CN111733142B

CN111733142B - 抗意蜂mrjp1的单克隆抗体及胶体金检测卡

Info

Publication number: CN111733142B
Application number: CN202010816910.2A
Authority: CN
Inventors: 杨术鹏; 李熠; 周金慧
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2040-08-14
Also published as: CN111733142A

Abstract

本发明涉及生物技术和免疫检测领域，具体涉及抗意蜂MRJP1的单克隆抗体及胶体金检测卡。本发明提供了稳定分泌抗意蜂MRJP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F6 1D7和杂交瘤细胞株6F12 4B4，其分泌的抗体仅识别意蜂MRJP1蛋白，不识别中华蜜蜂MRJP1蛋白，而且具有特异性好、灵敏度高等优点，与其他家族相关蛋白无交叉反应。由所述抗体进一步研制出意蜂MRJP1的胶体金检测卡和试纸条，具有精密度高、批间差小等优势，实现了蜂产品中意蜂MRJP1的快速检测，尤其适用于中蜂蜜(土蜂蜜)中是否混入意蜂蜜的高效率、大批量检测。

Description

抗意蜂MRJP1的单克隆抗体及胶体金检测卡

技术领域

本发明涉及生物技术和免疫检测领域，具体涉及抗意蜂MRJP1的单克隆抗体及胶体金检测卡。

背景技术

意大利蜜蜂主要采用追花逐蜜的方式进行转地饲养，倾向生产单花蜂蜜，且产蜜量大，是我国商品蜂蜜的主要来源。由于消费需求和产量的不匹配，当前市场上流通的蜂蜜存在一定程度的掺假。蜂蜜掺假的形式很多，主要可以分为蜜种掺假、蜜源地掺假以及勾兑糖浆等，其中勾兑果葡糖浆是蜂蜜掺假的最主要形式，如何快速的辨别蜂蜜掺假，已经成为当前蜂产品消费行业亟需解决的重大产业问题。

与常见的意蜂蜜相比，中蜂蜜(土蜂蜜)的口感独特、色香俱佳，并成为人们消费的新宠。但是由于土蜂蜜产量较低，市场供不应求，导致土蜂蜜的价格是常见意蜂蜜的5-10倍。部分企业为了追逐高额利润，往往采用廉价的意蜂蜜冒充土蜂蜜，或者在土蜂蜜中勾兑意蜂蜜，欺骗消费者。当前尚未制定或者颁布有关土蜂蜜的标准及真实性评价方法。如何科学有效地鉴别土蜂蜜中勾兑意蜂蜜的行为，俨然已成为当前蜂产品行业亟需解决的又一重大产业问题。

蛋白质是蜂蜜中重要的营养物质，它是蜜蜂在酿制蜂蜜过程混入自身分泌物，如王浆主蛋白和多种酶类等物质。其中王浆主蛋白1(MRJP1)是蜂蜜中丰度最高的蛋白质，且含量相对稳定。因此，基于MRJP1的含量水平便可有效的鉴别蜂蜜是否勾兑糖浆。此外，中蜂蜜和意蜂蜜中的MRJP1属于同源性蛋白质，两者的一级结构的氨基酸序列和三维表面结构均存在一定的差异。基于中蜂和意蜂同源性蛋白质的差异，可以有效地区分两种蜂蜜的品种。鉴于此，本发明拟采用意蜂MRJP1作为免疫原，免疫小鼠，获得其高特异性的杂交瘤细胞株。其表达的抗体可以为后续建立相应的ELISA试剂盒和胶体金检测卡等提供材料，进而适用于意蜂蜜真实性的评价和土蜂蜜中是否掺入了意蜂蜜的鉴别。

发明内容

为了提供只识别意蜂MRJP1蛋白，不识别中蜂MRJP1蛋白的特异性好、灵敏度高的抗体，本发明首先采用高纯度的意蜂MRJP1作为抗原，通过多次免疫小鼠，获得抗意蜂MRJP1的单克隆抗体或多克隆抗体。在研发过程中，本发明将所制备的抗原纯化后免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合技术制备融合细胞；进行半固体和液体融合共10板，一共获得阳性细胞株125株；其中，效价值为1.0-2.0区间的有75株，效价值大于2.0的有50株。经过与同源家族蛋白和天然蛋白的检测之后，去除跟同源家族蛋白有交叉反应，且不识别天然蛋白MRJP1的细胞株，最终获得8株MRJP1融合细胞株。8株全部进行一亚，一亚检测后筛选出6株二亚，经过三轮的亚克隆，最终定株杂交瘤细胞株5株，并进行后续抗体表位检测及配对实验。抗原表位配对检测与2G5具有不同表位的细胞株分别为2F12/1F6/12A2/12E4/6F12，接着进行下一步的配对初筛。抗体配对初筛结果表明，就灵敏度而言，6F12 4B4和1F6 1D7配对组合灵敏度较高，且标曲线性及测样均符合预期，其在应用于MRJP1检测或者相关的试剂盒或试纸条的制备时，具有更好的效果。

基于上述发现，本发明提供了抗意蜂MRJP1的单克隆抗体杂交瘤细胞株6F12 4B4和杂交瘤细胞株1F6 1D7，并将其分别提交相关的机构进行保藏。其中，杂交瘤细胞株6F124B4的微生物保藏编号为：CGMCC NO.19954；分类命名为：BalB/c小鼠杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株1F6 1D7的微生物保藏编号为：CGMCC NO.19955；分类命名为：BalB/c小鼠杂交瘤细胞株。两株细胞株的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2020年7月1日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮编为100101。

本发明进一步提供一种抗意蜂MRJP1的单克隆抗体6F12 4B4，其由杂交瘤细胞株6F12 4B4获得，所述杂交瘤细胞株6F12 4B4的保藏编号为CGMCC NO.19954。

本发明进一步提供一种抗意蜂MRJP1的单克隆抗体1F6 1D7，其由杂交瘤细胞株1F6 1D7分泌获得，所述杂交瘤细胞株1F6 1D7的保藏编号为CGMCC NO.19955。

本发明进一步提供一种用于检测意蜂MRJP1的试剂、试纸或试剂盒，其含有所述的单克隆抗体6F12 4B4或所述的单克隆抗体1F6 1D7。

本发明进一步提供一种用于检测意蜂MRJP1的试剂盒或试纸条，其含有所述的单克隆抗体6F12 4B4和所述的单克隆抗体1F6 1D7，所述单克隆抗体6F12 4B4和单克隆抗体1F6 1D7中的一种为检测抗体，另一种为捕获抗体。

作为优选，以所述单克隆抗体1F6 1D7为捕获抗体，以所述单克隆抗体6F12 4B4为检测抗体。

本发明进一步提供一种检测意蜂MRJP1的胶体金检测卡，含有所述的单克隆抗体6F12 4B4和所述的单克隆抗体1F6 1D7，以所述单克隆抗体6F12 4B4为胶体金颗粒标记抗体，以所述单克隆抗体1F6 1D7为捕获抗体。

按照常规，所述的胶体金检测卡还包括吸管和干燥剂等。

其中，所述的胶体金检测卡具有方便、快速、灵敏等特点，适用于现场大批量样本检测，可通过双抗体夹心ELISA法高特异性、高灵敏度地检测到MRJP1，工作原理或使用方法如下：

检测卡含有被事先固定于硝酸纤维素膜测试区（T）的抗原和控制区（C）的Ⅱ抗以及固定于结合垫上的金标抗体。若样本为阳性，加样后在 T 区出现一条紫红色条带；若样本为阴性性，则T区不会出现紫红色条带。无论样本中是否有意蜂MRJP1蛋白存在，C区都会出现一条紫红色条带。

本发明进一步提供一种检测意蜂MRJP1的方法，使用所述的单克隆抗体6F12 4B4，或者使用所述的单克隆抗体1F6 1D7，或者使用所述的试剂、试纸条或试剂盒，或者使用所述的胶体金检测卡。

本发明进一步提供所述的单克隆抗体6F12 4B4，或者所述的单克隆抗体1F6 1D7，或者所述的试剂、试纸条或试剂盒，或者所述的胶体金检测卡在评价蜂产品真实性中的应用。

本发明进一步提供所述的单克隆抗体6F12 4B4，或者所述的单克隆抗体1F6 1D7，或者所述的试剂、试纸条或试剂盒，或者所述的胶体金检测卡在检测意蜂MRJP1中的应用；优选在检测样品中意蜂MRJP1含量中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（1）本发明中的抗体可只识别意蜂MRJP1蛋白，不识别中蜂MRJP1蛋白，而且具有特异性好、灵敏度高等优势。

（2）应用本发明的胶体金检测卡采用双抗体加心ELISA法定量测定样本中MRJP1含量的结果表明，本发明的胶体金检测卡精密度实验结果表明，批内差CV%<8%，批间差CV%<10%；特异性实验结果表明，本发明试剂盒特异性检测意蜂MRJP1，与中蜂MRJP1及其他同源家族相关蛋白均无交叉反应。

（3）本发明为土蜂蜜的真实性评价和掺假鉴别提供了方法支撑，同时为维护中蜂产业的健康发展提供了科技保障。

附图说明

图1为天然意蜂MRJP1蛋白(抗原)的SDS-PAGE图；图中，Lane1为抗原，Lane2为Marker。

图2为不同批次免疫得到的血清的效价检测结果；其中，A图为第一批三免效价结果；B图为第一批四免效价结果；C图为第二批三免效价结果；D图为第二批四免效价结果。

图3为不同细胞株的细胞培养上清的western-boltting鉴定结果；图中，Lane1：杂交瘤细胞培养上清2G5 1E6原液；Lane2：杂交瘤细胞培养上清2F12 3B5原液；Lane3：杂交瘤细胞培养上清1F6 1D7原液；Lane4：杂交瘤细胞培养上清6F12 4B4原液；Lane5：SP2/0细胞培养上清；Lane6为Marker。

图4为抗体纯化后的SDS-PAGE图；图中，A图~C图分别为2G5 1E6、1F6 1D7和6F124B4的检测结果，其中，Lane1依次对应为2G5 1E6、1F6 1D7和6F12 4B4，Lane2为Marker。

图5为抗体抗体效价检测结果图。

图6为抗体WB验证蜂王浆样本结果图；图中，Lane1为2G5 1E6纯化抗体5µg/ml，Lane2为1F6 1D7纯化抗体1µg/ml，Lane3为6F12 4B4纯化抗体1µg/ml，Lane4为Marker。

图7为1F6作为捕获抗体，6F12作为检测抗体的标曲线性结果。

图8为MRJP1胶体金试纸条可能出现的四种结果示意图；

图9为MRJP1特异性试验中的实际检测结果图；

图10为MRJP1重复性试验中的实际检测结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂均为市售商品。

实施例1 意蜂王浆主蛋白1的单克隆抗体制备

一、抗原的获取

蜂王浆中含有丰富的王浆主蛋白1，基于文献报道方法，获得纯度较高的意蜂MRJP1的蛋白质，将其作为抗原免疫小鼠，旨在获得高特异性的抗体。采用SDS-PAGE检测获得抗原的纯度，结果见图1；图中，Lane1为MRJP1纯化蛋白，Lane2为Marker。由图1可知，本发明采用的抗原纯度较高，无干扰蛋白质。随后将纯度达到要求的抗原至于透析带中，4 ℃以1×PBS透析（换液2次），4 ^oC超滤浓缩透析产物。

二、抗体的制备

（一）、小鼠免疫及血清效价评价

1. 免疫Balb/c小鼠，8周左右成年雌性，抗原与等体积完全佐剂（首免）和不完全佐剂（加强免疫）混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:50000后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于PBS中，具体免疫程序见表1。

表1 小鼠免疫程序

2. 免疫后效价检测方法：间接法检测血清效价，具体方法如下：

1）包被：将抗原按1 µg/mL浓度包被96孔板每孔50 µL， 4 ^oC过夜；

2）封闭：5%的脱脂牛奶封闭液200 µL/孔，37 ^oC恒温箱放置2 h，TBST洗4遍；

3）一抗：加入抗血清，用样稀将血清按 1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000依次进行倍比稀释；

4）37 ^oC温育1 h后洗板4次，加二抗，用酶稀按1:10000稀释Jackson二抗，100 µL/孔，37 ^oC温育1 h；

5）洗板4次后显色：加底物溶液100 µL/孔，37 ^oC恒温箱放置5～10 min；

6）终止反应、比色：加30 µL/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450 nm的吸光值。

血清效价结果

效价检测结果见表2和图2。

表2 血清效价检测结果

根据效价检测结果可见，免疫后小鼠血清效价好，灵敏度较高，完全满足后续实验要求。

（二）、细胞融合

末次冲击3天后，摘除眼球处死，并收集阳性对照血，取出脾脏，制备成单细胞悬液，然后取出处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合1:10，50% PEG1450作用1 min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含20%胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×10⁷/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5% CO₂，37 ℃下培养。具体步骤如下：

1）脾细胞：小鼠解剖取出免疫好的脾脏，并分离脾脏中的淋巴细胞；

A. 在超净工作台中准备一个1.5 mL EP管，加入1 mL无血清培养基，两个3.5 cm培养皿，加入2 mL无血清培养基，两支15 mL离心管，其中一支加入10 mL无血清培养基，手术器械（高压湿热灭菌），绢网，移液器（1 mL），枪头。

B. 取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过断颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中5 min，放蜡盘上固定后剪开脾脏上皮肤，用镊子取出脾脏，放在1.5 mL 离心管中。

C. 将脾脏转移到超净台里的其中一个3.5 cm 培养皿中，摘除脾脏上面的脂肪和结缔组织，洗一遍，铺开一张绢网放在培养皿盖子上，将脾脏轻轻挤破，放在绢网中间位置。将绢网两次对折，用移液器吸取无血清培养基轻轻吹散，用研磨棒研磨，使脾脏内淋巴细胞透过绢网制成单细胞悬液，收集单细胞悬液于15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。

2）SP2/0准备：取瘤分离制备单细胞悬液后，1000 rpm，离心5 min后弃掉上清，10-20 mL DMEM（根据瘤子大小而定）重悬并混匀，利用淋巴细胞分离液进行分离，其与DMEM体积比为1:1，缓慢滴加分离液于重悬的细胞中，然后2500 rpm，离心15 min，后小心放置到超净工作台上，用移液枪将中间一层乳白色的晕圈转移至新的离心管中（事先准备好30 mLDMEM于管中），1000 rpm，离心5 min，最后弃掉上清，收集细胞于10 cm培养皿中，用10%的胎牛血清调整状态并扩大培养待用。

3）饲养层细胞准备：将健康的Balb/c小鼠在无菌条件下取出其脾脏，并用含20%胎牛血清的HAT培养基制成单个脾细胞悬液，然后根据铺板数量，预先将其铺入到96孔板中。

4）终止液：基础培养基DMEM 20 mL预先放入37 ℃水浴锅中孵育。

（三）、细胞建株

1. 融合板检测

待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测（检测方法为ELISA方法）在ELISA质控合格（即阴性对照<0.2，阳性对照>1.0）后挑选阳性孔（一般OD450≥0.5）作亚克隆。

）检测方法：效价检测-间接ELSIA

（1）抗原包被：用包被液稀释抗原到 1 µg/mL，100 μL/孔加入聚苯乙烯 96 孔反应板中，4 ℃放置过夜。

（2）洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗 3 次。

（3）封闭：加200 μL/孔封闭液，37 ℃恒温箱放置2h。

（4）洗涤：用洗涤液洗 3 次。

（5）加待测样品(一抗)：细胞培养上清原液，其中抗血清做阳性对照，空白血清做阴性对照，稀释好之后均每孔100 µL，37℃温育1h。

（6）洗涤：用洗涤液洗 3 次。

（7）加酶标抗抗体：加入 HRP标记羊抗鼠IgG（1:10000，酶稀稀释），100 µL/孔，37℃孵育40 min。

（8）洗涤：用洗涤液洗 5 次，蒸馏水洗 2 次。

（9）显色：加新鲜配制的底物溶液 100 μL/孔，室温暗处放置 5-30 min

（10）终止反应、比色：加 50 μL/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定 450 nm处各孔的吸光值。

）细胞融合检测结果

半固体和液体融合共10板，进行间接ELISA的检测，一共获得识别MRJP1重组蛋白的阳性细胞株125株；其中效价值OD450>2.0的有50株；OD450在1.0-2.0之间的有75株。

天然样本检测筛选

将意蜂蜂王浆样本进行纯化，获得纯度较高的MRJP1天然蛋白，通过多次免疫小鼠，获得杂交瘤细胞株，进行MRJP1天然蛋白的ELISA检测筛选。

）检测方法：效价检测-间接ELSIA（具体方法同上）

2）检测结果

将上述重组蛋白效价值OD450>1.0的125株细胞株进行天然蛋白MRJP1的检测，共获得阳性克隆18株，且OD450>2.0。

特异性细胞株筛选

经过与重组蛋白MRJP1和天然蛋白MRJP1共筛选检测后，下一步进行家族同源蛋白的交叉反应检测，去除有交叉反应的细胞株，最终获得8株只识别MRJP1的杂交瘤细胞株，根据表3的部分结果可见，MRJP1与其余四种重组蛋白共有7株交叉，3株MRJP1效价降低。

表3 MRJP1特异性细胞株筛选结果

3. 亚克隆方法及检测

从上述结果中挑出融合板中检测阳性值高的孔进行有限稀释，以每板60%的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆5-7天即可进行ELISA检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。

第一次亚克隆检测

结果见表4。

表4 第一次亚克隆结果

B. 第二次亚克隆

结果见表5。

表5 第二次亚克隆结果

MRJP1阳性较多，融合检测后筛选出8株阳性，全部进行一亚，一亚检测后筛选出6株二亚，二亚检测后挑选阳性克隆5株进行扩大，经过两轮的亚克隆，最终定株杂交瘤细胞株6株，挑选了其中亲和力较高的1株制备抗体，进行后续抗体表位检测和配对实验。

株细胞株定株及亚型鉴定

将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株（见表6），扩大培养于24孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用ELISA梯度稀释及WB验证其稳定性，收集细胞扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出较高的1-3株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存。

表6 5株细胞株的亚型鉴定

5. 细胞株冻存鉴定

在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株；③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌.真菌.支原体等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作ELISA，以确定是否分泌阳性抗体的同时做western-boltting的鉴定，结果见图3。

其中，

Antigen:

All lanes：意蜂蜂王浆样本1:300稀释 5µL/2*loading buffer

Primary antibody:

Lane1：杂交瘤细胞培养上清2G5 1E6原液

Lane2：杂交瘤细胞培养上清2F12 3B5原液

Lane3：杂交瘤细胞培养上清1F6 1D7原液

Lane4：杂交瘤细胞培养上清6F12 4B4原液

Lane5：SP2/0细胞培养上清

Second antibody: 羊抗鼠IgG(H+L)-HRP(1:5000)

Marker：250/130/95/72/55/43/34/26/17（kDa）。

腹水制备

制备腹水，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中。细胞定株后扩大培养选用10%胎牛血清培养基，当细胞密度达到以1×10⁶-2×10⁶/mL时，800 rpm离心，收集沉淀，并用PBS重悬后，腹腔注入到小鼠（液体石蜡）体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。

抗体纯化

1) 检测步骤如下：

（1）纯化柱安装及洗涤：依次在铁架台上安装纯化柱、加样斗和节流管，纯化水200-300ml，10ml/min洗涤柱床。

（2）样品过滤稀释：腹水用12000rpm离心5min，收上清，先用0.02mMPB稀释10倍，再用0.22um滤膜过滤之后上样。

（3）柱料平衡及上样：用1%乙酸钠10ml/min洗涤柱床至穿透液PH与1%乙酸钠一致，加入稀释样液，以0.5ml/min过柱。收集穿透液重新上柱3-5遍。

（4）洗杂：用1%乙酸钠10 ml /min洗涤柱床直至用100µLG250工作液测1滴穿透液不变蓝。

（5）洗脱：用3.5%冰乙酸溶液以0.5ml/min过柱，收集穿透液直至用100µLG250工作液测1滴穿透液不变蓝。边收集穿透边用饱和碳酸钠溶液调节PH至中性。

（6）洗涤：纯化水200-300ml，10ml/min洗涤柱床直至穿透液PH与纯化水一致。

（7）超滤：将洗脱液加入超滤浓缩管，托盘天平平衡；4℃、3500rpm超滤20min。

（8）透析：纯化水洗净透析袋，置于1*PBS中低速搅拌，4℃透析过夜。

（9）收样及质控：收集透析液，离心之后收集上清，抽检样品并质控。

）检测结果

检测结果见表7和图4。

表7 3株细胞株收获小鼠腹水情况

在图4中，A图~C图分别为2G5 1E6、1F6 1D7和6F12 4B4的检测结果，其中，Lane1依次对应为2G5 1E6、1F6 1D7和6F12 4B4，Lane2为Marker。

Marker浓度为0.1 mg/mL，上样5 µL；

Marker分子量116/66.2/45/35/25/18.5/14.5kDa；

抗体2G5 1E6稀释2倍后上样5 µL；

抗体1F6 1D7稀释4倍后上样5µL；

抗体6F12 4B4原液上样5 µL；

SDS质控结果：抗体2G5 1E6浓度约2.5 mg/ml，纯度90%；抗体1F6 1D7浓度约5 mg/mL，纯度90%；抗体6F12 4B4浓度约1 mg/mL，纯度90%。

NanoDrop 2000结果：抗体2G5 1E6浓度2.7 mg/mL；抗体1F6 1D7浓度5.1 mg/mL；抗体6F12 4B4浓度1.2 mg/mL。

抗体验证

1) 抗体效价检测结果：

结果见图5。

）抗体WB验证蜂王浆样本

结果见图6。图中：

Antigen:

All lanes：意蜂蜂王浆样本1:300稀释 5 µL/2*loading buffer

Primary antibody:

Lane1：2G5 1E6纯化抗体5 µg/mL

Lane2：1F6 1D7纯化抗体1 µg/mL

Lane3：6F12 4B4纯化抗体1 µg/mL

Second antibody: 羊抗鼠IgG(H+L)-HRP(1:5000)

Marker：250/130/95/72/55/43/34/26/17（kDa）。

（四）、抗体表位检测及抗体配对筛选

具体步骤如下：

1）经过亲和力以及样本检测，选择2G5 1E6制备抗体，并标记生物素，摸索最佳的稀释比例；

2）包被：用CBS包被对应的抗原，浓度为1 µg/mL，100 µL/孔，37 ℃2小时；

3）封闭：5% PBS的脱脂奶粉或者2% PBS的BSA封闭，4 ℃过夜；

4）一抗：将标记的抗体和检测的抗体均按照方阵摸索的稀释度稀释；阴性对照：50µL标记抗体+50 µL自身抗体；阳性对照：50 µL标记抗体+50 µL无关抗体；

5）二抗：羊抗鼠或者兔抗鼠均可，100 µL/孔，37 ℃1 h；

6）底物：根据标记的酶选择合适的底物，100 µL/孔，10 min；

7）显色，终止，读数。

抗体表位结果见表8。

表8 抗体表位结果

从表8的抗体表位检测结果可见，与2G5 1E6具有不同表位的细胞株有5株，下一步进行配对初筛。

实施例2 双抗体夹心ELISA实验建立

1.实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗MRJP1抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗MRJP1抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的MRJP1呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），计算样本浓度。

标准曲线图及标准曲线线性范围

1）抗体配对初筛

具体步骤如下：

A包被：将待测的抗体2 µg/mL包被，37 ℃ 2 h；

B 封闭： 5%的脱脂牛奶封闭液200 µL/孔，4 ℃过夜，TBST洗4遍；

C 标品及样本：标准品及样本按照图中备注信息添加到96孔中，100 µL/孔，37 ℃2 h；

D 二抗：生物素标记的抗体按照推荐的稀释比例加入96孔中，100 µL/孔，37 ℃1h；

E 二二抗：HRP-avidin，目前使用浓度1：4000，100 µL/孔，37 ℃ 1 h；

F 底物：90 µL/孔，37 ℃放置5-15 min；

G 终止反应、比色：加30 µL/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450 nm的吸光值。

配对筛选结果见表9。

表9 不同单克隆抗体夹心法配对结果

2）检测结果

根据表9的配对筛选结果可见，1F6作为捕获抗体，6F12作为检测抗体，标曲线性（见图7）和样本测值较好，符合预期，下一步进行胶体金产品的研发。

实施例3 MRJP1胶体金检测实验建立

1实验方案

1.1 材料

本实验所用到的蜂王浆及蜂蜜样本均由蜂场现场购买。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 试剂：MRJP1单克隆抗体对自主研发，羊抗鼠IgG-HRP二抗购自Jackson，硝酸纤维素膜为美国Millipore公司产品，氯金酸购自天津化工厂，柠檬酸三钠购自广州试剂厂，实验室用水为超纯水，所有化学试剂均为分析纯级别。

1.2.2 仪器：高速冷冻离心机为湘仪TGL-16，CO2培养箱为Thermo二氧化碳培养箱3111，接触式喷膜机为美国Imagene Technology Inc公司产品，NanoDrop 2000C分光光度计为美国Thermo Fisher。

1.3方法

1.3.1 MRJP1胶体金免疫层析方法的建立

1.3.1.1 抗体标记最适pH的选择：

用0.02% 20 nm胶体金标记MRJP1单克隆抗体6F12 4B4（简称单抗1），用胶体金梯度法确定抗体与胶体金结合的最适pH值。具体如下：

（1）取9支小玻璃试管，分别加入1 mL制备好的胶体金溶液；

（2）用0.2 mol/L碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH分别调为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5；

（3）取50µL 1 mg/mL的MRJP1单抗1加入上述胶体金管中，混匀后室温放20 min；

（4）然后每管分别加入100 µL 10%NaCl溶液，混匀，室温静置1-2 h；

（5）观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH；

（6）再将pH调为梯度最低pH±0.1；重复上述试验。记录仍保持红色的最低pH，即为最适pH。

1.3.1.2 抗体最适标记量的选择：

采用蛋白梯度法确定MRJP1单抗1与胶体金结合的最适浓度。具体如下：

（1）取10支小玻璃试管，分别加入1ml调到最适PH胶体金溶液；

（2）将MRJP1单抗1用纯化水稀释成1 mg/mL，各取0、5、10、20、30、40、60、80 µL按顺序加入上述小试管中混匀；

（3）放置10 min后，在每一小试管中加入10%NaCl水溶液0.1 mL，混匀，室温静置1-2 h，观察结果；

（4）观察小试管颜色变化，对照管和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的试管，呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入的蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持红色不变，找出胶体金液由红变蓝的交界管，其所含的蛋白量即为稳定1 mL胶体金所需的最小蛋白量。实际胶体金探针制备工作中，加入的抗体量往往为最小蛋白量的120%-130%。

1.3.1.3 胶体金探针的制备和纯化：

将最适pH胶体金溶液20 mL加入MRJP1单抗1中，在室温下搅拌30 min，制得胶体金－抗体结合物溶液，将10%BSA 2 mL加入制得的胶体金－抗体结合物溶液中（终浓度0.4%），室温搅拌10 min，或者加入10%聚乙二醇（MW20000）0.2 mL，室温搅拌10 min，9000-11000 r/min离心40-60 min，弃去上清，沉淀溶于2 mL胶体金－抗体保存液中，用0.45 µm滤膜过滤，所得即为胶体金－抗体结合物原液。

1.3.1.4 胶体金－抗体结合物原液工作浓度的确定和金标垫的制备：

用工作液将胶体金－抗体结合物原液按1:2、1:4、1:8、1:16进行稀释，取1.4 mL胶体金－抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，置37 ℃烤干，即为金标垫，测试后确定胶体金标记抗体的最适工作浓度。

1.3.1.5 不同型号硝酸纤维素膜的选择：

选择几种不同型号的NC膜，通过跑板功能测试、胶体金溶液在不同型号NC膜上流动性、滞后度和背景残留的测试和NC膜的重新选择测试等试验，确定最适型号的NC膜。

1.3.1.6 检测线（T线）及质控线（C线）条件的建立和优化：

将NC膜上T线及C线的包被抗体设置如下几个浓度梯度：1 mg/mL、1.5 mg/mL、2mg/mL、2.5 mg/mL，选择显色效果最优的一组作为MRJP1单克隆抗体1F6 1D7（简称单抗2）使用浓度（T线）和羊抗鼠IgG抗体使用浓度（C线）。

1.3.1.7 T线及C线的点膜：

用0.01mol/L PH8.0 PBS 将MRJP1单抗2和羊抗鼠IgG抗体分别稀释至所需浓度，用划膜机在NC膜上点膜。T线与C线的距离为0.5 cm，参数均为1 µL/cm，喷好的NC膜置37 -45℃烤干干燥8 h以上。

1.3.2 MRJP1胶体金试纸条的组装和结果判定

1.3.2.1 组装：

（1）将PVC底板切成宽2.8 mm×长6 cm的条；

（2）在PVC底板中间粘贴抗体固相NC膜，距离上段1.5 cm；

（3）在PVC底板下端（即靠近NC膜的T线端）粘贴玻璃纤维膜探针条带，并与固相抗体NC膜重叠0.1 cm，然后在下端粘贴1.7 cm宽样本垫（玻璃纤维膜）与探针条带重叠0.1-0.2 cm；

（4）在PVC底板上端（即靠近NC膜的C线端）粘贴1.7 cm宽的吸水纸，并与抗体固相NC膜重叠0.1-0.2 cm；

（5）切成2.8 mm宽的试纸条。

1.3.2.2 结果判定：

将随机抽取的试纸条检测卡，向加样孔中滴加60 µL处理好的待检样品，室温下反应15 min。可能出现的四种结果见图8，观察结果，阳性反应出现上下2条红色条带，阴性反应只在C线出现1条红色条带。C线必须显色，否则说明该试纸条无效。

1.3.3 MRJP1胶体金免疫层析方法的建立

1.3.3.1 胶体金标记的最适pH确定：

经胶体金梯度法试验确定MRJP1单抗1与胶体金结合的最适pH为8.0。

1.3.3.2 抗体最适标记量的确定：

经蛋白梯度法试验显示，MRJP1单抗1稳定1 mL胶体金所需的最小抗体量为10 µg/mL。

1.3.3.3 胶体金探针的制备和纯化：在1 mL胶体金－抗体结合物溶液中加入10%Nacl水溶液1 mL后，溶液仍为无沉淀的紫红色液体，说明制得的胶体金－抗体结合物原液具有良好的稳定性。

1.3.3.4 胶体金－抗体结合物原液工作浓度的确定和金标垫的制备：经试验测试结果显示，当胶体金－抗体结合物原液的工作浓度为1:4时，制得的金标垫检测效果最佳。

1.3.3.5 NC膜型号的选择：通过跑板功能测试、层析性能测试和重新选择试验，综合评定后，NC膜型号为赛多利斯CN140。

1.3.3.6 检测线（T线）及质控线（C线）条件的建立和优化：对NC膜上T线及C线的包被抗体设置几个浓度梯度进行试验，结果表明，检测显色效果最优的一组浓度：MRJP1单抗2（T线上）工作浓度为2 mg/mL，羊抗鼠IgG抗体（C线上）工作浓度为1 mg/mL。

1.3.4 MRJP1胶体金结果判定

随机抽取试纸条，对MRJP1阴性样品和阳性样品进行检测，结果显示，阴性样品仅在C线出现一条玫瑰红线，阳性样品出现T线、C线2条玫瑰红线，说明制备的试纸条有效。

1.3.5 MRJP1特异性试验

用样本稀释液代替样品，对试纸条特异性进行测定，结果（见图9）显示，PBS和阴性样品仅在Ｃ线出现1条玫瑰红线；阳性样品出现T线、C线２条玫瑰红线，说明MRJP1胶体金试纸条只与意蜂MRJP1蛋白发生特异性反应反应，而不能与中蜂MRJP1蛋白有交叉反应。

1.3.6 MRJP1检测卡和试纸条在实际样本中的应用

检测卡和试纸条分别检测2种意蜂蜜样本和2种中蜂蜜样本。蜂蜜样本用10倍PBS进行稀释，取100-250 μL点样进行检测，10-20 min查看结果。结果(见图10)表明意蜂蜜样本为T线和C线均显色，表明蜂蜜样本中含有意蜂MRJP1；而中蜂蜜样本为T线不显色，C线显色，表明蜂蜜样本中不含有意蜂MRJP1。因此，本发明提供的检测卡和试纸条具有鉴别中蜂蜜掺假的能力，尤其适用于中蜂蜜是否混入意蜂蜜的诊断。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种用于检测意蜂MRJP1的试剂盒或试纸条，其特征在于，含有单克隆抗体6F12 4B4和单克隆抗体1F6 1D7，所述单克隆抗体6F12 4B4由保藏编号为CGMCC NO.19954的杂交瘤细胞株6F12 4B4分泌获得，所述单克隆抗体1F6 1D7由保藏编号为CGMCC NO.19955的杂交瘤细胞株1F6 1D7分泌获得；

以所述单克隆抗体1F6 1D7为捕获抗体，以所述单克隆抗体6F12 4B4为检测抗体。

2.一种检测意蜂MRJP1的胶体金检测卡，其特征在于，含有单克隆抗体6F12 4B4和单克隆抗体1F6 1D7，所述单克隆抗体6F12 4B4由保藏编号为CGMCC NO.19954的杂交瘤细胞株6F12 4B4分泌获得，所述单克隆抗体1F6 1D7由保藏编号为CGMCC NO.19955的杂交瘤细胞株1F6 1D7分泌获得；

以所述单克隆抗体6F12 4B4为胶体金颗粒标记抗体，以所述单克隆抗体1F6 1D7为捕获抗体。

3.一种检测意蜂MRJP1的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的试剂盒或试纸条，或者使用权利要求2所述的胶体金检测卡。

4.权利要求1所述的试剂盒或试纸条，或者权利要求2所述的胶体金检测卡在评价蜂产品真实性中的应用。