CN104558112A - 糖基化多肽及其与载体蛋白的偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种糖基化多肽及其与载体蛋白的偶联物及其制备方法与应用，所述的糖基化多肽具有如下所示的序列结构：Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Cys，所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物是糖基化多肽的末端Cys偶联载体蛋白（如牛血清白蛋白、肌红蛋白或血蓝蛋白等）后的产物，所述的糖基化多肽或其与载体蛋白的偶联物能代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品制备层析试条（试纸条），该层析试条能快速、精确、定量、简便的检测全血中的糖化血红蛋白。

Description

糖基化多肽及其与载体蛋白的偶联物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种糖基化多肽及其与载体蛋白的偶联物及其制备方法与应用，所述的糖基化多肽或其与载体蛋白的偶联物能代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品制备层析试条（试纸条），该层析试条能快速、精确、定量、简便的检测全血中的糖化血红蛋白。

背景技术

糖尿病是一组病因和发病机制尚未完全明了的内分泌代谢疾病，目前发病率仅次于心血管疾病和肿瘤。根据医学杂志《The New England Journal of Medicine》2010年3月报道，我国的糖尿病患者数目已达9200万。目前临床已广泛开展检测患者血糖工作，实现了医院大型生化分析仪集中监测和患者使用手持式血糖仪家庭式即时检测的立体网络。但是，血糖测定只是代表即刻的血糖水平，提示患者当时的身体状况，并不能作为评价疾病控制程度的指标。

近年来，糖化血红蛋白（HbA1C）的检测日益受到临床的高度重视。HbA1C是指血液中和葡萄糖结合了的那一部分血红蛋白。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的糖化血红蛋白含量也会较高。人体内红细胞的寿命一般为120天，在红细胞死亡之前，血液中HbA1C含量也保持相对不变。因此HbA1C水平反应了检测前120天内的平均血糖水平，而与取血时间、病人是否空腹及是否使用胰岛素等因素无关，是判定糖尿病长期控制的良好指标。

常用的糖化血红蛋白检测方法有微柱法离子交换层析、亲和层析、高压液相、免疫凝集、离子捕获法、电泳法等。医院大型生化分析仪主要采用基于高效液相层析法原理的检测方法，使用阳离子交换柱通过与不同带电离子作用来将血红蛋白组分分离。利用不同盐浓度所形成的梯度洗脱液使得包括血红蛋白A1c在内的血红蛋白中的多种成分很快被分离成多个部分，并用检测器对分离后的各种血红蛋白组分的吸光度进行检测。分析结束后，以百分率表示的各种血红蛋白组分结果与层析图一起被传送到打印机，但是检测过程需要专业操作人员；仪器比较大，不适合即时、就地监控糖化血红蛋白水平。

CN101622541A公开了一种糖化血红蛋白定量检测系统及使用该系统检测糖化血红蛋白含量的方法，其中能同时检测血液中血红蛋白和糖化血红蛋白的系统装置包括侧流分析检测试纸条、用于检测来自所述试纸条上固定捕捉物区域的荧光信号的激光诱导表面荧光检测器、以及用于检测染料分析物的LED检测器，所述侧流分析检测试纸条是通过设置糖化血红蛋白，通过竞争性免疫反应与样品中的分析物通过抗原-抗体反应结合。然而，人糖化血红蛋白抗原纯制品非常昂贵，从而一定程度上限制了该检测技术的应用。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种新的糖化血红蛋白类似物的设计方案及制备方法，并采用该糖化血红蛋白类似物制备快速检测糖化血红蛋白的层析试条，利用该层析试条，可以快速、定量、简便的检测全血中的糖化血红蛋白含量。

首先，本发明提供了一种新的糖化血红蛋白类似物，本发明设计的糖化血红蛋白类似物可以代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品用于制备检测糖化血红蛋白的层析试条，与待检样本中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体。具体地，本发明设计的一种糖化血红蛋白类似物是一种糖基化多肽，该糖基化多肽具有如下所示的序列结构：

Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Cys。

该糖基化多肽可以按照现有技术的方法首先合成糖基化的缬氨酸、然后再按照常规多肽合成的方法逐次偶联上上述序列的氨基酸而制备获得。该糖基化多肽可在4℃保存备用。

另一方面，本发明还提供了一种糖基化多肽与载体蛋白的偶联物，该偶联物是本发明所述的糖基化多肽的末端Cys偶联载体蛋白后的产物。本发明的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物也可作为一种糖化血红蛋白类似物代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品用于制备检测糖化血红蛋白的层析试条，与待检样本中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体。

根据本发明的具体实施方案，其中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）、肌红蛋白、或血蓝蛋白（KLH），优选为牛血清白蛋白。

另一方面，本发明还提供了所述糖基化多肽与载体蛋白的偶联物的制备方法，该方法包括：

将所述载体蛋白如牛血清白蛋白（BSA）经SMCC修饰，在水溶液中反应活化所述载体蛋白，获得活化的载体蛋白（载体蛋白-SMCC）溶液；

将所述糖基化多肽溶解于含0.1M EDTA的0.1M pH7.2PBS溶液中；

将上述糖基化多肽溶液加入到活化的载体蛋白溶液中，混合均匀得混合液，室温放置1～3h；

用0.17%碳酸氢铵平衡sephadex G25柱，将上述混合液上柱层析，淋洗液为0.17%碳酸氢铵；280nm波长下监控收集淋出液，有两个280nm峰形，其中第一个峰形的流出液是糖基化多肽与载体蛋白的偶联物。

另一方面，本发明还提供了所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物在制备检测糖化血红蛋的层析试条中的应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物是代替人糖化血红蛋白抗原纯制品，与待检样品中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体，从而进行检测。

另一方面，本发明还提供了一种检测糖化血红蛋白的层析试条，该检测糖化血红蛋白的层析试条上设有本发明所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物，以所述糖基化多肽或偶联物与待检样品中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体，从而进行检测。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条，可以按照现有技术进行制备，本发明的关键在于以本发明所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物替代传统检测糖化血红蛋白的层析试条中的昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品。

具体实施时，本发明所述的糖基化多肽、或所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物的用量可参照现有技术中人糖化血红蛋白抗原纯制品的用量。

在本发明的一具体实施方案中，本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条包括底板以及在底板上依次顺序设置的样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸收垫；其中，按照待测样品在试条上的层析流动的上下游方向：

所述样品垫位于试条的起始端，其是用于接受待测样品，样品垫的末端与结合物释放垫部分叠合；

所述结合物释放垫的前端与样品垫部分叠合，末端与反应膜部分叠合；

所述反应膜贴合在底板上，前端与结合物释放垫部分叠合，末端与吸收垫部分叠合，且反应膜上未与结合物释放垫或吸收垫叠合的中间部分设置有检测区域，所述检测区域设有权利要求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物；

所述吸收垫设置在试条距样品垫最远的位置，与反应膜的末端部分叠合。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条中，所述结合物释放垫上设有微球标记蛋白或胶体金标记蛋白，所述微球的直径范围为100nm～300nm；优选地，所述标记蛋白为糖化血红蛋白单克隆抗体。

根据本发明的具体实施方案，本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条中，所述反应膜上未与结合物释放垫或吸收垫叠合的中间部分还设置有对照区域，该对照区域设置在检测区域的下游，对照区域内包被有糖化血红蛋白羊抗鼠二抗。

根据本发明的具体实施方案，所述待测样品为全血。

本发明的检测糖化血红蛋白的层析试条中，所述底板、样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸收垫的材质均可采用所属领域的常规材质。本发明对此不再赘述。

优选地，本发明中的样品垫可以为pall公司的CytoSep膜，能过滤血样中的各类血球细胞碎片。

优选地，可以按照以下方法制备反应膜：在硝酸纤维素膜上，用点样仪以1μl/cm的量将2mg/ml的糖化血红蛋白类似物点成带状的检测区域；糖化血红蛋白类似物溶液事先溶解于pH7.0的10mM PB中；以同样的办法再在试条的对照控制区包被羊抗鼠二抗，包被好的膜均放于干燥、密闭的干燥箱中干燥并保存待用。

优选地，可以按照以下方法制备彩色纳米微球-抗体结合物（微球标记蛋白）并进一步制备结合物释放垫：

先用MES缓冲液（pH6.5）预处理彩色纳米微球；

然后，将一定量的EDAC和NHS活化彩色纳米微球上的羧基官能团；

加入抗体，使得抗体蛋白分子的氨基官能团与上述羧基共价结合，从而获得彩色纳米微球-抗体结合物，用点样仪以1μl/mm的量将彩色纳米微球-抗体结合物均匀得喷涂于玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，得结合物释放垫。

在本发明的一具体实施方案中，是按照以下操作制备本发明的层析试条并对待测样品进行检测：分别组装制备糖化血红蛋白测试条和血红蛋白测试条。

其中，糖化血红蛋白测试条制备方案如下：

本发明的糖化血红蛋白类似物被包被在硝酸纤维素膜上作为检测区域，用于和血样中的糖化血红蛋白竞争结合微球-糖化血红蛋白抗体或胶体金-糖化血红蛋白抗体；同时包被羊抗鼠二抗为控制区，制备成自检对照区域。

本发明优选使用彩色纳米微球为标记物标记糖化血红蛋白抗体，喷涂于玻璃纤维素膜上，制备成标记物垫片（结合物释放垫）。

本发明借助毛细作用，使得样品在条状的纤维素膜上泳动，反应膜包被的糖化血红蛋白类似物将与待测样品中的糖化血红蛋白竞争结合彩色纳米微球-抗体，通过标记物显色，短时间内（15分钟内）得到结果。进一步通过光电检测仪（例如上海捷夫生物科技有限公司的“JF-200多用途标记物分析仪”）测定检测区域及对照区域的光学反射信号，可以快速、定量、简便的检测全血中的糖化血红蛋白含量。

血红蛋白试条可以采用现有技术。根据本发明的具体实施方案，本发明中所用血红蛋白试条的制备方案为：

血红蛋白被包被在硝酸纤维素膜上作为检测区域，用于和血样中的血红蛋白竞争结合微球-血红蛋白抗体或胶体金-糖化血红蛋白抗体；同时包被羊抗鼠二抗为控制区，制备成自检对照区域。

本发明中优选用彩色纳米微球标记的血红蛋白抗体标记物，喷涂于玻璃纤维素膜上，制备成标记物垫片；借助毛细作用，使得样品在条状的纤维素膜上泳动，通过标记物显色，借助光电检测仪器短时间内（与糖化血红蛋白测定同步进行）得到血红蛋白的测定值。

根据分别测定的糖化血红蛋白值与血红蛋白测定值，可以计算得到全血中的糖化血红蛋白含量。

综上所述，本发明提供了一种糖基化多肽及其与载体蛋白的偶联物及其制备方法，以及利用所述的糖基化多肽或其与载体蛋白的偶联物代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品制备得到的层析试条，本发明试条是基于现场检测的快速免疫分析技术，非常适合糖尿病人的自我监测及家庭个人的自我保健。本发明设计的糖化血红蛋白类似物可以代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品，与待检样本中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体。应用本发明的层析试条，能快速、精确、定量、简便的检测全血中的糖化血红蛋白。如图8、图9的实验结果所示，因为糖化血红蛋白类似物没有干扰显色信号的色原，所以优于带色团的人糖化血红蛋白抗原；另一方面，如图10所示合成的糖化血红蛋白类似物特异结合糖化血红蛋白抗体能力强于人糖化血红蛋白抗原，使得最终检测信号得到加强，相应的提高了检测的灵敏度。第三，合成的糖化血红蛋白类似物并不带来非特异背景信号。

附图说明

图1为BSA-SMCC的分离过程中BSA-SMCC（水溶性）收集液280nm处吸光度图。

图2为多肽-BSA的分离和制备过程中多肽BSA收集液280nm处吸光度图（碳酸氢铵过柱）。

图3是多肽-BSA试条显色图。

图4是糖化血红蛋白检测试条结构示意图。

图5是糖化血红蛋白检测标准曲线。

图6是血红蛋白检测标准曲线。

图7是糖化血红蛋白百分含量的检测标准曲线。

图8是本发明实施例3的糖化血红蛋白类似物试条的外观图片。

图9是以传统的糖化血红蛋白制备的试条的外观图片。

图10是本发明实施例3的糖化血红蛋白类似物试条的检测结果与对比例的糖化血红蛋白试条的检测结果的外观对比图。

图11A与图11B是本发明实施例3的糖化血红蛋白类似物试条的检测数据实例。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的测定方法的特点及所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。

下列实施例中未注明具体条件的操作方法，可以按照所属领域熟知的常规条件进行，或按照制造厂商所建议的条件进行，未标明温度的检测过程是在常温操作。

实施例1糖化血红蛋白类似物的设计及其制备

糖基化多肽为Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Cys，纯度为98%以上，检测合成产物的免疫活性。首先合成糖基化的缬氨酸，再按照常规多肽合成的方法(参阅《多肽合成》，黄惟德,陈常庆，科学出版社)，逐次偶联上上述序列的氨基酸，最后通过高效液相色谱分离提纯，冻干，4℃保存，通过质谱分析鉴定其纯度和分子量，证实为所述的糖基化多肽，其纯度为98%以上。

上述糖基化缬氨酸的合成可以参照现有技术进行。本实施例中的具体合成方法为：

取L-缬氨酸（0.16mol,18.8g），加入到400ml吡啶（pyridine）和400ml乙酸的混合液中，室温搅拌30分钟溶解。然后加入40g（0.22mol）的葡萄糖，通氮气5分钟密封，室温搅拌4天。过滤反应混合物，取固体物质，减压下干燥；固体物质加入到甲醇250ml，过滤，冷却到0℃再结晶，然后减压下干燥得到无色粉末，该粉末即为所述的糖基化缬氨酸。

糖基化多肽共价偶联载体蛋白的制备：

A.BSA的活化溶液的制备

1.Sephadex G-75凝胶灌注。

2.用0.1M PH7.2PBS含0.1M EDTA溶液平衡柱子。

3.样品制备

可参考Bioconjugate techniques2^nd edition,Elsevier出版社的第283-296页。

具体步骤如下：

溶液1：取4mgBSA在0.4ml水溶液中。

溶液2：用200ul水溶解2mgSMCC（水溶性，试剂盒中），并与上述溶液1完全混合，室温反应1h后得到BSA与SMCC反应混合液。

4.上样

将BSA与SMCC反应混合液上样，收集淋出液，每管500μl，收集约25管。

5.在紫外分光光度计（车间仪器）上测试上述步骤所得收集液280nm处吸收峰，如图1所示。

第7,8,9号管为活化的BSA溶液，混匀后备用。

B.多肽-BSA（糖化血红蛋白类似物）溶液的制备

1.取5mg多肽（1管），用0.5ml的0.1M pH7.2PBS含0.1M EDTA溶液溶解；

2.将上述多肽溶液与BSA-SMCC（水溶性）溶液1:1混合，室温放置2h。

3.用0.17%碳酸氢铵平衡sephadex G75柱，将上述混合液上柱层析，淋洗液为0.17%碳酸氢铵,流速0.1ml/min；每管收集500ul，280nm波长下监控收集的淋出液，如图2所示，在收集谱图上有两个280nm峰形，将收集的4～10号管的多肽BSA分别在空白试条上点样1ul，37℃固化2h，然后用彩色微球-糖化血红蛋白抗体（其制备方法参见实施例2，也可以采用胶体金-糖化血红蛋白抗体）层析，分析测试结果如图3所示，第5-10管有阳性信号，故先收集到的5-10号管为大分子量的多肽-BSA溶液，而后流出的13号～20号管为多肽溶液，回收后使用。合并第5-10管为一管，第13-20号管为一管，均冻干-20℃保存。其中第5-10管所得产物为本实施例的糖化血红蛋白类似物。

此外，图3同时表明本发明制备的多肽-BSA具有类似糖化血红蛋白抗原活性，在试条上可以俘获糖化血红蛋白抗体及胶体金复合物。

实施例2彩色纳米微球-糖化血红蛋白抗体的制备

a)用10ml的50mM MES缓冲液（pH6.5）悬浮500μl的400nm蓝色微球（Bangs公司），13000转5分钟离心，离心洗涤微球2次。

b)第3次清洗，10ml的50mM MES缓冲液（pH6.5）悬浮，使微球分散均匀。

c)称取0.5mg的EDAC(MW=191.7)和0.3mg的NHS（N-Hydroxysuccimimide,MW=115.09）溶于1ml的MES溶液，用1N的HCl调pH至5.42。

d)在剧烈搅拌下，EDAC水溶液缓慢滴入微球溶液。室温搅拌15分钟。13000转5分钟离心,用10ml的0.05M硼酸缓冲液（pH8.5）清洗一次。再离心，用10ml的0.05M硼酸缓冲液（pH8.5）悬浮微球。

e)轻微搅拌下偶联，将微球逐滴加入6ml的1mg/ml糖化血红蛋白抗体（北京怡成生物电子技术有限公司生产的冻干剂型）溶液中（用0.02M PBS，pH7.0复溶,加入前测定260nm和280nm吸光度值）。4℃反应过夜，约16小时。

f)微球溶液离心，上清留液待测蛋白浓度。用0.05M硼酸缓冲液（pH8.5）10ml悬浮微球，并室温反应30分钟。

g)然后，13000转5分钟离心2次，用10ml的0.05M硼酸缓冲液（pH8.5）悬浮微球。

h)13000转5分钟离心，用含10mg/ml BSA的0.05M硼酸缓冲液（pH8.5）悬浮，室温轻微搅拌30分钟。

i)13000转5分钟离心，用含10mg/ml BSA、10ppm Proclin的pH7.0PB悬浮微球。再次13000转5分钟离心，弃去上清，得所述彩色纳米微球-糖化血红蛋白抗体。

j)最后，用2ml的含10mg/ml蛋白稳定剂、10ppm Proclin的pH7.0PB悬浮所述彩色纳米微球-糖化血红蛋白抗体，4℃保存。

实施例3糖化血红蛋白检测试条的构建

1.将实施例1制备得到的多肽-载体蛋白（糖化血红蛋白类似物）溶液，事先溶解于pH7.0的10mM PB中配制成2mg/ml的浓度。

2.如图4所示，在反应膜上，用点样仪以1μl/mm的量将上述步骤中配制的2mg/ml的糖化血红蛋白类似物在硝酸纤维素（NC）膜上点成带状的检测区域401。

3.以同样的办法再在试条的对照区域402包被羊抗鼠二抗（长沙博优生物技术有限公司）。

4.包被好的硝酸纤维素膜均放于干燥、密闭的干燥箱中干燥并保存，得到反应膜4。

5.用点样仪以1μl/mm的量将实施例2制备的彩色纳米微球-糖化血红蛋白抗体均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，得到结合物释放垫3。

6.在PVC底板1上，依次顺序叠合样品垫2（pall公司的CytoSep膜），结合物释放垫3、反应膜4和吸收垫（Whatman CF6吸收垫）5。用切条机切成75mm×4mm条形的检测试条。该试条本发明中亦称为糖化血红蛋白类似物试条。

实施例4血红蛋白检测试条的构建

1.血红蛋白溶液事先溶解于pH7.0的10mM PB中。

2.在反应膜上，用点样仪以1μl/cm的量将1mg/ml的血红蛋白点成带状的检测区。

3.以同样的办法再在试条的对照控制区包被羊抗鼠二抗，包被好的膜均放于干燥、密闭的干燥箱中干燥并保存待用。

4.用点样仪以1μl/mm的量将彩色纳米微球-血红蛋白抗体均匀得喷涂于玻璃纤维素膜上，冷冻干燥。

5.在PVC底板上，依次顺序叠合样品垫，结合物释放垫、反应膜和吸收垫。用切条机切成75mm×4mm条形的检测试条。

实施例5检测糖化血红蛋白

1.在一小池里，将10μl试剂盒所提供的糖化血红蛋白系列标准血样用140μl样品处理液（层析液）裂解5分钟。

2.将糖化血红蛋白和血红蛋白检测试条的样品垫端同时插入小池子上，让试条略微斜靠并竖直得立在小池子上，使检测液从试条上的样品垫层析到吸收垫上。在试条的毛细管作用带动下的层析过程中，彩色纳米微球-抗体与样品中的待测分子糖化血红蛋白形成复合物；同时，样品及剩余的彩色纳米微球-抗体也流经由糖化血红蛋白类似物固定后形成的检测区域，并在流经检测区域时彩色纳米微球-抗体也与检测区中的糖化血红蛋白类似物反应而留在检测区。

3.室温5～10分钟后，将两条试条分别插入“JF-200多用途标记物分析仪”，检测仪的光学检测元件可以测定检测区带和对照区带的光学反射信号。

4.在分别测定试剂盒所提供的糖化血红蛋白系列标准血样后，按照如图5和图6所示作出糖化血红蛋白和血红蛋白的检测标准曲线。并获得如图7所示糖化血红蛋白百分含量的标准曲线。

5.同上述步骤，将10μl待测血样用140μl样品处理液（层析液）裂解5分钟。使检测液从试条上的样品垫层析到吸收垫上。室温5～10分钟后，将两条试条分别插入手持式检测仪，测定检测区带和对照区带的信号。将此测定信号代入上述已获得的糖化血红蛋白和血红蛋白的检测标准曲线，由仪器计算出待测血样的糖化血红蛋白和血红蛋白值，并给出糖化血红蛋白百分含量（糖化血红蛋白/血红蛋白×100%）。

应用本实施例的部分检测数据实例如表1、图11A及图11B所示。

表1试条标准血样梯度和一致性实验测试数据

对比例1传统的糖化血红蛋白试条的构建

参照实施例3中制备的方法，以传统的糖化血红蛋白代替实施例3中的糖化血红蛋白类似物制备糖化血红蛋白试条，点样量相同，并按照实施例5的方法对糖化血红蛋白血样（浓度为0、4.49-19.86μg/ml）进行检测，与本发明的糖化血红蛋白类似物试条进行对比。

1.试条外观的对比：

本发明实施例3的糖化血红蛋白类似物试条的外观请参见图8所示，该试条上的检测区，包被的是本发明的无色的糖化血红蛋白类似物，没有其它有色物质的干扰。

对比例的糖化血红蛋白试条的外观请参见图9所示，该试条上的检测区，由于包被的是带有血色素的糖化血红蛋白，因此试条上存在明显的血色素颜色物质的干扰；不利于定量检测。

2.试条检测结果外观的对比

本发明实施例3的糖化血红蛋白类似物试条的检测结果与对比例的糖化血红蛋白试条的检测结果的外观对比请参见图10所示。可以看出，对于相同浓度样品的检测，本发明的的糖化血红蛋白类似物试条的显色区块的颜色比对比例的糖化血红蛋白试条深很多。可以说明：在与糖化血红蛋白抗体-胶体金反应的活性方面，本发明的糖化血红蛋白类似物具有优于糖化血红蛋白的特性。因此，本发明的糖化血红蛋白类似物试条能够捕获大量糖化血红蛋白抗体-胶体金，使得显色区块颜色很深，便于检测血样中各浓度点的糖化血红蛋白；相反，糖化血红蛋白试条上的糖化血红蛋白捕获的糖化血红蛋白抗体-胶体金较少，这使得糖化血红蛋白试条上的显色区块颜色很浅，不便于检测血样中各浓度点的糖化血红蛋白，也不容易获得准确的检测信号；在实际研发过程中，显色很浅的糖化血红蛋白试条是很难用于建立检测血样中糖化血红蛋白含量的，只有糖化血红蛋白糖化血红蛋白类似物试条才可以。

此外，传统用来制备糖化血红蛋白试条的纯糖化血红蛋白价格昂贵，不利于大批量试条的生产；而本发明的糖化血红蛋白类似物的成本则相对低廉，适合控制成本、大批量生产。

Claims (10)

1.一种糖基化多肽，该糖基化多肽具有如下所示的序列结构：

Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Cys。

2.一种糖基化多肽与载体蛋白的偶联物，该偶联物是权利要求1所述的糖基化多肽的末端Cys偶联载体蛋白后的产物。

3.根据权利要求2所示的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物，其中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、肌红蛋白或血蓝蛋白。

4.权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物的制备方法，该方法包括步骤：

将所述载体蛋白经SMCC修饰，在水溶液中反应活化所述载体蛋白，获得活化的载体蛋白溶液；

将所述糖基化多肽溶解于含0.1M EDTA的0.1M pH7.2PBS溶液中；

将上述糖基化多肽溶液加入到活化的载体蛋白溶液中，混合均匀得混合液，室温放置1～3h；

用0.17%碳酸氢铵平衡sephadex G75柱，将上述混合液上柱层析，淋洗液为0.17%碳酸氢铵；280nm波长下监控收集淋出液，有两个280nm峰形，其中第一个峰形的流出液是糖基化多肽与载体蛋白的偶联物。

5.权利要求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物在制备检测糖化血红蛋的层析试条中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，权利要求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物是代替人糖化血红蛋白抗原纯制品，与待检样品中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体，从而进行检测。

7.一种检测糖化血红蛋白的层析试条，该检测糖化血红蛋白的层析试条上设有权利要求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物，以所述糖基化多肽或偶联物与待检样品中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体，从而进行检测。

8.根据权利要求7所述的检测糖化血红蛋白的层析试条，该检测糖化血红蛋白的层析试条包括底板以及在底板上依次顺序设置的样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸收垫；其中，按照待测样品在试条上的层析流动的上下游方向：

所述样品垫位于试条的起始端，其是用于接受待测样品，样品垫的末端与结合物释放垫部分叠合；

所述结合物释放垫的前端与样品垫部分叠合，末端与反应膜部分叠合；

所述反应膜贴合在底板上，前端与结合物释放垫部分叠合，末端与吸收垫部分叠合，且反应膜上未与结合物释放垫或吸收垫叠合的中间部分设置有检测区域，所述检测区域设有权利要求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物；

所述吸收垫设置在试条距样品垫最远的位置，与反应膜的末端部分叠合。

9.根据权利要求7所述的检测糖化血红蛋白的层析试条，其中，所述结合物释放垫上设有微球标记蛋白或胶体金标记蛋白，所述微球的直径范围为100nm～300nm；优选地，所述标记蛋白为糖化血红蛋白单克隆抗体。

10.根据权利要求7所述的检测糖化血红蛋白的层析试条，其中，所述反应膜上未与结合物释放垫或吸收垫叠合的中间部分还设置有对照区域，该对照区域设置在检测区域的下游，对照区域内包被有糖化血红蛋白羊抗鼠二抗。