CN114280306B - 牛筋草epsps蛋白elisa检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种牛筋草EPSPS蛋白ELISA检测试剂盒及检测方法。通过原核表达获得重组EPSPS蛋白，将重组蛋白免疫小鼠，筛选得到特异性的单克隆抗体，开发出定量检测EPSPS蛋白含量的酶联免疫定量检测试剂盒。并建立了双抗体夹心ELISA法，通过优化得到ELISA试剂盒体系，可定量检测EPSPS蛋白。本发明采用ELISA检测技术可实现对植物中的EPSPS蛋白进行定性定量检测，具有特异性强、灵敏度高、简单快速等优点。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地说，涉及一种牛筋草EPSPS蛋白ELISA检测试剂盒及检测方法。
背景技术
草甘磷是一种非选择性的广谱除草剂，具有高效、低毒、无残留等优点，尤其是对人畜毒害小，是全球应用最广的除草剂之一。草甘膦的靶标是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，EPSPS是生物体内芳香族氨基酸—色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键酶；草甘磷是通过抑制EPSPS的活性而阻断芳香族氨基酸的合成最终导致受试植物死亡。但是作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有灭生性作用，这限制了草甘膦在农业生产中的应用。美国孟山都公司通过向植物中转入具草甘膦抗性的CP4-EPSPS等基因，成功培育出了商业化的转基因抗草甘膦作物，为草甘膦的应用开辟了新途径。目前已经获得了大豆、玉米、棉花、油菜、烟草、甜菜、花生、小麦、水稻或向日葵等抗草甘膦转基因作物。
草甘膦的长期使用，引起杂草对草甘膦产生抗性，导致转基因作物减产。杂草对草甘膦的靶标抗性机制分为靶标突变和靶标酶过量表达两种。目前，抗性的分子检测方法主要有：(1)EPSPS序列保守位点PCR检测；(2)EPSPS基因表达量qPCR检测；(3)EPSPS蛋白免疫印迹检测等，其中PCR与qPCR的方法对场地、仪器、技术人员的要求比较高，样本处理复杂，成本较高。蛋白免疫印迹检测方利用免疫学原理对目的蛋白进行定性定量鉴定，利用靶标蛋白抗体可以通过Western blot和ELISA方法进行定性定量分析，检测植株中目的蛋白在不同组织器官和不同环境条件下的表达水平。利用该方法可以快速、批量检测不同牛筋草植株靶标蛋白EPSPS的含量，快速鉴定抗性牛筋草植株。
发明内容
本发明的目的是提供牛筋草EPSPS蛋白ELISA检测试剂盒及检测方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种牛筋草EPSPS蛋白，所述蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。
第二方面，本发明提供编码所述牛筋草EPSPS蛋白的核酸分子。
经过密码子优化后的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第四方面，本发明提供一种抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNo.22308的杂交瘤细胞株FL-374-08分泌产生。该杂交瘤细胞株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2021年4月14日。
抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的获得方法如下：将编码牛筋草EPSPS蛋白的基因经过优化重组构建到大肠杆菌表达系统中，表达纯化得到重组EPSPS蛋白；用该重组EPSPS蛋白免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体。
第五方面，本发明提供所述抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的以下任一应用：
1)用于检测牛筋草EPSPS蛋白；
2)用于制备牛筋草EPSPS蛋白检测试剂或试剂盒。
第六方面，本发明提供牛筋草EPSPS蛋白ELISA检测试剂盒(EPSPS双抗夹心ELISA定量检测试剂盒)，所述试剂盒包括预包被酶标板和酶标记抗体；
所述预包被酶标板为包被有所述抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的酶标板，所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的抗牛筋草EPSPS蛋白多克隆抗体。
其中，抗牛筋草EPSPS蛋白多克隆抗体的制备方法包括：将编码牛筋草EPSPS蛋白的基因经过优化后构建到大肠杆菌表达系统中，表达纯化得到EPSPS重组蛋白，然后用EPSPS重组蛋白免疫兔子(如新西兰大白兔)，采集兔子血清后纯化获得。
进一步地，所述抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的包被浓度为1.8-2.2μg/mL，优选1.9-2.1μg/mL，更优选2μg/mL。
进一步地，酶标记抗体的浓度为8-12μg/mL，优选9-11μg/mL，更优选10μg/mL。
进一步地，所述试剂盒还包括标准品冻干粉、样品提取液、洗涤液、显色剂和终止液：
所述标准品冻干粉为EPSPS重组蛋白。
所述样品提取液为0.01M PBS缓冲液，pH7.4。
所述洗涤液为含0.2％v/v吐温-20的0.01M PBS缓冲液，pH7.4。
所述终止液为1.8-2.2M(优选1.9-2.1M，更优选2M)硫酸水溶液或1M HCl水溶液。
所述显色剂包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液；所述辣根过氧化物酶催化底物A液为3％v/v H2O2水溶液；所述辣根过氧化物酶催化底物B液的制备方法如下：将1mL浓度为10mg/mL的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液加入到100mL浓度为0.1mol/L、pH6.0的磷酸缓冲液中，混匀即得。
第七方面，本发明提供牛筋草EPSPS蛋白ELISA检测方法，包括以下步骤：
(1)从待测植物样本中提取蛋白，得蛋白提取液；
(2)利用上述试剂盒对蛋白提取液进行检测，依次包括加样、孵育、洗板、加酶标记抗体、孵育、洗板、显色、终止和读数等步骤；
(3)利用EPSPS重组蛋白标准品制作的浓度-吸光度标准曲线，计算待测植物样本中的牛筋草EPSPS蛋白浓度。
牛筋草EPSPS蛋白的线性检测范围为5-80μg/kg，检出限为5μg/kg。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，对EPSPS蛋白特异性强、灵敏度高，效价高，可特异性对牛筋草植株不同器官中的EPSPS蛋白进行精准定量检测，鉴定结果准确、可靠，灵敏度高，而且检测方法简单快速，可以快速鉴定抗草甘膦的牛筋草，为快速精准选药防除牛筋草提供了有力工具。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白Marker；1为纯化蛋白。
图2为本发明较佳实施例中本发明牛筋草EPSPS蛋白ELISA检测试剂盒灵敏度检测；其中，横坐标为EPSPS蛋白含量，纵坐标为吸光值。
具体实施方式
为了实现对牛筋草体内EPSPS蛋白含量的快速、灵敏检测，并以此快速判断牛筋草是否产生靶标过量表达而对草甘膦产生抗药性，本发明提供一种牛筋草EPSPS蛋白的酶联免疫定量检测试剂盒及其应用。
本发明采用以下技术方案：
第一方面，将牛筋草中的EPSPS基因经过优化后构建入大肠杆菌表达系统，重组表达纯化得到EPSPS重组蛋白，然后用EPSPS重组蛋白免疫新西兰大白兔，得到多克隆抗体，用EPSPS重组蛋白免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合、克隆化筛选制备得到单克隆抗体杂交瘤细胞株。
所述EPSPS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
前期研究从牛筋草中克隆到EPSPS基因，其编码5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(EPSPS蛋白)，并通过原核表达获得重组蛋白，将重组蛋白免疫兔子，获得兔子血清后纯化得到多克隆抗体，将重组蛋白免疫小鼠，并通过大量试验筛选得到特异性强的单克隆抗体，最终开发出定量检测EPSPS蛋白含量的酶联免疫定量检测试剂盒。具体方案包括：将从牛筋草中获得EPSPS基因经过优化重组构建入大肠杆菌原核表达系统，通过表达纯化得到重组EPSPS蛋白；用该蛋白诱导免疫新西兰大白兔，通过获取兔血清，并经过纯化，得到兔多克隆抗体；用该蛋白诱导免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体；用用双抗体夹心的ELISA方法，筛选配对抗体；通过优化得到ELISA试剂盒体系，建立双抗体夹心ELISA检测方法；制备试剂盒，对实际样本进行检测。
第二方面，本发明提供一种检测EPSPS蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的单克隆抗体和多克隆抗体。
优选地，所述试剂盒包括如下组分：
(1)第一方面所述的单克隆抗体预包被酶标板；
(2)样品提取液，其为磷酸盐缓冲液；
(3)洗涤液，其为含Tween-20的磷酸盐缓冲液；
(4)反应终止液，其为H2SO4溶液；
(5)酶标抗体，其为辣根过氧化物酶(HRP)标记的第一方面所述的多克隆抗体；
(6)显色剂为TMB显色剂；
(7)EPSPS标准品。
即包被抗体和酶标抗体分别为第一方面所述的单克隆抗体和多克隆抗体，
预包被酶标板的制备方法如下：
(1)将抗体(单抗)稀释到一定浓度，加至96孔酶标板，每孔100μL，37℃反应3h；
(2)将板孔溶液甩干，加入洗涤液，浸泡5min，将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干；
(3)将封闭液加至96孔酶标板，每孔150μL，37℃反应2h；
(4)将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干，用冷冻干燥机抽干；
(5)用真空包装机包装于铝箔袋中。
优选地，抗体预包被酶标板的制备过程中，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；更优选地，所述碳酸盐缓冲液为0.1M的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，pH 9.6。
优选地，所述抗体为第二方面所述的单克隆抗体对的第一单克隆抗体或第二单克隆抗体。
优选地，所述抗体的包被浓度为1.8-2.2μg/mL，优选1.9-2.1μg/mL，更优选2μg/mL。
优选地，所述封闭液为含BSA的碳酸盐缓冲液(如含1％BSA的CB)。
所述酶标抗体为第二方面所述的单克隆抗体对的第二单克隆抗体或第一单克隆抗体，且被HRP标记。
优选地，所述酶标抗体的浓度为8-12μg/mL，优选9-11μg/mL，更优选10μg/mL。
优选地，加入抗体后的孵育温度为22-26℃，优选25℃，孵育时间为40-50分钟、优选45分钟。
所述EPSPS标准品为将牛筋草中的EPSPS基因经过优化后构建入大肠杆菌表达系统，重组表达纯化得到。
所述硫酸为1.8-2.2M或1M HCl水溶液，优选1.9-2.1M，更优选2M的硫酸。
第三方面，本发明提供一种检测EPSPS蛋白的方法，采用第二方面所述的试剂盒，包括如下步骤：
(1)从待检样本中提取蛋白，得蛋白提取液；
(2)用第二方面所述试剂盒对蛋白提取液进行检测，其主要过程包括加样、孵育、洗涤、加酶、孵育、洗涤、显色、终止和读数；
(3)通过用EPSPS蛋白标准品制作的浓度-吸光度标准曲线，计算待检样品中的EPSPS蛋白浓度。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例涉及的试剂、抗体、质粒、仪器见表1：
表1
实施例1 EPSPS蛋白的表达纯化
(一)EPSPS蛋白的小试表达
1、序列合成：根据蛋白序列(SEQ ID NO:1)，优化密码子，合成基因序列(SEQ IDNO:2)并克隆到载体pET30a上，序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。序列信息如下：
2、菌种活化：将构建的pET30a-EPSPS阳性质粒转化BL21(DE3)，涂布LB固体培养基(卡那浓度50μg/mL)。次日，挑取单克隆菌落接入5mL LB液体培养基(卡那浓度50μg/mL)，37℃培养12h-14h。
3、小试表达：次日，菌种以1:50比例接入5mL LB液体培养基(卡那浓度50μg/mL)，37℃培养至OD＝0.4-0.6，吸取1mL菌液离心处理后作为诱前对照。4mL菌液加入浓度为0.8mM的IPTG，25℃诱导表达6h后菌液8000rpm、4℃离心1min，收集菌体。SDS-PAGE鉴定蛋白的形式，结果显示有明显目的蛋白的表达。
4、蛋白表达形式的鉴定：上述表达的菌体加入1mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件：温度冰浴、功率40％、超声2s、间隔2s、时间30min。12000rpm、4℃离心1min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE鉴定蛋白表达形式，结果显示目的蛋白主要以可溶形式表达。
(二)蛋白的大量表达和纯化
1、菌种活化：固体平板上挑取pET30a-EPSPS单克隆菌落接入5mL LB液体培养基(卡那浓度50μg/mL)，37℃培养12h-14h。
2、小试表达：次日，菌种以1:50接入800mL LB液体培养基(卡那浓度50μg/mL)，37℃培养至OD＝0.4-0.6，加入浓度为1mM的IPTG，25℃诱导表达6h后菌液8000rpm、4℃离心15min，收集菌体。
3、菌种裂解：加100mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件：温度冰浴、功率60％、超声2s、间隔2s、时间15min。12000rpm、4℃离心15min，收集上清和沉淀。
4、上清纯化：收集的上清利用高亲和性NI树脂进行纯化，收集流穿液、洗脱液。SDS-PAGE检测纯化效果，结果显示200mM咪唑洗脱时蛋白纯度最佳。将200mM咪唑洗脱液透析去除咪唑，SDS-PAGE检测透析效果，结果显示(图1)蛋白透析后纯度和浓度均可行。经检测，最终目的蛋白纯度大于90％，浓度3mg/mL，蛋白量12mg。
(三)结果
pET30a-EPSPS蛋白诱导表达条件为：IPTG浓度1mM，诱导温度25℃，诱导时间6h。蛋白主要在上清表达，上清经Ni柱纯化，透析去除咪唑，最终所得EPSPS蛋白的浓度2mg/mL，纯度大于90％，得到冻干蛋白10mg。
实施例2抗体制备
(一)多抗制备
1、免疫原制备：将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，以备免疫兔子。
2、免疫策略：将蛋白免疫2只新西兰大白兔，皮下免疫3次，间隔4周，最后经间接ELISA检测。
间接ELISA方法如下：
1)用0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释表达纯化的蛋白至1μg/mL，加入96孔酶标板，每孔100μL，37℃反应3h或4℃静置过夜。
2)甩去板孔中液体，加入250μL洗涤缓冲液，静置30s，甩去板中液体，重复3次。
3)加入检测样本，每孔100μL，同时加入阳性对照(步骤2中所取阳性兔血清)、阴性对照(免疫前兔血清)和空白对照(不加兔血清)37℃反应45min，
4)重复步骤2)；
5)加入HRP标记的羊抗兔酶标二抗，每孔100μL，37℃反应45min。
6)重复步骤2)；
7)加入显色剂，每孔100μL，室温避光反应15min。
8)加入终止液，每孔100μL，使用酶标仪在波长450读取OD值，抗血清效价见表2：
表2
3、多克隆抗体纯化：兔血清离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M,pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein A小柱进行纯化，新柱子先用5mL超纯水过柱，再用5mL 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10mL 0.4M PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；5mL0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 3.0)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
(二)单抗制备
1、免疫原制备：将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，以备免疫小鼠。
2、免疫策略：将蛋白免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经间接ELISA检测。
间接ELISA方法如下：
1)用0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释表达纯化的蛋白至1μg/mL，加入96孔酶标板，每孔100μL，37℃反应3h或4℃静置过夜。
2)甩去板孔中液体，加入250μL洗涤缓冲液，静置30s，甩去板中液体，重复3次。
3)加入检测样本，每孔100μL，同时加入阳性对照(步骤2中所取阳性小鼠血清)、阴性对照(免疫前小鼠血清)和空白对照(不加小鼠血清)37℃反应45min，
4)重复步骤2)；
5)加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，每孔100μL，37℃反应45min。
6)重复步骤2)；
7)加入显色剂，每孔100μL，室温避光反应15min。
8)加入终止液，每孔100μL，使用酶标仪在波长450读取OD值，抗血清效价见表3：
表3
3、细胞融合：最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，3天后进行细胞融合。将小鼠断颈处死，70％乙醇浸泡30min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合，
4、融合筛选：将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，3天后换液，改用HT培养液培养。10天后，取细胞培养上清进行检测。
5、克隆化与建株：使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳性细胞株。最终获得阳性细胞株5株。
6、扩大培养：将建株的单克隆细胞扩大培养，并进行冻存。
(三)腹水制备与纯化
1、腹水制备：提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量的细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水，4000rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。
2、单克隆抗体纯化：腹水离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M,pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5mL超纯水过柱，再用5mL 0.4MPB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10mL 0.4M PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；5mL 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
(四)抗体筛选
1、效价检测
以间接ELISA方法对纯化后的抗体进行效价检测，结果见表4：
表4
2、亚型检测
用小鼠抗体亚型检测试剂盒对抗体进行亚型检测，结果均为IgG类抗体。
3、抗体配对
利用双抗夹心ELISA方法对制备得到的抗体进行筛选，筛选出可以配对的抗体对。
双抗夹心的ELISA方法如下：
a、用CB将包被抗体稀释至10μg/mL，每孔100μL，37℃包被3h；
b、洗板3-5次，拍干，加入阳性标品/阴性对照/阳性样本/阴性样本，每孔100μL，25℃反应45min；
c、洗板3-5次，拍干，加入酶标抗体，每孔100μL，25℃反应45min；
d、洗板3-5次，拍干，加入显色剂，25℃避光反应15min；
e、加入100μL终止液，OD450读取OD值，结果见表5：
表5
| 抗体编号 | 阴性对照 | 重组蛋白 | 阳性样本 | 阴性样本 |
| FL-374-01 | 0.1515 | 0.4524 | 0.176 | 0.1417 |
| FL-374-02 | 0.136 | 0.7681 | 0.7709 | 0.1614 |
| FL-374-03 | 0.142 | 0.4806 | 0.3578 | 0.1321 |
| FL-374-04 | 0.1322 | 0.5531 | 0.425 | 0.143 |
| FL-374-05 | 0.1309 | 0.3783 | 0.1352 | 0.1192 |
| FL-374-06 | 0.1221 | 0.4887 | 0.1345 | 0.1193 |
| FL-374-07 | 0.1452 | 0.2869 | 0.1847 | 0.129 |
| FL-374-08 | 0.1352 | 1.9016 | 1.5229 | 0.3065 |
| FL-374-09 | 0.1062 | 0.2559 | 0.2138 | 0.1429 |
| FL-374-10 | 0.1102 | 0.2275 | 0.205 | 0.1321 |
| FL-374-11 | 0.087 | 0.4112 | 0.8804 | 0.1274 |
| FL-374-12 | 0.1037 | 0.2789 | 0.169 | 0.1243 |
| FL-374-13 | 0.1015 | 0.2526 | 0.1591 | 0.1313 |
| FL-374-14 | 0.0899 | 0.7826 | 0.5128 | 0.1306 |
| FL-374-15 | 0.0915 | 0.2666 | 0.1327 | 0.116 |
| FL-374-16 | 0.0983 | 0.7068 | 0.6413 | 0.1355 |
| FL-374-17 | 0.1234 | 0.9342 | 1.3048 | 0.1977 |
| FL-374-18 | 0.1325 | 1.0463 | 3.4774 | 0.1905 |
| FL-374-19 | 0.1102 | 0.2404 | 0.2307 | 0.1888 |
| FL-374-20 | 0.1519 | 1.653 | 2.8649 | 0.6717 |
| FL-374-21 | 0.1215 | 0.8766 | 0.3307 | 0.1901 |
| FL-374-22 | 0.1002 | 0.7049 | 0.8621 | 0.1706 |
| FL-374-23 | 0.1005 | 0.3511 | 0.944 | 0.1478 |
| FL-374-24 | 0.1097 | 0.3207 | 0.2603 | 0.1486 |
| FL-374-25 | 0.1117 | 0.7694 | 0.2337 | 0.1512 |
| FL-374-26 | 0.1062 | 1.3339 | 0.8813 | 0.5641 |
| FL-374-27 | 0.1311 | 1.4462 | 1.8647 | 0.5575 |
| FL-374-28 | 0.1269 | 0.9628 | 0.2446 | 0.1296 |
| FL-374-29 | 0.1291 | 0.9716 | 3.3775 | 0.4059 |
| FL-374-30 | 0.1103 | 0.2361 | 0.344 | 0.124 |
| FL-374-31 | 0.1077 | 0.3452 | 0.1224 | 0.1021 |
| FL-374-32 | 0.0947 | 0.1878 | 0.1064 | 0.1033 |
| FL-374-33 | 0.1017 | 0.1915 | 0.1317 | 0.1059 |
| FL-374-34 | 0.1101 | 0.2415 | 0.1281 | 0.1101 |
| FL-374-35 | 0.0993 | 0.1928 | 0.1402 | 0.1118 |
其中FL-374-08的配对效果最好，因此采用FL-374-08(由保藏编号为CGMCCNo.22308的杂交瘤细胞株分泌产生)与兔多抗来制备试剂盒。
实施例3试剂盒的组装
1、缓冲液的配制
(1)包被缓冲液，0.1M碳酸盐缓冲液(CB)，pH9.6；
(2)样品提取液，0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.4；
(3)洗涤液，含0.2％吐温-20的PBS；
(4)封闭液，含1％BSA的CB；
(5)终止液，2M H2SO4。
2、酶标板的制备
(1)包被
移取一定量EPSPS多克隆抗体于所需体积的包被液中，使其浓度约为2μg/mL，配置成包被工作液。将包被工作液按每孔100μL加入酶标板微孔，4℃静置过夜(注意防止水分蒸发)。
(2)封闭
在CB缓冲液(pH9.6)中加入一定量的BSA、水杨酸钠和蔗糖，使BSA、水杨酸钠、蔗糖的浓度分别为1％、0.05％、5％，配置成封闭工作液。酶标板以洗板机吸干-洗涤二次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。将封闭工作液按每孔150μL加入微孔，37℃烘焙3小时。
(3)抽干密封
弃去封闭液，将板条在洁净的吸水纸上拍干，放入冷冻真空干燥机抽干3小时，真空热封。
3、EPSPS标准品冻干粉的制备
大肠杆菌E.coli中原核表达并通过亲和纯化的EPSPS重组蛋白，C端带有6个His标签，其母液浓度为3mg/mL，稀释到16ng/mL，3mL棕色玻璃瓶加入100μL 16ng/mL标准品，冷冻干燥机过夜抽干得到标准品冻干粉。
4、酶标记抗体工作液的配置
酶标抗体的制备：取纯化的EPSPS多克隆抗体，与HRP进行偶联，得到酶标记抗体。辣根过氧化物酶(HRP)标记的EPSPS多克隆抗体的制备方法为：
(1)5mg HRP溶于纯水，加入高碘酸钠，室温反应30分钟；
(2)将5mg抗体用偶联缓冲液透析过夜；
(3)将HRP加入抗体溶液中，室温反应2小时；
(4)加入硼氢化钠封闭反应位点；
(5)磷酸盐缓冲液透析过夜，加入等量甘油保存于-20℃。
取一定量的酶标记抗体加入到样品提取液中，充分混匀，使其终浓度为2μg/mL，2-8℃避光保存。
5、试剂盒的组装见表6：
表6
| 名称 | 数量 |
| 预包被酶标板 | 1块 |
| 标准品冻干粉 | 2瓶 |
| 酶标记抗体工作液 | 1瓶 |
| 样品提取液 | 2瓶 |
| 显色剂 | 1瓶 |
| 终止液 | 1瓶 |
| 洗涤液 | 1瓶 |
| 说明书 | 1份 |
实施例4利用本发明试剂盒检测牛筋草中的EPSPS蛋白
1、准备EPSPS标准品和未知浓度样品
1)EPSPS标准品配制：
用1mL样品提取液溶解EPSPS标准品，此溶液浓度为1.6ng/mL；
取EPSPS标准品1.6ng/mL，300μL加入样品提取液300μL，此溶液浓度为0.8ng/mL；
取EPSPS标准品0.8ng/mL，300μL加入样品提取液300μL，此溶液浓度为0.4ng/mL；
取EPSPS标准品0.4ng/mL，300μL加入样品提取液300μL，此溶液浓度为0.2ng/mL；
取EPSPS标准品0.2ng/mL，300μL加入样品提取液300μL，此溶液浓度为0.1ng/mL；
2)未知EPSPS浓度牛筋草植株叶片、茎、种子样品的处理：
牛筋草叶片与茎的前处理方法：取0.1g的叶片或茎秆样本，放入1.5mL离心管中捣碎，加入250μL的样品提取液，振荡混匀5分钟，4000rpm离心3分钟，取100μL上清用于分析。
种子前处理方法：取0.1g碾碎后的种子样本，放入1.5mL离心管中，加入1mL样品提取液，振荡混匀5分钟，4000rpm离心3分钟，取100μL上清用于分析。
2、加标准品或未知浓度样品：
将100μL的样品提取液(空白对照)/标准品/未知浓度样品加入到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min。
3、洗板：
将孔内液体甩干，用250μL洗涤液/孔充分洗涤3次，每次间隔1min，用吸水纸拍干。
4、加酶标抗体：
加入酶标抗体100μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min，取出重复洗板步骤3。
5、显色：
加入显色剂100μL/孔，置于25℃避光环境中反应15min。
6、终止与测定：
加入100μL终止液/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪设定至450nm，测定每孔OD值(优选用双波长450/630nm进行检测，在5min内读完数据)。若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定。
7、计算：
利用统计学绘图软件，根据所测定的标准品的OD值绘制标准曲线，如图2所示；通过标准曲线和未知浓度样品的OD值就可计算出未知样品中EPSPS的浓度。
结果见表7：
表7加标样品检测效果
由表7结果可知，使用本发明的试剂盒和方法检测牛筋草植株中的EPSPS蛋白，其加标回收率在95％-113％之间，说明本发明的检测牛筋草植株EPSPS蛋白的方法具有较好的准确性。
牛筋草EPSPS蛋白的线性检测范围为5-80μg/kg，检出限为5μg/kg。
实施例5利用本发明试剂盒鉴定抗草甘膦牛筋草
采用本发明提供的单克隆抗体对及相关方法能够检测抗性牛筋草植株。
1、准备EPSPS蛋白标准品和牛筋草样品
1)配制EPSPS蛋白标准品
用1mL样品提取液溶解EPSPS标准品，此溶液浓度为1.6ng/mL；
取EPSPS标准品1.6ng/mL，300μL加入样品提取液300μL，此溶液浓度为0.8ng/mL；
取EPSPS标准品0.8ng/mL，300μL加入样品提取液300μL，此溶液浓度为0.4ng/mL；
取EPSPS标准品0.4ng/mL，300μL加入样品提取液300μL，此溶液浓度为0.2ng/mL；
取EPSPS标准品0.2ng/mL，300μL加入样品提取液300μL，此溶液浓度为0.1ng/mL。
2)待测牛筋草植株叶片与对照样品的处理
牛筋草叶片(待测植株与对照植株)的前处理方法：取0.1g叶片或茎秆样本，放入1.5mL离心管中捣碎，加入250μL样品提取液(0.01M PBS缓冲液，pH7.4)，振荡混匀5分钟，4000rpm离心3分钟，取100μL上清用于分析。
2、加标准品或待测样品：将100μL样品提取液(空白对照)/标准品/待测样品加入到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min。
3、洗板：将孔内液体甩干，用250μL洗涤液/孔充分洗涤3次，每次间隔1min，用吸水纸拍干。
4、加酶标抗体：加入酶标抗体100μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min，取出重复洗板(参照步骤3)。
5、显色：加入显色剂100μL/孔，置于25℃避光环境中反应15min。
6、终止与测定：加入100μL终止液/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪设定至450nm，测定每孔OD值(优选用双波长450/630nm进行检测，在5min内读完数据)。若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定。
7、计算：利用统计学绘图软件，根据所测定的标准品的OD值绘制标准曲线，如图2所示；通过标准曲线和检测样品的OD值即可计算出未知样品中EPSPS的浓度。结果见表8：
表8
| 样品编号 | 吸光值 | 样品编号 | 吸光值 | 样品编号 | 吸光值 |
| 未知1 | 0.1556 | 未知7 | 0.151 | 对照1 | 0.1813 |
| 未知2 | 0.1857 | 未知8 | 0.1816 | 对照2 | 0.2023 |
| 未知3 | 0.3296 | 未知9 | 0.3966 | 对照1 | 0.151 |
| 未知4 | 0.3901 | 未知10 | 0.4222 | 对照2 | 0.1816 |
| 未知5 | 0.6093 | 未知11 | 0.5912 | 对照1 | 0.1747 |
| 未知6 | 0.6388 | 未知12 | 0.5396 | 对照2 | 0.2242 |
由表8可知，抗性植株的吸光值高于对照敏感样品的吸光值，使用本发明的试剂盒和方法能够鉴定牛筋草样品对草甘膦是否产生抗性。
综上，本发明提供的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体对EPSPS蛋白特异性强、灵敏度高，效价高，可特异性对抗性与敏感牛筋草植株中的EPSPS蛋白进行精准定量检测，鉴定结果准确、可靠，灵敏度高，为抗草甘膦牛筋草的快速检测提供有力工具。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 牛筋草EPSPS蛋白ELISA检测试剂盒及检测方法
<130> KHP211111573.2
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 539
<212> PRT
<213> 牛筋草(Eleusine indica L. Gaertn.)
<400> 1
Asn Arg Ser Gln Thr Asn Leu Asp Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10 15
Asn Pro Pro Pro Pro Ser Pro Arg Ala Ser Ala Met Ala Ala Met Ala
20 25 30
Ser Lys Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Leu Asp Leu Ala Ser Pro Ala
35 40 45
Leu Ser Arg Arg His Arg Leu Asn Ser Ala Arg Pro Ser Arg His Pro
50 55 60
Ala Ala Ala Ser Cys Ser Leu Arg Ala Arg Gly Arg Asp Arg Arg Ser
65 70 75 80
Ala Val Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Gly
85 90 95
Ala Glu Glu Val Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly Val Val
100 105 110
Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ser
115 120 125
Ala Leu Ala Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser Glu
130 135 140
Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Lys Thr Leu Gly Leu Ser Val
145 150 155 160
Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly
165 170 175
Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe Leu
180 185 190
Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala
195 200 205
Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg
210 215 220
Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val Lys
245 250 255
Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile
260 265 270
Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu
275 280 285
Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro Tyr
290 295 300
Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala Glu
305 310 315 320
His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys Tyr
325 330 335
Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Glu
355 360 365
Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val
370 375 380
Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val Thr
385 390 395 400
Val Thr Gly Pro Gln Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys Ala
405 410 415
Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala
420 425 430
Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val Ala
435 440 445
Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr Glu
450 455 460
Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile
465 470 475 480
Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val
500 505 510
Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asp
515 520 525
Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
530 535
<210> 2
<211> 1629
<212> DNA
<213> 牛筋草(Eleusine indica L. Gaertn.)
<400> 2
catatgaatc gtagccagac caacctggat gcgcgtccac cgccgccgcc gccgaacccg 60
ccaccgccgt caccgcgtgc gtccgcaatg gcagcaatgg cttctaaggc tgctgcagct 120
actgtttctc tggatctggc aagcccggca ctgagccgcc gtcaccgtct gaattctgcg 180
cgtccgagcc gtcacccggc ggcggctagc tgctctctgc gtgcgcgtgg tcgtgatcgt 240
cgtagcgcgg ttgttgttgc tgcggctgcg gcggcagcgc cggcgaaagc gggcgcggaa 300
gaagtggttc tgcagccgat caaagaaatc agcggcgttg tgaaactgcc gggctctaaa 360
agcctgagca accgcattct gctgctgtcc gcgctggcgg aaggtaccac cgttgttgac 420
aacctgctga acagcgaaga tgttcactac atgctgggcg ctctgaaaac gctgggcctg 480
tctgttgaag ctgacaaagc ggcgaaacgt gcagttgttg tgggatgtgg tggcaaattc 540
ccggttgaaa aagatgcgaa agaagaagta cagctgttcc tgggcaacgc gggcaccgct 600
atgcgtccgc tgaccgcggc ggtgaccgca gcgggcggca acgcgaccta cgtgctggat 660
ggcgttccgc gtatgcgtga acgtccgatc ggcgatctgg ttgttggcct gaaacagctg 720
ggcgctgatg ttgattgctt tttaggcacc gactgtccgc cggttcgcgt taaaggtatc 780
ggtggtctgc cgggcggtaa agttaaactg agcggttcta tctccagcca gtacctgtct 840
gctctgctga tggcagcccc gctggccctg ggtgacgttg aaatcgaaat catcgataaa 900
ctgatctcca tcccgtacgt tgaaatgacc ctgcgtctga tggaacgttt cggcgttaaa 960
gcagaacact ctgactcttg ggatcgtttc tacatcaaag gtggccagaa atacaaatct 1020
ccgaaaaacg cgtacgtgga gggtgatgca tcttctgcga gctacttcct ggctggcgcc 1080
gcgatcaccg gtggcaccgt aactgttgaa ggttgcggca ccacctctct gcagggcgat 1140
gttaaattcg cggaagttct ggaaatgatg ggtgctaaag tgacctggac cgaaaccagc 1200
gttaccgtga ccggcccgca gcgcgaaccg ttcggtcgta aacacctgaa agcaattgat 1260
gttaacatga acaaaatgcc ggatgttgcg atgaccctgg ctgttgttgc gctgttcgca 1320
gatggcccga ctgctatccg tgatgtagcg agctggcgcg ttaaagaaac cgaacgtatg 1380
gtggcgatcc gtaccgaact gaccaaactg ggtgcgagcg ttgaagaagg tccggattac 1440
tgcatcatca ccccgccgga aaaactgaac gttaccgcta tcgataccta cgatgatcac 1500
cgcatggcga tggcatttag cctggcagcg tgcgcagatg ttccggtgac catccgtgat 1560
ccgggttgca cccgtaaaac cttcccggat tacttcgatg ttctgagcac cttcgttaaa 1620
aacctcgag 1629
Claims (3)
1.牛筋草EPSPS蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括预包被酶标板和酶标记抗体；
所述预包被酶标板为包被有抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的酶标板，所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的抗牛筋草EPSPS蛋白多克隆抗体；
其中，所述抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.22308的杂交瘤细胞株FL-374-08分泌产生；
抗牛筋草EPSPS蛋白多克隆抗体的制备方法包括：将编码牛筋草EPSPS蛋白的基因经过优化后构建到大肠杆菌表达系统中，表达纯化得到EPSPS重组蛋白，然后用EPSPS重组蛋白免疫兔子，采集兔子血清后纯化获得；其中所述牛筋草EPSPS蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；
所述抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的包被浓度为1.8-2.2μg/mL，酶标记抗体的浓度为8-12μg/mL；
所述试剂盒还包括标准品冻干粉、样品提取液、洗涤液、显色剂和终止液；
所述标准品冻干粉为EPSPS重组蛋白；
所述样品提取液为0.01M PBS缓冲液，pH7.4；
所述洗涤液为含0.2％v/v吐温-20的0.01M PBS缓冲液，pH7.4；
所述终止液为1.8-2.2M硫酸水溶液或1M HCl水溶液；
所述显色剂包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液；所述辣根过氧化物酶催化底物A液为3％v/v H2O2水溶液；所述辣根过氧化物酶催化底物B液的制备方法如下：将1mL浓度为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液加入到100mL浓度为0.1mol/L、pH6.0的磷酸缓冲液中，混匀即得。
2.牛筋草EPSPS蛋白ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待测植物样本中提取蛋白，得蛋白提取液；
(2)利用权利要求1所述试剂盒对蛋白提取液进行检测，依次包括加样、孵育、洗板、加酶标记抗体、孵育、洗板、显色、终止和读数的步骤；
(3)利用EPSPS重组蛋白标准品制作的浓度-吸光度标准曲线，计算待测植物样本中的牛筋草EPSPS蛋白浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，牛筋草EPSPS蛋白的线性检测范围为5-80μg/kg，检出限为5μg/kg。
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