CN102279269A - 胱抑素c检测剂盒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胱抑素C抗体制备方法及检测试剂盒的配制方法。胱抑素C(Cys C)是目前临床肾脏病变最灵敏的诊断标志物之一，本发明所述抗体制备是经由人正常血清中提取纯化，再通过人工修饰的方法得到高敏感性抗原，并采取多次免疫动物，获得含有Cys C抗体的高免血清，利用亲和层析的方法得到高纯度Cys C抗体。制备过程中抗体活性损失小，易于批量生产，且抗体具有高亲和力，高效价，不产生交叉免疫反应。用该抗体与聚苯乙烯胶乳球偶联后，配制成的检测试剂盒具有更高灵敏度及线性范围，且重复性好，检测限低，易于自动化分析，操作快速，简便。由于抗体纯度高，杂抗体含量极少，因此干扰少，基质稳定。

Description

胱抑素C检测剂盒的制备方法

技术领域  本发明涉及一种胱抑素C检测试剂盒的制备方法，本发明属于检验医学和生物技术领域。 

背景技术

胱抑素C(Cys C)是一种低分子量蛋白质，可由机体所有的有核细胞产生，且产率恒定。人体循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物，而肾小球的滤过率(glomerular filtration rate，GFR)是监测肾功能的一个重要指标，尤其对于肾移植的病人，快速准确的掌握肾小球滤过率的变化是十分重要的。此外由于胱抑素C分子量大于肌酐，且带正电荷，所以它更容易反映肾小球滤过膜通透性的早期变化，可以在肾小球滤过率轻微降低时升高，较肌酐更敏感，作为肾功能试验优于血清肌酐指标，具有重要的临床应用价值(《胱抑素C的临床应用及进展》，临床酶学。)。 

研究表明胱抑素C是低分子量蛋白质中与GFR最相关的内源性标志物，甚至优于血清肌酐。血清β2-微球蛋白浓度由于在炎症。肿瘤及免疫疾病时也可升高，故不是理想的GFR内源性标志物。而胱抑素C即使在炎症状态下，其产生率也不会改变，血清浓度受年龄、性别、疾病的病情变化的影响较小。说明胱抑素C的诊断准确性明显优于血清肌酐。 

胱抑素C的检测方法学经历了大概4个阶段的发展过程，从最初的单向免疫扩散到酶免疫测定，再到后来的胶乳增强法及匀相溶胶颗粒法等，几种方法都属于免疫检测法，但含量低且分子量小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。于是发展了免疫胶乳浊度测定法，是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的一种非放射性均相免疫浊度测定法，其基本原理是：将抗体偶联在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度成正比，当然也与待测抗原量呈正比，由此可测出标本中待测物的含量。这种方法会产生免疫沉淀。后来又出现了匀相胶乳颗粒免疫测定法，其基本原理是：将抗体吸附在大小适中，均匀一致的胶体金颗粒上，当遇到相应抗原时，由于抗原抗体的相互作用使吸附抗体的胶体金颗粒发生凝聚。金颗粒凝聚后颜色由红变蓝，在波长540nm处吸光度会逐渐降低。而这种降低的程度与胶体金颗粒凝聚的程度呈正 比，当然也与待测抗原量呈正比，由此可测出标本中待测物的含量。但是，目前的匀相溶胶颗粒免疫测定法，其分析灵敏度还不令人满意，期待着进一步提高该方法的检测灵敏度。 

由于血清中胱抑素C浓度较低，故其测定方法需较高的分析灵敏度及特异性。最早采用单向免疫扩散法(RID)及酶免疫测定法(EIA)对胱抑素C含量进行测定，而这两种方法不仅费时，而且灵敏度也较差。较简单且更灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定(RIA、FIA及EIA)的方法能改善胱抑素C测定的可靠性，但测定时间仍较长，无法常规应用，更无法用于急诊测定。就检测灵敏度而言，RID法最差，而EIA、RIA及FIA法均优于PETIA、PENIA及SPIAs法。由于RIA法存在放射性污染，FIA法需昂贵的仪器，以及RIA、FIA、EIA法测定时间长，且不能全自动化，无法用于临床大批量标本的测定。PETIA、PENIA及SPIAs法虽然检测灵敏度差些，但仍可达0.15mg/L左右，远远低于健康人血清胱抑素C浓度(小于1.0mg/L)的下限值，可满足临床需要；这三种测定方法基本上不受血红蛋白、胆红素、类风湿因子、甘油三脂的影响，回收率可达95％～109％，批内及批间变异系数均较小(＜4.5％)；但由于PETIA和PENIA两种方法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗。而SPIAs法则不会陈述沉淀。故在血清胱抑素C测定的常规临床应用中可首选SPIAs法，Tanaka对SPIAs法进行了研究，但其提出的方法的灵敏度仍有待提高(《胱抑素C及其检测方法研究进展》，国际医学检验杂志2007年11月第28卷第11期。)。 

发明内容

本发明的主要目的在于：满足临床高胱抑素C含量测定分析，提供一种高灵敏度、特异性好的临床诊断用抗体。并提供准确度高、基质稳定、并具有良好的抗血脂，溶血等内在因素干扰、适用于可见/紫外半自动生化分析仪等特点的试剂盒。 

本发明技术方案 

Cys C是一种由120个氨基酸组成的非糖基化的小分子量蛋白质，化学组成结构相对简单，其抗原决定簇较少，当与相应抗体发生免疫复合反应时，就要求抗体亲和力极高，特异性极好时，才能在最快时间内发生凝集，产生沉淀，但是目前市场能满足相关技术性能的抗体成本较高，而且无法满足临床诊断用量。 

同时由于Cys C抗原决定簇较少，分子量低，在进行动物免疫时，容易造成免疫耐受，生产的相应抗体亲和力及特异性都易受到严重的影响。 

本发明为解决上述相关抗体生产过程中出现的问题，同时获得能满足本发明试剂盒性能要求的抗体，采取抗原修饰的方法增加胱抑素C抗原的免疫原性，进行动物免疫时，能产生高效价、高亲和力、高特异性抗人胱抑素C抗体。采取了一种针对人抗原进行抗原表位修饰 的方法：引入一种载体蛋白和芳香族氨基酸，通过肽键缩合剂与Cys C表位上的氨基或羧基发生缩合生成酰胺键而达到Cys C蛋白与载体蛋白偶联的目的，从而增加抗原的免疫原性。并利用该方法获得的高亲和抗体配制定量检测人血清中Cys C的胶乳增强免疫比浊试剂盒及配套的Cys C标准液，配合具有546nm波长、1cm光径、37℃恒温装置的半，全自动生化分析仪进行人血样本Cys C检测。 

本发明的具体实施方式 

(1)胱抑素C抗原的制备是引入一种载体蛋白和芳香族氨基酸，通过肽键缩合剂与CysC表位上的氨基或羧基发生缩合生成酰胺键而达到Cys C蛋白与载体蛋白偶联的目的，从而增加抗原的免疫原性； 

(2)用以上胱抑素C抗原免疫动物，优选兔，按常规高免血清的制备方法及常用纯化方法获得胱抑素C高亲和抗体； 

(3)用以上胱抑素C高亲和抗体与活化的羧基聚苯乙烯胶乳作用制备成胱抑素C抗体胶乳液。 

一、抗人Cys C多克隆抗体的制备 

1.Cys C抗原提取，纯化 

(1)经过筛选采集Cys C浓度较高的正常人混合血清。 

(2)将琼脂糖Sepharose 4B活化，将高纯度的Cys C抗体按偶联量3∶100的量置于0.1M，pH为9.0的碳酸缓冲液中透析数小时后与活化的琼脂糖Sepharose 4B按3∶100的量混合，4℃搅拌过夜；b、装柱；将已与蛋白偶联的琼脂糖Sepharose 4B装入层析柱内，待其下沉后，控制溶液流速为1ml/min，洗柱；用0.2M，pH为9.0的碳酸缓冲液洗柱，直至洗出液OD₂₈₀＜0.02为止，并测定偶联率。 

(3)吸附及解吸附按床体系1/10加入浓度1％～2％混合血清，用0.01M，pH为7.4的PBS缓冲液洗脱，流速为1ml/min，至OD₂₈₀＜0.02为止，然后加入0.1M，pH为2.4的甘氨酸缓冲液，收集解吸附下来的成分，并用1M的碳酸缓冲液中和，并以2倍体积的7M的尿素洗后，0.01M，7.4的PBS平衡，将纯化后获得的Cys C抗原冻干保存。 

2.Cys C抗原修饰 

(1)载体蛋白的偶联取100mg纯化载体蛋白(优选牛血清白蛋白，BSA)，碳化二亚胺2mg，N-羟基琥珀酰亚胺8mg，溶于pH＝6.0磷酸盐缓冲液，震荡混匀，4℃旋转反应4小时，透析3次，稀释至10ml，备用。 

(2)取纯化冻干Cys C抗原20mg，溶于pH＝9.0的碳酸盐缓冲液至20ml，将A步骤收 集的载体活化液10ml震荡滴加入Cys C抗原溶液中，震荡混匀，4℃旋转反应24小时，透析3次，浓缩至10ml，4℃保存备用。 

(3)取酪氨酸10mg，溶于30ml的pH＝7.4磷酸缓冲液，加入B步骤收集的10ml含Cys C抗原的溶液，加入碳化二亚胺4mg，N-羟基琥珀酰亚胺5mg，混匀，4℃旋转反应24小时，透析3次，浓缩至10ml，备用。 

(4)将(3)步骤获得的溶液进行亲和层析，具体操作步骤同抗原纯化步骤。 

本发明所用载体蛋白可以选用：牛血清白蛋白(BSA)，人白蛋白，人血清蛋白，本发明首先推荐使用BSA。缩合剂选用：碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。 

本发明所用芳香族氨基酸可以选用：酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。偶联剂选用：碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。 

3.免疫原接种： 

(1)动物：本发明中的实验免疫动物的选择可以是：只要对Cys C抗原敏感但又不易产生免疫耐受的健康兔子，羊、牛中任一种动物制备含抗Cys C抗体的高免血清。本发明中优先选择的是同一直系兔做为免疫对象。 

(2)动物免疫：待免疫的用兔移入接种动物舍，大概需要四天适应期，在免疫接种抗原前采取兔血，提取血清制备成用于抗体检测时作为阴性对照血清。 

(3)免疫方法可采用背部多点皮下注射法，剂量0.2～3ml/只，每点注0.1-0.5ml，每间隔1-2周后再于上述部位选不同点注射。在免疫3～4次后可以获得较高效价的抗体，为此第3次免疫后一周进行检测抗体效价的试血，用单向免疫扩散法测定抗体效价(《实用临床免疫学检验》，江苏科技出版社。)如抗体效价符合要求(抗人Cys C抗体效价在1∶128～1∶256)，可于最后一次注射一周后颈动脉取血。用羊、牛制备高免血清免疫方法和程序相同，但免疫剂量应按体重增加，即按每千克体重0.3～0.4ml计，每点注射0.6～1.2.0ml。 

4.Cys C抗体的提取及抗体纯化： 

(1)抗血清提取：将上述颈动脉血置于室温(25℃)条件下24小时，3000r/min离心30min，弃沉淀，获得含Cys C的血清后，测定抗血清蛋白量备用。 

(2)抗体纯化： 

1)将琼脂糖Sepharose 4B活化，将高纯度的Cys C抗原按偶联量3∶100的量置于0.1M，pH为9.0的碳酸缓冲液中透析数小时后与活化的琼脂糖Sepharose 4B按3∶100的量混合，4℃搅拌过夜； 

2)装柱；将已与蛋白偶联的琼脂糖Sepharose 4B装入层析柱内，待其下沉后，控制溶液 流速为1ml/min，洗柱；用0.2M，PH为9.0的碳酸缓冲液洗柱，直至洗出液OD280＜0.02为止，并测定偶联率； 

3)吸附及解吸附：按床体系1/10加入浓度1-2％抗血清，用0.01M，pH为7.4的PBS缓冲液洗脱，流速为1ml/min，至OD280＜0.02为止，然后加入0.1M，pH为2.4的甘氨酸缓冲液，收集解吸附下来的成分，并用1M的碳酸缓冲液中和，并以2倍体积的7M的尿素洗后，0.01M，pH 7.4的PBS平衡，加入0.02％的叠氮钠，4℃保存备用。 

二、Cys C免疫胶乳的制备 

1.羧基聚苯乙烯胶乳的活化：取0.4ml羧化聚苯乙烯胶乳微球(美国Bangslabs公司)置于离心管中，用1mlPBS缓冲液洗涤3遍，14000r/min离心，弃上清。加入水溶性碳化二亚胺(EDC)0.5ml和PBS 0.5ml，室温搅拌30min，再用硼酸缓冲液洗涤3遍，14000r/min离心，弃上清，用1ml硼酸缓冲液重悬备用。 

2.向胶乳悬液中加入Cys C抗体0.2ml，室温摇床上摇动4小时后，加入甘氨酸终止剂100uL，反应30min后，14000r/min离心，弃上清，用PH为7.4的PBS缓冲液重悬，4℃保存备用。 

三、用于检测人血清中Cys C含量的检测试剂盒的配制 

检测人血清中Cys C含量的检测试剂盒的检测原理是：在适合的缓冲体系里，待测样品中的Cys C抗原与聚苯乙烯胶乳微球上的抗Cys C抗体发生免疫复合反应，因为Cys C抗原具有数个甚至更多的抗原表位，因此聚苯乙烯胶乳微球之间因抗原抗体的免疫反应而凝集，通过的光强度边弱，凝集的增加量与光强度减弱量形成正比，从而达到检测待测样本中的CysC抗原的含量。因为Cys C蛋白是分子量只有12KD的可溶性抗原，当与抗体发生免疫复合反应时，在一定时间内无法形成可见沉淀，只有通过胶乳颗粒偶联的方法增强其比浊灵敏度。 

用于检测血清中Cys C含量的检测试剂盒，它由功能试剂(试剂1)，胶乳试剂(试剂2)和校准液组成。本试剂盒适用于波长为540nm的半、全自动生化分析仪进行人血清中Cys C含量的测定。 

(1)功能试剂(试剂1)，其成分为： 

补纯化水到1000ml 

本试剂盒选取磷酸盐缓冲液，pH为6.9～8.0。缓冲液还可选择Tris-HCl缓冲液，甘氨酸缓冲液，HEPES缓冲液，TAPASO缓冲液等替代。 

本试剂盒的增敏剂采用PEG-8000(聚乙二醇8000)，也可以选择分子量在2000～10000之间的其他PEG和聚蔗糖400。 

本试剂盒防腐剂采用叠氮钠，也可以采用硫柳汞及大环内酯类抗生素。 

本试剂盒中的牛血清白蛋白可以用EDTA-Na₂，氯化镁，甘露醇，丙三醇等代替。 

本试剂盒中选用的表面活性剂为吐温系列、聚氧乙烯醚类。表面活性剂还可以选用阴离子表面活性剂、两性表面活性剂(Sigma公司)。 

(2)胶乳试剂(试剂2)，成分为： 

补充纯化水至1000ml。 

本试剂盒中选用磷酸缓冲液，pH为6.9，也可以用甘氨酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，硼酸缓冲液代替。 

本试剂中可以选用羧基化聚苯乙烯，氨基化聚苯乙烯进行抗体包被，偶联剂可以选用水溶性碳化二亚胺，戊二醛。推荐使用羧基化聚苯乙烯胶乳和碳化二亚胺偶联剂。 

本试剂中抗体胶乳浓度为10％(重量体积比)，也可以选择用5％(重量体积比)的抗体胶乳。 

本试剂中防腐剂选用硫柳汞，但也可以用叠氮钠，大环内酯类抗生素替代。 

本试剂中稳定剂选用丙三醇，也可以选用甘露醇，蔗糖替代。 

本试剂中表面活性剂优先选用吐温-20，但也可以选用曲拉通X-100，布里杰-35和其他聚氧乙烯醚类。 

(3)校准液： 

本发明制备的Cys C校准液在2～8℃1年内保持稳定，试剂应用参数固定，本发明的校准液定值范围为：0～10mg/L，优选4mg/L。由正常人混合血清中提取的Cys C抗原，经过纯 化后，效价在126420(酶联免疫测定)，校准液主要成分组成： 

本校准液中，缓冲液可以用Tris，甘氨酸，柠檬酸等代替，小牛血清白蛋白主要用于保护抗原，防止因为温度变化，氧化剂，重金属引起抗原变性而引起免疫活性降低。 

四、Cys C试剂盒检测使用 

1.检测仪器：具有546nm波长的手动、半自动、全自动紫外分光光度计，37℃恒温设备。 

2.待测血清：新鲜人血清，血清中的Cys C抗原在2～8℃能保存7天左右，-20℃能保存1个月，室温保存6个小时。 

3.具体程序： 

4.结果计算：待测样本中Cys C含量＝校准液浓度×ΔA(待测管)/ΔA(校准管) 

5.参考值范围：0～8mg/L 

五、试剂盒性能检测： 

1.灵敏度测定： 

根据本发明试剂盒按上述参数，采用日立7170型全自动生化分析仪，测定已知浓度的血清样本，用水做空白对照，浓度为0～8mg/L本发明配套校准液定标(采用5点定标法)，同时采用商售获得的Cys C胶乳增强免疫比浊试剂盒(日本BIOLINKS公司，简称“日本公司”) 进行对比(根据该公司操作说明书进行测定。) 

表1本发明试剂盒灵敏度检测结果 

本试剂灵敏度为＝(5.45+8×2.32775)×0.2/77.9＝0.06mg/L 

表2日本公司试剂盒灵敏度检测结果 

该公司试剂灵敏度＝(4.85+10×2.323224)×0.8/184.7＝0.12mg/L。 

2.试剂盒准确度 

取20例已知浓度血清，按上述测定方法测定，并与商售获得的Cys C胶乳增强免疫比浊型试剂盒(日本BIOLINKS公司，简称“日本公司”)测定结果进行对比。 

表3两种试剂盒准确度测定结果比较 

本发明的积极意义： 

本发明涉及一种胱抑素C抗体制备方法及检测试剂盒的配制方法。胱抑素C(Cys C)是目前临床肾脏病变最灵敏的诊断标志物之一，本发明所述抗体制备是经由人正常血清中提取纯化，再通过人工修饰的方法得到高敏感性抗原，并采取多次免疫动物，获得含有Cys C抗体的高免血清，利用亲和层析的方法得到高纯度Cys C抗体。制备过程中抗体活性损失小，易于批量生产，且抗体具有高亲和力，高效价，不产生交叉免疫反应。用该抗体与聚苯乙烯胶乳球偶联后，配制成的检测试剂盒具有更高灵敏度及线性范围，且重复性好，检测限低，易于自动化分析，操作快速，简便。由于抗体纯度高，杂抗体含量极少，因此干扰少，基质稳定。 

本发明中涉及的各种试剂和药品均购自于国内试剂公司的分析纯或化学纯级的商品。 

实施例1 

抗原的修饰 

1.按上述方法制备纯化的胱抑素C抗原，-20℃保存备用。 

2.载体蛋白的偶联。取100mg纯化的牛血清白蛋白，碳化二亚胺2mg，N-羟基琥珀酰亚胺8mg，溶于pH＝6.0磷酸盐缓冲液，震荡混匀，4℃旋转反应4小时，透析3次，稀释至10ml，备用。 

3.取纯化冻干Cys C抗原20mg，溶于pH＝9.0的碳酸盐缓冲液至20ml，将A步骤收集的载体活化液10ml震荡滴加入Cys C抗原溶液中，震荡混匀，4℃旋转反应24小时，透析3次，浓缩至10ml，4℃保存备用。 

4.取苯丙氨酸10mg，溶于30ml的pH＝7.4磷酸缓冲液，加入B步骤收集的10ml含Cys C抗原的溶液，加入碳化二亚胺4mg，N-羟基琥珀酰亚胺5mg，混匀，4℃旋转反应24小时，透析3次，浓缩至10ml，备用。 

5.将上述获得的修饰后的胱抑素C抗原进行亲和层析后，-20℃保存备用 

实施例2 

抗体制备 

1.选取10头健康，年龄在2周岁，体重在40kg左右的成年雄性山羊，移至接种房，适应1周后，开始进行免疫接种。 

2.在免疫接种抗原前采取兔血，提取血清制备成用于抗体检测时作为阴性对照血清，第1次接种采用弗氏完全佐剂(FCA)为抗原乳剂，第2次接种采用弗氏不完全佐剂(FIA)为抗原乳剂。 

3.第1次接种采用后腿内侧皮下及后腹腔多点注射，3ml/头，每点0.5ml。第2次接种采用背部多点及前腹部多点注射，3ml/头，每点0.5ml。第3次和第4次接种与第2次接种相同，每次接种间隔期为2周。 

4.第三次接种1周后，腿静脉取血，双向免疫扩散法测定效价(《免疫学检验》，人民卫生出版社。)，效价达到要求后，再进行第四次接种，免疫1周后进行颈动脉取血。 

5.将上述获得的抗血清进行亲和层析纯化后，进行透析，浓缩，获得的纯抗体液置于-20℃冰箱冷冻保存。 

实施例3 

免疫胶乳的制备 

1.羧基聚苯乙烯胶乳的活化：取0.4ml的10％羧化聚苯乙烯胶乳置于离心管中，用1mlPBS缓冲液洗涤3遍，14000r/min离心，弃上清。加入水溶性碳化二亚胺(EDC)0.5ml和PBS 0.5ml，室温搅拌30min，再用硼酸缓冲液洗涤3遍，14000r/min离心，弃上清，用1ml硼酸缓冲液重悬备用。 

2.向胶乳悬液中加入Cys C抗体0.2ml，室温摇床上摇动4小时后，加入甘氨酸终止剂100μl，反应30min后，14000r/min离心，弃上清，用pH为7.4的PBS缓冲液重悬，4℃保存备用。 

实施例4 

检测人血清中Cys C含量的试剂的配制 

试剂1： 

试剂2： 

标准液： 

实施例5 

检测人血清中Cys C含量的试剂的配制 

试剂1： 

试剂2： 

标准液： 

。

Claims (3)

1.一种胱抑素C检测剂盒的制备方法，其特征在于该试剂盒主要是由功能试剂，胶乳试剂和校准液组成；本试剂盒适用于波长为540nm的半、全自动生化分析仪进行人血清中Cys C含量的测定。

2.如权利要求1所述的一种胱抑素C检测剂盒的制备方法，其特征在于该试剂盒中：

(1)功能试剂的成分为：pH 7.4磷酸盐缓冲液300～500ml、氯化钠8.5～16g、PEG-800035～50g、BSA 8～20g、叠氮钠0.2～1.5g、补纯化水到1000ml；

(2)胶乳试剂的成分为：磷酸盐缓冲液400～600ml、抗体胶乳液100～500ml、防腐剂0.2～1.5g、稳定剂3～10g、表面活性剂2～6g、补充纯化水至1000ml。

(3)校准液的成分为：pH 7.4磷酸缓冲液50～200ml、Cys C抗原2～4g、BSA 3～4g、EDTA-Na₂ 0.5～1.86g和叠氮钠0.1～0.5g。

3.如权利要求1和2所述的一种胱抑素C检测剂盒的制备方法，其特征在于：

(1)胱抑素C抗原的制备是引入一种载体蛋白和芳香族氨基酸，通过肽键缩合剂与CysC表位上的氨基或羧基发生缩合生成酰胺键而达到Cys C蛋白与载体蛋白偶联的目的，从而增加抗原的免疫原性；

(2)用以上胱抑素C抗原免疫动物，优选兔，按常规高免血清的制备方法及常用纯化方法获得胱抑素C高亲和抗体；

(3)用以上胱抑素C高亲和抗体与活化的羧基聚苯乙烯胶乳作用制备成胱抑素C抗体胶乳液。