sequências reguladoras de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas a uma sequência nucleotídica que codifica a POI, em que as referidas uma ou mais sequências ligadas operacionalmente não estão naturalmente associadas à sequência de codificação da POI.

9. A CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pela POI ser um peptídeo ou proteína selecionado(a) do grupo que consiste em uma proteína de ligação ao antígeno, uma proteína terapêutica, uma enzima, um peptídeo, um antibiótico proteico, uma proteína de fusão de toxinas, um conjugado carboidrato - proteína, uma proteína estrutural, uma proteína reguladora, um antígeno de vacina, um fator de crescimento, um hormônio, uma citocina, uma enzima de processo e uma enzima metabólica.

10. A CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que qualquer tal célula pode ser de um animal, uma célula de vertebrado, uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula de planta, uma célula de nematóide, uma célula de invertebrado, uma célula de inseto, um célula de molusco, uma célula-tronco derivada de qualquer uma das anteriores, ou uma célula de levedura ou fungo.

11. A CÉLULA HOSPEDEIRA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por ser a) uma célula de levedura de um gênero selecionado do grupo que consiste em Pichia, Hansenula, Komagataella, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Ogataea, Yarrowia e Geotrichum, tais como Pichia pastoris, Komagataella phaffii, Komagataella pastoris, Komagataella pseudopastoris, Komagataella pseudopastoris, Ogataea minuta, Kluyveromces lactis, Kluyveromes marxianus, Yarrowia lipolytica ou Hansenula polymorpha; ou b) uma célula de fungos filamentosos, como Aspergillus awamori ou Trichoderma reesei.

12. UM MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA DE INTERESSE (POI) em uma célula hospedeira eucariótica, caracterizado por compreender as etapas: i) modificar geneticamente a célula hospedeira para reduzir a produção de pelo menos uma proteína da célula hospedeira endógena (HCP) selecionada do grupo que consiste em uma primeira HCP (HCP1), uma segunda HCP (HCP2) e uma terceira HCP (HCP3), em que a) HCP1 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 1, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie; b) HCP2 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 3, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie; e c) HCP3 compreende a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 5, se a célula hospedeira for Komagataella phaffii, ou sua sequência homóloga que é endógeno para a célula hospedeira, se de outra espécie; ii) introduzir na célula hospedeira um cassete de expressão compreendendo uma ou mais sequências reguladoras de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas a uma sequência nucleotídica que codifica a POI; iii) cultivar a referida célula hospedeira sob condições para produzir a referida POI; e opcionalmente; iv) isolar a referida POI da cultura de células; e opcionalmente v) purificar a referida POI.

13. UM MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA DE INTERESSE (POI) caracterizado por cultivar a célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sob condições para produzir a referida POI.

14. O MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a quantidade de qualquer uma das referidas, pelo menos uma HCP é reduzida em pelo menos 50% (mol / mol) em comparação com a célula hospedeira sem a referida modificação, de preferência por um nocaute de um gene que codifica qualquer uma das referidas, pelo menos uma HCP.

15. UM MÉTODO PARA REDUZIR O RISCO DE CONTAMINAÇÃO POR PROTEÍNA DE CÉLULA HOSPEDEIRA ENDÓGENA (HCP) de uma proteína de interesse (POI) produzida em uma cultura de célula hospedeira, caracterizado por cultivar a célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 sob condições para produzir a referida POI e isolar a POI da referida cultura de células.

(continuação)

(continuação)

(continuação)

(continuação)

Cepas de deleção

Tipo selvagem Tipo selvagem Não digerida

NC cepa

NC ce pa NC cepa

NC cepa

Não digerida Tipo selvagem Digestão EcoRI

NC cepa

NC cepa

Digestão EcoRI NC cepa

NC cepa

Tipo selvagem Digestão Ncol

NC cepa Digestão Ncol

NC cepa

NC cepa

NC cepa

Tipo selvagem NC cepa Tipo selvagem

NC Tipo selvagem

NC de Tipo selvagem outras NC Tipo selvagem

NC Outra

Redução da HCP total TS em cepas de HCP1 NC vs cepas do tipo selvagem (%) NC1

POI não expressada

[*CellRange: células na coluna especificada]