CN110760003A - 一种抗her3单链抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗HER3单链抗体的制备方法，包括以下步骤，设计抗HER3单链抗体基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，并合成该基因，并克隆至质粒pGAPZαA中，获得重组质粒；将重组质粒转化至毕赤酵母，并筛选出高表达菌株；将筛选出的高表达菌株在液体YPD培养基中进行发酵，获得发酵液并浓缩发酵液；进行疏水层析纯化；进行镍柱亲和层析纯化；进行G25分子筛置换缓冲液。本发明成功使得抗HER3单链抗体在毕赤酵母中高水平表达，实现利用重组酵母菌株进行发酵获取的发酵上清液中高效纯化抗HER3单链抗体，纯化产物纯度高，并且产率高，其抗HER3‑scFv得到正确表达，并可特异识别HER3，有利于抗HER3单链抗体的应用。

Description

一种抗HER3单链抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种抗HER3单链抗体的制备方法。

背景技术

人类表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor 3,HER3/ERBB3)是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族中的第三个成员，与其他成员的结构类似，HER3也由胞外配体结合区、跨膜区和胞内酪氨酸激酶区三部分组成。

由于胞内酪氨酸激酶活性缺失，长期以来HER3作为治疗靶点并未受到重视。近年随着研究的不断深入，HER3与肿瘤的发生发展、预后的关系不断被揭示。HER3通常与EGFR家族中的其他成员，如EGFR、HER2等共表达于肿瘤细胞的表面，并与之形成异源二聚体参与肿瘤信号，特别是PI3K/AKT磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PK B,又称AKT)通路、Src激酶信号的传导，促进肿瘤细胞的存活、增殖和迁移。

HER3高表达于前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的细胞表面，这种表达量的高低与肿瘤的进展、预后密切相关，若表达量高则进展快、预后差。研究还发现，HER3信号通路的激活是赫赛汀、吉非替尼等多种靶向药物产生耐药的一个重要原因。阻断HER3信号通路，则可使耐药细胞对药物重新敏感、抑制HER3高表达肿瘤的生长。

因此，HER3已成为新药研究中的热门靶点。目前已有U3-1287、MM-121和LJM716等抗HER3的单克隆抗体药物处于临床研究阶段。其中LJM716单克隆抗体是筛选自全合成人组合抗体文库(fully synthetic human combinatorial antibody libraries，HuCAL)的高亲和力抗体，其作用于HER3胞外区的Ⅱ和Ⅳ结构域，使HER3处于无活性构象中，从而阻断受体的活化和信号的转导。LJ M716抗体在配体依赖和非依赖的HER3激活通路、HER2过表达信号通路以及其他配体激活通路中均有着显著的抑制作用，具有良好的发展前景。

但由于单克隆抗体分子量较大，免疫原性强，在肿瘤组织的渗透性较差，一定程度上影响到单抗的效用功能。另外，单抗的生产成本高昂，给病人带来了沉重的经济负担。因此，研究开发具有相同抗原结合特性的小分子抗体就具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种抗HER3单链抗体的制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种抗HER3单链抗体。

本发明的第二个目的是提供一种抗HER3单链抗体的编码基因。

本发明的第三个目的是提供所述抗HER3单链抗体的高效制备方法。

本发明的第四个目的是提供所述的筛选出高表达菌株的方法筛选出的高表达菌株。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

根据基因文库中抗HER3的单克隆抗体LJM716的基因序列及毕赤酵母密码子偏好性，设计并化学合成抗HER3单链抗体anti-HER3-scFv基因序列，并构建pUC57-anti-HER3-scFv重组克隆载体。进一步将抗HER3单链抗体基因通过双酶切后连接的方式整合至含Zeocin抗性基因的pGAPZαA穿梭质粒上，提取质粒后通过化学转化法把穿梭质粒转化到大肠杆菌JMC109。扩增后提取得到大量的重组质粒，进行线性化采用电转化法将质粒转化入处于感受态的毕赤酵母X-33中，利用含有高浓度的Zeocin的固体培养基筛选出高拷贝转化子，发酵表达后通过SDS-PAGE鉴定出抗HER3单链抗体基因的表达产物。扩大发酵体积并浓缩发酵上清，运用疏水层析技术、亲和层析技术及G25分子筛层析技术对样品进行纯化，最终得到抗HER3单链抗体样品。

因此本发明要求保护一种抗HER3单链抗体，其氨基酸如SEQ ID NO：2所示。

以及，一种抗HER3单链抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种抗HER3单链抗体的高效制备方法，包括以下步骤，

S1.设计抗HER3单链抗体基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，并合成该基因，并克隆至质粒pGAPZαA中，获得重组质粒；

S2.将重组质粒转化至毕赤酵母，并筛选出高拷贝菌株；

S3.将筛选出的高拷贝菌株在液体YPD培养基中进行发酵，获得发酵液并浓缩发酵液；

S4.将浓缩后的发酵液使用phenyl-sepharose Fast Flow 6疏水层析柱，进行疏水层析纯化；

S5.上一步的产物使用Ni-NTA亲和层析柱，进进行镍柱亲和层析纯化；

S6.上一步的产物进行置换缓冲液。

优选地，步骤S6中使用Sephadex G25分子筛柱进行置换缓冲液。

优选地，抗HER3单链抗体基因克隆至质粒pGAPZαA中XhoⅠ和XbaⅠ之间。

优选地，所述毕赤酵母为毕赤酵母X-33。

优选地，步骤S2中，筛选出高表达菌株步骤为：

S21.菌株接种于含0.1～0.2％Zeocin的YPDS平板，置于30℃培养2～3天；

S22.挑取单菌落接种于含0.1～0.2％Zeocin的YPDS平板，置于30℃培养2～3天；

S23.挑取单菌落接种于含1.0～1.1％Zeocin的YPDS平板，置于28～30℃培养2～3天；

S24.挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，28～30℃，180～200rpm摇床培养72～74小时，SDS-PAGE检测各菌落抗HER3-scFv的表达量，筛选出高表达菌株。

更优选地，步骤S21中，菌株接种于含0.5％Zeocin的YPDS平板。

更优选地，步骤S21中，置于30℃培养2～3天。

更优选地，步骤S22中，挑取中等大小的单菌落接种于含1％Zeocin的YPDS平板。

更优选地，步骤S21中，置于30℃培养2～3天。

更优选地，步骤S24中，30℃，200rpm培养培养72小时。

优选地，步骤S3中，发酵的步骤为：

S31.将筛选出的高拷贝菌株接种于含0.1～0.2％Zeocin的YPD液体培养基，28～30℃，180～200rpm摇床培养12～14小时；

S32.以1:100～200的体积比将上一步的到的菌液接种到YPD液体培养基，28～30℃，180～200rpm培育2～3天；

步骤S3中，浓缩发酵液步骤为：

S33.取发酵上清液75～100rpm搅拌，分次加入硫酸铵粉末，至终浓度为45～50％；

S34.3～4℃静置12～14h，取上清液，固液分离；

S35.弃上清，用缓冲液溶解沉淀，该缓冲液体为含有0.4～0.5M NaCl的pH＝7.4～7.6的20～25mM PBS缓冲液；

S36.0.45μm的滤膜过滤看，去除不溶物。

更优选地，步骤S3中，发酵的步骤为：

S31.以1:100的体积比将筛选出的高拷贝菌株接种于含0.1％Zeocin的YPD液体培养基，30℃，170rpm摇床培养12～14小时；

S32.以1:100的体积比将上一步的到的菌液接种到YPD液体培养基，30℃，170rpm培育3天；

步骤S3中，浓缩发酵液步骤为：

S33.取发酵上清液200rpm搅拌，分次加入硫酸铵粉末，至终浓度为45～50％；

S34.4℃静置过夜，取上清液，固液分离；

S35.弃上清，用缓冲液溶解沉淀，该缓冲液体为含有0.5M(NH₄)₂SO₄的pH＝7.4的20mM PBS缓冲液；

S36.0.45μm的滤膜过滤看，去除不溶物。

优选地，步骤S4中，疏水层析纯化的步骤为：

S41.用5～6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，流速为2.0～2.5ml/min；

S42.以2.0～2.5ml/min的流速进行柱平衡，平衡液为含有0.45～0.50M(NH₄)₂SO₄的pH＝7.4～7.6的20～25mM PBS；

S43.以2.0～2.5ml/min的流速上样；

S44.以2.0～2.5ml/min的流速进行洗脱，洗脱液为10～15mM Tris-HCl pH＝8.3～8.4，收集洗脱峰样品。

更优选地，步骤S4中，疏水层析纯化的步骤为：

S41.用5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，流速为2ml/min；

S42.以2ml/min的流速进行柱平衡，平衡液为含有0.5M(NH₄)₂SO₄的pH＝7.4的20mMPBS；

S43.以2ml/min的流速上样；

S44.以2ml/min的流速进行洗脱，洗脱液为10mM Tris-HCl pH＝8.3，收集洗脱峰样品。

优选地，步骤S5中，镍柱亲和层析纯化的步骤为：

S51.将上一步的产物与咪唑混合，使得咪唑的浓度为20～25mM，用0.45μm滤膜，去除不溶物；

S52.平衡柱子；

S53.以2.0～2.5ml/min的流速上样步骤S51的产物；

S54.以2.0～2.5ml/min的流速进行洗脱，洗脱液为含有0.25～0.30M咪唑的pH＝8.3～8.4的10～15mM Tris-HCl，收集洗脱峰样品。

更优选地，步骤S5中，镍柱亲和层析纯化的步骤为：

S51.将上一步的产物与咪唑混合，使得咪唑的浓度为20mM，用0.45μm滤膜，去除不溶物；

S52.平衡柱子；

S53.以2ml/min的流速上样步骤S51的产物；

S54.以2ml/min的流速进行洗脱，洗脱液为含有0.25M咪唑的pH＝8.3的10mMTris-HCl，收集洗脱峰样品；

优选地，步骤S6中，筛选G25分子筛纯化的步骤为：

S61.将上一步的产物与等体积饱和硫酸铵溶液混和，3～4℃，静置12～14h；

S62.3～4℃，9000～10000rpm，离心25～30min，弃上清，用原混和体积4～5％的10～15mM PBS pH＝7.4～7.6溶解沉淀；

S63.洗涤并平衡柱子；

S64.以2.0～2.5ml/min的流速上样步骤S62的产物；

S65.上样，收集洗脱峰。

更优选地，步骤S6中，筛选G25分子筛纯化的步骤为：

S61.将上一步的产物与等体积饱和硫酸铵溶液混和，4℃，静置12h；

S62.4℃，10000rpm，离心30min，弃上清，1ml 10mM PBS pH＝7.4溶解沉淀；

S63.洗涤并平衡柱子；

S64.以2ml/min的流速上样步骤S62的产物；

S65.上样，收集洗脱峰。

进一步优选地，步骤S63中，洗涤并平衡柱子的步骤为：

S61.流速为2.0～2.5ml/min，用3～4倍柱体积的去离子水洗涤柱子；

S62.流速为2.0～2.5ml/min，用4～5倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，平衡液为10～15mM pH＝7.4～7.6的PBS。

进一步更优选地，步骤S63中，洗涤并平衡柱子的步骤为：

S61.流速为2ml/min，用3倍柱体积的去离子水洗涤柱子；

S62.流速为2ml/min，用3倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，平衡液为10mM pH＝7.4的PBS。

优选地，步骤S2中，将重组质粒转化至毕赤酵母的方法为电击转化，电击转化参数为：U＝1500，R＝200，C＝25。

以上所述的筛选出高表达菌株的方法筛选出的高表达菌株，也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明成功制备出抗HER3单链抗体，其制备方法使得纯化出纯度大于95％的目的产物，产率为192mg/L。结果显示抗HER3-scFv得到正确表达，并可特异识别HER3。本发明成功使得抗HER3单链抗体表达载体在毕赤酵母中表达，实现利用重组酵母菌株进行发酵获取的发酵上清液中纯化抗HER3单链抗体，有利于抗HER3单链抗体的应用。

附图说明

图1为DNA提取试剂盒提取质粒pGAPZαA电泳图；M为marker DL 2000pb；1、2、3和4为pGAPZαA载体。

图2为AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化质粒pGAPZαA电泳图；M为marker DL2000pb；1为pGAPZαA载体。

图3为目的基因PCR产物电泳图。

图4为目的基因PCR产物胶回收提纯电泳图。

图5为双酶切胶回收鉴定电泳图；M为marker DL 2000；1为pGAPZαA载体双酶切后切胶回收片段；2为目的基因双酶切后切胶回收片段。

图6为构建得到的载体质粒pGAPZαA-anti-HER3-scFv。

图7为转化JMC109培养平板图。

图8为转化JMC109挑选单菌落划平板图。

图9为菌落PCR电泳图；M为marker DL 2000；1、2、3、4、5、6、7、8和10为菌落PCR产物，9为阴性对照组。

图10为重组质粒提取电泳图；M为marker DL 2000；1、2、3、4、5、6和7为重组质粒提取物。

图11为重组质粒线性化酶切电泳图；图中M为marker DL2000；1为线性化前质粒(对照组)；2为线性化质粒。

图12为重组质粒转化X-33平板图。

图13为0.5％Zeocin筛选高抗性菌株培养平板图；图中分别为不同单菌落划线所得。

图14为目的蛋白SDS-PAGE电泳图；M为Marker(Low)；1～11为高抗性菌株的蛋白；12为阴性对照组。

图15为疏水纯化层析图。

图16为经疏水层析柱纯化后SDS-PAGE电泳图。

图17为镍柱纯化层析图。

图18为经镍柱亲和层析后SDS-PAGE电泳图。

图19为570nm吸光值制作标准曲线图。

图20为Western blot法鉴定目的蛋白抗HER3-scFv；M：Enhanced 3-colorExcelBandTM Regular Range Protein Marker；1：毕赤酵母菌株X-33空宿主发酵上清对照样品；2：抗HER3-scFv纯化蛋白。

图21为ELISA鉴定抗HER3-scFv的结合活性；1：无菌水；2：脱脂奶粉；3：抗HER3-scFv.aP<0.05vs其他2组。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

菌株和质粒

PCR模板：PUC载体、表达载体pGAPZαA质粒、E.coliJMC109甘油种、X33甘油种均由本实验室保存。

主要材料和试剂

AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，Zeocin抗生素、氨苄青霉素、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、Taq酶(mix)、dNTPmix、T4连接酶、限制性内切酶XhoⅠ、XbaⅠ、线性化酶BlnⅠ、MarkerDM2000、山梨醇、DTT、乙酸锂、乙酸钠、氯化钠、异丙醇、氢氧化钠、氯仿、10×TE溶液、无水乙醇、60％甘油、ddH2O、琼脂粉、YPDS培养基、YPD培养基、Tris-Hcl、PBS、BSA(牛血清白蛋白溶液)、1ml镍柱、40mlG25分子筛、30ml疏水柱、咪唑、硫酸镍、乙二胺四乙酸二钠、硫酸铵、BCA试剂盒。

仪器与用具

恒温水浴锅、无菌工作台、恒温培养箱、PCR仪、低温高速离心机、凝胶成像仪、琼脂糖电泳系统、超低温冰箱、基因导入仪；无菌EP管、无菌枪头与移液器、无菌PCR管、烧杯、玻璃棒、锥形瓶、培养皿。

实施例1载体质粒pGAPZαA-anti-HER3-scFv的制备

一、载体质粒pGAPZαA的提取及纯化

(一)、实验方法

1、DNA试剂盒提取pGAPZαA质粒

1)取2ml过夜培养的含pGAPZαA的菌液于无菌的2ml离心管中，10000rpm离心1min，弃上清；

2)再取2ml过夜培养的含pGAPZαA的菌液于无菌的2ml离心管中，10000rpm离心1min，弃上清；

3)加250μl Buffer S1重新悬浮细菌沉淀；

4)加250μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转6～8次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；

5)加350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6～8次，10000rpm离心10min；

6)吸取上清并转移到制备管(置于2ml离心管中)，10000rpm离心1min，弃滤液；

7)将制备管置回离心管，加500μl Buffer W1，10000rpm离心1min，弃滤液；

8)将制备管置会离心管，加700μl Buffer W2，10000rpm离心1min，弃滤液；以同样的方法重复一次；

9)将制备管置回离心管，10000rpm离心1min；

10)将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加20μl 65℃水浴预热的Eluent，室温静置1min，10000rpm离心1min，取1μl滤液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，剩下滤液于-20℃保存。

2、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收pGAPZαA质粒

1)取剩下的滤液进行1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切出荧光条带的胶块，装入一个预先称重的1.5EP管中，再次称重，计算凝胶重量(该重量作为一个凝胶体积，如100mg＝100μl体积)；

2)加入等凝胶体积的膜结合液(MB)，混匀后置于55℃水浴，每隔1-2分钟混匀一次，直至胶块完全溶解，并冷却到室温。

3)转移至离心吸附柱内，10000rpm离心1min，弃滤液

4)将离心吸附柱置回收集管中，加入600μl膜漂洗液(MW)，10000rpm离心1min，弃滤液；以同样的方法重复一次；

5)弃去离心吸附柱的盖子，10000rpm离心2min，将离心吸附柱转入另一个新的离心管中。

6)加入30μl预先55℃水浴的洗脱缓冲液(EB)，室温静置1min，10000rpm离心1min，取1μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，剩下离心液于-20℃保存备用。

(二)、实验结果

图1用DNA试剂盒提取4ml菌液中pGAPZαA质粒得到的电泳图，其中样品均为1μl，marker为2μl，由图可见1条明亮条带大小均约为2800bp，与预期质粒大小基本符合，说明质粒提取操作正确，图上显示的条带比较亮，说明质粒浓度较大。图2用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收pGAPZαA质粒后得到的电泳图，其中样品为2μl，marker为2μl。由图可见，经纯化后质粒中杂质已明显去除，但同时经纯化后有部分的质粒损失。经估算，浓度大概为290ng/μl。

二、目的基因PCR

查找基因文库中抗HER3的单克隆抗体LJM716的基因序列，将基因序列通过NCBI的IgBLAST分析其可变区序列，以分别获得单抗LJM716的重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列。基因序列翻译为氨酸酸序列后，在重链可变区氨基酸序列后加上“GGGGSGGGGSGGGGS”接头序列，之后再加上轻链可变区序列，以构建成抗HER3的单链抗体，具体氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。将氨基酸序列转换为核苷酸序列，根据毕赤酵母密码子偏好性，初步优化抗HER3单链抗体的基因序列。之后，根据GC含量、接头序列的重复性、转录出的mRNA二级结构等方面，结合偏好密码子进一步优化，最终获得anti-HER3-scFv基因序列，并构建pUC57-anti-HER3-scFv重组克隆载体。

E.coli pUC57-anti-HER3-scFv为发明人之前构建的携带有含有重组的抗HER3单链抗体基因的质粒的大肠杆菌。其中，重组的抗HER3单链抗体的基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，其编码的HER3单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

(一)实验方法

所用引物由广州Invitrogen公司合成，见表1。引物处理：瞬时离心后，于无菌条件下各加入1.5ml 1×TE溶液溶解，-20℃保存。

表1抗HER3单链抗体基因片段克隆及相关实验所用引物序列：

在冰盒中按下述配方配制PCR反应体系，加完全部试剂后瞬时离心，于PCR仪中调节PCR条件如下进行PCR，然后取1μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 PCR体系配制表：

(二)实验结果

图3以含有anti-HER3-scFv的PUC载体为模板进行PCR得到目的基因的电泳图，其中样品为1μl，marker为2μl。在750bp附近有一明亮条带，而目的基因片段大小为778bp左右，其大小与目的基因片段基本相符，说明已成功通过PCR方法扩增出抗HER3单链抗体的基因。

三、PCR产物纯化及鉴定

(一)实验方法

1)将19μl PCR产物上样进行1％琼脂糖凝胶电泳；

2)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μl体积)；

3)加入等凝胶体积的膜结合液(MB)，混匀后于55℃加热至凝胶块完全熔化；

4)加入等凝胶体积的异丙醇，混匀并冷却至室温；

5)吸取混合液转移到含有收集管的离心柱中，静置1min，10000rpm离心1min，弃滤液；

6)将离心吸附柱置回收集管中，加入600μl膜漂洗液(MW)，10000rpm离心1min，弃滤液；以同样的方法重复一次；

7)弃去离心吸附柱的盖子，10000rpm离心2min，将离心吸附柱转入另一个新的离心管中。

8)加入30μl预先55℃水浴的洗脱缓冲液(EB)，室温静置1min，10000rpm离心1min，取1μl滤液与1μl 10×Loading Buffer混合后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，剩下离心液于-20℃保存备用，得到回收的目的基因。

(二)实验结果

图4是PCR产物经AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒提纯后的电泳图其中样品为1μl，marker为2μl，由图可见，纯化后目的基因虽然损失了一部分，但明显去除了大部分的杂质。经估算，其含量大概是140ng/μl。

图5是双酶切产物通过DNA凝胶回收试剂盒提纯后的电泳图，其中样品为1μl，marker为5μl。由图可得，pGAPZαA条带较亮，双酶切产物浓度较高，这可能是胶回收损失较少。对比目的基因的回收产物浓度较低，这可能是胶回收过程损失较大，使得酶切产物的丢失。但还是能清晰看出两条目的条带的位置是符合预期的，所以可进行下一步的连接。

四、DNA体外重组

(一)实验方法

1)取2支干净的PCR管按下述配方分别配制目的基因和pGAPZαA的双酶切体系：

表3酶切体系配制：

2)瞬时离心后置于37℃水浴2小时；

3)1％琼脂糖凝胶电泳检测双酶切片段；

4)胶回收；

5)取回收片段各1μl经1％琼脂糖凝胶电泳检测；剩下的胶回收产物于-20℃保存备用。

6)根据琼脂糖凝胶电泳所得条带判断大概相对量，按目的基因：载体＝6:1(摩尔数)来设计连接体系如下表，瞬时离心后置于PCR仪16℃过夜连接。

表4接体系配制：

7)加入2μlE.coli DH5α酶，37℃水浴锅中消除空载体2h，取出备用。

(二)实验结果

构建得到的载体质粒pGAPZαA-anti-HER3-scFv如图6所示。

五、E.coli JMC109感受态制备及化学法转化

(一)实验方法

1)按1％(V/V)量接种E.coli JMC109甘油种于3ml低盐LB培养基，37℃、170rpm过夜活化；

2)按1％(V/V)量转接20ml低盐LB培养基，37℃、170rpm培养2.5h；

3)取1ml于1.5EP管中，取两管，10000rpm离心1min，弃尽上清；

4)在一管中加入5μl上述已制备好的连接产物，在另一管中加入5μl GAP载体(对照组)，混匀；

5)冰上放置30min

6)迅速放入42℃水浴锅中热激90s，再迅速插入冰中3min；

7)加入800μl低盐LB，37℃、170rpm培养1h；

8)10000rpm离心1min，弃去800μl上清液；剩下的用枪头吹打均匀；

9)取混匀液涂布于含0.1％Zeocin的低盐LB平板，37℃培养箱中培养过夜。

(二)实验结果

图7是目的基因与载体连接，通过化学法转化JMC109后涂布于固体培养基3天后看到的结果图片，所用的平板为含有0.1％Zeocin的低盐LB培养基；图上可见，在含Zeocin抗性的选择LB培养基上长出了许多的白色圆形单菌落，与标准的JMC109的形态基本相似，可初步判断目的基因与载体pGAPZαA的连接产物重组载体已成功转化到JMC109中。

图8是从图7挑取长势较好的单菌落化线接种于含有0.5％Zeocin的低盐LB固体培养基得到的结果图，由图可见所挑选的单菌落有一部分长势较好，一部分长势较缓慢，一部分没有生长。这说明在含有0.1％Zeocin的低盐LB培养基上所生长的单菌落中有一部分是高拷贝数的，可在高浓度Zeocin的低盐LB固体培养基上生长。而有一部分是低拷贝或是活性不佳等原因，其生长速度较慢。

六、重组子菌落PCR鉴定

(一)实验方法

1)在1.5EP管中按下述配方配制PCR体系并进行PCR反应：

表5 PCR体系配制：

2)无菌操作下用牙签从转化平板中挑取长势较好的单菌落划线接种于另一新的含0.1％Zeocin低盐LB平板后洗入PCR管，并标记好相应编号；

3)将0.1％Zeocin低盐LB平板置于37℃培养箱中培养，将PCR管置于仪中调节如上PCR条件进行PCR；

4)用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，记录阳性编号；

5)无菌操作下，用牙签从平板中挑取阳性重组子的菌落接入3ml含0.1％Zeocin的低盐LB液体培养基中，37℃、170rpm培养过夜，取1ml送至英基潍捷基因公司测序，剩下的菌液按1:1的比例加入300μl 60％甘油中保种，并置于-20℃保存。

(二)、实验结果

图9是图8中的菌落PCR产物的电泳图，其中样品为1μl，marker为2μl，由9号的阴性对照可看出，根据亮带的位置可知，经菌落PCR鉴定挑选的转化子均阳性转化子。

图10是从图8中挑取的菌株在低盐LB培养基中过夜培养后，经DNA试剂盒法提取的重组质粒电泳图，其中样品为1μl，marker为5μl。由图可知，条带亮度基本相近，说明浓度差别不大，且条带较亮。选取1、2、3和4号菌株所培养出的菌液送至英潍捷基基因公司进行测序，其中1号、2号和4号菌液测序的核苷酸序列与已发表的抗HER3单链抗体基因序列完全一致，说明在转化过程中没有发生突变，且成功转化到JMC109中保存，表明载体构建完成，可进行下一步工作。

实施例2高抗性菌株的获得

一、重组质粒的大量提取、线性化及提纯

(一)、实验方法

1)取经测序确定含目的基因且无碱基突变的实施例1制备的菌种，按1％接种量接种于2ml含0.1％Zeocin低盐LB培养基，于37℃摇床170rpm过夜培养；

2)以1％接种量取300μl过夜培养的菌液接种到30ml含0.1％Zeocin低盐LB培养基，于37℃摇床170rpm过夜培养；

3)过夜培养的30ml菌液用试剂盒方法提取重组质粒；

4)取1μl提纯后的重组质粒经1％琼脂糖凝胶电泳测浓度；

5)按下述配方配制线性化单酶切体系，于37℃水浴酶切3h；

表6线性化酶切体系：

6)取酶切前和酶切后的重组质粒2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；

7)剩下的酶切体系中加入300μl无菌水；

8)加入等体积(500μl)酚氯仿，充分混匀，10000rpm离心5min；

9)小心转移上清于新的2ml离心管，加入1/10体积(50μl)3M PH5.2醋酸钠溶液、2.5倍体积(1250μl)预冷的无水乙醇，混匀，置于-80℃放置2h；

10)4℃10000rpm离心15min，弃上清；

11)加入700μl 75％乙醇清洗，10000rpm离心15min，弃上清；重复一次；

12)完全干燥离心管后，加入10μl无菌水充分溶解质粒；

13)取0.5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测含量，剩余于-20℃保存。

(二)实验结果

图11是重组质粒线性化电泳图，其中线性化前为2μl，线性化后质粒1μl，marker为2μl，图上明显看出，在线性化酶的作用下，质粒被酶切成线性状态，在1％琼脂凝胶电泳中迁移率较慢。表明环形质粒被完全线性化且酶切后质粒条带较亮，浓度较高。

二、X-33感受态制备

1)按1％接种量接种30μl X33甘油种于3ml YPD液体培养基，30℃、170rpm过夜培养至饱和；

2)按0.2％接种2ml饱和菌液至100ml YPD培养基，30℃、170rpm培养7h至OD600＝1.2～1.6；

3)取25ml于50ml离心管，4℃以10000rpm离心2min，无菌操作中小心弃上清，

4)用25ml预冷无菌水重悬细胞，4℃以10000rpm离心2min，无菌操作中小心弃上清

5)加入1ml的处理液悬浮菌体，室温放置20min(处理液：10mM醋酸锂,10mM DTT,0.6M山梨醇，pH7.5的10mM Tris-Hcl)

6)4℃以10000rpm离心2min，弃上清；

7)加入1ml预冷的1M山梨醇，4℃以10000rpm离心2min，弃上清；重复一次

8)加入100μl预冷的悬浮液(悬浮液：0.6M山梨醇，pH7.5的10mM Tris-Hcl)，轻轻吹打菌体均匀，冰浴10min；

9)将细胞悬液分装(80μl/管)，置于冰浴备用。

三、电穿孔转化

(一)实验方法

1)取9μl线性化质粒加入于80μl感受态细胞中，轻轻吹打混匀，转移至预冷的无菌电极杯中，冰浴10min；

2)用基因导入仪进行电击，参数设置：U＝1500，R＝200，C＝25；

3)电击后立刻加入1ml预冷的1M山梨醇，转入1.5mlEP管，于30℃培养箱中培养1h；

4)取100μl菌液均匀涂布于含0.1％Zeocin YPDS平板；

5)30℃培养3～5天。

(二)实验方法

图12可知，电转化后的菌株能在含Zeocin抗性的选择平板上生长，形成单克隆菌落，通过观察菌落形态，可初步说明重组质粒成功转化入X-33中，但固体培养基上菌落数较少，可说明转化效率不高。

四、高拷贝菌落的筛选

(一)实验方法

1)在无菌超净台中，从0.1％Zeocin YPDS平板上挑取长势良好的单菌落接种于含0.5％Zeocin的YPDS平板，并做好对应编号后置于30℃培养箱中培养2～3天；

2)在无菌超净台中，从0.5％Zeocin YPDS平板上挑取长势良好的单菌落接种于含1％Zeocin的YPDS平板，并做好对应编号后置于30℃培养箱中培养2～3天。

(二)实验结果

由图13可知，随机挑取的长势较好的35个单菌落划线在0.5％Zeocin浓度的选择培养基上培养3天后，其中11个菌株生长良好，其他菌株生长较慢。挑取其中长势较好的11个菌株做后续实验。

实施例3抗HER3单链抗体蛋白的表达

一、实验方法

1)从高抗性选择平板上挑取抗性生长的高拷贝菌落接种于3ml YPD培养基，标好对应编号后置于30℃、170rpm培养72h；

2)取100μl菌液10000rpm离心5min；

3)取30μl上清，加入10μl 5×Loading buffer,混匀，沸水浴煮10min，10000rpm离心1min；

4)取10μl上清进行SDS-PAGE电泳鉴定:

准备配胶所需试剂，按说明书组装SDS蛋白电泳玻璃板层与制胶槽；在50mL的烧杯中配制分离胶(分离胶浓度根据目的蛋白的分子量而定，本实验所配胶浓度为12％)；配制好分离胶后用移液器将其加至组装好的玻璃板层中(具体加入的量视实验需要而定，一般加至离短板2cm处即可)，随即用单蒸水补满至短板，待其凝聚后将水倒掉，并用吸水纸吸干多余水分；配制浓缩胶，加入玻璃板层中并插入梳子，待其凝聚后备用。以下为本实验所配制12％的分离胶与5％的浓缩胶配方：

表7分离胶配方：

表8浓缩胶配方：

SDS-PAGE电泳：往上槽中加入电泳缓冲液，室温静置1min后拔出梳子，取10μl样品量加入梳孔中，80V，400mA电泳至分离胶面时换为120V，400mA；直至溴酚蓝至胶底部，电泳结束，约需1.8h。

染色：小心的打开玻璃板，取出凝胶，放入盛有染色液的培养皿中，轻轻摇晃染色1h。用脱色液脱色，直到背景清晰，并将凝胶进行胶扫描、拍照。

二、实验结果

如图14所示，与蛋白质标准分子量相比较，在29.0KDa条带附近，实验组均有条带，阴性对照组没有，而抗HER3单链抗体的蛋白分子量为26640，与预期的目的蛋白基本相符。而且实验组的电泳条带位置基本一致，但是条带的大小及浓度不一致，其中3、6、7、10的条带较浓，可能为高表达。由图还可看出，除了目的蛋白的条带有明显差异之外，实验组及对照组均有表达其他蛋白，在其他不一样的分子量位置有条带的出现，且对照组与实验组间差异不大，说明实验组与对照组除了对目的蛋白的表达出现差异，对其他基因的表达基本相似。总得来说本实验基本实现了抗HER3单链抗体的表达。

实施例4高纯度的抗HER3单链抗体蛋白的获得

一、实验方法

(一)、工程菌的发酵与发酵液的浓缩

1)取保存于甘油的实施例2筛选出的高拷贝菌种30μL接种于3ml含0.1％Zeocin的YPD培养基。30℃，170rpm摇床培养过夜。

2)取2mL过夜培养液转接于200mL YPD培养基，共5瓶，1000mL。30℃，170rpm培育3天。10000rpm离心20min收集发酵上清。

3)将发酵上清转移至大烧杯中，放入电动搅拌棒，调节至200rpm，分多次加入研磨后的硫酸铵固体，至终浓度为50％。

4)将样品放置4℃冰箱，静置过夜。

5)取浓缩过夜的发酵上清，4℃，8000rpm，15min。

6)离心后，弃上清，用300ml缓冲液(20mM PBS pH＝7.4、0.5M(NH₄)₂SO₄)溶解沉淀。用0.45μm的滤膜进行抽滤备用。

(二)、疏水层析纯化

(1)实验方法

1)用5倍柱体积的去离子水洗涤phenyl-sepharose Fast Flow 6疏水层析柱，流速为2ml/min。

2)用5倍柱体积的平衡缓冲液(20mM PBS pH＝7.4，0.5M(NH₄)₂SO₄)，流速为2ml/min。

3)调节基线归零。

4)先做样品的bypass。

5)上样，流速为2ml/min。

6)冲平，用平衡缓冲液冲至基线走平，流速为2ml/min。

7)用洗脱液(10mM Tris-HCl pH＝8.3)进行洗脱，流速为2ml/min。收集洗脱峰样品。

8)用5倍柱体积的NaOH洗涤,流速为2ml/min。

9)用去离子水洗涤柱子至pH＝7，流速为2ml/min。

10)用5倍柱体积的20％乙醇洗涤柱子，流速为2ml/min，并封存。

11)用SDS-PAGE检测纯化效果。

(2)实验结果

图15上方为A通道是280吸附检测峰，下方为B通道是254吸收检测峰。从图可以看的出，洗脱峰(上图右边第二个峰)峰型较高，峰面积较大，洗脱效果较好。此时蛋白质的吸收峰280的数值大于核酸等小分子的吸收峰254的数值，可以判定该洗脱峰为蛋白峰。出峰占据一定时间而且峰宽较大，说明样品通过疏水层析后有一定的纯化效果。

如图16所示，比较柱前样品和洗脱样品的电泳条带，可以明显看到在29KD附近的目的蛋白条带的粗细度和颜色深浅有明显的区别，经过疏水层析的样品中目的蛋白的含量明显增大，说明纯化的结果较好，此条件下的疏水层析对目的蛋白的选择性较好，得到了纯度较高的蛋白样品。同时，在44.3～66.4KD之间有较多的杂蛋白，相比疏水层析柱前的样品和疏水层析柱纯化后的样品，杂蛋白的含量并未有明显的区别，说明此条件下的疏水层析对杂蛋白的去除效果不佳，仍需进行更进一步的纯化。

(三)、镍柱亲和层析纯化

(1)实验方法

1)在上清中加入咪唑至其终浓度为20mM咪唑，用0.45μm滤膜抽滤。

2)过5倍柱体积的去离子水洗涤Ni-NTA亲和层析柱，流速为2ml/min。

3)过5倍柱体积的Stripping buffer(50mM EDTA*2Na，10mM Tris-HCl pH＝8.3，0.5M NaCl)去镍，流速2ml/min。

4)过5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，流速为2ml/min。

5)过5倍柱体积的1M NaOH，流速为2ml/min。

6)过10倍柱体积的dH₂O洗涤柱子至ph＝6，流速为2ml/min。

7)过5倍柱体积的30％异丙醇去脂溶性蛋白，流速为2ml/min。

8)过5倍柱体积的dH₂O洗涤柱子至ph＝6，流速为2ml/min。

9)过5倍柱体积的50mM NiSO₄重新上镍，流速为2ml/min。

10)过5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，流速为2ml/min。

11)过10倍柱体积的平衡缓冲液(10mM Tris-HCl pH＝8.3，0.5M NaCl，20mM咪唑)平衡，流速为2ml/min。

12)先做样品的bypass。

13)上样，流速为2ml/min。

14)冲平，用平衡缓冲液冲至基线走平，流速为2ml/min。

15)用洗脱液(0.25M咪唑，10mM Tris-HCl pH＝8.3)进行洗脱，流速为2ml/min，并收集洗脱峰样品。

16)用5倍柱体积NaOH进行洗涤，流速为2ml/min。

16)用dH₂O洗涤柱子至pH＝7，流速为2ml/min。

17)用5倍柱体积的20％乙醇洗柱子，流速为2ml/min，并封存。

18)SDS-PAGE检测纯化效果。

(2)实验结果

图17上方是A通道是280吸附检测峰，下方是B通道是254吸收检测峰。从图可以看的出，洗脱峰(上图最高峰)峰型尖锐，无杂峰，洗脱效果很好，没有拖尾，后面的平台期是咪唑自身的吸收值。而最右边两个平台期分别是500mM咪唑和1M咪唑自身的吸收值带来的。由此看出，使用含250mM的咪唑的洗脱液可将蛋白质洗脱下来。此时蛋白质的吸收峰280的数值大于核酸等小分子的吸收峰254的数值，可以判定该洗脱峰为蛋白峰。由图可看出，出峰时间很短而且很尖锐，这反映了洗脱出来的蛋白质的浓度很高。

如图18所示，比较未经镍柱纯化的柱前样品和经镍柱纯化后用含250mM咪唑的洗脱液洗脱的样品的电泳条带，可以非常明显的看出在29KD附近的目的蛋白条带在粗细度和颜色深浅有很大的差异。经镍柱纯化后样品的蛋白浓度很高，从电泳图上可判断纯度达95％以上。还可以明显看到在44.3KD附近的杂蛋白条带经镍柱的纯化后，已经被除去。这说明此条件下镍柱的纯化效果很好，得到了很高纯度的蛋白样品。

(四)、G25分子筛纯化

(1)实验方法

1)将用镍柱纯化收集到的洗脱峰样品(10mL)，加入10mL饱和硫酸铵溶液，放置4℃冰箱，静置过夜。

2)4℃，10000rpm，30min，弃上清。

3)用1ml 10mM PBS pH＝7.4溶解沉淀。

4)用3倍柱体积的去离子水洗涤Sephadex G25分子筛柱，流速为2ml/min。

5)用3倍柱体积的平衡缓冲液(10mM PBS pH＝7.4)平衡，流速为2ml/min。

6)将样品用洁净的针筒加到柱子上。

7)收集洗脱峰样品。

8)用3倍柱体积NaOH进行洗涤，流速为2ml/min。

9)用dH₂O洗涤柱子至pH＝7，流速为2ml/min。

10)用3倍柱体积的20％乙醇洗柱子，流速为2ml/min，并封存。

(2)实验结果

获得了含一定浓度的抗HER3-scFv的溶液，可应用到后续的工作中。

实施例5抗HER3单链抗体样品蛋白含量的测定

一、实验方法

1)用BCA试剂盒对样品含量的测定，制作工作液：取2500μl的BCA试剂A，加入50μl的BCA试剂B，混匀备用。

2)制作标准曲线样品：

表9标准蛋白样品制作：

3)制作待测样品：

表10待测样品制作：

4)将标准样品及待测样品各10μL按浓度梯度依次加到96孔板中，每孔加入工作液200μL，放置37℃培养箱20min。

5)用酶标仪测定在570nm吸收值。

6)制作标准曲线及计算待测样品蛋白浓度。

二、实验结果

用酶标仪测出的标准蛋白的浓度为：

表11标准蛋白吸光度值：

用酶标仪测出的待测蛋白的浓度为：

表12样品吸光度值：

将上述数据制作成标准曲线，如图19所示。

由表12的测定数据及图20经过数据分析得到的标准曲线公式，可计算稀释倍数不同的三个样品的蛋白质含量分别为：0.308mg/ml、0.177mg/ml、0.0615mg/ml。分别乘以相应稀释倍数，得到的蛋白质含量为：1.54mg/ml、1.77mg/ml、1.23mg/ml。最终计算平均值得到样品蛋白质浓度含量大约为1.51mg/ml。结合洗脱体积及发酵体积，可计算出目的产物的收率为192mg/L。

由图19可知，本次制作的标准蛋白浓度曲线所得趋势线的方差是0.9926，说明标准曲线制作比较好，准确性较高。但最终三个不同稀释倍数样品算出来的蛋白质浓度的差值较大，这说明在待测蛋白样品制作上产生误差，有可能是由于稀释倍数大，在原样品中的取样量太小，导致有样品残留在枪头上，影响了样品蛋白浓度的测定。

实施例6 Western blot法鉴定抗HER3-scFv的正确表达

一、实验方法

对纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE后，以200mA的电流转移至PDVF膜上，用脱脂奶粉封闭1h，加入HRP标记的抗6×His标签的抗体(1∶5000)，4℃孵育过夜；用PBST洗膜后，超敏ECL化学发光试剂盒显影鉴别。

二、实验方法

对纯化后的目的蛋白抗HER3-scFv进行Western blot鉴定，毕赤酵母菌株X-33空宿主发酵上清经纯化处理样品无反应条带出现，而纯化的目的蛋白有预期大小的单一条带出现，表明抗HER3-scFv得到了正确的表达(图20)。

实施例7 ELISA鉴定抗HER3-scFv与HER3的结合活性

一、实验方法

将人HER3胞外区蛋白稀释至2μg/mL，50μL/孔包被酶标板，4℃放置过夜；次日，PBST洗板后，分成3组，分别加入50μL无菌水、50g/L的脱脂奶粉以及2μg/mL实施例4制备的纯化的抗HER3-scFv，设置3个复孔，37℃孵育1h；洗涤后，加入HRP标记的抗6×His Tag抗体(1∶5000)，室温轻摇1h；PBST洗5次，TMB显色，测定450nm处的吸光度(A450)值。

二、实验结果

将无菌水，脱脂奶粉和纯化后的抗HER3单链抗体分别在人HER3胞外区蛋白包被孔中进行ELISA反应，检测制备的抗HER3-scFv的结合活性。结果显示，抗HER3-scFv与人HER3胞外区反应呈强阳性，吸光度(A450)均值达到0.961±0.057，而无菌水和脱脂奶粉的吸光度均值分别为0.134±0.020和0.256±0.025，表明制备的抗HER3-scFv具有特异的结合活性(图21)。

序列表

<110> 广东药科大学

<120> 一种抗HER3单链抗体的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagagagagg ctgaggctca agttcaattg gttgagtctg gtggtggttt ggttcaacca 60

ggtggttctt tgagattgtc ttgtgctgct tctggtttca ctttctcttc ttacgctatg 120

tcttgggtta gacaagctcc aggtaagggt ttggagtggg tttctgctat caactctcaa 180

ggtaagtcta cttactacgc tgactctgtt aagggtagat tcactatctc tcgtgacaac 240

tctaagaaca ctttgtactt gcaaatgaac tctttgagag ctgaggacac tgctgtttac 300

tactgtgcta gatggggtga cgagggtttc gacatctggg gtcaaggtac tttggttact 360

gtttcttctg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctgacatc 420

caaatgactc aatctccatc ttctttgtct gcttctgttg gtgacagagt tactatcact 480

tgtagagctt ctcaaggtat ctctaactgg ttggcttggt accaacaaaa gccaggtaag 540

gctccaaagt tgttgatcta cggtgcttct tctttgcaat ctggtgttcc atctcgtttc 600

tctggttctg gttctggtac tgacttcact ttgactatct cttctttgca accagaggac 660

ttcgctgttt actactgtca acaatactct tctttcccaa ctactttcgg tcaaggtact 720

aaggttgaga tcaagcacca ccaccaccac cactga 756

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly

145 150 155 160

Ile Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser

210 215 220

Ser Phe Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His

225 230 235 240

His His His His His

245

Claims (9)

1.一种抗HER3单链抗体，其特征在于，其氨基酸如SEQ ID NO：2所示。

2.一种抗HER3单链抗体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1所述抗HER3单链抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1.设计抗HER3单链抗体基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，并合成该基因，并克隆至质粒pGAPZαA中，获得重组质粒；

S2.将重组质粒转化至毕赤酵母，并筛选出高表达菌株；

S3.将筛选出的高表达菌株在液体YPD培养基中进行发酵，获得发酵液并浓缩发酵液；

S4.将浓缩后的发酵液使用phenyl-sepharose Fast Flow 6疏水层析柱，进行疏水层析纯化；

S5.上一步的产物使用Ni-NTA亲和层析柱，进进行镍柱亲和层析纯化；

S6.上一步的产物进行置换缓冲液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，筛选出高表达菌株的方法，包括以下步骤：

S21.将转化菌株接种于含0.1～0.2％Zeocin的YPDS平板，置于28～30℃培养3～5天；

S22.挑取单菌落接种于含0.5～0.6％Zeocin的YPDS平板，置于28～30℃培养2～3天；

S23.挑取单菌落接种于含1.0～1.1％Zeocin的YPDS平板，置于28～30℃培养2～3天；

S24.挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，28～30℃，180～200rpm摇床培养72～74小时，SDS-PAGE检测各菌落抗HER3-scFv的表达量，筛选出高表达菌株。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，发酵的步骤为：

S31.将筛选出的高表达菌株接种于含0.1～0.2％Zeocin的YPD液体培养基，28～30℃，180～200rpm摇床培养12～14小时；

S32.以1:100～200的体积比将上一步的得到的菌液接种到YPD液体培养基，28～30℃，180～200rpm培育2～3天；

步骤S3中，浓缩发酵液步骤为：

S33.取发酵上清液75～100rpm搅拌，分次加入硫酸铵粉末，至终浓度为45～50％；

S34.3～4℃静置12～14h，，固液分离；

S35.弃上清，用缓冲液溶解沉淀，该缓冲液体为含有0.4～0.5M NaCl的pH＝7.4～7.6的20～25mM PBS缓冲液；

S36.0.45μm的滤膜过滤，去除不溶物。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，疏水层析纯化的步骤为：

S41.用5～6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，流速为2.0～2.5ml/min；

S42.以2.0～2.5ml/min的流速进行柱平衡，平衡液为含有0.45～0.50M(NH₄)₂SO₄的pH＝7.4～7.6的20～25mM PBS；

S43.以2.0～2.5ml/min的流速上样；

S44.以2.0～2.5ml/min的流速进行洗脱，洗脱液为10～15mM Tris-HCl pH＝8.3～8.4，收集洗脱峰样品。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中，镍柱亲和层析纯化的步骤为：

S51.将上一步的产物与咪唑混合，使得咪唑的浓度为20～25mM，用0.45μm滤膜，去除不溶物；

S52.平衡柱子；

S53.以2.0～2.5ml/min的流速上样步骤S51的产物；

S54.以2.0～2.5ml/min的流速进行洗脱，洗脱液为含有0.25～0.30M咪唑的pH＝8.3～8.4的10～15mM Tris-HCl，收集洗脱峰样品。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中，筛选G25分子筛纯化的步骤为：

S61.将上一步的产物与等体积饱和硫酸铵溶液混和，3～4℃，静置12～14h；

S62.3～4℃，9000～10000rpm，离心25～30min，弃上清，用原混和体积4～5％的10～15mM PBS pH＝7.4～7.6溶解沉淀；

S63.洗涤并平衡柱子；

S64.以2.0～2.5ml/min的流速上样步骤S62的产物；

S65.上样，收集洗脱峰样品；

其中，步骤S63中，洗涤并平衡柱子的步骤为：

S631.流速为2.0～2.5ml/min，用3～4倍柱体积的去离子水洗涤柱子；

S632.流速为2.0～2.5ml/min，用4～5倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，平衡液为10～15mM pH＝7.4～7.6的PBS。

9.权利要求4所述的筛选出高表达菌株的方法筛选出的高表达菌株。

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