CN109085333A - 一种类风湿因子抗原的制备、检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种类风湿因子抗原的制备、检测试剂盒及制备方法，将IgG溶液与变性缓冲液在4℃平衡混合；IgG分子与变性剂充分作用后，于55℃～65℃的恒温水浴中热聚反应30～60min，得到多聚的变性IgG；使用透析缓冲液过滤除去杂质；用储存缓冲液稀释至合适浓度并保存，制备得到的类风湿因子抗原应用于检测试剂盒中。与现有技术相比，本发明能够大幅提高此类产品的试剂性能，并且制备方法简单，制备批间差可控，可进行大批量工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物试剂，具体涉及检测试剂盒，尤其涉及一种高特异性多聚变性IgG(类风湿因子抗原)的制备、以及一种线性范围宽、灵敏度高、制备成本低的类风湿因子胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
类风湿因子(Rheumatoid Factor，RF)是一种以变性IgG为靶抗原的自身免疫性抗体，最初被发现于类风湿性关节炎患者的血清中。其本质是一种免疫球蛋白，主要为19S的IgM型类风湿因子，也有7S的IgG型和IgA型，而IgE型和IgD型的类风湿因子则较为少见。类风湿因子可识别变性IgG Fc片段的CH2、CH3部分，无种属特异性，当两者形成免疫复合物时可激活补体，引起组织损伤。RF主要存在于类风湿性关节炎患者及某些自身免疫性疾病患者血清和关节液内，阳性率高达80％，某些免疫性疾病如系统性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合症等也常见RF阳性。部分健康老年人亦可见轻度阳性，阳性率5％。而正常人体内基本没有或含量很低，RF阳性率仅为2％。因此，类风湿因子被普遍认为是诊断类风湿性关节炎患者的重要指标之一，快速高效准确地检测RF对类风湿性关节炎患者的诊断及预后具有非常重要的意义。
测定类风湿因子的方法主要有胶乳凝集反应、酶联免疫吸附试验、免疫比浊法(包括透散射免疫比浊法、透射免疫比浊法、胶乳增强免疫比浊法)。其中，胶乳凝集反应在临床上主要用于IgM-RF的检测，且干扰因素较多，只能进行半定量分析，具有局限性。酶联免疫吸附试验可进行定量分析，但人工操作误差大，实验耗时长，且易出现假阴性或者假阳性结果。而免疫比浊法尤其是胶乳增强免疫比浊法可成功避开上述缺点，可使用全自动生化分析仪实现大批量自动化操作，反应速度快、结果精确定量、可重复性强，是临床上最常用的一种检测方法。
目前，市场上已有的国产RF胶乳免疫比浊试剂盒反应特异性普遍较差。所采用的主要原料变性IgG(类风湿因子抗原)通常采用热变性的方法制备，不能保证一直维持结合位点暴露的状态，稳定性和批间差较差；进一步导致试剂盒的线性范围、灵敏度、特异性、稳定性等指标均不理想，这些技术问题都需进一步深入研究。
中国专利CN105911285A公开了一种测定类风湿因子的试剂盒，在于解决现有技术中类风湿因子检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，采用的试剂盒由试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，其中R1试剂包含Tris缓冲液30～230mmol/L、吐温-80 2.0～6.0mL/L、聚乙二醇-8000 5～15g/L、EDTA 30～50mmol/L、叠氮钠0.4～1.0g/L其溶剂为纯化水；R2试剂包含Tris缓冲液50～150mmol/L、甘油5～25mmol/L、叠氮钠0.4～1.0g/L、牛血清白蛋白20～60g/L乳胶包被抗人类风湿因子抗体0.5～4.0％、其溶剂为纯化水；其中，胶乳包被抗人类风湿因子抗体为含有能与抗人类风湿因子抗体特异性结合的Fab功能部位的单克隆完整抗体或者抗体片段，因此单位表面积胶乳微球上的类风湿因子结合位点较少，导致检测线性范围窄，不能满足临床检测要求。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种特异性强、稳定性好、批间差小的类风湿因子抗原(多聚变性IgG)。
本发明的另一个目的在于研究设计具有线性范围宽、灵敏度高、制备成本低的检测类风湿因子的试剂盒。
本发明的第三个目的在于研究检测试剂盒的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种类风湿因子抗原的制备方法，采用以下步骤：
将IgG溶液与变性缓冲液充分混合，4℃平衡过夜；
IgG分子与变性剂充分作用后，于55℃～65℃的恒温水浴中热聚反应30～60min，得到多聚的变性IgG；
选用合适的透析设备，使用透析缓冲液过滤除去杂质；
用储存缓冲液稀释至合适浓度并保存，可以稀释到浓度为5～30mg/mL，可放置于4℃短期保存或-20℃长期保存。
所述变性缓冲液由下列配比成分组成：20mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、5～8mol/L尿素或2～3mol/L盐酸胍、10～15mmol/Lβ-巯基乙醇、0.5～2g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为8.0。
透析时采用的透析设备包括但不限于透析袋、中空纤维柱或超滤杯。
所述透析缓冲液为20～100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，含0.5～2g/L叠氮化钠，pH值为7.4。
储存缓冲液由下列配比成分组成：20～100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)、100～200mM L-精氨酸、30～60g/L海藻糖、0.5～2g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为7.4。
一种检测试剂盒，由试剂R1和试剂R2按体积比为4:1组成，所述试剂R2含有类风湿因子抗原。
所述试剂R1由下列配比的成分组成：20～100mmol/L缓冲液、2～10g/L稳定剂、1～20g/L电解质、10～50g/L增敏剂、1～10g/L表面活性剂、0.5～2g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为5.5～8.0。
所述试剂R1中，
缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液(Mops)或三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、硼酸盐缓冲液中的任意一种，更优选为磷酸盐缓冲液，缓冲液pH值为5.5～8.0；
所述稳定剂选自但不限于牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠或甘氨酸中的一种或多种；
所述电解质为氯化钠或氯化钾中的一种或两种；
所述增敏剂选自但不限于聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇20000，优选为聚乙二醇20000。增敏剂主要作用于调节抗体抗原的反应速率；
所述表面活性剂选自但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、曲拉通X-405、聚乙二醇辛基苯基醚、乙二胺聚氧丙烯聚氧乙烯醚中的一种或多种，可充分暴露血清样中类风湿因子的结合位点，有利于抗原抗体的充分识别；
所述防腐剂为选自叠氮化钠、亚硝酸钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin 300中的一种或多种。其中ProClin 300为商品名，ProClin 300为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合溶液。所述pH值经12mol/L浓盐酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节。
所述试剂R2由下列配比的成分组成：20～100mmol/L缓冲液、2～10g/L蛋白保护剂、1～20g/L电解质、5～20g/L偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球、0.5～2g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为7.5～9.0。
所述偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球为偶联多聚变性IgG，粒径为120～250nm的胶乳微球。
所述胶乳微球为带有羧基的聚苯乙烯微球，所述羧基含量为0.080～0.470mmol/g。
所述试剂R2中，
所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液(Mops)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)或硼酸盐缓冲液中的任意一种，优选为甘氨酸缓冲液，缓冲液pH值为7.5～9.0；
所述蛋白保护剂选自但不限于牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、乳糖、氯化胆碱、山梨醇、甘油、甘氨酸或精氨酸中的一种或多种。
检测试剂盒的制备方法，采用以下步骤：
I、制备试剂R1：
依次将缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂、防腐剂加入到纯水中；每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料，待所有物料完全溶解后，用12mol/L浓盐酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至pH值为5.5～8.0；用0.22μm滤膜过滤以除去不溶性杂质，即为试剂R1；
II、制备试剂R2：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取粒径120～250nm的胶乳微球，加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，混合均匀后20℃-25℃活化30min；
(2)偶联：将步骤(1)中活化的聚苯乙烯胶乳微球与类风湿因子抗原混合，于20℃-25℃反应2h进行共价偶联；
(3)洗涤：洗涤步骤(2)中结合有类风湿因子抗原的胶乳微球反应液，除去游离抗体、小分子杂质；
(4)封闭：在步骤(3)得到的胶乳微球中加入牛血清白蛋白，封闭聚苯乙烯胶乳微粒上未反应的基团及其他吸附位点，封闭1h后得到初反应液；
(5)混合与保存：使用含蛋白保护剂、电解质、防腐剂的缓冲液将步骤(4)获得的初反应液稀释3～6倍，最终得到试剂R2，于4℃保存；
Ⅲ、组成试剂盒：
将上述制备的试剂R1和试剂R2按体积比R1：R2＝4:1分装入瓶组成试剂盒。
制备试剂R2的步骤(3)中采用50～100mM，pH7.0～8.0的缓冲液对胶乳微球反应液进行洗涤。
本发明通过使用偶联类风湿因子抗原的胶乳微球，与临床血清样本中的类风湿因子发生免疫反应，胶乳微球聚集导致体系浊度的改变，在特定波长下，通过测定反应前后浊度的变化测得血清样本中类风湿因子的含量。其中，胶乳微球的粒径、胶乳微球所含羧基量、偶联剂等因素均会对结果产生影响。通常情况下，小粒径微球比表面积较大所需类风湿因子抗原量较多，精密度和线性相对较好；反之大粒径微球精密度和线性相对较差，但是灵敏度较高。相同粒径微球所含羧基量不同，可活化的位点不同，也会对实验结果产生影响。羧基的化学偶联剂通常使用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)一步完成，或者利用EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分两步进行，偶联剂影响偶联效率、试剂稳定性、灵敏度等指标。上述因素均需在具体实验过程中进行优化改进，达到最佳性能指标。
本专利采用热化学变性聚合方法制备的多聚变性IgG具有多个类风湿因子结合位点，将其包被到胶乳微球表面可用于制备线性范围宽、灵敏度高、制备成本低的类风湿因子检测试剂盒。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明使用的类风湿因子抗原是采用热化学变性聚合的方法制备的多聚变性IgG，具有同类风湿因子反应的特性。目前，类风湿因子检测试剂所使用的抗原原料多为热变性方法制备的变性IgG单体或Fc片段，类风湿因子的结合位点单一；即使采用热聚合方法制备的热聚IgG具有多个结合表位，因其在低温的储存条件下结构不稳定，导致批间差难以控制。而本发明制备类风湿因子抗原在热聚反应前增加化学变性剂的预处理步骤，热聚后随温度变化结构稳定，且活性位点数目较变性IgG单体增多，特异性强、批间差小、且稳定性好。
(2)本发明试剂盒以热化学变性聚合反应制备的多聚变性IgG为原料，灵敏度高、特异性强、稳定性好，大幅提高此类产品的试剂性能。
(3)本发明试剂盒的线性范围为0～360IU/mL，高于同类产品线性范围的2～4倍；且检测血清样品迅速，准确度高，与进口对照试剂相关性良好。
(4)本发明试剂盒制备成本低、制备方法简单、制备批间差可控，可进行大批量工业化生产，有较好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例2试剂盒的线性测试结果。
图2为实施例2试剂盒与进口对照试剂盒的相关性试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
一种类风湿因子抗原的制备方法，采用以下步骤：
将IgG溶液与变性缓冲液充分混合，4℃平衡过夜；
IgG分子与变性剂充分作用后，于55℃～65℃的恒温水浴中热聚反应30～60min，得到多聚的变性IgG；
选用合适的透析设备，例如可以使用透析袋、中空纤维柱或超滤杯，或者其他的透析设备，并使用与透析设备相配套的透析缓冲液过滤除去杂质；
用储存缓冲液稀释至5～30mg/mL的浓度并保存，可放置于4℃短期保存或-20℃长期保存，可以应用在检测类风湿因子的检测试剂盒中。
在类风湿因子抗原的制备方法中，采用的变性缓冲液由下列配比成分组成：20mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、5～8mol/L尿素或2～3mol/L盐酸胍、10～15mmol/Lβ-巯基乙醇、0.5～2g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为8.0。
所述透析缓冲液为20～100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，含0.5～2g/L叠氮化钠，pH值为7.4。
储存缓冲液由下列配比成分组成：20～100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)、100～200mM L-精氨酸、30～60g/L海藻糖、0.5～2g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为7.4。
应用制备得到的多聚的变性IgG，得到检测试剂盒，该种试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比为4:1组成。
其中，试剂R1由下列配比的成分组成：20～100mmol/L缓冲液、2～10g/L稳定剂、1～20g/L电解质、10～50g/L增敏剂、1～10g/L表面活性剂、0.5～2g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为5.5～8.0。
缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液(Mops)或三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、硼酸盐缓冲液中的任意一种，最好可以选择磷酸盐缓冲液，缓冲液pH值为5.5～8.0；
稳定剂选自但不限于牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠或甘氨酸中的一种或多种；
电解质为氯化钠或氯化钾中的一种或两种；
增敏剂选自但不限于聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇20000，优选为聚乙二醇20000。增敏剂主要作用于调节抗体抗原的反应速率；
表面活性剂选自但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、曲拉通X-405、聚乙二醇辛基苯基醚、乙二胺聚氧丙烯聚氧乙烯醚中的一种或多种，可充分暴露血清样中类风湿因子的结合位点，有利于抗原抗体的充分识别；
防腐剂为选自叠氮化钠、亚硝酸钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin 300中的一种或多种。其中ProClin 300为商品名，ProClin 300为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合溶液。所述pH值经12mol/L浓盐酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节。
试剂R2由下列配比的成分组成：20～100mmol/L缓冲液、2～10g/L蛋白保护剂、1～20g/L电解质、5～20g/L偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球、0.5～2g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为7.5～9.0。
试剂R2中，偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球为偶联多聚变性IgG，粒径为120～250nm的胶乳微球。使用的胶乳微球为带有羧基的聚苯乙烯微球，羧基含量为0.080～0.470mmol/g。
缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液(Mops)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)或硼酸盐缓冲液中的任意一种，优选为甘氨酸缓冲液，缓冲液pH值为7.5～9.0；
蛋白保护剂选自但不限于牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、乳糖、氯化胆碱、山梨醇、甘油、甘氨酸或精氨酸中的一种或多种。
上述检测试剂盒的制备方法，采用以下步骤：
I、制备试剂R1：
依次将缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂、防腐剂加入到纯水中，利用磁力搅拌装置进行搅拌溶解，每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料，待所有物料完全溶解后，用12mol/L浓盐酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至pH值为5.5～8.0；用0.22μm滤膜过滤以除去不溶性杂质，即为试剂R1；
II、制备试剂R2：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取粒径120～250nm的胶乳微球，加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，混合均匀后20℃-25℃活化30min；
(2)偶联：将步骤(1)中活化的聚苯乙烯胶乳微球与类风湿因子抗原混合，于20℃-25℃反应2h进行共价偶联；
(3)洗涤：采用50～100mM，pH7.0～8.0的缓冲液对胶乳微球反应液进行洗涤，除去游离抗体、小分子杂质；
(4)封闭：在步骤(3)得到的胶乳微球中加入牛血清白蛋白，封闭聚苯乙烯胶乳微粒上未反应的基团及其他吸附位点，封闭1h后得到初反应液；
(5)混合与保存：使用含蛋白保护剂、电解质、防腐剂的缓冲液将步骤(4)获得的初反应液稀释3～6倍，最终得到试剂R2，于4℃保存；
Ⅲ、组成试剂盒：
将上述制备的试剂R1和试剂R2按体积比R1：R2＝4:1分装入瓶组成试剂盒，可以采用的包装规格为：R1(4×40mL/瓶)，R2(2×20mL/瓶)。
以下是进一步采用的具体实施例，实施例所用原料和辅料通过市售得到。
实施例1
类风湿因子抗原(多聚变性IgG)的制备
(1)配制变性缓冲液：取995mL水，依次加入2.42g三羟甲基氨基甲烷、303g尿素、1mLβ-巯基乙醇(14.4mol/L)、1g叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至8.0；用0.22μm滤膜过滤，制成1L变性缓冲液。
(2)配制透析缓冲液：取995mL水，依次加入0.59g二水合磷酸二氢钠、5.80g十二水合磷酸二氢钠、1g叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至7.4。
(3)配制储存缓冲液：取995mL水，依次加入0.59g二水合磷酸二氢钠、5.80g十二水合磷酸二氢钠、17.42g L-精氨酸、30g海藻糖、1g叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至7.4；用0.22μm滤膜过滤，制成1L变性缓冲液。
(4)热化学变性聚合反应：取10mL IgG溶液(10mg/mL)，加入90mL变性缓冲液充分混合，4℃平衡过夜；之后置于60℃的恒温水浴中热聚反应30min。
(5)透析换液：使用截留分子量为7000Da的透析袋，将上述反应液装入透析袋中，放置于透析缓冲液中透析换液；控制透析缓冲液体积为样品溶液的5倍以上，每4h更换一次，反复透析三次。
(6)浓缩：将透析袋包埋于聚乙二醇20000固体中，浓缩至10mL。
(7)保存：收集浓缩后的反应液，用储存缓冲液稀释至100mL，即得具有类风湿因子抗原活性的多聚变性IgG，可放置于4℃短期保存或-20℃长期保存。
实施例2
类风湿因子胶乳免疫比浊试剂盒的制备
I、实施例2试剂盒涉及的主要原材料如下：
类风湿因子抗原(多聚变性IgG：实施例1制备)
胶乳微球：采用直径为160nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒(日本捷时雅)
II、本实施例的主要试剂配制方法如下：
制备试剂R1：取995g水，依次加入4.1g磷酸二氢钠、5.64g十二水合磷酸氢二钠、2g乙二胺四乙酸二钠、2g牛血清白蛋白、15g氯化钠、20g聚乙二醇20000、5g吐温-20、5g乙二胺聚氧丙烯聚氧乙烯醚、1g叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5；用0.22μm滤膜过滤，制成1L试剂R1。该R1试剂添加抗干扰的表面活性剂、有助于提高抗原抗体识别特异性。
制备试剂R2，步骤如下：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取20g 160nm胶乳微球(100mg/mL)，加入10mL500mM pH值为6.1的MES溶液、2mL新鲜配制的浓度为20mg/mL的EDC溶液，纯化水补足至终体积100mL，充分混匀，室温(20～25℃)混合30min；
(2)偶联：按微球：抗原质量比＝10:1的比例将类风湿因子抗原加入步骤(1)的体系中，室温混合2h，完成抗原的偶联；
(3)洗涤：选择合适的中空纤维柱(mPES/500KD/790cm2，SPECTRUM公司)，将步骤(2)中偶联类风湿因子抗原的胶乳微球经切向流过滤系统(KrosFlo research IIi TFFsystem，SPECTRUM公司)过滤换液，控制剪切力值为4000，在此条件下过滤5倍体积的50mM的甘氨酸缓冲液；
(4)封闭：在步骤(3)重悬的体系中加入10mL 20％牛血清白蛋白溶液，于室温混合30min；
(5)混合与保存：将步骤(4)获得的胶乳微球初反应液用50mM甘氨酸缓冲液(含2％牛血清白蛋白、1.5％蔗糖、1.5％氯化钠、0.07％叠氮化钠，pH值8.0)稀释至终体积1000mL，即得到试剂R2。
III、制备类风湿因子校准品：取995mL水，依次加入50mM PBS缓冲剂、0.9％氯化钠、0.5％乙二胺四乙酸二钠、1.0％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至7.0～7.8，优选7.4；之后加入类风湿因子抗体(市售，深圳菲鹏生物)，过0.22μm滤膜，得到配制成终浓度为360IU/mL的类风湿因子校准品溶液。
IV、组成试剂盒：将上述制备的R1试剂、R2试剂按体积比R1：R2＝4：1组成试剂盒，包装规格为：R1(4×40mL/瓶)，R2(2×20mL/瓶)。
实施例3
本发明测定类风湿因子试剂盒的性能试验
检测工具：迪瑞AU680型全自动生化分析仪。
分析方法：两点终点法。主波长：600nm；副波长：无。取实施例2制得的试剂R1 280μl，加入5μl血清样本，于37℃孵育5min后加入试剂R2 70μl，读取吸光度A1，反应5min后读取吸光度A2，最终反应吸光度的计算为A2与A1的差值。
校准模式：多点非线性。反应方向：上升。
计算方法：根据吸光度与校准品的不同浓度做出校准曲线。测试血清样本获得吸光度，根据校准曲线计算得到样本含量。
参考范围：0～360IU/mL。
I、本发明试剂盒的线性测试
将实施例2制备的类风湿因子校准品用水分别稀释至0.00、22.50、45.00、90.00、180.00、360.00IU/mL，并用实施例2制备的试剂R1、试剂R2测试校准曲线。如图1所示，图中X轴表示理论值(IU/mL)，Y轴表示实测值(IU/mL)，R2＝0.9997，Y＝0.9978X+0.3429。说明本发明试剂盒在浓度0～360IU/mL范围内线性关系良好，优于专利(CN105181962A)的线性范围0～100IU/mL、专利(CN107356750A)的线性范围0～120IU/mL，专利(CN107422114A)0～100IU/mL。本发明试剂盒可检测的类风湿因子的线性范围宽，高于国产同类产品线性范围的2～4倍。
II、本发明试剂盒与进口对照试剂盒的灵敏度与相关性试验
将实施例2试剂盒与进口对照试剂盒(胶乳免疫比浊法)分别测试不同浓度校准品，吸光度对比如表1所示。说明本发明试剂盒具有较高的灵敏度。
表1
| 校准品浓度(IU/mL) | 自配试剂吸光度 | 对照试剂吸光度 |
| 0.00 | 0.0006 | 0.0017 |
| 22.5 | 0.061 | 0.0505 |
| 45.0 | 0.1123 | 0.09275 |
| 90.00 | 0.1915 | 0.17575 |
| 180.00 | 0.36836 | 0.32865 |
| 360.00 | 0.63478 | 0.5662 |
将实施例2试剂盒与进口对照试剂盒(胶乳免疫比浊法)分别测试校准曲线。并测试60例不同浓度临床血清样本，检测结果如图2所示，两者的线性相关系数R2＝0.994，相关性良好。
III、本发明试剂盒的批间差测试
依照实施例1所述的实验方法，重复制备三批次类风湿因子抗原(多聚变性IgG)，分别用于制备三批次实施例2所述的类风湿因子胶乳免疫比浊试剂盒。分别测试不同浓度校准品，吸光度对比如表2所示。结果说明本发明使用热化学变性制备的类风湿因子抗原进一步制备的类风湿因子胶乳免疫比浊试剂盒批间差小，重复性好。
表2
IV、本发明试剂盒的抗干扰测试
取体检正常的健康人血液样本(无明显溶血、黄疸、乳糜)制成混合血清(样本来源于上海复旦大学附属中山医院)，精密秤取抗坏血酸、胆红素、血红蛋白和甘油三酯，溶于上述的类似人血清基质的溶液中，制成4组高浓度干扰物溶液。分别精密量取高浓度干扰物溶液与混合血清，制成不同干扰物浓度的混合血清样本(如表3所示)，每个样本重复测定3次，取其平均值。干扰度的计算方法为：
干扰度＝加干扰物样本均值/未加干扰物样本均值×100％
干扰度在90％～110％之间为可接受干扰范围。
表3
结果说明：当抗坏血酸浓度小于等于20mg/dL、胆红素浓度小于等于40mg/dL、血红蛋白浓度小于等于500mg/dL、甘油三酯浓度小于等于1500mg/dL时，各干扰物质对本发明中的试剂盒测定结果无明显影响。
V、本发明试剂盒的效期稳定性测试
在2～8℃储存条件下，将实施例2配制好的试剂盒分别于0月、3月、6月、9月、12月、14月对同一高值校准品(本试剂配套校准品：360IU/mL)和血清样本进行检测，每个样本测定5次取平均值(如表4所示)。结果说明本发明试剂盒可在2～8℃条件下稳定储存一年。
表4
从上述实施例可知本发明研究制备的类风湿因子抗原(多聚变性IgG)特异性强、稳定性好、批间差小，用其制备的测定类风湿因子胶乳增强免疫比浊试剂盒具有线性范围宽、灵敏度高、稳定性好等优点。本发明关于制备类风湿因子抗原、类风湿因子检测试剂盒的方法简便易行，批间差可控，可进行大批量工业化生产，有较好的临床应用前景。
实施例4
一种类风湿因子抗原的制备方法，采用以下步骤：
将IgG溶液与变性缓冲液充分混合，4℃平衡过夜，采用的变性缓冲液由下列配比成分组成：20mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、5mol/L尿素、10mmol/Lβ-巯基乙醇、0.5g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为8.0；
IgG分子与变性剂充分作用后，于55℃的恒温水浴中热聚反应60min，得到多聚的变性IgG；
使用透析袋，并使用与透析设备相配套的透析缓冲液过滤除去杂质，本实施例中使用的透析缓冲液为20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，含0.5g/L叠氮化钠，pH值为7.4；
用储存缓冲液稀释至5mg/mL并保存，可放置于4℃短期保存或-20℃长期保存，可以应用在检测类风湿因子的检测试剂盒中，本实施例中储存缓冲液由下列配比成分组成：20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)、100mM L-精氨酸、30g/L海藻糖、0.5g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为7.4。
应用制备得到的多聚的变性IgG，得到检测试剂盒，该种试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比为4:1组成。
试剂R1由下列配比的成分组成：20mmol/L缓冲液、2g/L稳定剂、1g/L电解质、10g/L增敏剂、1g/L表面活性剂、0.5g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为5.5。
本实施例中，使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，pH值为5.5，稳定剂为牛血清白蛋白，电解质为氯化钠，增敏剂主要作用于调节抗体抗原的反应速率，选用的是聚乙二醇4000，表面活性剂可充分暴露血清样中类风湿因子的结合位点，有利于抗原抗体的充分识别，选用的是吐温20，防腐剂为叠氮化钠。
试剂R2由下列配比的成分组成：20mmol/L缓冲液、2g/L蛋白保护剂、1g/L电解质、5g/L偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球、0.5g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为7.5。
偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球为偶联多聚变性IgG，粒径为120nm的胶乳微球。使用的胶乳微球为带有羧基的聚苯乙烯微球，羧基含量为0.080mmol/g。缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，pH值为7.5，蛋白保护剂为牛血清白蛋白。
上述检测试剂盒的制备方法，采用以下步骤：
I、制备试剂R1：
依次将缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂、防腐剂加入到纯水中，利用磁力搅拌装置进行搅拌溶解，每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料，待所有物料完全溶解后，用12mol/L浓盐酸溶液调节pH至pH值为5.5；用0.22μm滤膜过滤以除去不溶性杂质，即为试剂R1；
II、制备试剂R2：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取粒径120nm的胶乳微球，加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，混合均匀后20℃活化30min；
(2)偶联：将步骤(1)中活化的聚苯乙烯胶乳微球与类风湿因子抗原混合，于20℃反应2h进行共价偶联；
(3)洗涤：采用50mM，pH7.0的缓冲液对胶乳微球反应液进行洗涤，除去游离抗体、小分子杂质；
(4)封闭：在步骤(3)得到的胶乳微球中加入牛血清白蛋白，封闭聚苯乙烯胶乳微粒上未反应的基团及其他吸附位点，封闭1h后得到初反应液；
(5)混合与保存：使用含蛋白保护剂、电解质、防腐剂的缓冲液将步骤(4)获得的初反应液稀释3倍，最终得到试剂R2，于4℃保存；
Ⅲ、组成试剂盒：
将上述制备的试剂R1和试剂R2按体积比R1：R2＝4:1分装入瓶组成试剂盒，可以采用的包装规格为：R1(4×40mL/瓶)，R2(2×20mL/瓶)。
实施例5
一种类风湿因子抗原的制备方法，采用以下步骤：
将IgG溶液与变性缓冲液充分混合，4℃平衡过夜；
IgG分子与变性剂充分作用后，于60℃的恒温水浴中热聚反应40min，得到多聚的变性IgG；
选用中空纤维柱，并使用与中空纤维柱相配套的透析缓冲液过滤除去杂质；
用储存缓冲液稀释至30mg/mL并保存，可放置于4℃短期保存或-20℃长期保存，可以应用在检测类风湿因子的检测试剂盒中。
采用的变性缓冲液由下列配比成分组成：20mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、8mol/L尿素、12mmol/Lβ-巯基乙醇、1g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为8.0。透析缓冲液为40mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，含1g/L叠氮化钠，pH值为7.4。
储存缓冲液由下列配比成分组成：40mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)、150mM L-精氨酸、40g/L海藻糖、1g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为7.4。
应用制备得到的多聚的变性IgG，得到检测试剂盒，该种试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比为4:1组成。
其中，试剂R1由下列配比的成分组成：40mmol/L缓冲液、4g/L稳定剂、10g/L电解质、20g/L增敏剂、4g/L表面活性剂、1g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为6。缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)，pH值为6.0；稳定剂为乙二胺四乙酸二钠，电解质为氯化钾；增敏剂为聚乙二醇6000，主要作用于调节抗体抗原的反应速率；表面活性剂为曲拉通X-100，可充分暴露血清样中类风湿因子的结合位点，有利于抗原抗体的充分识别；防腐剂为N-甲基-异噻唑酮，pH值经12mol/L浓盐酸溶液调节。
试剂R2由下列配比的成分组成：80mmol/L缓冲液、5g/L蛋白保护剂、5g/L电解质、10g/L偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球、1g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为8.0。偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球为偶联多聚变性IgG，粒径为150nm的胶乳微球。使用的胶乳微球为带有羧基的聚苯乙烯微球，羧基含量为0.2mmol/g。缓冲液为甘氨酸缓冲液，pH值为8.0；蛋白保护剂为海藻糖。
上述检测试剂盒的制备方法，采用以下步骤：
I、制备试剂R1：
依次将缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂、防腐剂加入到纯水中，利用磁力搅拌装置进行搅拌溶解，每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料，待所有物料完全溶解后，用12mol/L浓盐酸溶液调节pH至pH值为6；用0.22μm滤膜过滤以除去不溶性杂质，即为试剂R1；
II、制备试剂R2：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取粒径150nm的胶乳微球，加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，混合均匀后20℃活化30min；
(2)偶联：将步骤(1)中活化的聚苯乙烯胶乳微球与类风湿因子抗原混合，于20℃-25℃反应2h进行共价偶联；
(3)洗涤：采用60mM，pH7.0的缓冲液对胶乳微球反应液进行洗涤，除去游离抗体、小分子杂质；
(4)封闭：在步骤(3)得到的胶乳微球中加入牛血清白蛋白，封闭聚苯乙烯胶乳微粒上未反应的基团及其他吸附位点，封闭1h后得到初反应液；
(5)混合与保存：使用含蛋白保护剂、电解质、防腐剂的缓冲液将步骤(4)获得的初反应液稀释4倍，最终得到试剂R2，于4℃保存；
Ⅲ、组成试剂盒：
将上述制备的试剂R1和试剂R2按体积比R1：R2＝4:1分装入瓶组成试剂盒，可以采用的包装规格为：R1(4×40mL/瓶)，R2(2×20mL/瓶)。
实施例6
一种类风湿因子抗原的制备方法，采用以下步骤：
将IgG溶液与变性缓冲液充分混合，4℃平衡过夜；
IgG分子与变性剂充分作用后，于60℃的恒温水浴中热聚反应40min，得到多聚的变性IgG；
选用超滤杯，并使用与中空纤维柱相配套的透析缓冲液过滤除去杂质；
用储存缓冲液稀释至20mg/mL并保存，可放置于4℃短期保存或-20℃长期保存，可以应用在检测类风湿因子的检测试剂盒中。
选用合适的透析设备，例如可以使用透析袋、中空纤维柱或超滤杯，或者其他的透析设备，并使用与透析设备相配套的透析缓冲液过滤除去杂质；
用储存缓冲液稀释至合适浓度并保存，可放置于4℃短期保存或-20℃长期保存，可以应用在检测类风湿因子的检测试剂盒中。
在类风湿因子抗原的制备方法中，采用的变性缓冲液由下列配比成分组成：20mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、2mol/L盐酸胍、12mmol/Lβ-巯基乙醇、1g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为8.0。透析缓冲液为60mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，含1g/L叠氮化钠，pH值为7.4。储存缓冲液由下列配比成分组成：50mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)、180mM L-精氨酸、20g/L海藻糖、1.5g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为7.4。
应用制备得到的多聚的变性IgG，得到检测试剂盒，该种试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比为4:1组成。
其中，试剂R1由下列配比的成分组成：80mmol/L缓冲液、8g/L稳定剂、15g/L电解质、40g/L增敏剂、8g/L表面活性剂、1.5g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为7.0。缓冲液为3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液(Mops)，pH值为7.0；稳定剂为甘氨酸，电解质为氯化钾中的一种或两种，增敏为聚乙二醇20000，调节抗体抗原的反应速率；表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚，可充分暴露血清样中类风湿因子的结合位点，有利于抗原抗体的充分识别，防腐剂为市售的ProClin 300，ProClin 300为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合溶液。pH值经10mol/L氢氧化钠溶液调节。
试剂R2由下列配比的成分组成：80mmol/L缓冲液、7g/L蛋白保护剂、15g/L电解质、15g/L偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球、1.5g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为8.0。
试剂R2中，偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球为偶联多聚变性IgG，粒径为200nm的胶乳微球。使用的胶乳微球为带有羧基的聚苯乙烯微球，羧基含量为0.4mmol/g。缓冲液为甘氨酸缓冲液，pH值为8.0，蛋白保护剂为氯化胆碱、山梨醇。
上述检测试剂盒的制备方法，采用以下步骤：
I、制备试剂R1：
依次将缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂、防腐剂加入到纯水中，利用磁力搅拌装置进行搅拌溶解，每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料，待所有物料完全溶解后，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至pH值为7.0；用0.22μm滤膜过滤以除去不溶性杂质，即为试剂R1；
II、制备试剂R2：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取粒径200nm的胶乳微球，加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，混合均匀后25℃活化30min；
(2)偶联：将步骤(1)中活化的聚苯乙烯胶乳微球与类风湿因子抗原混合，于25℃反应2h进行共价偶联；
(3)洗涤：采用80mM，pH7.0的缓冲液对胶乳微球反应液进行洗涤，除去游离抗体、小分子杂质；
(4)封闭：在步骤(3)得到的胶乳微球中加入牛血清白蛋白，封闭聚苯乙烯胶乳微粒上未反应的基团及其他吸附位点，封闭1h后得到初反应液；
(5)混合与保存：使用含蛋白保护剂、电解质、防腐剂的缓冲液将步骤(4)获得的初反应液稀释4倍，最终得到试剂R2，于4℃保存；
Ⅲ、组成试剂盒：
将上述制备的试剂R1和试剂R2按体积比R1：R2＝4:1分装入瓶组成试剂盒，可以采用的包装规格为：R1(4×40mL/瓶)，R2(2×20mL/瓶)。
实施例7
一种类风湿因子抗原的制备方法，采用以下步骤：
将IgG溶液与变性缓冲液充分混合，4℃平衡过夜；
IgG分子与变性剂充分作用后，于65℃的恒温水浴中热聚反应30～60min，得到多聚的变性IgG；
选用超滤杯，并使用与超滤杯相配套的透析缓冲液过滤除去杂质；
用储存缓冲液稀释至30mg/mL并保存，可放置于4℃短期保存或-20℃长期保存，可以应用在检测类风湿因子的检测试剂盒中。
在类风湿因子抗原的制备方法中，采用的变性缓冲液由下列配比成分组成：20mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、3mol/L盐酸胍、15mmol/Lβ-巯基乙醇、2g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为8.0。透析缓冲液为100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，含2g/L叠氮化钠，pH值为7.4。储存缓冲液由下列配比成分组成：100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)、200mM L-精氨酸、60g/L海藻糖、2g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为7.4。
应用制备得到的多聚的变性IgG，得到检测试剂盒，该种试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比为4:1组成。
其中，试剂R1由下列配比的成分组成：100mmol/L缓冲液、10g/L稳定剂、20g/L电解质、50g/L增敏剂、10g/L表面活性剂、2g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为8.0。
缓冲液为硼酸盐缓冲液，pH值为8.0；稳定剂为甘氨酸，电解质为氯化钠及氯化钾；增敏剂为聚乙二醇8000，作用于调节抗体抗原的反应速率；表面活性剂为乙二胺聚氧丙烯聚氧乙烯醚，可充分暴露血清样中类风湿因子的结合位点，有利于抗原抗体的充分识别；防腐剂为N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲，pH值经10mol/L氢氧化钠溶液调节。
试剂R2由下列配比的成分组成：100mmol/L缓冲液、10g/L蛋白保护剂、20g/L电解质、20g/L偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球、2g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为9.0。
试剂R2中，偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球为偶联多聚变性IgG，粒径为250nm的胶乳微球。使用的胶乳微球为带有羧基的聚苯乙烯微球，羧基含量为0.470mmol/g。缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)，pH值为9.0；蛋白保护剂选为精氨酸。
上述检测试剂盒的制备方法，采用以下步骤：
I、制备试剂R1：
依次将缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂、防腐剂加入到纯水中，利用磁力搅拌装置进行搅拌溶解，每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料，待所有物料完全溶解后，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至pH值为8.0；用0.22μm滤膜过滤以除去不溶性杂质，即为试剂R1；
II、制备试剂R2：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取粒径250nm的胶乳微球，加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，混合均匀后25℃活化30min；
(2)偶联：将步骤(1)中活化的聚苯乙烯胶乳微球与类风湿因子抗原混合，于25℃反应2h进行共价偶联；
(3)洗涤：采用100mM，pH～8.0的缓冲液对胶乳微球反应液进行洗涤，除去游离抗体、小分子杂质；
(4)封闭：在步骤(3)得到的胶乳微球中加入牛血清白蛋白，封闭聚苯乙烯胶乳微粒上未反应的基团及其他吸附位点，封闭1h后得到初反应液；
(5)混合与保存：使用含蛋白保护剂、电解质、防腐剂的缓冲液将步骤(4)获得的初反应液稀释6倍，最终得到试剂R2，于4℃保存；
Ⅲ、组成试剂盒：
将上述制备的试剂R1和试剂R2按体积比R1：R2＝4:1分装入瓶组成试剂盒，可以采用的包装规格为：R1(4×40mL/瓶)，R2(2×20mL/瓶)。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种类风湿因子抗原的制备方法，其特征在于，该方法采用以下步骤：
将IgG溶液与变性缓冲液在4℃平衡混合；
IgG分子与变性剂充分作用后，于55℃～65℃的恒温水浴中热聚反应30～60min，得到多聚的变性IgG；
使用透析缓冲液过滤除去杂质；
用储存缓冲液稀释至浓度为5～30mg/mL并保存。
2.根据权利要求1所述的一种类风湿因子抗原的制备方法，其特征在于：
所述变性缓冲液由下列配比成分组成：20mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、5～8mol/L尿素或2～3mol/L盐酸胍、10～15mmol/Lβ-巯基乙醇、0.5～2g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为8.0；
所述透析时采用的透析设备包括但不限于透析袋、中空纤维柱或超滤杯；
所述透析缓冲液为20～100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，含0.5～2g/L叠氮化钠，pH值为7.4；
所述储存缓冲液由下列配比成分组成：20～100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)、100～200mM L-精氨酸、30～60g/L海藻糖、0.5～2g/L叠氮化钠、纯化水，pH值为7.4。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，由试剂R1和试剂R2按体积比为4:1组成，所述试剂R2含有如权利要求1或2中任一项所述方法制备得到的类风湿因子抗原。
4.根据权利要求3所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1由下列配比的成分组成：20～100mmol/L缓冲液、2～10g/L稳定剂、1～20g/L电解质、10～50g/L增敏剂、1～10g/L表面活性剂、0.5～2g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为5.5～8.0。
5.根据权利要求4所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，
缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液(Mops)或三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、硼酸盐缓冲液中的任意一种，更优选为磷酸盐缓冲液，缓冲液pH值为5.5～8.0；
所述稳定剂选自但不限于牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠或甘氨酸中的一种或多种；
所述电解质为氯化钠或氯化钾中的一种或两种；
所述增敏剂选自但不限于聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇20000，优选为聚乙二醇20000；
所述表面活性剂选自但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、曲拉通X-405、聚乙二醇辛基苯基醚、乙二胺聚氧丙烯聚氧乙烯醚中的一种或多种；
所述防腐剂为选自叠氮化钠、亚硝酸钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合溶液中的一种或几种；
所述pH值经12mol/L浓盐酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节。
6.根据权利要求3所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2由下列配比的成分组成：20～100mmol/L缓冲液、2～10g/L蛋白保护剂、1～20g/L电解质、5～20g/L偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球、0.5～2g/L防腐剂、以及纯化水，pH值为7.5～9.0。
7.根据权利要求6所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述偶联有类风湿因子抗原的胶乳微球为偶联多聚变性IgG，粒径为120～250nm的胶乳微球；所述胶乳微球为带有羧基的聚苯乙烯微球，所述羧基含量为0.080～0.470mmol/g。
8.根据权利要求6所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中，
所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液(Mops)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)或硼酸盐缓冲液中的任意一种，优选为甘氨酸缓冲液，缓冲液pH值为7.5～9.0；
所述蛋白保护剂选自但不限于牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、乳糖、氯化胆碱、山梨醇、甘油、甘氨酸或精氨酸中的一种或多种。
9.如权利要求3-8中任一项所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法采用以下步骤：
I、制备试剂R1：
依次将缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂、防腐剂加入到纯水中；每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料，待所有物料完全溶解后，用12mol/L浓盐酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至pH值为5.5～8.0；用0.22μm滤膜过滤以除去不溶性杂质，即为试剂R1；
II、制备试剂R2：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取粒径120～250nm的胶乳微球，加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，混合均匀后20℃-25℃活化30min；
(2)偶联：将步骤(1)中活化的聚苯乙烯胶乳微球与类风湿因子抗原混合，于20℃-25℃反应2h进行共价偶联；
(3)洗涤：洗涤步骤(2)中结合有类风湿因子抗原的胶乳微球反应液，除去游离抗体、小分子杂质；
(4)封闭：在步骤(3)得到的胶乳微球中加入牛血清白蛋白，封闭聚苯乙烯胶乳微粒上未反应的基团及其他吸附位点，封闭1h后得到初反应液；
(5)混合与保存：使用含蛋白保护剂、电解质、防腐剂的缓冲液将步骤(4)获得的初反应液稀释3～6倍，最终得到试剂R2，于4℃保存；
Ⅲ、组成试剂盒：
将上述制备的试剂R1和试剂R2按体积比R1：R2＝4:1分装入瓶组成试剂盒。
10.根据权利要求9所述的一种检测试剂盒的制备方法，其特征在于，制备试剂R2的步骤(3)中采用50～100mM，pH7.0～8.0的缓冲液对胶乳微球反应液进行洗涤。
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