CN105693858A

CN105693858A - 针对蜂蜜中mrjp1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒

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Publication number: CN105693858A
Application number: CN201610146713.8A
Authority: CN
Inventors: 沈立荣; 王然; 王一然; 谌迪; 张帆; 张一帆; 沈苗宏; 辛晓璇
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2016-03-15
Publication date: 2016-06-22

Abstract

本发明公开了一种针对蜂蜜中MRJP1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒。所述的MRJP1的特异性多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQ ID NO：1所示；所述的MRJP1的特异性多肽M5的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQ ID NO：2所示；然后免疫新西兰白兔。ELISA双抗夹心法，按以下步骤进行处理：包被捕获抗体SP-1，封闭，洗涤，加入抗原，加入酶标的检测抗体HRP-SP-2，洗涤，加显色底物，加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450 nm-630 nm。所述的抗原为待测蜂蜜或已知蜜源的纯蜂蜜，通过比较待测蜂蜜和已知蜜源的纯蜂蜜的MRJP1的吸光值判断待测蜂蜜的质量。本发明为蜂蜜质量及掺假量检测提供了一种可靠的快速检测新方法，可用于蜂产品质量监管部门、加工贸易企业蜂蜜产品质量控制。

Description

针对蜂蜜中MRJP1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及蜂蜜成分含量的测定技术，尤其涉及一种蜂蜜所含的由蜜蜂封后分泌的内源性蜂王浆主蛋白MRJP1特异性双抗体的制备方法，及用双抗体检测掺假蜂蜜的双抗体夹心方法等。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂工蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，在巢脾中经充分酿造形成的天然甜物质。我国是蜂蜜生产和出口大国，2012年全国产量达到45.16万吨，占世界蜂蜜总产量的1/4；2013年出口蜂蜜12.5万吨，占世界蜂蜜贸易量的1/4。根据中华人民共和国供销合作行业标准GH/T18796-2012《蜂蜜》对蜂蜜真实性的描述，“蜂蜜中不得添加任何当前明确或不明确的添加物；如果在蜂蜜中添加其它物质,不应以’蜂蜜’或’蜜’作为产品名称或名称主词；采用我国国家标准GB/T18932.1(2012)《蜂蜜中碳-4植物糖含量测定方法稳定碳同位素比率法》方法检测，蜂蜜中的碳-4植物糖含量不得大于7。”由于蜂蜜掺假成本低廉，检测困难，不法商贩容易牟利，已严重扰乱蜂蜜市场秩序，导致产品信任度严重下降，导致行业整体价格和效益下降。目前市场上最常见的蜂蜜掺假方式是加入果葡糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆等，尤其是用大米糖浆勾兑的假蜂蜜，其理化指标和风味完全可以通过欧盟标准，难以检测，严重影响了我国国际贸易声誉。近年来，蜂蜜市场鱼龙混杂，掺假造假的事件不断被曝出。2015年3月，在十二届全国人大三次会议上，10名全国人大代表提交了“严厉打击假劣蜂产品的建议”。2015年7月，国家食品药品监督管理总局在其官网正式作出回应：现行蜂蜜国家标准无法鉴别蜂蜜的真假，将积极推动蜂蜜食品安全国家标准的修订和蜂蜜掺假补充检验方法的建立。

为打击掺假蜂蜜，多年来国内外开展了大量以掺假物质：来自于甘蔗和玉米等碳四植物蔗糖和高果糖浆，来源于碳三植物的大米糖浆为指标的检测方法研究。由于蜜蜂采集的花粉来自于碳三植物，与甘蔗和玉米这两类植物产生的糖中C13同位素的比例不一样。理论上可用碳四植物糖的同位素检测方法确定蜂蜜的“真假”。但不同的蜂蜜差异实在太大，C13同位素偏移的范围也很大，很难准确判断真假。有了碳四检测法后，一些不良商家便开始改为添加碳三糖，常见就是用碳三植物源的大米糖浆和甜菜糖浆，如果在蜂蜜中掺入大米糖浆，碳四检测方法就无能为力了。随后发明了用高效液相色谱质谱联用(LC-MS)仪来检测大米糖浆。但如果把大米糖浆水解转化成葡萄糖和果糖，即便同时使用碳四检测和LC-MS仪检测，都无法辨别是否掺假。

我国曾先后颁布了GB/T18932.22-2003《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法液相色谱示差折光检测法》、GB/T18932.16-2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法》、GB/T18932.16-2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法》等多项检测方法标准。国内外已报道的检测掺假蜂蜜技术有：（1）液相色谱-同位素比率质谱联用（LC-IRMS）：通过对蜂蜜样品中的蔗糖、葡萄糖、果糖和蛋白质的δ13C进行分析，发现Δδ13C[果糖-葡萄糖]、Δδ13C[果糖-蔗糖]、Δδ13C[葡萄糖-蔗糖]可以指示掺假蜂蜜中的外源糖类，有效识别出C3糖（甜菜糖）和C4糖（蔗糖、蔗糖糖浆、高果玉米糖浆）(Cabaneroetal,2006)。（2）液相色谱/元素分析-同位素比值质谱联用法（LC/EA-IRMS）：发现纯正蜂蜜样品Δδ13C[蛋白质-蜂蜜]≥-0.95‰，Δδ13C[果糖-葡萄糖]在-0.64‰~0.53‰之间(费晓庆等,2011)。（3）光谱技术鉴别：陈兰珍等采用近红外光谱分析（NIR）与DPLS化学计量学结合的方法建立了5组数学模型，以C4植物糖检测结果为判定依据，进行了蜂蜜样本识别(陈兰珍等,2008)。Kelly等利用用户傅里叶变换-拉曼光谱法，并结合SIMCA分类法检测了掺入C3甜菜糖浆和C4高果玉米糖浆的蜂蜜样品，进行了蜂蜜真伪鉴定，并用PLS法预测了掺假水平(Kelly等,2006)。（4）核磁共振法（NMR）：Bertelli等利用一维和二维核磁共振法，结合多变量统计分析，检测蜂蜜中掺入不同浓度的糖浆(Bertellietal,2010)。Spiteri等用1H-NMR对采自全球范围内的800余个蜂蜜样品进行了分析，在200余份样品中发现了糖浆成分(Spiterietal,2015)。（4）蜂蜜元素组成分析：吴招斌等采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）结合主成分分析和判别分析，测定了洋槐蜜、葵花蜜和油菜蜜中20种矿物质元素含量，用筛选出Mg、Sr、Ba、Ni、Sb、Cr和Na7种矿物质元素建立判别模型，利用该模型对蜂蜜品种作了鉴别(吴招斌等,2015)。桂茜雯等采用ICP-MS测定了大米糖浆和纯正蜂蜜中砷的含量，发现纯蜂蜜与大米糖浆中的砷元素含量相差10倍以上，纯蜂蜜中砷含量均低于15μg/kg，确定蜂蜜中砷含量超过15μg/kg为大米糖浆掺假蜂蜜(桂茜雯等,2014)。但由于蜜蜂中的掺假方法和掺假成分多，用检测外源成分鉴别假蜂蜜需要同时采用多种方法，单一方法很难凑效。同时，以上各种方法需要采用昂贵的精密仪器，检测成本很高。我国以往公布的发明专利申请中，基本涵盖了以上论文报道所述的液相色谱、质谱、近红外光谱测定掺假外源糖类的方法。其中胡福良等申请的发明专利“一种蜂蜜真伪的鉴别方法及应用”（申请号：201110067242.9）报道了用分光光度计检测蜂蜜有无β-葡萄糖苷酶活力来鉴别掺假蜂蜜的方法，但迄今未见实际应用。

为此，国外科学家开始探索以蜂蜜内源成分王浆主蛋白【MajorRoyalJellyProteins(MRJPs)（LenskyandRakover1983,CompBiochemPhysiol.75:607-615）】为指标的掺假蜂蜜检测方法。王浆主蛋白属于水溶性蛋白，是蜜蜂工蜂头部王浆腺蜂蜜物蜂王浆的主要活性成分，约占蜂王浆总蛋白的46%-89%(Tomoda等.1977,JApicRes.16:125-130;TakenakaandEchigo1983,NipponNogeikagakuKaishi.57:1203-1209)。目前已通过对西方蜜蜂基因组研究确定，MRJPs家族有9个成员，即MRJP1~MRJP9(Drapeauetal.2006，GenomeResearch,16:1385-1394)，其分子量范围在25~87kDa。在MRJPs家族中，分子量为55-57的MRJP1（或者Albumin-1）是含量最高的蛋白质，约占水溶性蛋白（MRJPs家族）的48%（HanesandSimuth.1992,J.Apicult.Res.31:22-26)，是反映蜂王浆质量和新鲜度的典型生物标记物。斯洛伐克学者Bilikova和Jozef(Bilikova和Jozef.2010.J.Agric.FoodChem.2010,58,8776-8781)已发现蜂蜜含0.05-0.79%的蛋白质，蛋白质主要为蜂王浆主蛋白MRJPs，其中以MRJP1含量最高，可作为蜂蜜质量的检测指标。为此他们设计了检测蜂蜜中MRJP1含量的间接法ELISA定量分析方法。其主要方法原理是：以从蜂王浆中分离纯化的MRJP1全蛋白为抗原免疫大白兔，制备成MRJP1多克隆抗体；以MRJP1蛋白为标准物，用间接ELISA法建立吸光度和MRJP1标准蛋白间的直线回归方程。最后，以此MRJP1多克隆抗体为一抗，用间接ELISA法定量检测了蜂蜜中的MRJP1含量。但由于MRJPs成员间具有高度的同源性，用MRJP1全蛋白建立的抗体并不具备特异性，检测得到的结果是所有王浆主蛋白的总含量。根据我们研究，以在大肠杆菌种中表达的MRJP7、MRJP1重组全蛋白免疫大白兔所制备的抗体为一抗Westernblot法检测蜂王浆，可显示有MRJPs家族蛋白成员的所印迹。因此，Bilikova和Jozef所报道的方法存在缺陷，不具备专一性检测MRJP1的特性。

申请人曾经开发成功用MRJP1特异性抗体检测蜂王浆中MRJP1含量判断蜂王浆新鲜度的间接法ELISA（发明专利CN201210576152.7），但若需要判别真假蜂蜜尚需克服灵敏性和特异性等问题。

综上所述，目前尚无检测蜂蜜质量或者掺假的快速低成本办法。

发明内容

本发明公开了一种针对蜂蜜中内源MRJP1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒。

一种针对蜂蜜中内源MRJP1抗体对的制备方法，所述的MRJP1的特异性多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQIDNO：1所示；所述的MRJP1的特异性多肽M5的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQIDNO：2所示；然后免疫新西兰白兔。

一种针对蜂蜜中内源MRJP1的免疫检测方法，

1）利用MRJP1特异性多克隆抗体SP-1为捕获抗体，MRJP1特异性多克隆抗体SP-2为检测抗体，以免疫双抗夹心法测定待测蜂蜜中MRJP1含量；

所述的MRJP1特异性多克隆抗体SP-1通过利用MRJP1特异性多肽M4免疫新西兰白兔得到；所述的MRJP1特异性多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQIDNO：1所示；

所述的MRJP1特异性多克隆抗体SP-2通过利用MRJP1特异性多肽M5免疫新西兰白兔得到，所述的MRJP1特异性多肽M5的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQIDNO：2所示。

所述的免疫双抗夹心法为ELISA双抗夹心法，按以下步骤进行处理：包被捕获抗体SP-1，封闭，洗涤，加入抗原，加入酶标的检测抗体HRP-SP-2，洗涤，加显色底物，加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450nm-630nm。

所述的抗原为待测蜂蜜或已知蜜源的纯蜂蜜，通过比较待测蜂蜜和已知蜜源的纯蜂蜜的MRJP1的吸光值判断待测蜂蜜的质量。

所述的抗原为已知的不同浓度的MRJP1，绘制以MRJP1浓度为横坐标，以OD₄₅₀-OD₆₃₀为纵坐标的标准曲线，建立回归方程；

所述的抗原为待测蜂蜜时，将获得的吸光值，代入上述回归方程，从而得到待测蜂蜜中MRJP1的含量。

所述的免疫检测方法，通过比较待测蜂蜜和已知蜜源的纯蜂蜜的MRJP1的含量判断待测蜂蜜的质量。

所述的MRJP1特异性多克隆抗体SP-1、SP-2的效价均＞1:20000，酶标抗体HRP-SP-2的效价＞1:5000，以合成多肽M4、M5和纯化的MRJP1为抗原，经ELISA测定。

一种采用所述的免疫检测方法的试剂盒，主要包括MRJP1特异性多克隆抗体SP-1、SP-2抗体对，其中以MRJP1特异性多克隆抗体SP-1为捕获抗体，MRJP1特异性多克隆抗体SP-2为检测抗体，以双抗夹心法测定待测蜂蜜中MRJP1含量。

所述的试剂盒为ELISA或者免疫层析试纸条试剂盒。

本发明具有如下有益效果：

本发明选取的多肽特异性强，能单一地识别蜂王浆主蛋白MRJP1。蜂王浆蛋白家族有9个成员MRJP1~MRJP9，来自同一个祖先，各成员间具有高度的序列同源性，并具备如下相同的结构：均含有四个保守的半胱氨酸位点，序列中存在一些完全相同的氨基酸区域，C末端均具有高度疏水的特征性结构。本发明从MRJP1全序列中筛选多肽的氨基酸序列不同于同一家族中其他蛋白的氨基酸序列，化学法合成该多肽，用于免疫兔子，可制备出特异性多克隆抗体，从而实现特异性识别单一蛋白MRJP1的目的。经理论分析预测，抗体SP-1和SP-2可与MRJP1构成夹心结构。

将蜂蜜中MRJP1鉴别作为衡量蜂蜜质量和真伪的指标，可填补了现行蜂蜜国家标准中缺乏MRJP1检测指标的不足。

为蜂蜜中MRJP1的真实含量的测定提供了一种简便易行、准确度高的快速测定方法。ELISA法等作为一种抗原抗体的定量分析法，由于酶的催化效率很高，可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的灵敏度。同时，该方法操作简单，方便迅速，成本低廉，用此方法检测蜂蜜质量具有可行性和市场前景。

附图说明

图1是意大利蜜蜂蜂王浆主蛋白MRJPs家族的9个成员（MRJP1~MRJP9）全基因所编码的氨基酸序列同源性分析。其中所有MRJPs家族成员共享的同源性氨基酸残基，在MRJP9序列的氨基酸残基下用“*”标出。根据同源性选出的MRJP1特异性多肽的氨基酸残基及其它MRJPs家族成员中与其共享的同源性氨基酸残基用灰色阴影标出。

图2是从蜂王浆离心分离的MRJPs和从蜂王浆超速离心分离的MRJP1的SDS-PAGE电泳分析图，用特异性抗体SP-1检测MRJP1和MRJPs的Westernblot印迹分析图。其中A部分为MRJPs和MRJP1的SDS-PAGE电泳分析图,M为标准蛋白分子量，MRJPs为蜂王浆主蛋白，MRJP1为纯化的蜂王浆主蛋白1标准样品,箭头所示为MRJP1的蛋白条带。B部分为MRJP1和MRJPs的Westernblot印迹分析结果，箭头所示为MRJP1的蛋白印迹。

图3是从蜂王浆离心分离的MRJPs的SDS-PAGE电泳分析图，用特异性抗体SP-2检测MRJPs的Westernblot印迹分析图。其中A部分为蜂王浆主蛋白MRJPs的SDS-PAGE电泳图，泳道1为标准蛋白分子量，泳道2为蜂王浆主蛋白MRJPs，箭头所示分别为MRJPs成员MRJP1、MRJP2、MRJP3和MRJP5的条带，各条带位置的标示参照Schmitzova等发表的西方蜜蜂蜂王浆（Schmitzovaetal,1998,CellMolLifeSci.54(9):1020-1030）。B部分为MRJPs的Westernblot印迹分析结果，只特异性地显示MRJP1条带。

图4为以SP-1抗体为捕获抗体，HRP-SP-2抗体为检测抗体，采用所建双抗体夹心法，测定450nm-630nm处的吸光值。然后，以MRJP1浓度为横坐标，A₄₅₀-A₆₃₀为纵坐标建立MRJP1浓度标准曲线，建立回归方程为：y=0.0872x+0.2987，R2=0.99741。

具体实施方式

本发明采用生物信息软件分析了MRJPs家族9个成员MRJP1~MRJP9氨基酸序列的同源性，筛选出了两个MRJP1特异性氨基酸残基序列，并用化学法合成了这两个特异性多肽。用这两个特异性多肽分别免疫新西兰白兔，制备出特异性抗体SP-1和SP-2。然后以SP-1为捕获抗体，SP-1为检测抗体，建立了双抗夹心法测定蜂蜜中MRJP1含量的新方法，为快速检测蜂蜜中MRJP1含量，鉴别真伪蜂蜜提供了可靠方法。该方法为蜂产品质量监管部门、蜂蜜产品加工贸易企业蜂蜜产品质量控制提供了可靠依据，弥补了原有标准和方法的缺陷。

实施例1：MRJP1特异性多肽的筛选

登入国际基因信息库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，搜索下载MRJPs家族9个成员(MRJP1~MRJP9)基因所编码的氨基酸序列，MRJP1的序列号为NM_001011579、MRJP2的序列号为NM_001011580、MRJP3的序列号为NM_001011601、MRJP4的序列号为NM_001011610、MRJP5的序列号为NM_001011599、MRJP6的序列号为NM_001011622、MRJP7的序列号为NM_001014429、MRJP8的序列号为NM_001011564、MRJP9的序列号为NM_001024697。将上述序列MRJP1~MRJP9基因所编码的氨基酸序列输入GENTYX软件，进行同源性分析，完成分析后输出如图1所示的同源性分析图（图1）。

根据图1同源性分析结果，筛选出MRJP1的两段特异性多肽：位于MRJP1氨基酸序列第56-70位的多肽SGEYDYKNNYPSDID（SEQIDNO：2），由15个氨基酸残基多肽组成；第360~371位的IKEALPHVPIFD（SEQIDNO：1），由12个氨基酸残基多肽组成。MRJP1特异性多肽的选择原则是与其它MRJPs蛋白序列共享的连续排列同源性氨基酸残基不超过3个（图1）。

实施例2：MRJP1特异性多克隆抗体制备

（1）抗原制备

根据多肽序列C-IKEALPHVPIFD-NH2和C-SGEYDYKNNYPSDID-NH2，进行化学合成。将5mg合成多肽与KLH偶联（偶联剂为Sulfo-SMCC），作为免疫抗原；将另5mg合成多肽与牛血清白蛋白（BSA,是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa）偶联（偶联剂为戊二醛）作为检测抗原。用PBS稀释至浓度为1mg/mL，分装，冻存于-20℃。

（2）免疫兔子

选择健康新西兰白兔2只，在第1、15、29、43天进行免疫。免疫操作如下：取1mL抗原，加入1mL福氏完全佐剂，乳化，将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，用注射器在白兔颈背部皮下作多点（至少8点）注射。

（3）多克隆抗体血清制备

第53天，在兔子颈动脉取血，将兔血置4℃过夜，离心30min（4℃、10000rpm），收集上清。上清即为多克隆抗体血清。用检测抗原ELISA法检测所获得的多克隆抗体血清效价，以判断所制备抗体的有效性。

实施例3：亲和层析法纯化多克隆抗体

（1）亲和层析柱制备

以1mL巯基蛋白琼脂糖偶联树脂(SulfolinkResin)与1mg合成MRJP1特异性多肽偶联。将5mg合成MRJP1多肽连接到活化的巯基蛋白琼脂糖偶联树脂上，制备成抗原亲和柱，亲和柱用10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液。

（2）抗体纯化

将多克隆抗体血清用0.45μm滤膜过滤，然后过抗原亲和柱，排尽溶液，收集流穿液；再用10倍柱体积的PBS缓冲液平衡，排尽溶液；加入5mL抗体洗脱液（甘氨酸5g，溶于100mL超纯水，用浓HCl调节pH值至2.7，4℃保存），按1mL/tube分管收集洗脱液。

用分光光度在280nm处检测收集到的洗脱液，将吸光度大于1.0的组分合并，置于截留分子量14kDa的透析袋中，在超纯水中透析12h，中间换水一次，透析后即为纯化的MRJP1特异性抗体溶液，以1mL/管分装，冻存于-20℃。

实施例4：Westernblot检测MRJP1特异性抗体的专一性

1.蜂王浆中MRJPs蛋白的离心分离与SDS-PAGE电泳检测

称取适量新鲜蜂王浆，以1:1比例溶于PBS中，4℃抽提24h，然后在12000g、4℃下离心30min，取上清。上清用孔径14k的透析膜在超纯水中，4℃下透析24h，中间换水3-4次，再冻干，所得冻干粉即为蜂王浆可溶性蛋白MRJPs，-20℃保存。

取上述MRJPs蛋白样品，作变性聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳检测。具体方法是，取适量蛋白样品溶于超纯水中，用Bradford法测定总蛋白含量，配成终浓度为1mg/mL的溶液。制备变性聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。取MRJPs蛋白溶液，加上样缓冲液，煮沸，离心，取上清按15μL/孔的上样量加入变性聚丙烯酰胺凝胶样孔，同时在同一胶上加蛋白标准品，加样后将胶置电泳仪电泳，取胶用考马氏亮蓝染色，经甲醇脱色，凝胶上样品泳道显示分子量范围在25~87kDa的多个条带，其中包括MRJP1蛋白（图2A和图3A泳道MRJPs）。

蜂王浆中MRJP1蛋白的超速离心分离与SDS-PAGE电泳检测

称取适量新鲜蜂王浆，用等质量超纯水稀释，充分抽提6h。混合液在245000g、6℃下离心5h，出现分层现象后，将中间层取出；用2倍质量超纯水将中间层溶解，室温下抽提1h，混匀；将该液在30000g、6℃下离心30min，取上清。上清液在245000g、6℃下离心5h，取沉淀。此沉淀即为所需蛋白样品，即MRJP-1，-20℃保存。

取超速离心法得到的MRJP1蛋白样品，作变性聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳检测。具体方法是，取适量蛋白样品溶于超纯水中，用Bradford法测定总蛋白含量，配成终浓度为1mg/mL的溶液。制备变性聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。取MRJP1蛋白溶液，加上样缓冲液，煮沸，离心，取上清按15μL/孔的上样量加入变性聚丙烯酰胺凝胶样孔，同时在同一胶上加蛋白标准品，加样后将胶置电泳仪电泳，取胶用考马氏亮蓝染色，经甲醇脱色，凝胶上样品泳道显示一条分子量约57kDa的单一条带，此即为纯MRJP1蛋白（图3AMRJP1泳道）。

检测MRJPs和MRJP1蛋白

以MRJPs和MRJP1为抗原，用MRJP1特异性合成多肽免疫兔子得到的多克隆抗体SP-1和SP-2为一抗，分别进行Westernblot分析。结果如图2B和图3B所示，由这两图可见，SP-1和SP-2抗体只能与分子量为57kDa的MRJP1发生免疫反应，即具有专一识别MRJP1的特异性。

实施例5：ELISA法检测抗体效价

分别用实施例4所述抗体SP-1或SP-2为一抗，按以下步骤操作：

（1）包被：用MRJP1标准蛋白为抗原，用CBS稀释为1μg/mL，100μL/孔加入96孔板中，4℃过夜；

（2）封闭：将包被液弃去，以200μL/孔将封闭液加入96孔板中，37℃放置1.5h；

（3）加入一抗：弃去封闭液，分别加入的SP-1或SP-2，以及对照，100μL/孔，37℃放置1h；

（4）洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；

（5）加入二抗：酶标羊抗兔根据抗体说明书稀释，以100μL/孔加入96孔板中，37℃放置30min；

（6）洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；

（7）加入TMB显色底物：100μL/孔加入96孔板中，37℃放置15min；

（8）加入终止液：以50μL/孔将2MH₂SO₄加入96孔板中；

（9）读数：立即置于酶标仪上，450nm、630nm处测吸光值；

抗体标记辣根过氧化物酶及HRP-SP-2抗体效价检测，按以下步骤操作：

a.称取2mgHRP溶解于0.5mLdH₂O中，加入0.5mL新配的0.06MNaHO₄溶液，4℃避光30min；

b.上液中加入160MM的乙二醇0.5mL，室温30min；

c.上液中加入SP-2多克隆抗体2mg，混匀；

d.将上述溶液装入透析袋中，置于2000mL的0.05mMCBS中透析，4℃搅拌过夜；

e.透析液吸至15mL的离心管中，加0.2mL新配的5mg/mLNaBH₄液，混匀，4℃下放置2h；

f.加入等量的饱和硫酸铵溶液，4℃下放置30min，4000rpm、4℃离心20min，弃上清，沥干；

g.将沉淀溶于少量PBS中，装入透析袋中，用PBS透析，4℃过夜（中途换PBS一次）；

h.将透析液中液体吸至离心管中，4000rpm、4℃离心20min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用。

采用直接ELISA法检测HRP-SP-2抗体效价，具体方法如下：

a.包被：将MRJP1用CBS缓冲液稀释至1μg/mL，按100μL/孔加入到96孔酶标板，4℃过夜；

b.洗板：弃尽包被液，每孔加入200μLPBST，置于平板摇床上洗涤5min，洗板5次；

c.封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃反应1.5h；

d.洗板：方法同上；

e.加入HRP-SP-2：用PBS将HRP-SP-2多克隆抗体按梯度稀释，每孔加入100μL，37℃反应1h，空白兔血清（1：1000）为对照；

f.洗板：方法同上；

g.显色：每孔加入200μLTMB显色液（按试剂盒说明书操作），37℃避光反应15min；

h.终止显色：每孔加入50μL终止液；

i.读数：立即置于酶标仪上，读取450nm、630nm处的吸光值。

对SP1检测结果方差分析（表1）显示，在1%显著水平上，稀释20000倍的SP1抗体的OD值极显著地高于对照BSA;对SP2检测结果方差分析（表2）显示，在1%显著水平上，稀释20000倍的SP2抗体的A₄₅₀-A₆₃₀显著高于空白血清对照，与空白兔血清之比大于2，因此，SP-2抗体的效价大于1：20000。

用ELISA法检测酶标HRP-SP-2抗体效价(表3),方差分析结果显示，稀释5000倍的HRP-SP-2抗体的A450-A630显著高于空白血清对照，与空白兔血清之比大于2，因此，HRP-SP-2抗体的效价大于1：5000。

表1ELISA测定特异性多克隆抗体（SP-1抗体）对MRJP1标准蛋白的效价

实施例6：双抗体夹心法ELISA定量测定蜂蜜中MRJP1的含量

1.抗原、抗体溶液的配制

将蜂蜜样品用dH₂O以质量比1:1稀释，4℃抽提过夜，然后12000rpm、4℃离心30min，取上清，得蜂蜜水提液。将超速离心法得到的MRJP1标准蛋白溶于CBS中，配成10μg/mL的溶液。以SP-1（1:10000稀释）抗体为捕获抗体，HRP-SP-2（1:10000稀释）抗体为检测抗体。

双抗体夹心法ELISA标准曲线绘制

将SP-1多克隆抗体用CBS以1：10000稀释，以100μL/孔加入96孔酶标板；每孔加入200μL5%脱脂奶粉，37℃封闭1.5h。弃脱脂牛奶封闭液，用PBST缓冲液洗5遍，每次5min；用PBS将MRJP1稀释为1μg/mL和5μg/mL，以100μL/孔的量加入到96孔板；用PBS将HRP-SP-2抗体以1：1000稀释，100μL/孔加入96孔酶标板；弃尽包被液，每孔加入200μLPBST，置于平板摇床上洗涤5次，每次5min；每孔加入200μLTMB显色液（按试剂盒说明书操作），37℃避光反应15min；每孔加入50μLTMB终止液2MH2SO4；立即置于酶标仪上，读取450nm、630nm处的吸光值。

以OD₄₅₀-OD₆₃₀吸光值平均值（n=3）为纵坐标，MRJP1标准蛋白溶液浓度为横坐标，得到标准曲线（图4）：y=0.0872x+0.2987，R2=0.99741。

．掺假蜂蜜的ELISA检测

（1）蜂蜜样品预处理

取纯洋槐蜂蜜样品用dH₂O以质量比1:1稀释，4℃抽提过夜，然后12000rpm、4℃离心30min，取上清，得蜂蜜水提液。

（2）ELISA分析

夹心ELISA方法的具体操作步骤如下：

a.包被捕获抗体：将MRJP1多克隆抗体SP-1用CBS以1：10000稀释，以100μL/孔加入96孔酶标板，37℃孵育2h；

b.封闭：每孔加入200μL5%脱脂奶粉，4℃过夜；

c.洗板：弃尽包被液，每孔加入200μLPBST，置于平板摇床上洗涤5次，每次5min；

d.加入抗原：用PBS将蜂蜜水提液稀释至标准曲线检测范围，以100μL/孔加入96孔酶标板，4℃过夜；

e.加入酶标抗体：用PBS将HRP-SP-2抗体以1：1000稀释，100μL/孔加入96孔酶标板，37℃反应2h；

f.洗板：弃尽包被液，每孔加入200μLPBST，置于平板摇床上洗涤5次，每次5min；

h.终止显色：每孔加入50μL终止液；

i.读数：立即置于酶标仪上，读取450nm、630nm处的吸光值。

将洋槐蜜和玉米糖浆按比例混合，用夹心法检测450nm和630nm处吸光值，将样品A₄₅₀-A₆₃₀代入标准曲线，计算得出掺假蜂蜜中MRJP1含量，以纯洋槐蜜的计算值作为理论值对照，结果如表4所示。当样品理论值为0mg/g时，在标准曲线检测范围外，误差为100%。由表4可知，采用夹心法检测蜂蜜中MRJP1含量，并以此推测掺假程度具有可行性。

实施例7：根据纯蜂蜜的MRJP1含量范围判别商品蜂蜜真伪

1.各种纯蜂蜜MRJPs含量分析

（1)蜂蜜样品预处理

取6种已知蜜源的蜂蜜样品洋槐蜜、冬青蜜、百花蜜、狼牙刺蜜、枇杷蜜、枣花蜜，分别用dH₂O以质量比1:1稀释，4℃抽提过夜，然后12000rpm、4℃离心30min，取上清，得蜂蜜水提液。

分析

分别用CBS和PBS稀释蜂蜜水提液至标准曲线检测范围，按如下夹心ELISA法步骤操作：

a.包被捕获抗体：将MRJP1多克隆抗体SP-1用CBS以1：10000稀释，以100μL/well加入96孔酶标板，37℃孵育2h；

b.封闭：每孔加入200μL5%脱脂奶粉，4℃过夜；

d.加入抗原：用PBS将蜂蜜水提液稀释至标准曲线检测范围，以100μL/well加入96孔酶标板，4℃过夜；

e.加入酶标抗体：用PBS将2.2.1.4得到的HRP-SP-2抗体以1：1000稀释，100μL/well加入96孔酶标板，37℃反应2h；

h.终止显色：每孔加入50μL终止液；

i.读数：立即置于酶标仪上，读取450nm、630nm处的吸光值。

（3）纯蜂蜜样品MRJPs含量测定

将用夹心法检测各种蜂蜜样品450nm处的得到吸光度代入标准曲线：y=0.084x+0.2972，计算得到蜂蜜样品中MRJP1含量。结果（表5）表明，不同蜜源的MRJP1含量存在差别，但MRJP1含量一般大于0.50mg/g，多数蜂蜜的MRJP1含量在1.00mg/g以上。

2.商品蜂蜜真伪

将来自澳门市场的未知的蜜源蜂蜜样品（编号W1、W2、W3、W4、W5、C12、C13、C14、C15、C16）用dH₂O以质量比1:1稀释，4℃抽提过夜，然后12000rpm、4℃离心30min，取上清液，用夹心ELISA法检测蜜源未知的商品蜂蜜样品的吸光度，代入标准曲线：y=0.084x+0.2972，计算得到各样品中MRJP1含量，结果如表6所示。因样品W1、W2、W5、C12、C16的MRJP1含量大于1mg/g，可判定为真蜂蜜；样品W3、W4、C13、C15的MRJP1含量低于0.5mg/g，可判定为掺假蜂蜜。

在已知本发明公开的抗体对的情况下，本领域技术人员可以根据现有技术得到ELISA试剂盒或者免疫层析试纸条等。

SEQUENCELISTING

<110>浙江大学

<120>针对蜂蜜中MRJP1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>M4

<400>1

IleLysGluAlaLeuProHisValProIlePheAsp

1510

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>M5

<400>2

SerGlyGluTyrAspTyrLysAsnAsnTyrProSerAspIleAsp

151015

Claims

1.一种针对蜂蜜中内源MRJP1抗体对的制备方法，其特征在于，所述的MRJP1的特异性多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQIDNO：1所示；所述的MRJP1的特异性多肽M5的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQIDNO：2所示；然后免疫新西兰白兔。

2.一种针对蜂蜜中内源MRJP1的免疫检测方法，其特征在于，

3.根据权利要求2所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的免疫双抗夹心法为ELISA双抗夹心法，按以下步骤进行处理：包被捕获抗体SP-1，封闭，洗涤，加入抗原，加入酶标的检测抗体HRP-SP-2，洗涤，加显色底物，加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450nm-630nm。

4.根据权利要求3所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的抗原为待测蜂蜜或已知蜜源的纯蜂蜜，通过比较待测蜂蜜和已知蜜源的纯蜂蜜的MRJP1的吸光值判断待测蜂蜜的质量。

5.根据权利要求3所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的抗原为已知的不同浓度的MRJP1，绘制以MRJP1浓度为横坐标，以OD₄₅₀-OD₆₃₀为纵坐标的标准曲线，建立回归方程；

6.根据权利要求5所述的免疫检测方法，其特征在于，通过比较待测蜂蜜和已知蜜源的纯蜂蜜的MRJP1的含量判断待测蜂蜜的质量。

7.根据权利要求2所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的MRJP1特异性多克隆抗体SP-1、SP-2的效价均＞1:20000，酶标抗体HRP-SP-2的效价＞1:5000，以合成多肽M4、M5和纯化的MRJP1为抗原，经ELISA测定。

8.一种采用如权利要求2所述的免疫检测方法的试剂盒，其特征在于，主要包括MRJP1特异性多克隆抗体SP-1、SP-2抗体对，其中以MRJP1特异性多克隆抗体SP-1为捕获抗体，MRJP1特异性多克隆抗体SP-2为检测抗体，以双抗夹心法测定待测蜂蜜中MRJP1含量。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为ELISA或者免疫层析试纸条试剂盒。