CN110376384A

CN110376384A - 检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN110376384A
Application number: CN201910550683.0A
Authority: CN
Inventors: 胡福良; 张言政; 郑火青; 张翠平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2019-10-25
Anticipated expiration: 2039-06-24
Also published as: CN110376384B

Abstract

本发明提供一种检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒，选择MRJP2(王浆主蛋白2)作为中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测的目标蛋白，以原核表达纯化的方法得到中蜂MRJP2和意蜂MRJP2，制备纯化得到两者的特异性和同一性抗体，以双抗体夹心法开发中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度，通过肉眼观察显色情况，能够在45min内鉴定出中蜂蜂蜜中1％比例的意蜂蜂蜜掺入，满足方便快捷的检测要求，是中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测的可靠工具。

Description

检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明属于蜂产品检测领域，涉及一种中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒。

技术背景

中蜂蜂蜜作为中国特有蜂蜜品种，深受国人喜爱，但其产量较低，在国内市场上，中蜂蜂蜜的零售价格一般在80-200元/500g，是国产意蜂蜂蜜价格的三到五倍。受利益驱使，市场上用意蜂蜂蜜冒充或掺入中蜂蜂蜜中的现象十分猖獗，加之相关检测方法的缺失，导致造假者更加肆无忌惮，使中蜂蜂蜜的生产者和消费者蒙受损失。目前市场上还未有相关的检测试剂盒，为了遏制此种造假掺假现象，满足行业对快速灵敏检测的需求，非常有必要进行相关检测试剂盒的开发。

MRJPs是蜜蜂咽下腺分泌的一组同源蛋白，由MRJP1-9组成。MRJPs具有比较好的免疫原性，可以制备MRJPs的抗体并用于相关检测。蜂蜜中的MRJPs组成与蜂王浆类似，只是在含量上低了三到四个数量级，MRJPs是蜂蜜中水溶性蛋白的主要成分，其中MRJP1-3是其中含量最高的三种。MRJPs是蜂蜜中稳定存在的固有成分，根据其免疫特性，用MRJPs作为蜂蜜蜂种来源检测的内源性标记物是可行的思路。中蜂与意蜂的MRJPs具有蜂种差异性，这为制备两者的特异性抗体提供了可能。

酶联免疫吸附实验(ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体在固相表面进行反应的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有特异性强、快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点，广泛应用于快速诊断检测领域。

为了提高检测的灵敏度，快速准确地检测中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，满足行业对快速灵敏检测的需求，本发明基于MRJPs制备得到中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜蜂种特异性抗体，并在特异性抗体的基础上开发了商业化的中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜ELISA检测试剂盒，可作为中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测的有效、快速的检测手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测的ELISA检测试剂盒，是一种基于蜂蜜蛋白检测检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的双抗体夹心法ELISA检测试剂盒。

本试剂盒包含以下成分：包被中蜂MRJP2和意蜂MRJP2共有抗体的酶标板(康宁)、HRP标记的特异性中蜂MRJP2抗体、HRP标记的特异性意蜂MRJP2抗体、样品稀释液(TBST，1％BSA，0.02％硫柳汞)、清洗液(TBST)、TMB显色剂A、TMB显色剂B、阳性对照(中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜)。

本发明试剂盒需于2-8℃避光保存，不正确存放或过于频繁开启使用有可能造成使有效期缩短。

本试剂盒通过以下步骤制备：

(1)目标抗原及抗体制备方案的选择：选择MRJP2蛋白作为相关抗体制备的目标蛋白。以原核表达的方法得到中蜂MRJP2和意蜂MRJP2。

(2)中、意蜂MRJP2蛋白结构分析及序列优化：中蜂MRJP2和意蜂MRJP2原核表达纯化方案为去除信号肽后进行序列优化，中蜂MRJP2N端的1-25个氨基酸为信号肽(SEQ.No.1:MTKWLFMVACLGIACQGAIIRQNS)，意蜂MRJP2N端的1-17个氨基酸为信号肽(SEQ.No.2:MTRWLFMVACLGIACQ)。中蜂MRJP2去除1-25氨基酸，进行氨基酸序列优化，优化后的中蜂MRJP2序列如SEQ.No.3所示，然后进行密码子优化，优化后的中蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.4所示。意蜂MRJP2去除1-17氨基酸，进行氨基酸序列优化，优化后的意蜂MRJP2序列如SEQ.No.5所示，然后进行密码子优化，优化后的意蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.6所示。利用C端HIS标签纯化蛋白，在优化好的基因序列两端分别设计Nde I和Xho I酶切位点，然后进行基因合成，将合成好的基因片段插入pET-22b(+)表达载体中，构建重组质粒中蜂MRJP2-pET-22b(+)和意蜂MRJP2-pET-22b(+)。

(3)中蜂MRJP2与意蜂MRJP2原核表达：重组鉴定后的中蜂MRJP2-pET-22b(+)质粒与意蜂MRJP2-pET-22b(+)转化BL21(DE3)感受态细胞，得到对应的单克隆菌株。在最适培养条件进行原核表达，最终得到原核表达的中蜂MRJP2与意蜂MRJP2。

(4)中蜂MRJP2和意蜂MRJP2的多克隆抗体制备、纯化及效价测定：以纯化后的中蜂MRJP2蛋白和意蜂MRJP2为抗原免疫兔子，用亲和柱对多克隆抗体进行纯化，得到中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性及特异性抗体。

(5)中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜ELISA检测试剂盒制备：采用双抗夹心ELISA方法，中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性抗体包被微孔板，与加入的中蜂或意蜂蜂蜜中的蛋白结合，再加入HRP标记的抗中蜂蜂蜜蛋白抗体、抗意蜂蜂蜜蛋白抗体来分别反应，最后用TMB底物系统显色，通过肉眼观察待测样品显色为蓝色的微孔所加的酶标抗体对应的蜂种信息(HRP标记兔抗中蜂蛋白或HRP标记兔抗意蜂蛋白)，判断待测样品的蜂种来源信息。

本发明以中蜂MRJP2和意蜂MRJP2为中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测的目标蛋白，制备纯化得到中蜂MRJP2与意蜂MRJP2的特异性和同一性抗体，采用双抗体夹心法制得中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜ELISA检测试剂盒。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的检测中的应用。所述应用包括中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜蜂种来源真实性的检测、意蜂蜂蜜掺假中蜂蜂蜜的检测，以及中、意蜂蜂蜜相关产品的检测。

本发明试剂盒的使用方法：

1.首先将试剂盒恢复至室温(大约30分钟)。

2.取出酶标板。每个待测蜂蜜样品需要2孔，中蜂蜂蜜阳性对照2孔，意蜂蜂蜜阳性对照2孔。每套试剂盒能测试4个样品。

3.加样：用样品稀释液配制样品(包括待测样品和阳性对照)浓度至20-100mg/ml，即蜂蜜样品稀释10到70倍，取100μl加入酶标微孔板，每个样品加2孔，阳性对照也是加2孔，每孔100μl。加样时，枪头或牙签应尽量不要碰到微孔的壁和底。对样品加样顺序做好记录，加样后的微孔板37℃温育10分钟或室温放置15分钟。

注：如果没有移液器，用牙签取样，每孔先加入100μl样品稀释液(或3滴)，用牙签一端蘸取少许蜂蜜样品，然后点样品于稀释液中，牙签另一端蘸取相同量的样品点入另外一孔样品稀释液中，微微振动酶标板，使样品溶解。

4.洗板：弃去板内液体，进行洗板，每孔加6滴清洗液，停留10秒然后弃尽，洗板5遍后板子在不掉纤维的吸水材料上拍干。

5.加HRP标记抗体：在每个样品的2孔中，一孔加入HRP标记兔抗中蜂蛋白100μl(或3滴)，另一孔加入HRP标记兔抗意蜂蛋白100μl(或3滴)，阳性对照也同样操作。做好HRP标记抗体的加孔记录。37℃温育10分钟或室温放置15分钟。

6.洗板：重复步骤4。最后一次洗板时一定要甩净孔内液体并拍干。

7.显色：每孔加入显色剂A50μl(或1滴)，然后每孔再加入显色剂B 50μl(或1滴)，避光室温显色10-15分钟。肉眼即可观察出结果，观察待测样品显色为蓝色的微孔所加的酶标抗体对应的蜂种信息(HRP标记兔抗中蜂蛋白或HRP标记兔抗意蜂蛋白)，就可以判断此蜂蜜样品是中蜂蜂蜜还是意蜂蜂蜜，如果两孔都为蓝色，则该蜂蜜样品为掺有意蜂蜂蜜的中蜂蜂蜜。显色判断可同时参考阳性对照。中蜂蜂蜜阳性对照加入HRP标记兔抗中蜂蛋白的孔显蓝色，加HRP标记兔抗意蜂蛋白的孔无色(如果洗板不干净，会有微弱蓝色，比阳性对照孔要浅)，意蜂蜂蜜阳性对照加入HRP标记兔抗中蜂蛋白的孔无色(如果洗板不干净，会有微弱蓝色，比阳性对照孔要浅)，加HRP标记兔抗意蜂蛋白的孔显蓝色。

本发明提出了一种检测中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，根据中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中MRJP2蛋白差异，制备了中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜同一性及特异性抗体，以双抗体夹心法开发了第一款中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜ELISA检测试剂盒。本发明通过ELISA检测试剂盒检测蜂蜜中的MRJP2，可以快速准确地检测中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。通过肉眼观察显色情况即可获悉蜂蜜的蜂种来源信息，满足了行业对快速方便检测的需求。

本发明方法中用于检测的MRJP2在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中稳定存在，其热稳定性良好，该ELISA检测试剂盒特异性和灵敏度良好，检测不受蜂蜜浓缩加工和货架期的影响。本ELISA检测试剂盒设计合理，方便快捷，检测准确，用于鉴定中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜蜂种来源的真实性以及相关产品检测，也适用于一定比例意蜂蜂蜜掺入中蜂蜂蜜中的鉴定。

附图说明

图1MRJP2基因表达结果的SDS-PAGE鉴定。其中A为中蜂MRJP2，B为意蜂MRJP2。泳道M：Protein Marker；泳道1：诱前样；泳道2-6：0.5mM IPTG诱后样。

图2MRJP2复性结果。其中A为中蜂MRJP2；B为意蜂MRJP2。泳道M：Protein Marker；泳道Sample：透析样。

图3MRJP2多克隆抗体效价的ELISA曲线。其中A为中蜂MRJP2多克隆抗体；B为意蜂MRJP2多克隆抗体。

图4是MRJP2原核表达可溶性分析SDS-PAGE结果。其中A为中蜂MRJP2，B为意蜂MRJP2。泳道M：Protein Marker；泳道1：未诱导样品；泳道2：诱导后样品；泳道3：37℃1.0mMIPTG诱后沉淀样；泳道4：37℃1.0mM IPTG诱后上清样；泳道5：37℃0.2mM IPTG诱后沉淀样；泳道6：37℃0.2mM IPTG诱后上清样；泳道7：15℃1.0mM IPTG诱后沉淀样；泳道8：15℃1.0mMIPTG诱后上清样；泳道9：15℃0.2mM IPTG诱后沉淀样；泳道10：15℃0.2mM IPTG诱后上清样。

图5是MRJP2表达优化的SDS-PAGE结果。其中A为中蜂MRJP2，B为意蜂MRJP2。泳道M：Protein Marker；泳道1：未诱导样品；泳道2-4：37℃1.0mM IPTG诱导后样品；泳道5-7：37℃0.2mM IPTG诱导后样品；泳道8-10：15℃1.0mM IPTG诱导后样品；泳道11-13：15℃0.2mMIPTG诱导后样品。

图6是中、意蜂蜂蜜抗体特异性和灵敏度验证。其中A是中蜂蜜抗体；B是意蜂蜜抗体。

图7是试剂盒灵敏度测试。

图8是试剂盒对盲样检测结果。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例对中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜ELISA检测试剂盒作进一步的说明。

实施例一本试剂盒的制备通过如下步骤实现。

(1)目标抗原及抗体制备方案的选择：MRJP2在西方蜜蜂中未表现出多态性现象，而其在中蜂上存在一定的多态性水平，且MRJP2在种间水平上的遗传差异较为明显，选择MRJP2蛋白作为相关抗体制备的目标蛋白。MRJPs性质相近，蜂蜜和王浆中单个王浆主蛋白成分难以实现高纯度分离。我们采取原核表达的方法得到中蜂和意蜂的MRJP2。

(2)中、意蜂MRJP2蛋白结构分析及序列优化：TMHMM Server V2.0在线分析软件进行跨膜结构域分析，中蜂和意蜂的MRJP2均无跨膜结构。Signal P 4.1预测结果显示，中蜂MRJP2N端的1-25个氨基酸为信号肽(SEQ.No.1:MTKWLFMVACLGIACQGAIIRQNS)，意蜂MRJP2N端的1-17个氨基酸为信号肽(SEQ.No.2:MTRWLFMVACLGIACQ)。

中蜂MRJP2去除1-25氨基酸，进行氨基酸序列优化，优化后的中蜂MRJP2序列如SEQ.No.3所示。

然后进行密码子优化，优化后的中蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.4所示。

意蜂MRJP2去除1-17氨基酸，进行氨基酸序列优化，优化后的意蜂MRJP2序列如SEQ.No.5所示。

然后进行密码子优化，优化后的意蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.6所示。

利用C端HIS标签纯化蛋白，在优化好的基因序列两端分别设计Nde I和Xho I酶切位点，然后进行基因合成，将合成好的基因片段插入pET-22b(+)表达载体中，构建重组质粒中蜂MRJP2-pET-22b(+)和意蜂MRJP2-pET-22b(+)。

(3)中、意蜂MRJP2表达载体的构建与结果鉴定：重组质粒中中蜂MRJP2插入大小为1341bp，意蜂MRJP2插入大小为1317bp。经过测序，与插入序列对比分析，确定优化后的中蜂MRJP2和意蜂MRJP2已正确插入载体pET-22b(+)。

(4)中蜂MRJP2与意蜂MRJP2原核表达：重组鉴定后的中蜂MRJP2-pET-22b(+)质粒与意蜂MRJP2-pET-22b(+)转化BL21(DE3)感受态细胞，得到对应的单克隆菌株。对0.5mMIPTG诱导后的样品(中蜂MRJP2样品5个、意蜂MRJP2样品5个)收菌制样后进行SDS-PAGE分析，在49kDa附近可以看到明显的蛋白表达带(图1)，表明中蜂和意蜂的MRJP2原核表达成功。

在最适培养条件进行原核表达，原核表达的中蜂MRJP2和意蜂MRJP2经亲和纯化后进行复性，复性后的样品进行SDS-PAGE分析，复性样条带单一(图2)，证明纯化复性后目的蛋白的纯度很高，复性后的样品透析后冻干保存。

(5)中蜂MRJP2和意蜂MRJP2的多克隆抗体制备、纯化及效价测定：以纯化后的中蜂MRJP2蛋白和意蜂MRJP2为抗原免疫兔子，免疫程序结束后获得血清，用ELISA方法检测血清中抗体效价，中蜂MRJP2和意蜂MRJP2抗体效价均大于192000(图3)。表明原核表达的中、意蜂MRJP2可以诱导新西兰大白兔产生良好的免疫反应。

用亲和柱对多克隆抗体进行纯化，得到中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性及特异性抗体。

(6)中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜ELISA检测试剂盒制备：采用双抗夹心ELISA方法，中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性抗体包被微孔板，与加入的中蜂或意蜂蜂蜜中的蛋白结合，再加入HRP标记的抗中蜂蜂蜜蛋白抗体、抗意蜂蜂蜜蛋白抗体来分别反应，最后用TMB底物系统显色，通过肉眼观察待测样品显色为蓝色的微孔所加的酶标抗体对应的蜂种信息(HRP标记兔抗中蜂蛋白或HRP标记兔抗意蜂蛋白)，就可以判断此蜂蜜样品是中蜂蜂蜜还是意蜂蜂蜜，如果两孔都为蓝色，则该蜂蜜样品为掺有意蜂蜂蜜的中蜂蜂蜜。显色判断可同时参考阳性对照。中蜂蜂蜜阳性对照加入HRP标记兔抗中蜂蛋白的孔显蓝色，加HRP标记兔抗意蜂蛋白的孔无色(如果洗板不干净，会有微弱蓝色，比阳性对照孔要浅)，意蜂蜂蜜阳性对照加入HRP标记兔抗中蜂蛋白的孔无色(如果洗板不干净，会有微弱蓝色，比阳性对照孔要浅)，加HRP标记兔抗意蜂蛋白的孔显蓝色。

实施例二本实施例对中蜂MRJP2和意蜂MRJP2原核表达的条件进行了确定。

转化后的大肠杆菌，以不同诱导条件进行培养，设置IPTG终浓度0.2mM和1mM两个组别，培养温度37℃下4h或者15℃下16h。目标在各条件下均有表达，各条件下的菌液离心收集沉淀后，进行破碎，上清可沉淀分别制样进行可溶性SDS-PAGE分析(图4)，原核表达的中蜂MRJP2蛋白在15℃诱导条件下可溶，而原核表达的意蜂MRJP2蛋白在各诱导条件下目的蛋白均以包涵体形式存在。

对中、意蜂MRJP2原核表达最适诱导条件进行确定，不同条件诱导结果见图5，确定中蜂MRJP2原核表达最适诱导条件为15℃诱导16h，IPTG终浓度为0.2mM。意蜂MRJP2原核表达最适诱导条件为37℃诱导4h，IPTG终浓度为0.2mM。

实施例三

本实施例中，我们对制备得到的特异性中蜂MRJP2抗体和特异性意蜂MRJP2抗体进行了特异性和灵敏度验证。

用纯化得到的中蜂蜂蜜MRJPs和意蜂蜂蜜MRJPs进行抗体特异性和灵敏度验证。中蜂蜂蜜MRJPs和意蜂蜂蜜MRJPs的浓度是2μg/mL，对抗体进行倍比稀释(抗体起始浓度为1mg/mL)，结果见图6，中蜂蜂蜜抗体的稀释倍数从2000倍-16000倍。意蜂蜂蜜抗体的稀释倍数从5000倍-160000倍。特异性中蜂蛋白抗体滴度大于160000，当滴度大于20000与意蜂蛋白无交叉反应(判定标准：意蜂蛋白OD450nm/空白对照OD450nm小于2.1)。特异性意蜂蛋白抗体滴度大于800000，当滴度大于50000与中蜂蛋白无交叉反应(判定标准：中蜂蛋白OD450nm/空白对照OD450nm小于2.1)。中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的特异性抗体效价很好，灵敏度也很高，满足试剂盒开发需要。

实施例四

本实施例中，我们对HRP标记中蜂MRJP2特异性抗体和HRP标记意蜂MRJP2特异性抗体的工作浓度范围进行了确定。

表1HRP标记的特异性中蜂MRJP2抗体工作浓度滴定

*结果表明：HRP标记的特异性中蜂MRJP2抗体稀释倍数1000-2000时与意蜂蛋白无交叉反应(判定标准：意蜂蛋白OD450nm/空白对照OD450nm小于2.1)，且灵敏度高。

表2HRP标记的特异性意蜂MRJP2抗体工作浓度滴定

*结果表明：HRP标记的特异性意蜂蛋白抗体稀释倍数4000-8000时与中蜂蛋白无交叉反应(判定标准：中蜂蛋白OD450nm/空白对照OD450nm小于2.1)，且灵敏度高。

最终确定HRP标记的特异性中蜂MRJP2抗体稀释倍数为1000-2000倍，HRP标记的特异性意蜂MRJP2抗体稀释倍数为4000-8000倍。

实施例四本实施例中我们对ELISA反应时间及温度等条件进行了确定。

表3中蜂MRJP2特异性抗体ELISA反应时间及温度优化

共同抗体包被浓度：2μg/ml中蜂蛋白浓度2μg/ml HRP中蜂抗体稀释1:1500

表4意蜂MRJP2特异性抗体ELISA反应时间及温度优化

共同抗体包被浓度：2μg/ml意蜂蛋白浓度2μg/ml HRP意蜂抗体稀释1:5000。

结果表明：ELISA在室温或37℃，样品反应时间和HRP标记抗体反应时间在15-30min，都能得到理想的结果。

实施例五本实施例中，我们对试剂盒的灵敏度进行了测试。

蜂蜜成分复杂，具有高糖高渗透压低pH等理化性质，为了测试试剂盒对蜂蜜直接检测的灵敏度，我们将蜂蜜样品进行倍比稀释，蜂蜜稀释倍数从100倍到3200倍，中、意蜂蜂蜜在稀释800倍时，仍然能显示出肉眼可见的蓝色(图7)，说明试剂盒抗体灵敏度很高，完全可以直接用于蜂蜜样品的检测，而不需要对蜂蜜中的蛋白进行提取浓缩。在所有稀释样品中，均未出现交叉反应，说明试剂盒特异性良好。

实施例六

为了验证此试剂盒的实用性，我们将意蜂蜂蜜与中蜂蜂蜜按不同比例混合，配制了24个不同掺和比例混合蜂蜜样品，样品蜂种来源信息见表5。

表5 24个盲样蜂种来源信息表

隐去蜂种来源信息，将这些样品和试剂盒交由具有ELISA操作技能的实验室其他人员检测，操作人员按照说明书进行操作，检测结果见图8，所有样品的蜂种特异性信息均得到验证，试剂盒特异性和灵敏度良好，通过了盲样检测，具有很好的实用性，可以检测出意蜂蜂蜜1％的掺入。

虽然上述实施例已对本发明作出了详尽的描述，但本发明的保护范围并不局限于此，还可对本发明的方案作出其不偏离中心的修改，它们都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 中蜂MRJP2蛋白信号肽(人工序列Unknown)

<400> 1

Met Thr Lys Trp Leu Phe Met Val Ala Cys Leu Gly Ile Ala Cys Gln

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ile Arg Gln Asn Ser

20

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 意蜂MRJP2蛋白信号肽(人工序列Unknown)

<400> 2

Met Thr Arg Trp Leu Phe Met Val Ala Cys Leu Gly Ile Ala Cys Gln

1 5 10 15

<210> 3

<211> 452

<212> PRT

<213> 优化后中蜂MRJP2蛋白质序列(人工序列Unknown)

<400> 3

Met Lys Asn Leu Glu Asn Ser Leu Asn Val Ile His Glu Trp Lys Tyr

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Glu Glu Arg Arg Gln Ala Ala Ile Gln

20 25 30

Ser Gly Glu Tyr Asp His Thr Lys Asn Tyr Pro Phe Asp Val Asp Gln

35 40 45

Trp His Asp Lys Thr Phe Val Thr Ile Leu Lys Tyr Asp Gly Val Pro

50 55 60

Ser Thr Leu Asn Met Ile Ser Asn Lys Ile Gly Lys Gly Gly Arg Leu

65 70 75 80

Leu Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Trp Ala Glu Asn Lys Asp Cys Ser

85 90 95

Gly Ile Val Ser Ala Phe Lys Ile Ala Ile Asp Lys Phe Asp Arg Leu

100 105 110

Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Ile Asn Arg Thr Glu Pro Ile Cys Ala

115 120 125

Pro Lys Leu His Val Phe Asp Leu Lys Asn Thr Lys His Leu Lys Gln

130 135 140

Ile Glu Ile Pro His Asp Ile Ala Val Asn Ala Thr Thr Gly Lys Gly

145 150 155 160

Gly Leu Val Ser Leu Val Val Gln Ala Met Asp Pro Met Asn Thr Leu

165 170 175

Val Tyr Ile Ala Asp His Lys Gly Asp Ala Leu Ile Val Tyr Gln Asn

180 185 190

Ser Asp Asp Ser Phe His Arg Met Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp

195 200 205

Pro Arg Tyr Ala Lys Met Thr Ile Asn Gly Glu Ser Phe Thr Leu Lys

210 215 220

Asn Gly Ile Cys Gly Met Ala Leu Ser Pro Val Thr Asn Asn Leu Tyr

225 230 235 240

Tyr Ser Pro Leu Ala Ser His Gly Leu Tyr Tyr Val Asn Thr Glu Pro

245 250 255

Phe Met Lys Ser Gln Phe Gly Asp Asn Asn Asn Val Gln Tyr Glu Gly

260 265 270

Ser Gln Asp Thr Leu Asn Thr Gln Ser Leu Ala Lys Ala Val Ser Lys

275 280 285

Asp Gly Val Leu Phe Val Gly Leu Val Gly Asn Ser Ala Leu Gly Cys

290 295 300

Leu Asn Glu His Gln Pro Leu Gln Arg Glu Asn Leu Glu Leu Val Ala

305 310 315 320

Gln Asn Glu Lys Thr Leu Gln Met Ile Ala Gly Met Lys Ile Lys Glu

325 330 335

Glu Leu Pro His Phe Val Gly Ser Asn Lys Pro Val Lys Asp Glu Tyr

340 345 350

Met Leu Val Leu Ser Asn Lys Met Gln Lys Ile Val Asn Asn Asp Phe

355 360 365

Asn Phe Asn Asp Val Asn Phe Arg Ile Leu Gly Ala Asn Val Lys Glu

370 375 380

Leu Met Arg Asn Thr His Cys Ala Asn Phe Asn Asn Lys Asn Asn Gln

385 390 395 400

Lys Asn Asn Asn Gln Lys Asn Asn Asn Gln Asn Asn Asn Asn Gln Lys

405 410 415

Asn Asn Asn Gln Lys Asn Asn Asn Gln Lys Asn Asn Asn Gln Lys Asn

420 425 430

Asn Asn Gln Lys Asn Asn Asn Gln Asn Thr Asn Asn Leu Glu His His

435 440 445

His His His His

450

<210> 4

<211> 1341

<212> DNA

<213> 优化后中蜂MRJP2序列(人工序列Unknown)

<400> 4

catatgaaga acctggaaaa tagtctgaat gttattcatg aatggaagta tatcgactat 60

gattttggta gcgaagaacg ccgtcaggcc gccattcaga gcggtgaata tgatcatacc 120

aaaaattatc cgttcgatgt ggatcagtgg catgataaaa cctttgttac cattctgaaa 180

tacgatggcg ttccgagtac cctgaatatg attagcaata agattggcaa aggtggccgc 240

ctgctgcagc cgtatccgga ttggagctgg gcagaaaata aggattgtag tggcattgtt 300

agcgccttta aaattgccat tgataaattt gaccgcctgt gggtgctgga tagcggtctg 360

attaatcgta ccgaaccgat ttgtgcaccg aaactgcatg tttttgatct gaaaaatacc 420

aaacacctga aacagattga aattccgcat gatattgcag tgaatgccac caccggtaaa 480

ggcggcctgg ttagcctggt ggttcaggca atggatccga tgaataccct ggtgtatatt 540

gccgatcata aaggtgacgc cctgattgtt tatcagaata gtgatgatag tttccatcgc 600

atgaccagta atacctttga ttatgatccg cgttatgcaa aaatgaccat taatggtgaa 660

agttttaccc tgaaaaacgg tatttgcggc atggccctga gcccggttac caataatctg 720

tattatagtc cgctggcaag ccatggcctg tattatgtta ataccgaacc gtttatgaag 780

agtcagtttg gtgacaataa taatgttcag tatgagggca gccaggatac cctgaatacc 840

cagagcctgg caaaagcagt tagtaaagat ggtgtgctgt ttgtgggcct ggtgggtaat 900

agcgccctgg gttgtctgaa tgaacatcag ccgctgcagc gtgaaaatct ggaactggtg 960

gcacagaatg aaaaaaccct gcagatgatt gccggcatga aaattaagga agaactgccg 1020

cattttgttg gcagtaataa gccggttaaa gatgaatata tgctggtgct gagcaataag 1080

atgcagaaaa ttgttaataa cgacttcaac ttcaacgatg tgaattttcg cattctgggc 1140

gccaatgtta aagaactgat gcgtaatacc cattgcgcaa attttaataa taagaacaac 1200

cagaagaaca acaaccagaa aaataataac cagaacaaca acaaccaaaa gaataataac 1260

caaaagaaca acaatcagaa gaacaataac cagaaaaaca acaatcaaaa gaacaataat 1320

cagaacacca acaatctcga g 1341

<210> 5

<211> 444

<212> PRT

<213> 优化后意蜂MRJP2蛋白质序列(人工序列Unknown)

<400> 5

Met Ala Ile Val Arg Glu Asn Ser Pro Arg Asn Leu Glu Lys Ser Leu

1 5 10 15

Asn Val Ile His Glu Trp Lys Tyr Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Glu

20 25 30

Glu Arg Arg Gln Ala Ala Ile Gln Ser Gly Glu Tyr Asp His Thr Lys

35 40 45

Asn Tyr Pro Phe Asp Val Asp Gln Trp Arg Asp Lys Thr Phe Val Thr

50 55 60

Ile Leu Arg Tyr Asp Gly Val Pro Ser Thr Leu Asn Val Ile Ser Gly

65 70 75 80

Lys Thr Gly Lys Gly Gly Arg Leu Leu Lys Pro Tyr Pro Asp Trp Ser

85 90 95

Phe Ala Glu Phe Lys Asp Cys Ser Lys Ile Val Ser Ala Phe Lys Ile

100 105 110

Ala Ile Asp Lys Phe Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val

115 120 125

Asn Arg Thr Val Pro Val Cys Ala Pro Lys Leu His Val Phe Asp Leu

130 135 140

Lys Thr Ser Asn His Leu Lys Gln Ile Glu Ile Pro His Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Asn Ala Thr Thr Gly Lys Gly Gly Leu Val Ser Leu Ala Val Gln

165 170 175

Ala Ile Asp Leu Ala Asn Thr Leu Val Tyr Met Ala Asp His Lys Gly

180 185 190

Asp Ala Leu Ile Val Tyr Gln Asn Ala Asp Asp Ser Phe His Arg Leu

195 200 205

Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Arg Tyr Ala Lys Met Thr Ile

210 215 220

Asp Gly Glu Ser Phe Thr Leu Lys Asn Gly Ile Cys Gly Met Ala Leu

225 230 235 240

Ser Pro Val Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Leu Ala Ser His Gly

245 250 255

Leu Tyr Tyr Val Asn Thr Ala Pro Phe Met Lys Ser Gln Phe Gly Glu

260 265 270

Asn Asn Val Gln Tyr Gln Gly Ser Glu Asp Ile Leu Asn Thr Gln Ser

275 280 285

Leu Ala Lys Ala Val Ser Lys Asn Gly Val Leu Phe Val Gly Leu Val

290 295 300

Gly Asn Ser Ala Val Gly Cys Trp Asn Glu His Gln Ser Leu Gln Arg

305 310 315 320

Gln Asn Leu Glu Met Val Ala Gln Asn Asp Arg Thr Leu Gln Met Ile

325 330 335

Ala Gly Met Lys Ile Lys Glu Glu Leu Pro His Phe Val Gly Ser Asn

340 345 350

Lys Pro Val Lys Asp Glu Tyr Met Leu Val Leu Ser Asn Arg Met Gln

355 360 365

Lys Ile Val Asn Asp Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe Arg Ile

370 375 380

Leu Gly Ala Asn Val Lys Glu Leu Ile Arg Asn Thr His Cys Val Asn

385 390 395 400

Asn Asn Gln Asn Asp Asn Ile Gln Asn Thr Asn Asn Gln Asn Asp Asn

405 410 415

Asn Gln Lys Asn Asn Lys Lys Asn Ala Asn Asn Gln Lys Asn Asn Asn

420 425 430

Gln Asn Asp Asn Leu Glu His His His His His His

435 440

<210> 6

<211> 1317

<212> DNA

<213> 优化后意蜂MRJP2序列(人工序列Unknown)

<400> 6

catatggcta ttgtgcgcga aaatagtccg cgtaatctgg aaaaaagcct gaatgtgatt 60

catgaatgga aatatttcga ctatgacttt ggtagtgaag aacgtcgcca ggccgccatt 120

cagagtggcg aatatgatca taccaaaaat tatccgttcg atgttgatca gtggcgtgat 180

aaaacctttg tgaccattct gcgctatgat ggtgtgccga gcaccctgaa tgtgatcagt 240

ggcaaaaccg gcaaaggtgg ccgcctgctg aaaccgtatc cggattggag ctttgccgaa 300

ttcaaagatt gtagtaaaat cgtgagcgcc tttaaaattg ccattgataa atttgaccgc 360

ctgtgggtgc tggatagtgg cctggtgaat cgtaccgtgc cggtttgtgc accgaaactg 420

catgtgtttg atctgaaaac cagtaatcat ctgaaacaga ttgaaattcc gcatgatatt 480

gccgttaatg caaccaccgg taaaggcggc ctggtgagcc tggcagttca ggccattgat 540

ctggcaaata ccctggttta tatggcagat cataaaggtg acgcactgat tgtgtatcag 600

aatgcagatg atagctttca tcgcctgacc agcaatacct ttgattatga tccgcgctat 660

gcaaaaatga ccattgatgg tgaaagtttt accctgaaaa atggcatttg tggcatggcc 720

ctgagtccgg tgaccaataa tctgtattat agcccgctgg ccagtcatgg tctgtattat 780

gttaataccg caccgtttat gaaaagtcag tttggcgaaa ataacgttca gtatcagggt 840

agtgaagata ttctgaatac ccagagtctg gcaaaagccg tgagcaaaaa tggtgttctg 900

tttgttggtc tggttggcaa tagcgcagtg ggttgctgga atgaacatca gagcctgcag 960

cgccagaatc tggaaatggt ggcccagaat gatcgtaccc tgcagatgat tgccggtatg 1020

aaaattaagg aagaactgcc gcattttgtt ggcagtaata agccggttaa agatgaatat 1080

atgctggttc tgagtaatcg catgcagaaa attgttaatg atgattttaa cttcgacgac 1140

gtgaattttc gtattctggg cgcaaatgtg aaagaactga ttcgcaatac ccattgcgtt 1200

aataataatc agaacgataa catccagaac accaataatc agaatgataa taaccagaag 1260

aacaacaaaa agaacgcaaa taatcagaag aacaataacc agaatgacaa tctcgag 1317

Claims

1.一种检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包含以下成分：包被中蜂MRJP2和意蜂MRJP2共有抗体的酶标板、HRP标记的特异性中蜂MRJP2抗体、HRP标记的特异性意蜂MRJP2抗体、样品稀释液、清洗液、TMB显色剂A、TMB显色剂B、阳性对照。

2.根据权利要求1所述的一种检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒，其特征在于，以制备得到的中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性和特异性抗体为基础，以双抗体夹心法建立中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测的ELISA方法。

3.权利要求1所述的一种检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，通过以下步骤获得：

(1)目标抗原的选择：选择MRJP2作为中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜抗体制备的目标蛋白；

(2)MRJP2的制备：确定原核表达纯化方案，优化MRJP2蛋白原核表达条件，得到中蜂MRJP2和意蜂的MRJP2；

(3)MRJP2多克隆抗体的制备纯化：制备中蜂MRJP2和意蜂MRJP2兔多克隆抗体，亲和纯化得到中蜂MRJP2和意蜂MRJP2的特异性和同一性抗体；

(4)试剂盒的制备：采用双抗夹心法，以中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性抗体包被微孔板，以HRP标记抗中蜂MRJP2抗体和抗意蜂MRJP2抗体，用TMB底物系统显色。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，中蜂MRJP2和意蜂MRJP2原核表达纯化方案为去除信号肽后进行序列优化，中蜂MRJP2N端的1-25个氨基酸为信号肽，其序列如SEQ.No.1所示:MTKWLFMVACLGIACQGAIIRQNS，意蜂MRJP2N端的1-17个氨基酸为信号肽，其序列如SEQ.No.2所示:MTRWLFMVACLGIACQ，中蜂MRJP2去除1-25氨基酸，进行氨基酸序列优化，优化后的中蜂MRJP2序列如SEQ.No.3所示，然后进行密码子优化，优化后的中蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.4所示，意蜂MRJP2去除1-17氨基酸，进行氨基酸序列优化，优化后的意蜂MRJP2序列如SEQ.No.5所示，然后进行密码子优化，优化后的意蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.6所示，利用C端HIS标签纯化蛋白，酶切位点选择Nde I和Xho I，表达载体选择pET-22b(+)，感受态细胞为大肠杆菌BL21；MRJP2蛋白原核表达条件范围为：温度15℃-37℃，时间4h-16h，IPTG终浓度为0.2mM-1.0mM；中蜂MRJP2原核表达最适诱导条件为15℃诱导16h，IPTG终浓度为0.2mM；意蜂MRJP2原核表达最适诱导条件为37℃诱导4h，IPTG终浓度为0.2mM。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述HRP标记的抗中蜂MRJP2抗体稀释倍数为1000-2000倍，HRP标记的抗意蜂MRJP2抗体稀释倍数为4000-8000倍。

6.权利要求1所述试剂盒在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜蜂种来源真实性的检测、意蜂蜂蜜掺假中蜂蜂蜜的检测，以及中、意蜂蜂蜜相关产品的检测。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：加样、洗板、加入HRP标记的中蜂MRJP2抗体和HRP标记的意蜂MRJP2抗体、洗板、显色。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，对蜂蜜样品进行直接检测，或对蜂蜜蛋白提取物进行检测时，蜂蜜样品稀释倍数为5-200倍，对蜂蜜蛋白提取物进行检测时，蜂蜜水溶性蛋白浓度检测范围为0.01μg/mL-10mg/mL，室温或37℃，蜂蜜样品反应时间和HRP标记抗体反应时间在15-30min。

10.根据权利要求书8所述的应用，其特征在于，通过肉眼观察待测样品显色情况，根据显色为蓝色的微孔所加的酶标抗体对应的蜂种信息，判断此蜂蜜样品是中蜂蜂蜜还是意蜂蜂蜜，如果两孔都为蓝色，则该蜂蜜样品为掺有意蜂蜂蜜的中蜂蜂蜜。