CN109913427B

CN109913427B - 泽泻鲨烯环氧化酶及其应用

Info

Publication number: CN109913427B
Application number: CN201811640584.3A
Authority: CN
Inventors: 谷巍; 吴启南; 巢建国; 张阿琴; 徐飞; 李思蒙; 田方
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109913427A

Abstract

本发明公开了一种泽泻鲨烯环氧化酶及其应用，所述泽泻鲨烯环氧化酶具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本发明首次克隆了泽泻鲨烯环氧化酶基因全长，并提供了一种泽泻鲨烯环氧化酶，以及该酶基因的原核表达方法，并制得了该酶蛋白的多克隆抗体，提供了该蛋白的ELISA检测方法和Western Blot检测方法，本发明可用于提高泽泻原萜烷型三萜生物合成效率及监测药效成分动态积累过程。

Description

泽泻鲨烯环氧化酶及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及泽泻鲨烯环氧化酶及其应用。

背景技术

东方泽泻(Alisma orientale)为泽泻科属的一种植物，其主要药效成分为原萜烷型四环三萜类，该成分具有明显抗高血脂、降血压、抗HIV1等作用，尤其抗癌活性显著，其开发应用前景广阔，但其资源分布窄、含量低，仅存在于泽泻属等少数植物类群中，不能满足利用需求，生物工程是提高药效成分产量的有效途径之一。鲨烯环氧化酶(Squaleneepoxidase,SE)是原帖烷型三萜生物合成的关键酶，可用于研究提高原萜烷型三萜生物合成效率，以适应需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从东方泽泻(Alisma orientale)中获取的鲨烯环氧化酶(Squalene epoxidase)。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种泽泻鲨烯环氧化酶，具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

一种编码所述泽泻鲨烯环氧化酶的基因，具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

所述泽泻鲨烯环氧化酶基因原核表达方法为：构建N端携带有His表达标签的重组表达载体；将重组载体质粒转化至BL21感受态细胞；IPTG诱导载体融合蛋白表达。

本发明还提供了所述泽泻鲨烯环氧化酶的多克隆抗体制备方法，通过原核表达纯化泽泻鲨烯环氧化酶并用免疫家兔制备多克隆抗体。具体为：取纯化蛋白进行BCA蛋白浓度测定，免疫2只新西兰白兔，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，纯化得多克隆抗体，并进行免疫印迹检测。

其中，所述纯化得多克隆抗体步骤为：将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

通过ELISA检测纯化抗体的效价，步骤如下：

①用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将纯化的抗体稀释为20μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜；

②次日每孔加入100μL5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，用pH7.4的PBST洗涤3次；

③每孔加入500～51,200倍稀释的兔抗血清100μL，阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液PBS，每份样品均做1平行，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；

④再次每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后，同上洗涤3次；

⑤每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光反应20min后，每孔再加入50μL 2mol/L硫酸终止液；

⑥在酶标仪上测450nm下的OD值。

Western Blot检测步骤如下：

①分别取200mg泽泻植物组织样品，剪碎加入适量裂解液，裂解液使用前加PMSF，匀浆器匀浆，充分裂解。取上清10μL加入等体积2X样品缓冲液，每个泳道上样20μL；

②上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；

③电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h；

④电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5min。然后置于5％m/V脱脂奶粉封闭液中封闭37℃，1h；

⑤用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1h；

⑥洗膜4次，每次5min；用含5％牛奶的封闭液稀释二抗；膜在二抗中37℃反应1h；

⑦洗膜ECL显影。

本发明还提供了泽泻鲨烯环氧化酶在泽泻原萜烷型三萜生物合成中的应用。

本发明首次克隆了泽泻鲨烯环氧化酶基因全长，并提供了一种泽泻鲨烯环氧化酶，以及该酶基因的原核表达方法，并制得了该酶蛋白的多克隆抗体，提供了该蛋白的ELISA检测方法和Western Blot检测方法，本发明可用于提高泽泻原萜烷型三萜生物合成效率及监测药效成分动态积累过程。

附图说明

图1a是AoSE1蛋白分析图；

图1b是AoSE1蛋白纯化分析图；

图2a是AoSE2蛋白分析图；

图2b是AoSE2蛋白纯化分析图；

图3为AoSE1和AoSE2酶促反应的高效液相色谱分析图谱；其中A：2，3-氧化鲨烯标准品色谱峰图；B：阴性对照；C：AoSE1催化的反应产物色谱图；D：AoSE2催化的反应产物色谱图；

图4是AoSE1、AoSE2多克隆抗体的Western Blot鉴定；

图5为泽泻块茎不同生长期AoSE表达水平分析；其中A：泽泻块茎不同生长期AoSE1mRNA表达水平分析；B：泽泻块茎不同生长期AoSE2mRNA表达水平分析；C:AoSE1在泽泻不同生长期的蛋白表达水平分析；D:AoSE2在泽泻不同生长期的蛋白表达水平分析；

图6是泽泻块茎不同生长期23-乙酰泽泻醇B的含量分析；

图7是MeJA诱导处理前后泽泻中AoSE1，AoSE2和23-乙酰泽泻醇B含量变化，**P<0.01。

具体实施方式

下面结合附图说明和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1

本实施例具体说明本发明泽泻鲨烯环氧化酶的全长克隆方法。

泽泻采自道地产区福建建瓯种植基地，经南京中医药大学谷巍教授鉴定为泽泻科植物东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep。采集后移植至南京中医药大学花房，待植株生长稳定后，取新鲜取叶片分装于冻存管中，在液氮中保存备用。

1.1泽泻总RNA的提取及检测

总RNA的提取按照Tiangen公司总RNA提取试剂盒(批号：DP419)操作步骤进行：

①取植物组织100mg，转移至预冷的研钵中，在液氮中研成粉末；

②在粉末中加入1mL裂解液，待完全裂解成透明液体后，将液体转移至离心管内；

③于离心管内加入200μL氯仿，剧烈震荡15sec，静置3min，12000g离心10min；

④离心后，液体分为三层，将最上层的水相转移至新的离心管内，加入0.5倍体积的无水乙醇，轻柔的混匀，此时可能会出现沉淀；

⑤将制备管放入2mL离心管中，然后将液体和沉淀一起移至制备管内，12000g离心30sec；

⑥弃滤液，加入500μL去蛋白液，室温静置1min，12000g离心30sec；

⑦弃滤液，加入500μL Washing Buffer，室温静置1min，12000g离心30sec；

⑧弃滤液，加入700μL Washing Buffer，室温静置1min，12000g离心30sec；

⑨弃滤液，12000g离心2min；

⑩将制备管放入一个新的离心管中，加30μL双蒸水，室温静置1min，12000g离心2min，即可得到RNA。

用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像系统观察拍照，并用Eppendorf蛋白核酸分析仪检测RNA纯度和浓度。

1.2cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)

根据泽泻AoSE1，AoSE2基因保守区序列，设计5'RACE和3'RACE特异引物SF1、SF2和SR1、SR2，见表1，利用Clontech公司SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒扩增该基因的cDNA 5′端和3′端。

5′RACE以5′RACE-ready first-strand cDNA为模板，按照BD Advantage2PCR kit操作，反应条件为：94℃30s，68℃30s，72℃3min，35个循环；72℃10min；4℃终止反应。3′RACE以3′RACE-ready first-strand cDNA为模板操作，反应条件为：94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，30个循环；72℃10min，4℃终止反应。产物由上海生工生物工程有限公司进行测序。

表1文中引物序列表

1.3AoSE基因全长克隆验证

根据拼接结果设计AoSE全长引物，包括AoSE1全长引物SF3、SF4和和AoSE2全长引物SR3、SR4(见表1)。

以5`RACE Ready cDNA为模板，采用扩增长片段效率较高的rTaq酶进行扩增，反应体系和反应条件如下：

反应程序为：95℃变性3min，然后95℃30s，56℃60s，72℃120s，循环30次，再72℃延伸5min。将以上获得的PCR扩增产物经1.0％的琼脂糖电泳后，分别割胶、用DNA胶回收试剂盒纯化回收。连入pMD19-T载体(购自Takara)，大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存。对转化子进行蓝白斑筛选。挑取白斑质粒，提取质粒DNA进行酶切鉴定，获得带有目的PCR产物的阳性克隆质粒，测序由上海生工完成。

1.4序列分析

将所测定的序列结果通过BLAST搜索NCBI的蛋白质和核苷酸数据库，并通过DNAMAN软件翻译成氨基酸序列。

将拼接获得的AoSE基因全长cDNA序列用NCBI的BLAST程序进行cDNA全长完整性验证。AoSE的开放阅读框(ORF)查找与相应的氨基酸序列翻译使用ORF Finder。测序结果与验证结果一致。以泽泻叶片总RNA反转录的cDNA为模板，用简并引物从泽泻中克隆得423bp的SE基因保守区序列，运用快速cDNA末端扩增(RACE)技术，克隆了泽泻AoSE1cDNA全长为2157bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有1个1563bp的开放阅读框，编码520个氨基酸的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；AoSE2cDNA全长为1948bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，含有1个1566bp的开放阅读框，编码521个氨基酸的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述序列已登录GenBank，同时已向GenBank申请不公开序列。

实施例2

本实施例说明本发明基因的原核表达方法。

2.1载体构建：根据泽泻AoSE1、AoSE2序列分别设计表2所示引物(SF5，SR5；SF6，SR6)，将SE克隆进pGHn载体，反应体系和程序如下：

表2文中引物序列表

反应体系为：

反应程序：94℃5min；94℃30sec，54℃30sec，72℃1min，30cycles；72℃1min。

PCR产物与Loading Buffer混匀后上样于1％琼脂糖凝胶中，在凝胶成像系统中检测目的条带。目的片段的回收、连接、PCR鉴定及克隆测序。将基因AoSE ORF克隆进pCzn1表达载体的NdeI和XhoI之间，目标基因融合了6X his标签蛋白，获得pCzn1-AoSEs质粒。

载体构建及鉴定方法如下：利用PCR引入酶切位点的方法，将泽泻AoSE1cDNA插入到原核表达载体pCzn1的KpnI和XbaI酶切位点之间，获得了N端携带有His表达标签的重组表达载体pCzn1-AoSE1，提取质粒，酶切验证，获得了一条1500bp大小的DNA片段和一条约5000bp的载体片段，与预期大小一致；将泽泻AoSE2cDNA插入到原核表达载体pCzn1的KpnI和EcoRI酶切位点之间，获得了N端携带有HIS6表达标签的重组表达载体pCzn1-AoSE2，提取质粒，酶切验证，获得了一条1500bp大小的DNA片段和一条约5000bp的载体片段，与预期大小一致；测序结果显示，重组表达载体pCzn1-AoSE1、pCzn1-AoSE2插入的序列与克隆的泽泻AoSE1、AoSE2基因序列完全一致，为预期的AoSE1、AoSE2编码序列，表明获得了正确的重组原核表达载体pCzn1-AoSE1、pCzn1-AoSE2。

2.2将重组质粒转化至BL21感受态细胞：

①将上一步质粒pCzn1-AoSE 1μL加入100μL感受态细胞TOP10中，于冰上放置20min；

②42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μL 37℃预热的LB液体培养基；

③混匀后于37℃，220rpm振摇1h，离心后，在超净工作台上全部涂布于含50μg/mLAmp的LB平板，并于37℃培养箱倒置培养过夜。

2.3IPTG诱导pCzn1-AoSE载体融合蛋白的表达

①挑取转化平板上的单克隆接种于含50g/mL Amp的3mL LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；

②次日按1:100接种于50g/mL Amp的30mL LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)；

③取出1mL培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

④向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM，11℃220rpm振摇12h，诱导SE融合蛋白表达；

⑤取出1mL培养物，12,000g室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。

⑥取上清作为样品，进行10％SDS-PAGE电泳分析。

2.3包涵体蛋白的纯化

①将1.6L诱导表达的培养菌液低温离心10,000g，20min，菌体沉淀重悬与20mLlysis buffer(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSF and bacteria proteaseinhibitor cocktail，pH8.0)，超声破碎(功率400W，工作4s，间歇8s，共20min)；

②将超声破碎的细胞裂解液4℃10,000g离心20min，收集沉淀；

③使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；

④用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素pH8.0)，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，15,000rpm离心15min；

⑤将包涵体溶解液滴加到20mM Tris，pH8.0缓冲液逐步成倍梯度稀释，缓慢搅拌；至尿素浓度达到0.5M时，将蛋白溶液装入透析袋于4℃在20mM PBS，pH7.4中透析过夜。

⑥进行10％SDS-PAGE分析。

将IPTG诱导后的菌体经超声破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，在56.36kD处出现一条预期大小的特异性条带(图1a-b)，同时在56.07KD处出现一条预期大小的特异性条带(图2a-b)，与预测的蛋白分子量相吻合，表明已表达出融合蛋白AoSE1、AoSE2，且目标蛋白存在于沉淀中，为包涵体蛋白。通过稀释和透析相结合的变复性方式，重溶获得了目标纯化蛋白。

实施例3

本实施例说明AoSE1和AoSE2酶的功能验证。

为了验AoSE1和AoSE2的催化功能，建立体外酶促反应体系。

反应体系为500μl：0.1mM DTT，25mM MgCl₂，490μM鲨烯，0.14mM NADPH，0.5％Triton X-100，1mM FAD，10μL目的蛋白，加入Tris-HCl(PH 7.4)至500μL反应体系，25℃温育反应20h，在每个试管中加入15％KOH/MeOH终止实验反应，等体积正己烷萃取2次，用于含量测定。阴性对照组相同的条件下进行，但使用提取携带空载体大肠杆菌。

采用HPLC对代谢产物进行定性分析，色谱条件：YMC C₁₈色谱柱(5μm,4.6×250mm)。流动相：(A相：水，B相：乙腈)；洗脱程序：0–20min,25％–65％B；20–40min,65％–85％B；40–50min,85％B；50–60min,85-95％B；检测器：UV检测器；检测波长：220nm；流速：1mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL。

结果如图3所示，通过比对对照品图峰，确定催化反应产物为2，3-氧化鲨烯，表明AoSE1和AoSE2均具有催化鲨烯产生2，3-氧化鲨烯的功能。

实施例4

本实施例说明AoSE酶的抗体制备与Western Blot检测方法。

(1)动物免疫

将实施例2获取的蛋白进行BCA蛋白浓度测定，免疫2只新西兰白兔(2-2.5Kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，共免疫4次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。

(2)抗体纯化

将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

(3)纯化抗体浓度测定(96孔酶标板法测定)

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定，具体步骤如下：

①BCA工作液配制：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

②根据需要取适量BSA蛋白标准，加入去离子水稀释成1mg/mL(原液5mg/mL)，并混匀。

③标准曲线绘制，工作线性范围为50-1000μg/mL。

④振荡混匀后，37℃放置30min。

⑤用酶标仪测定562nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收值为空白对照。

⑥以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。

⑦样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取20μL样品，加入200μLBCA工作液，混匀后37℃放置30min，然后以A号孔为对照，测定样品吸收值A562。

⑧根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。

⑨计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积20μL，再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定，BCA法测定所得抗体浓度为0.68mg/mL、0.9mg/mL。

(4)纯化抗体的效价检测

通过ELISA检测纯化抗体的效价，具体步骤如下：

①用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将纯化的抗体稀释为20μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。

②次日每孔加入100μL5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，用pH7.4的PBST洗涤3次。

③然后每孔加入500～51,200倍稀释的兔抗血清100μL，阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液(PBS)，每份样品均做1平行，37℃孵育1h后，同上洗涤3次。

④再次每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后，同上洗涤3次。

⑤每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光反应20min后，每孔再加入50μL 2mol/L硫酸终止液。

⑥在酶标仪上测450nm下的OD值。

效价即样品OD值/空白OD值≥2.1的最高稀释度，纯化抗体效价大于512K。

(5)纯化抗体的纯度观察

通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。抗体纯化后纯度在95％以上。

(6)Western Blot检测

①分别取200mg泽泻植物组织样品，剪碎加入适量裂解液(使用前加PMSF)，匀浆器匀浆，充分裂解。取上清10μL加入等体积2X样品缓冲液，每个泳道上样20μL。

②上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。

③电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h。

④电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5min。然后置于5％(m/V)脱脂奶粉封闭液中封闭37℃，1h。

⑤用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1h。

⑥洗膜4次，每次5min；用含5％牛奶的封闭液稀释二抗(羊抗兔-HRP)。膜在二抗中37℃反应1h。

⑦洗膜ECL显影。

结果表明，以纯化蛋白制备的抗血清可特异性与泽泻块茎部位的体内蛋白进行特异性结合，AoSE2在泽泻块茎中的表达量较AoSE1略大。如图4所示。

实施例5

本实施例具体说明本发明的技术方案在生产实践中的一种具体应用方式。在实际种植过程中，通过检测不同生长阶段泽泻鲨烯环氧化酶AoSE1和AoSE2的表达量及药效成分23-乙酰泽泻醇B的含量，并分析其相关性，从而监测药效成分动态积累过程，指导生产实践，说明AoSE酶的应用方式和应用前景。

5.1研究AoSE基因在泽泻不同生长时期中的表达状况。

根据保守区序列设计表3所示引物，采用QRT-PCR、Western Blot检测不同生长期泽泻的块茎中AoSE1、AoSE2mRNA、蛋白水平相对表达量。

5.1.1QRT-PCR

用ABI7500实时荧光定量PCR仪，以泽泻18S为内参基因，根据泽泻AoSE1、AoSE2序列设计表3所示的荧光定量引物，检测样品AoSE1、AoSE2基因相对表达量，引物由合成。

表3引物序列表

提取泽泻RNA，去除基因组DNA，在RNase free的离心管中配制如下混合液：4×gDNA wiper Mix 2μL，模板(RNA)500ng，RNase free ddH2O 10μL，用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。反转录反应：5×qRT SuperMixII 2μL，第一步的反应液8μL。反转录反应条件的设置：25℃10min，42℃30min，85℃5min。荧光定量PCR反应体系：

荧光定量PCR扩增条件的设置：

扩增曲线：94℃30s；94℃10s，60℃12s，72℃30s循环45次，72℃单点检测信号。

溶解曲线：95℃0s，65℃15s，95℃0s，连续检测信号。

5.1.2Western Blot

用蛋白抽提试剂盒提取不同时期泽泻块茎蛋白；SDS-PAGE电泳将总蛋白通过BSA法定量，以确定每个样品的上样体积，电泳后，用考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后观察蛋白条带，以确定最佳电泳条件；Western印迹确定最佳电泳条件后，于该条件下跑电泳，取出凝胶用半干式电转移槽转移2小时，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，一抗4℃孵育6h，二抗室温孵育2h，ECL显色，观察结果。以膜反应的第二抗体稀释液在37℃1h，β-actin作为参考，通过增强化学发光(ECL)研制的试剂(圣克鲁斯生物)，密度使用ImageJ软件进行量化比较。

结果如图5所示，可以看出AoSE mRNA、蛋白水平在块茎相对表达量在10月至12月上旬相对表达量均呈上升趋势，后下降。

5.2研究泽泻中2,3-乙酰泽泻醇B在不同生长阶段的表达状况。

2,3-乙酰泽泻醇B是东方泽泻的主要活性成分，也是其质量评价的指标性成分。采用高效液相色谱法测定块茎中2,3-乙酰泽泻醇B在不同生长阶段的含量。

取不同时期泽泻块茎新鲜样品洗净，真空干燥，粉碎，精密称取泽泻样品粉末(过40目筛)2.000g置100mL具塞锥形瓶中，加乙腈10mL，超声提取20min，滤过；残渣加乙腈10mL同法提取(每次超声提取后称质量并补足减失的质量)，滤过，合并滤液，定容至50ml。过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。泽泻对照品：23-乙酰泽泻醇B标准品由南京中医药大学药学院彭国平研究员提供。水为双蒸水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

色谱柱：LichrospherC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)(汉邦科技有限公司)；体积流量：0.8mL/min；柱温为30℃；流动相：乙腈-水(75:25)；检测波长208nm；检测样片量：20μL。根据对照品峰面积计算泽泻块茎中23-乙酰泽泻醇B的含量。

结果如图6所示，可以看出，不同生长期的2,3-乙酰泽泻醇B表达变化与不同生长期的AoSEs基因表达变化基本一致。

5.3相关性分析

将以上研究结果通过和网络数据比对及SPSS19.0统计软件，分析泽泻成分23-乙酰泽泻醇B含量与关键酶基因AoSE1、AoSE2表达量之间的相关性，结果如表4所示。

表4泽泻AoSE基因表达量与23-乙酰泽泻醇B的含量的相关性分析

*相关系数0.05水平上显著

可以看出，泽泻成分23-乙酰泽泻醇B含量与关键酶基因AoSE1、AoSE2表达量显著相关。

实施例6

本实施例具体说明本发明的技术方案在生产实践中的另一种具体应用方式。在实际种植过程中，通过定期施加诱导子，调控合成原帖烷型三萜的主要合成路径-甲羟戊酸途径，提高了泽泻鲨烯环氧化酶的表达量，从而提高泽泻药效成分23-乙酰泽泻醇B的含量。

本实施例中用0.3mmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)进行诱导，喷施泽泻叶面，每个处理重复5次，于喷施后7d用Western Blot检测方法检测鲨烯环氧化酶AoSE1和AoSE2在蛋白水平的表达量，用HPLC检测23-乙酰泽泻醇B的含量。结果如图7所示，由于MeJA诱导后泽泻中AoSE1和AoSE2表达量显著上升，23-乙酰泽泻醇B的含量明显升高，是对照组的1.51倍。

序列表

<110> 南京中医药大学

<120> 泽泻鲨烯环氧化酶及其应用

<130> xb18122904

<141> 2018-12-29

<150> 201711487375.5

<151> 2017-12-29

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2157

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> CDS

<222> (304)..(1866)

<400> 1

ctcgagttag gggatctacc cctgctgttc cagcgtgttc ggagggacaa agaagggcct 60

tgctgcggcg gcccttccga ggttgaaggt accgacggtg tccggtgatc agcttaagca 120

gccgcccttg ccccttcgtc cactgggcaa cccgcctgca gccacggcga ggttggcggc 180

gtgggtgaac gggttggagg agttctaacg aggcgggcgc gttgaaaccg cagctaacta 240

cagctacttg cagccaacgg caaactctgc gcttggaaaa ggagactgga ccctgaggct 300

gtc atg gtg aca atc cct ttc ctc ctc cag tgc ctc ctg gcc ggg 345

Met Val Thr Ile Pro Phe Leu Leu Gln Cys Leu Leu Ala Gly

1 5 10

tcg ctt gca gcc ttc att gcc tat ctg ttc gtg cgg ccg cgg ccc acg 393

Ser Leu Ala Ala Phe Ile Ala Tyr Leu Phe Val Arg Pro Arg Pro Thr

15 20 25 30

agg aaa gag ctg cat ggg gtg aac ggt ggt ctg tct tct gct gat aag 441

Arg Lys Glu Leu His Gly Val Asn Gly Gly Leu Ser Ser Ala Asp Lys

35 40 45

gcg ctg att caa ggg aaa gat ggc gat aca gac atc ctc att gtc ggc 489

Ala Leu Ile Gln Gly Lys Asp Gly Asp Thr Asp Ile Leu Ile Val Gly

50 55 60

gcc gga gtg gcc ggc tcg gcg cta gcc tac acg cta gga aag gac ggc 537

Ala Gly Val Ala Gly Ser Ala Leu Ala Tyr Thr Leu Gly Lys Asp Gly

65 70 75

cgc cga gtg cgc gtc atc gag agg gac ctc acc gag ccc gac agg atc 585

Arg Arg Val Arg Val Ile Glu Arg Asp Leu Thr Glu Pro Asp Arg Ile

80 85 90

gtc ggg gag ctg ctt cag ccg gga gga tac ctc aag ctc atc gaa ttg 633

Val Gly Glu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Tyr Leu Lys Leu Ile Glu Leu

95 100 105 110

ggc ctc gag gat tgc gtc caa gag atc gat gcc cag cgt gtc cat ggc 681

Gly Leu Glu Asp Cys Val Gln Glu Ile Asp Ala Gln Arg Val His Gly

115 120 125

tac gct ctg ttc aag gac ggg agg agc acc aaa atg gcg tac cca ttg 729

Tyr Ala Leu Phe Lys Asp Gly Arg Ser Thr Lys Met Ala Tyr Pro Leu

130 135 140

gag aat ttc gac tct gat gtt gca ggt agg agc ttc cac cat ggg cga 777

Glu Asn Phe Asp Ser Asp Val Ala Gly Arg Ser Phe His His Gly Arg

145 150 155

ttc ata gag agg ctc agg gag aaa gct gca tcg ctt ccc aat gtt act 825

Phe Ile Glu Arg Leu Arg Glu Lys Ala Ala Ser Leu Pro Asn Val Thr

160 165 170

ttg gaa gag ggg aca gtg aca tcc ttg att gat gat aat ggg act att 873

Leu Glu Glu Gly Thr Val Thr Ser Leu Ile Asp Asp Asn Gly Thr Ile

175 180 185 190

aag ggg gtc tca tac aag agc aaa act ggt gaa gag tcc aag gca tat 921

Lys Gly Val Ser Tyr Lys Ser Lys Thr Gly Glu Glu Ser Lys Ala Tyr

195 200 205

gcg cct ctc acg att gtc tgt gat gga tgc ttc tca aat ctg agg aga 969

Ala Pro Leu Thr Ile Val Cys Asp Gly Cys Phe Ser Asn Leu Arg Arg

210 215 220

gtt ctt tgc tcc gca aag gta gac atc ccc tct tgt ttt gtt ggc ttg 1017

Val Leu Cys Ser Ala Lys Val Asp Ile Pro Ser Cys Phe Val Gly Leu

225 230 235

gtg ctg gag aat tgc gaa ctt ccc tac cca aat cat ggc cac gtc atc 1065

Val Leu Glu Asn Cys Glu Leu Pro Tyr Pro Asn His Gly His Val Ile

240 245 250

ttg gcc gac cca tct ccg atc ctg ttc tac ccc atc agt acc acg gag 1113

Leu Ala Asp Pro Ser Pro Ile Leu Phe Tyr Pro Ile Ser Thr Thr Glu

255 260 265 270

gtt cgc tgc ttg gtc gat gtt cca ggc cag aag tta ccg tcc att gca 1161

Val Arg Cys Leu Val Asp Val Pro Gly Gln Lys Leu Pro Ser Ile Ala

275 280 285

aag ggg gag atg act act tac ttg aaa acc gtc gtg gca cct cag ctc 1209

Lys Gly Glu Met Thr Thr Tyr Leu Lys Thr Val Val Ala Pro Gln Leu

290 295 300

cca gaa gaa ctg cac aac tct ttt gta gca gct gtt gat aag ggt gac 1257

Pro Glu Glu Leu His Asn Ser Phe Val Ala Ala Val Asp Lys Gly Asp

305 310 315

atc aga tca atg ccc aac agg agc atg cca gca tct cct tat ccg act 1305

Ile Arg Ser Met Pro Asn Arg Ser Met Pro Ala Ser Pro Tyr Pro Thr

320 325 330

ccc ggt gct ctg ctc atg gga gat gcg ttc aat atg cgc cat cct ctg 1353

Pro Gly Ala Leu Leu Met Gly Asp Ala Phe Asn Met Arg His Pro Leu

335 340 345 350

aca gga ggt ggg atg aca gtg gca ctg tcc gac gtt gta gtc ttg aac 1401

Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Ala Leu Ser Asp Val Val Val Leu Asn

355 360 365

aat ctt ctg aag ccg ctg cgt gat ctg aat gat gca tca tcc ctg tgc 1449

Asn Leu Leu Lys Pro Leu Arg Asp Leu Asn Asp Ala Ser Ser Leu Cys

370 375 380

aac tac ctg gaa tct ttc tac aca ttg cgg aag ccg gtg gca tcc aca 1497

Asn Tyr Leu Glu Ser Phe Tyr Thr Leu Arg Lys Pro Val Ala Ser Thr

385 390 395

ata aac acc ttg gcc ggt gca cta tac aag gtc ttc tgc gcc tca cca 1545

Ile Asn Thr Leu Ala Gly Ala Leu Tyr Lys Val Phe Cys Ala Ser Pro

400 405 410

gat cag gca atg aag gag atg cgt caa gca tgc ttc gac tac ctg agc 1593

Asp Gln Ala Met Lys Glu Met Arg Gln Ala Cys Phe Asp Tyr Leu Ser

415 420 425 430

ctt ggt ggc gtc ttt tca aat ggt cca gta gca ttg ctc tca ggt ctt 1641

Leu Gly Gly Val Phe Ser Asn Gly Pro Val Ala Leu Leu Ser Gly Leu

435 440 445

aac cct cga ccg tta agc ttg gtc acc cat ttc ttt gct gtt gca ata 1689

Asn Pro Arg Pro Leu Ser Leu Val Thr His Phe Phe Ala Val Ala Ile

450 455 460

tac ggt gtt ggt cgc ctg ctg gtt cct ttt cct tcc ccg aaa cgc ata 1737

Tyr Gly Val Gly Arg Leu Leu Val Pro Phe Pro Ser Pro Lys Arg Ile

465 470 475

tgg atc ggt att cga ctg cta aca gga gca tcg agc ata ata ttg ccc 1785

Trp Ile Gly Ile Arg Leu Leu Thr Gly Ala Ser Ser Ile Ile Leu Pro

480 485 490

atc att aaa gca gaa ggg atc aga caa atg ttt ttc cca gcc acg gta 1833

Ile Ile Lys Ala Glu Gly Ile Arg Gln Met Phe Phe Pro Ala Thr Val

495 500 505 510

cca tcc tac tac aga gct cct cca gtc aat tga aagatgaaag agcacgatgc 1886

Pro Ser Tyr Tyr Arg Ala Pro Pro Val Asn

515 520

gtggggggcg agaggcagtc ttggagaccc ggatttttgt tgtacaatga ctattatgat 1946

gtaatttctg tattccttct acggtcacct caaccaccat ctgtaagccg ttagtgcaca 2006

ttgtttctta catttgtctg ggcatctgtt tcgtggttac tggctgcttt gtacatccat 2066

ttgttagacc cttttgttaa cggtgctcta aataaaactc tagcagctga ctgctgacat 2126

tcaagtaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2157

<210> 2

<211> 520

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Val Thr Ile Pro Phe Leu Leu Gln Cys Leu Leu Ala Gly Ser Leu

1 5 10 15

Ala Ala Phe Ile Ala Tyr Leu Phe Val Arg Pro Arg Pro Thr Arg Lys

20 25 30

Glu Leu His Gly Val Asn Gly Gly Leu Ser Ser Ala Asp Lys Ala Leu

35 40 45

Ile Gln Gly Lys Asp Gly Asp Thr Asp Ile Leu Ile Val Gly Ala Gly

50 55 60

Val Ala Gly Ser Ala Leu Ala Tyr Thr Leu Gly Lys Asp Gly Arg Arg

65 70 75 80

Val Arg Val Ile Glu Arg Asp Leu Thr Glu Pro Asp Arg Ile Val Gly

85 90 95

Glu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Tyr Leu Lys Leu Ile Glu Leu Gly Leu

100 105 110

Glu Asp Cys Val Gln Glu Ile Asp Ala Gln Arg Val His Gly Tyr Ala

115 120 125

Leu Phe Lys Asp Gly Arg Ser Thr Lys Met Ala Tyr Pro Leu Glu Asn

130 135 140

Phe Asp Ser Asp Val Ala Gly Arg Ser Phe His His Gly Arg Phe Ile

145 150 155 160

Glu Arg Leu Arg Glu Lys Ala Ala Ser Leu Pro Asn Val Thr Leu Glu

165 170 175

Glu Gly Thr Val Thr Ser Leu Ile Asp Asp Asn Gly Thr Ile Lys Gly

180 185 190

Val Ser Tyr Lys Ser Lys Thr Gly Glu Glu Ser Lys Ala Tyr Ala Pro

195 200 205

Leu Thr Ile Val Cys Asp Gly Cys Phe Ser Asn Leu Arg Arg Val Leu

210 215 220

Cys Ser Ala Lys Val Asp Ile Pro Ser Cys Phe Val Gly Leu Val Leu

225 230 235 240

Glu Asn Cys Glu Leu Pro Tyr Pro Asn His Gly His Val Ile Leu Ala

245 250 255

Asp Pro Ser Pro Ile Leu Phe Tyr Pro Ile Ser Thr Thr Glu Val Arg

260 265 270

Cys Leu Val Asp Val Pro Gly Gln Lys Leu Pro Ser Ile Ala Lys Gly

275 280 285

Glu Met Thr Thr Tyr Leu Lys Thr Val Val Ala Pro Gln Leu Pro Glu

290 295 300

Glu Leu His Asn Ser Phe Val Ala Ala Val Asp Lys Gly Asp Ile Arg

305 310 315 320

Ser Met Pro Asn Arg Ser Met Pro Ala Ser Pro Tyr Pro Thr Pro Gly

325 330 335

Ala Leu Leu Met Gly Asp Ala Phe Asn Met Arg His Pro Leu Thr Gly

340 345 350

Gly Gly Met Thr Val Ala Leu Ser Asp Val Val Val Leu Asn Asn Leu

355 360 365

Leu Lys Pro Leu Arg Asp Leu Asn Asp Ala Ser Ser Leu Cys Asn Tyr

370 375 380

Leu Glu Ser Phe Tyr Thr Leu Arg Lys Pro Val Ala Ser Thr Ile Asn

385 390 395 400

Thr Leu Ala Gly Ala Leu Tyr Lys Val Phe Cys Ala Ser Pro Asp Gln

405 410 415

Ala Met Lys Glu Met Arg Gln Ala Cys Phe Asp Tyr Leu Ser Leu Gly

420 425 430

Gly Val Phe Ser Asn Gly Pro Val Ala Leu Leu Ser Gly Leu Asn Pro

435 440 445

Arg Pro Leu Ser Leu Val Thr His Phe Phe Ala Val Ala Ile Tyr Gly

450 455 460

Val Gly Arg Leu Leu Val Pro Phe Pro Ser Pro Lys Arg Ile Trp Ile

465 470 475 480

Gly Ile Arg Leu Leu Thr Gly Ala Ser Ser Ile Ile Leu Pro Ile Ile

485 490 495

Lys Ala Glu Gly Ile Arg Gln Met Phe Phe Pro Ala Thr Val Pro Ser

500 505 510

Tyr Tyr Arg Ala Pro Pro Val Asn

515 520

<210> 3

<211> 1948

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> CDS

<222> (87)..(1652)

<400> 3

agacgtcccc ggaccaattg cacacaccct caatcccccc cgcgtccttc cctttgctct 60

ctcgttctcc actcctgccc tcaggg atg gtt gcg ctc ccg ctc ctc ctc cag 113

Met Val Ala Leu Pro Leu Leu Leu Gln

1 5

tgc ctc ctg gcc gga tcc gta gcg gcg gtg ctc gct tac ctc ctc ctc 161

Cys Leu Leu Ala Gly Ser Val Ala Ala Val Leu Ala Tyr Leu Leu Leu

10 15 20 25

ccg cgg cag cgg ccc acg agg aaa gag ccg cac gga gtg ggc acc gtc 209

Pro Arg Gln Arg Pro Thr Arg Lys Glu Pro His Gly Val Gly Thr Val

30 35 40

ctg tcg gcg gca ggg aac gtg cct gct caa ggt ggg gat gcc gac gcc 257

Leu Ser Ala Ala Gly Asn Val Pro Ala Gln Gly Gly Asp Ala Asp Ala

45 50 55

gac gtc ctc att gtt ggc gcc ggg gta gct gga gca gcg ctc gcg tat 305

Asp Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Ala Tyr

60 65 70

acg cta gga aag gac ggc cgc cgc gtg cgt gtc atc gag agg gac ctc 353

Thr Leu Gly Lys Asp Gly Arg Arg Val Arg Val Ile Glu Arg Asp Leu

75 80 85

gcc cag cca gac agg atc gtc ggg gag ctg cta cag cca gga gga tac 401

Ala Gln Pro Asp Arg Ile Val Gly Glu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Tyr

90 95 100 105

ctc aag ctc gtc gag tta gga ctt gag gac tgt gtg gaa gag atc gat 449

Leu Lys Leu Val Glu Leu Gly Leu Glu Asp Cys Val Glu Glu Ile Asp

110 115 120

gcc cag cga gtt cac ggc tac gct cta ttc aaa gac ggg agg aac acc 497

Ala Gln Arg Val His Gly Tyr Ala Leu Phe Lys Asp Gly Arg Asn Thr

125 130 135

aaa gtc gct tac ccg ctc gaa agc ttc gac tcg gat gtc gca ggg agg 545

Lys Val Ala Tyr Pro Leu Glu Ser Phe Asp Ser Asp Val Ala Gly Arg

140 145 150

agc ttc cac cac ggc cgc ttc ata cag aga ctc agg gag aaa gca gcc 593

Ser Phe His His Gly Arg Phe Ile Gln Arg Leu Arg Glu Lys Ala Ala

155 160 165

tcg ctt ccc aat gtc agg ttg gag caa gga act gtg aca tcc tta att 641

Ser Leu Pro Asn Val Arg Leu Glu Gln Gly Thr Val Thr Ser Leu Ile

170 175 180 185

gat gac aat ggg aca gtc aag ggg gca aca tac aag aag aaa gac ggt 689

Asp Asp Asn Gly Thr Val Lys Gly Ala Thr Tyr Lys Lys Lys Asp Gly

190 195 200

gaa gaa tcc aag gca tat gca cct ctc act att gtt tgt gat ggt tgc 737

Glu Glu Ser Lys Ala Tyr Ala Pro Leu Thr Ile Val Cys Asp Gly Cys

205 210 215

ttc tcc aat ctg cgg aaa gga ctg tgc tct gca aag gta gac gtt cct 785

Phe Ser Asn Leu Arg Lys Gly Leu Cys Ser Ala Lys Val Asp Val Pro

220 225 230

tcc tgc ttt gtg ggt tta gtt cta gag aac tgc caa ctg ccc cac cca 833

Ser Cys Phe Val Gly Leu Val Leu Glu Asn Cys Gln Leu Pro His Pro

235 240 245

aat cat ggc cat gtt atc ttg gca gac ccg tca ccc atc ctg ttc tac 881

Asn His Gly His Val Ile Leu Ala Asp Pro Ser Pro Ile Leu Phe Tyr

250 255 260 265

cca atc agt agc acg gag gtc cgc tgc ttg gta gat gtt cca gga caa 929

Pro Ile Ser Ser Thr Glu Val Arg Cys Leu Val Asp Val Pro Gly Gln

270 275 280

aag gtg cct tcc att gca aag gga gag atg gct tct tat ttg aag acg 977

Lys Val Pro Ser Ile Ala Lys Gly Glu Met Ala Ser Tyr Leu Lys Thr

285 290 295

gca gtg gca cct cag ctc cca gag gaa ctg cgc tgc tca ttc ata gat 1025

Ala Val Ala Pro Gln Leu Pro Glu Glu Leu Arg Cys Ser Phe Ile Asp

300 305 310

gct gtt gat aag ggt gac atc aga tct atg ccc aac agg agc atg cca 1073

Ala Val Asp Lys Gly Asp Ile Arg Ser Met Pro Asn Arg Ser Met Pro

315 320 325

gca tct cct tat cca act cct ggt gcc ctc ctc atg gga gat gca ttc 1121

Ala Ser Pro Tyr Pro Thr Pro Gly Ala Leu Leu Met Gly Asp Ala Phe

330 335 340 345

aac atg cgt cat cct ctg aca gga ggt gga atg aca gtg gca ttg tct 1169

Asn Met Arg His Pro Leu Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Ala Leu Ser

350 355 360

gat gtt gtc gtc cta aac aat ctc ctc aaa cca cta cgt gat ttg aat 1217

Asp Val Val Val Leu Asn Asn Leu Leu Lys Pro Leu Arg Asp Leu Asn

365 370 375

gat gca tct tct ctt tgc aag tac ctg gag tct ttt tac aca ttg cga 1265

Asp Ala Ser Ser Leu Cys Lys Tyr Leu Glu Ser Phe Tyr Thr Leu Arg

380 385 390

aag ccg gta gca tct acc ata aac acc ttg gcc ggt gct ctg tac aag 1313

Lys Pro Val Ala Ser Thr Ile Asn Thr Leu Ala Gly Ala Leu Tyr Lys

395 400 405

gta ttc tgt gcc tca cca gat cag gct atg aag gag atg cgt caa gcg 1361

Val Phe Cys Ala Ser Pro Asp Gln Ala Met Lys Glu Met Arg Gln Ala

410 415 420 425

tgc ttt gat tat ctg agc ctc ggt ggg gtc ttt tca aat ggt ccc gtg 1409

Cys Phe Asp Tyr Leu Ser Leu Gly Gly Val Phe Ser Asn Gly Pro Val

430 435 440

gca ttg ctc tcg ggt ctc aac ccc cga cca ttg agc ctg gtg aca cat 1457

Ala Leu Leu Ser Gly Leu Asn Pro Arg Pro Leu Ser Leu Val Thr His

445 450 455

ttc ttt gcg gtt gca ata tac ggt gtt ggt cgt ctg atg gtt cca ttt 1505

Phe Phe Ala Val Ala Ile Tyr Gly Val Gly Arg Leu Met Val Pro Phe

460 465 470

cca tcc cct aaa cgc ata tgg att agc att cga ttg ata atg ggt gca 1553

Pro Ser Pro Lys Arg Ile Trp Ile Ser Ile Arg Leu Ile Met Gly Ala

475 480 485

tct aac ata ata ttc cct att atc ata gca gaa ggg gtc aga caa atg 1601

Ser Asn Ile Ile Phe Pro Ile Ile Ile Ala Glu Gly Val Arg Gln Met

490 495 500 505

ttc tta cca gct acc ata cct gcc tac tac aga gct ccc cct gtc aat 1649

Phe Leu Pro Ala Thr Ile Pro Ala Tyr Tyr Arg Ala Pro Pro Val Asn

510 515 520

tga aaattgaaac aacggcacaa cactagggga gcactccggg aatttggact 1702

ttttgctgta cggatccttt ttgatgcact ttctgttttc tttactacgc tgtatccaat 1762

gcaatcccag caaatttaag tctcctttca catgcgactc cctttcacct cagccaatgg 1822

ttttgctatt gttcctctat gttgtccagt atctgtatcg aacgtgaacg tgaacttgat 1882

tgttgattgc tatatgtaca actgggatct gtttccgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1942

aaaaaa 1948

<210> 4

<211> 521

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Val Ala Leu Pro Leu Leu Leu Gln Cys Leu Leu Ala Gly Ser Val

1 5 10 15

Ala Ala Val Leu Ala Tyr Leu Leu Leu Pro Arg Gln Arg Pro Thr Arg

20 25 30

Lys Glu Pro His Gly Val Gly Thr Val Leu Ser Ala Ala Gly Asn Val

35 40 45

Pro Ala Gln Gly Gly Asp Ala Asp Ala Asp Val Leu Ile Val Gly Ala

50 55 60

Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Ala Tyr Thr Leu Gly Lys Asp Gly Arg

65 70 75 80

Arg Val Arg Val Ile Glu Arg Asp Leu Ala Gln Pro Asp Arg Ile Val

85 90 95

Gly Glu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Tyr Leu Lys Leu Val Glu Leu Gly

100 105 110

Leu Glu Asp Cys Val Glu Glu Ile Asp Ala Gln Arg Val His Gly Tyr

115 120 125

Ala Leu Phe Lys Asp Gly Arg Asn Thr Lys Val Ala Tyr Pro Leu Glu

130 135 140

Ser Phe Asp Ser Asp Val Ala Gly Arg Ser Phe His His Gly Arg Phe

145 150 155 160

Ile Gln Arg Leu Arg Glu Lys Ala Ala Ser Leu Pro Asn Val Arg Leu

165 170 175

Glu Gln Gly Thr Val Thr Ser Leu Ile Asp Asp Asn Gly Thr Val Lys

180 185 190

Gly Ala Thr Tyr Lys Lys Lys Asp Gly Glu Glu Ser Lys Ala Tyr Ala

195 200 205

Pro Leu Thr Ile Val Cys Asp Gly Cys Phe Ser Asn Leu Arg Lys Gly

210 215 220

Leu Cys Ser Ala Lys Val Asp Val Pro Ser Cys Phe Val Gly Leu Val

225 230 235 240

Leu Glu Asn Cys Gln Leu Pro His Pro Asn His Gly His Val Ile Leu

245 250 255

Ala Asp Pro Ser Pro Ile Leu Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Thr Glu Val

260 265 270

Arg Cys Leu Val Asp Val Pro Gly Gln Lys Val Pro Ser Ile Ala Lys

275 280 285

Gly Glu Met Ala Ser Tyr Leu Lys Thr Ala Val Ala Pro Gln Leu Pro

290 295 300

Glu Glu Leu Arg Cys Ser Phe Ile Asp Ala Val Asp Lys Gly Asp Ile

305 310 315 320

Arg Ser Met Pro Asn Arg Ser Met Pro Ala Ser Pro Tyr Pro Thr Pro

325 330 335

Gly Ala Leu Leu Met Gly Asp Ala Phe Asn Met Arg His Pro Leu Thr

340 345 350

Gly Gly Gly Met Thr Val Ala Leu Ser Asp Val Val Val Leu Asn Asn

355 360 365

Leu Leu Lys Pro Leu Arg Asp Leu Asn Asp Ala Ser Ser Leu Cys Lys

370 375 380

Tyr Leu Glu Ser Phe Tyr Thr Leu Arg Lys Pro Val Ala Ser Thr Ile

385 390 395 400

Asn Thr Leu Ala Gly Ala Leu Tyr Lys Val Phe Cys Ala Ser Pro Asp

405 410 415

Gln Ala Met Lys Glu Met Arg Gln Ala Cys Phe Asp Tyr Leu Ser Leu

420 425 430

Gly Gly Val Phe Ser Asn Gly Pro Val Ala Leu Leu Ser Gly Leu Asn

435 440 445

Pro Arg Pro Leu Ser Leu Val Thr His Phe Phe Ala Val Ala Ile Tyr

450 455 460

Gly Val Gly Arg Leu Met Val Pro Phe Pro Ser Pro Lys Arg Ile Trp

465 470 475 480

Ile Ser Ile Arg Leu Ile Met Gly Ala Ser Asn Ile Ile Phe Pro Ile

485 490 495

Ile Ile Ala Glu Gly Val Arg Gln Met Phe Leu Pro Ala Thr Ile Pro

500 505 510

Ala Tyr Tyr Arg Ala Pro Pro Val Asn

515 520

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggtagacatc ccctcttgtt ttgttggctt ggtgc 35

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ccagcaccaa gccaacaaaa caagagggga tg 32

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tcttggcaga cccgtcaccc atcctg 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

catgatttgg gtggggcagt tggcag 26

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ctcgagttag gggatctacc cctgctg 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

acttgaatgt cagcagtcag ctgctag 27

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

agacgtcccc ggaccaattg cacac 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aaacagatcc cagttgtaca tatag 25

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

cggaattcat ggtgacaatc cctttcct 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

acgcgtcgac tcaattgact ggaggagc 28

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

cggaattcat ggttgcgctc ccgctc 26

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

acgcgtcgac tcaattgact ggaggagc 28

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

aaacggctac cacatcca 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

cacatcccaa ggtccaac 18

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

ccttgattga tgataatggg act 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gatgtctacc tttgcggagc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

cacccatcct gttctaccca 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

gccactgccg tcttcaaata 20

Claims

1.一种泽泻鲨烯环氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述泽泻鲨烯环氧化酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.一种泽泻鲨烯环氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.编码权利要求3所述泽泻鲨烯环氧化酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

5.权利要求2、4任一项所述基因的原核表达方法，其特征在于，构建N端携带有His表达标签的重组表达载体；将重组载体质粒转化至BL21感受态细胞；IPTG诱导载体融合蛋白表达。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述载体选用pCzn1质粒。

7.权利要求1、3任一项所述泽泻鲨烯环氧化酶的多克隆抗体制备方法，其特征在于，原核表达纯化泽泻鲨烯环氧化酶并用免疫家兔制备多克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，取纯化蛋白进行BCA蛋白浓度测定，免疫2只新西兰白兔，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，纯化得多克隆抗体，并进行免疫印迹检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化得多克隆抗体步骤为：将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过ELISA检测纯化抗体的效价，步骤如下：

②次日每孔加入100μL 5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，用pH7.4的PBST洗涤3次；

⑥在酶标仪上测450nm下的OD值。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，Western Blot检测步骤如下：

①分别取200mg泽泻植物组织样品，剪碎加入适量裂解液，裂解液使用前加PMSF，匀浆器匀浆，充分裂解；取上清10μL加入等体积2X样品缓冲液，每个泳道上样20μL；

④电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5min；然后置于5%m/V脱脂奶粉封闭液中封闭37℃，1h；

⑤用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1h；

⑥洗膜4次，每次5min；用含5%牛奶的封闭液稀释二抗；膜在二抗中37℃反应1h；

⑦洗膜ECL显影。