CN111308089A - 一种类风湿因子测定试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种类风湿因子测定试剂盒。具体地，所述试剂盒包含试剂R1和试剂R2；其中，试剂R1和试剂R2的比例为4:1。具体组分详见说明书定义。本发明的试剂盒分析灵敏度高、线性范围宽、前带高、重复性好、抗干扰能力强，可用于各种生化分析仪器。

Description

一种类风湿因子测定试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种类风湿因子测定试剂盒。
背景技术
类风湿因子是一种以变性IgG的Fc片段为靶抗原的自身抗体。类风湿因子主要为19S的IgM，也有7S的IgG和IgA，它与天然IgG结合的能力较差，最易与人和动物变性IgG或免疫复合物中的IgG结合。类风湿因子与体内变性IgG结合形成免疫复合物后可活化补体或被吞噬细胞吞噬。吞噬细胞释放的溶酶体酶、活化肽、胶原酶、前列腺素E2等物质，在细胞因子和炎性粘附分子的参与下，致组织炎性损伤，发生骨关节炎及血管炎。常见的类风湿因子有IgM型、IgG型、IgA型和IgE型。IgM型被认为是类风湿因子的主要类型，也是临床免疫检验中最常测定的类型。类风湿因子是类风湿关节炎血清中常见的自身抗体。其高滴度有助于早期类风湿关节炎诊断，且滴度与患者的临床表现相关。此外，在系统性红斑狼疮、硬化症等患者和部分老年人体内也可检测到类风湿因子，但滴度较低(＜40IU/ml)，随着类风湿因子滴度增加，其对类风湿关节炎特异性增高。
临床上常用的类风湿因子检测方法主要有胶乳凝集法、ELISA法以及免疫比浊法。胶乳凝集法操作简便，不需要特殊仪器，但灵敏度低，易受多种因素影响，如实验温度、稀释液PH、胶乳颗粒的大小等，重复性差，特异性和线性均不高容易出现假阴性和假阳性，且只能定性或半定量，对临床患者的疗效观察有一定的局限性。ELISA和免疫比浊法准确性和灵敏度均高于胶乳凝集实验，但ELISA相对于免疫比浊法步骤较多，操作复杂耗时长且容易造成重复性差。免疫比浊法基于反应速度快更适用于大批量的自动化操作。然而，目前市面上主要流通的基于免疫比浊法的类风湿因子检测试剂盒的检测范围在3-120IU/ml，前带仅到500IU/ml。而IgM型类风湿因子效价＞80IU/ml并伴有严重关节功能障碍时，常提示类风湿关节炎预后不良。而且临床上类风湿阳性样本高达8000IU/ml，现有试剂的检测结果可能是弱阳性、甚至是假阴性，容易延误患者的诊断和治疗。因此，提高类风湿因子检测试剂的检测线性范围是一项具有重要临床意义的项目。
发明内容
本发明的目的是提供一种分析灵敏度高、线性范围宽、前带高、重复性好、抗干扰能力的类风湿因子测定试剂盒。
本发明提供了一种类风湿因子测定试剂盒，所述测定试剂盒包含试剂R1和试剂R2；其中，试剂R1和试剂R2的比例为4:1；
所述试剂R1包含以下组分：
Figure BDA0002393379010000021
所述的试剂R2包含以下组分：小粒径聚苯乙烯胶乳、大粒径聚苯乙烯胶乳和胶乳保护剂；
所述胶乳保护剂包含以下组分：
Figure BDA0002393379010000022
所述小粒径聚苯乙烯胶乳的粒径为20-80nm；
所述大粒径聚苯乙烯胶乳的粒径为150-200nm；
且所述小粒径聚苯乙烯胶乳或大粒径聚苯乙烯胶乳表面包被有变性IGG并修饰有8-氨基正辛酸。
在另一优选例中，所述聚苯乙烯胶乳各自独立地为羧酸化聚苯乙烯胶乳。
在另一优选例中，所述缓冲液各自独立地为磷酸盐缓冲液。
在另一优选例中，所述小粒径聚苯乙烯胶乳的粒径为60-80nm。
在另一优选例中，所述大粒径聚苯乙烯胶乳的粒径为180-190nm。
在另一优选例中，试剂R2中，所述小粒径聚苯乙烯胶乳和所述大粒径聚苯乙烯胶乳的用量比为1:1。
在另一优选例中，试剂R1或试剂R2中，所述防腐剂各自独立地为叠氮钠。
在另一优选例中，试剂R1中，所述渗透压保持剂为氯化钠。
在另一优选例中，试剂R1中，所述增浊剂为聚乙二醇6000。
在另一优选例中，试剂R2中，所述第一保护剂选自下组：牛血清白蛋白、甘氨酸或其组合。
在另一优选例中，试剂R2中，第二保护剂选自下组：牛血清白蛋白、甘氨酸或其组合。
在另一优选例中，试剂R2中，所述第一渗透压保持剂选自下组：氯化钠、氯化钾或其组合。
在另一优选例中，试剂R2中，第二渗透压保持剂选自下组：氯化钠、氯化钾或其组合。
在另一优选例中，试剂R1或试剂R2中的各个组分为实施例1中描述的各个组分。
在另一优选例中，试剂R1或试剂R2中的各个组分的含量为实施例1中描述的各个组分的含量。
在另一优选例中，所述的试剂R1由以下组分组成：
Figure BDA0002393379010000031
在另一优选例中，所述的胶乳保护剂由以下组分组成：
Figure BDA0002393379010000041
在另一优选例中，所述小粒径聚苯乙烯胶乳的制备方法如下：
(1)羧酸化聚苯乙烯胶乳的修饰：
在交联剂的作用下，将小粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳颗粒表面用8-氨基正辛酸修饰，从而得到表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳；
(2)聚苯乙烯胶乳与变性IGG的交联：
在交联剂的作用下，将上述步骤得到的表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳与变性IGG蛋白进行交联反应，从而得到表面包被有变性IGG的小粒径聚苯乙烯胶乳。
在另一优选例中，所述交联剂各自独立地为EDC。
在另一优选例中，所述表面包被有变性IGG的小粒径聚苯乙烯胶乳的制备方法如下：
(1)羧酸化聚苯乙烯胶乳的修饰：
在含有小粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的磷酸盐缓冲液溶液中加入8-氨基正辛酸水溶液；然后加入EDC的磷酸盐缓冲液溶液，进行胶乳表面修饰反应；表面修饰反应结束后，离心，收集沉淀用甘氨酸缓冲液重悬，得到表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳溶液；
(2)聚苯乙烯胶乳与变性IGG的交联：
在上述步骤得到的表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳溶液中加入EDC的甘氨酸缓冲液溶液，进行活化反应；活化反应结束后，离心，收集沉淀用甘氨酸缓冲液重悬，得到经活化的聚苯乙烯胶乳溶液；
上述经活化的聚苯乙烯胶乳溶液中加入变性IGG蛋白，进行交联反应；交联反应结束后，离心，收集沉淀用牛血清白蛋白封闭液封闭；然后离心，收集沉淀得到表面包被有变性IGG的小粒径聚苯乙烯胶乳。
在另一优选例中，小粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳为固含量为5％的小粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳粒子。
在另一优选例中，步骤(2)还包括步骤：将所述表面包被有变性IGG的小粒径聚苯乙烯胶乳用胶乳保护剂重悬。
在另一优选例中，所述胶乳保护剂与小粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的体积比为1:1。
在另一优选例中，变性IGG蛋白与小粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的质量比为1:10～1:5。
在另一优选例中，步骤(1)中，8-氨基正辛酸与小粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的摩尔质量比为9：10000。
在另一优选例中，步骤(1)或步骤(2)中，所述甘氨酸缓冲液的pH值为8。
在另一优选例中，步骤(1)或步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.2。
在另一优选例中，步骤(1)中，EDC和小粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的质量比为1:25。
在另一优选例中，步骤(1)中EDC和步骤(2)中EDC的用量比为1:1。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述表面修饰反应的时间为2-4小时。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述活化反应的时间为10-20min。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述交联反应的时间为2-3小时。
在另一优选例中，所述大粒径聚苯乙烯胶乳的制备方法如下：
(a)羧酸化聚苯乙烯胶乳粒子修饰：
在交联剂的作用下，将大粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳颗粒表面用8-氨基正辛酸修饰，从而得到表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳溶液；
(b)聚苯乙烯胶乳与变性IGG的交联：
在交联剂的作用下，将上述步骤得到的表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳与变性IGG蛋白进行交联反应，从而得到表面包被有变性IGG的大粒径聚苯乙烯胶乳。
在另一优选例中，所述交联剂各自独立地选自下组：EDC、NHS或其组合。
在另一优选例中，所述表面包被有变性IGG的大粒径聚苯乙烯胶乳的制备方法如下：
(a)羧酸化聚苯乙烯胶乳的修饰：
在含有大粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的磷酸盐缓冲液溶液中加入8-氨基正辛酸水溶液；然后加入EDC的磷酸盐缓冲液溶液，进行胶乳表面修饰反应；表面修饰反应结束后，离心，收集沉淀用甘氨酸缓冲液重悬，得到表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳溶液；
(b)聚苯乙烯胶乳与变性IGG的交联：
在上述步骤得到的表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳溶液中加入EDC和NHS的甘氨酸缓冲液，进行活化反应；活化反应结束后，离心，收集沉淀用甘氨酸缓冲液重悬，得到经活化的聚苯乙烯胶乳溶液；
上述经活化的聚苯乙烯胶乳溶液中加入变性的IGG蛋白，进行交联反应；交联反应结束后，离心，收集沉淀用牛血清白蛋白封闭液封闭；然后离心，收集沉淀得到表面包被有变性IGG的大粒径聚苯乙烯胶乳。
在另一优选例中，大粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳为固含量为5％的大粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳粒子。
在另一优选例中，步骤(b)还包括步骤：将所述表面包被有变性IGG的大粒径聚苯乙烯胶乳用胶乳保护剂重悬。
在另一优选例中，所述胶乳保护剂与大粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的体积比为1:1。
在另一优选例中，变性IGG蛋白与大粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的质量比为1:5～3:10。
在另一优选例中，步骤(a)中，8-氨基正辛酸与大粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的摩尔质量比为9：10000。
在另一优选例中，步骤(a)或步骤(b)中，所述甘氨酸缓冲液的pH值为8。
在另一优选例中，步骤(b)或步骤(b)中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.2。
在另一优选例中，步骤(a)中，EDC和大粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳的质量比为1:25。
在另一优选例中，步骤(a)中EDC和步骤(b)中EDC的用量比为1:1。
在另一优选例中，步骤(b)中EDC和步骤(b)中NHS的用量比为2:1。
在另一优选例中，步骤(a)中，所述表面修饰反应的时间为2-4小时。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述活化反应的时间为10-20min。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述交联反应的时间为2-3小时。
本发明的主要优点包括：
本发明提供了一种类风湿因子测定试剂盒。本发明的试剂盒具有分析灵敏度高、线性范围宽(在2-200IU/ml之间)、前带高(前带可达到8000IU/ml)、重复性好、抗干扰能力等优点。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明的类风湿因子检测试剂与对比试剂的准确度比较图。
图2为本发明的类风湿因子检测试剂的前带实验结果。
图3为对照组试剂的前带实验结果。
图4为本发明的类风湿因子检测试剂与实验组2的前带实验结果比较图。
具体实施方式
本发明的测定试剂盒中，试剂R1中五种表面活性剂相互作用增加了试剂的均一性、重复性、抗乳糜、黄疸、溶血样本的干扰能力以及线性。变性IGG的抗原决定簇和在聚苯乙烯的交联位点同时在Fc端，在与人血清中免疫球蛋白反应时由于位阻效应，只能结合少量的抗体，极易导致抗体过量并出现假阴性。试剂R2的交联工艺中对聚苯乙烯胶乳粒子上的羧酸官能团进行修饰，使羧酸官能团上增加了8个碳原子的长度，增加了胶乳粒子与变性IGG Fc端之间的距离，减少在免疫反应中的位阻效应，使包被后的胶乳粒子上可以结合更多的抗体，大大提高了类风湿因子试剂盒的线性范围和前带。并且试剂R2包含粒径大小在150-200nm和20-80nm两种粒径的胶乳粒子组成，粒径大的胶乳粒子比表面积小，根据Marrack的网格理论，易与低浓度的类风湿因子形成大网格免疫复合物，粒径大的胶乳粒子用于提高类风湿因子试剂盒的低值灵敏度和低值重复性。粒径小的胶乳粒子比表面积大，能够结合大量的类风湿因子并形成大网格免疫复合物，粒径小的胶乳粒子用于提高类风湿因子试剂盒的线性范围和前带。粒径大聚苯乙烯胶乳粒子的交联过程中使用两种交联剂，使变性IGG稳定共价结合在聚苯乙烯微球表面，有利于提高类风湿因子的低值灵敏度和重复性。粒径小聚苯乙烯胶乳粒子采用一种交联剂交联，使变性IGG更易结合在聚苯乙烯微球表面有利于提高类风湿因子的高值线性和前带。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1类风湿因子检测试剂的制备
本发明试剂盒为液体双试剂，分别为试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1和试剂R2的比例为4:1。
一、所述的试剂R1由以下组分组成：
Figure BDA0002393379010000081
按照R1的配方，先加入磷酸盐缓冲液和氯化钠，用80％总体积的纯化水进行溶解，搅拌20min，再加入聚乙二醇6000，搅拌20min，然后加入五种表面活性剂(Emulgen B66、曲拉通X-100、曲拉通X-405、吐温20和吐温80)，搅拌30min，最后加入防腐剂(叠氮钠)定容搅拌10min，即得到试剂R1。
二、所述的试剂R2由以下组分组成：
1.包被变性IGG的小粒径聚苯乙烯胶乳
2.包被变性IGG的大粒径聚苯乙烯胶乳
3.胶乳保护剂
所述的胶乳保护剂由以下组分组成：
Figure BDA0002393379010000082
变性IGG采购于上海生物制品研究所；
带有羧酸官能团的聚苯乙烯胶乳粒子采购于北京博尔迈生物技术有限公司。带有羧酸官能团的聚苯乙烯胶乳粒子的固含量为5％，例如取100ml带有羧酸官能团的聚苯乙烯胶乳粒子，其重量为5g。
包被变性IGG的大粒径聚苯乙烯胶乳的交联工艺如下(以100ml固含量为5％聚苯乙烯胶乳粒子为例)：
1.带有羧酸官能团的聚苯乙烯胶乳粒子修饰：量取100ml带有羧酸官能团的聚苯乙烯胶乳粒子，粒径为186nm，置于超速离心机上30000rpm离心30min，弃上清，沉淀用50mlpH7.2的磷酸盐缓冲液重悬并超声分散，加入150ml 30mmol/L的8-氨基正辛酸溶液并搅拌均匀。称取0.2g EDC用5ml pH7.2的磷酸盐缓冲溶解后，加入上述胶乳溶液中，室温反应2-4小时后12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用100ml pH8.0甘氨酸缓冲液重悬并超声分散，得到修饰后的聚苯乙烯胶乳粒子溶液。
2.修饰后的聚苯乙烯胶乳粒子与变性IGG的交联：
称取0.2g EDC和0.1g NHS用pH8.0的甘氨酸缓冲液充分溶解，加入100ml修饰后的聚苯乙烯胶乳粒子溶液反应15min，12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用100ml pH8.0的甘氨酸缓冲液重悬并超声分散，得到活化的胶乳溶液。
上述活化的胶乳溶液中加入1000mg变性IGG蛋白，搅拌反应2-3小时后12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用100ml 1％牛血清白蛋白封闭液封闭2-3小时后12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用200ml胶乳保护剂重悬，并超声分散，得到包被变性IGG的大粒径聚苯乙烯胶乳粒子溶液。
包被变性IGG的小粒径聚苯乙烯胶乳的交联工艺如下(以100ml固含量为5％聚苯乙烯胶乳粒子为例)：
1.带有羧酸官能团的聚苯乙烯胶乳粒子修饰：量取100ml带有羧酸官能团的聚苯乙烯胶乳粒子，粒径为70nm，置于超速离心机上30000rpm离心30min，弃上清，沉淀用50mlpH7.2的磷酸盐缓冲液重悬并超声分散，加入150ml 30mmol/L的8-氨基正辛酸溶液并搅拌均匀。称取0.2g EDC用5ml pH7.2的磷酸盐缓冲液溶解后，加入上述胶乳溶液中，室温反应2-4小时后12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用100ml pH8.0甘氨酸缓冲液重悬并超声分散，得到修饰后的聚苯乙烯胶乳粒子溶液。
2.修饰后的聚苯乙烯胶乳粒子与变性IGG的交联：
称取0.2g EDC用pH8.0的甘氨酸缓冲液充分溶解，加入100ml修饰后的聚苯乙烯胶乳粒子溶液反应15min，12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用100ml pH8.0的甘氨酸缓冲液重悬并超声分散，得到活化的胶乳溶液。
上述活化的胶乳溶液中加入500mg变性IGG蛋白，搅拌反应2-3小时后12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用100ml 1％牛血清白蛋白封闭液封闭2-3小时后12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用100ml胶乳保护剂重悬，并超声分散，得到包被变性IGG的小粒径聚苯乙烯胶乳粒子溶液。
包被变性IGG的大粒径聚苯乙烯胶乳粒子溶液和包被变性IGG的小粒径聚苯乙烯胶乳粒子溶液按照1比1的比例混合，即为类风湿因子R2试剂。
三、校准品的组分如下：
1.类风湿因子高值样本
2.牛血清白蛋白 2％
3.麦芽糖 2％
4.氯化钠 1％
实施例2类风湿因子检测试剂的性能检测
1.准确度实验
检测方法：采用具有双试剂功能的日立7180全自动生化分析仪，加入生理盐水、样本或校准品3.6μl，之后再加入200μl的R1试剂，预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入50μl的试剂R2，反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。
对以下两组进行对比实验，对100个样本进行检测。
实验组：实施例1制备的类风湿因子检测试剂。
对照组：对照组试剂是市场上获得认可的一种准确度优异的类风湿因子试剂盒。对照组试剂组成如下：
1.试剂1：甘氨酸缓冲液 150mM
2.试剂2：包被变性IgG的胶乳颗粒 ＜0.5％
3.校准品：类风湿因子抗原、Tris缓冲液20mmol/L、牛血清白蛋白5％、叠氮钠＜0.1％
检测结果如图1。通过图1的检测数据可知，实验组与对照组的检测结果相关性为0.9985，相关性比较好。结果表明本发明的试剂盒准确度好，完全可以满足临床需要。
2.线性范围实验
检测方法同上。
实验组：实施例1制备的类风湿因子检测试剂。
对照组：市场常见的国家食品药品监督管理局认可的类风湿因子试剂盒。对照组试剂组成如下：
1.试剂1：磷酸盐缓冲液20mmol/L、聚乙二醇6000 0.5％、吐温-20 2.0％、Proclin300 0.1％
2.试剂2：磷酸盐缓冲液20mml/L、抗人RF-IgG致敏胶乳颗粒0.8％、Proclin3000.1％
3.校准品：磷酸盐缓冲液、1％牛血清白蛋白、0.9％氯化钠、1％甘露醇、类风湿因子高值样本
使用类风湿因子高值样本为200IU/mL，用生理盐水进行系列稀释，配制7个不同浓度的样本，依次为200IU/mL、160IU/mL、120IU/mL、80IU/mL、40IU/mL、20IU/mL、2IU/mL浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值，实验结果如表1所示。
表1线性范围实验结果
理论浓度(IU/ml) 实验组(IU/ml) 相对偏差 对照组(IU/ml) 相对偏差
2 1.9 -5.00％ 1.8 -10.00％
20 21.3 6.50％ 21.6 8.00％
40 41.5 3.75％ 40.8 2.00％
80 81.3 1.62％ 79.6 -0.50％
120 118.6 -1.17％ 118.5 -1.25％
160 163.5 2.19％ 141.5 -11.56％
200 194.5 -2.75％ 169.5 -15.25％
相关系数r 0.9993 / 0.9954 /
由表1可以看出，实验组和对照组的检测结果线性相关系数均大于0.999，但是对照组在2IU/mL-200IU/mL的范围内检测结果相对偏差较大，而实验组的结果相对偏差较小，这说明本发明试剂在高值范围内具有更好的线性相关性，所测的线性范围更宽。
3.前带范围实验
检测方法同上。
实验组：实施例1制备的类风湿因子检测试剂。
对照组：市场常见的国家食品药品监督管理局认可的类风湿因子试剂盒作。对照组试剂组成如下：
1.试剂1：磷酸盐缓冲液20mmol/L、聚乙二醇6000 0.5％、吐温-20 2.0％、Proclin300 0.1％
2.试剂2：磷酸盐缓冲液20mml/L、抗人RF-IgG致敏胶乳颗粒0.8％、Proclin3000.1％
3.校准品：磷酸盐缓冲液、1％牛血清白蛋白、0.9％氯化钠、1％甘露醇、类风湿因子高值样本
使用类风湿因子高值样本为8000IU/mL，用生理盐水进行系列稀释，配制9个不同浓度的样本，依次为8000IU/mL、6000IU/mL、4000IU/mL、2000IU/mL、1000IU/mL、750IU/mL、500IU/mL、250IU/mL、125IU/mL、62.5IU/mL浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值，实验结果如表2、图2和图3所示。
表2前带实验结果
理论浓度(IU/ml) 实验组实验结果(IU/ml) 对照组实验结果(IU/ml)
62.5 61.3 60.6
125 124.5 119.6
250 251.3 189.6
500 496.5 129.6
750 743.6 105.4
1000 896.4 89.6
2000 765.3 70.5
4000 542.1 69.3
6000 396.4 59.3
8000 258.3 46.5
由表2、图2和图3可以看出，对照组在样本浓度大于500IU/ml时测值结果检测结果小于120IU/ml，线性范围为120IU/ml时前带可以做到500IU/ml；但实验组在样本浓度为8000IU/ml时测值结果检测结果大于200IU/ml，线性范围为200IU/ml时前带可以做到8000IU/ml。这说明本发明试剂在宽线性的范围内前带也可以做到更高，增加了高值样本被筛查出的概率。
4.低值重复性实验
检测方法同上。
实验组：实施例1制备的类风湿因子检测试剂。
对照组：市场常见的国家食品药品监督管理局认可的类风湿因子试剂盒。对照组试剂组成如下：
1.试剂1：磷酸盐缓冲液20mmol/L、聚乙二醇6000 0.5％、吐温-20 2.0％、Proclin300 0.1％
2.试剂2：磷酸盐缓冲液20mml/L、抗人RF-IgG致敏胶乳颗粒0.8％、Proclin3000.1％
3.校准品：磷酸盐缓冲液、1％牛血清白蛋白、0.9％氯化钠、1％甘露醇、类风湿因子样本
使用类风湿因子浓度为15IU/mL和30IU/ml的样本，每个浓度水平各样本分别测定20次，计算CV值，实验结果如表3所示。
表3低值重复性实验结果
Figure BDA0002393379010000131
Figure BDA0002393379010000141
由表3可以看出，实验组和对照组检测结果CV值均小于10％，但实验组的实验结果小于5％，对照组的重复性的CV值较大，而实验组的结果CV值相对较小，这说明本发明试剂在医学决定水平20IU/ml附近精密度更高，由于重复性引起的误差更小。
对比例
对以下两组进行前带范围实验。
实验组1：实施例1制备的类风湿因子检测试剂。
实验组2：与实验组1的不同点在于用6-氨基正己酸代替8-氨基正辛酸。
使用类风湿因子高值样本为8000IU/mL，用生理盐水进行系列稀释，配制9个不同浓度的样本，依次为8000IU/mL、6000IU/mL、4000IU/mL、2000IU/mL、1000IU/mL、750IU/mL、500IU/mL、250IU/mL、125IU/mL、62.5IU/mL浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值，实验结果如表4和图4所示。
表4前带实验结果
理论浓度(IU/ml) 实验组1实验结果(IU/ml) 实验组2实验结果(IU/ml)
62.5 61 61.5
125 121.6 120.3
250 252.3 219.3
500 509.8 221.3
750 742.6 189.6
1000 901.3 165.3
2000 768.9 143.6
4000 541.3 121.1
6000 401.2 103.5
8000 260.3 98.3
由表4和图4可以看出，实验组1在样本浓度为8000IU/ml时测值结果检测结果大于200IU/ml，线性范围为200IU/ml时前带可以做到8000IU/ml；实验组2在样本浓度为500IU/ml时测值结果检测结果大于200IU/ml，线性范围为200IU/ml时前带可以做到500IU/ml。说明连接8个碳原子的试剂比连接6个碳原子的试剂在相同的线性范围内前带可以做到更高，增加了高值样本被筛查出的概率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述测定试剂盒包含试剂R1和试剂R2；其中，试剂R1和试剂R2的比例为4:1；
所述试剂R1包含以下组分：
Figure FDA0002393376000000011
pH值为7.2；
所述的试剂R2包含以下组分：小粒径聚苯乙烯胶乳、大粒径聚苯乙烯胶乳和胶乳保护剂；
所述胶乳保护剂包含以下组分：
Figure FDA0002393376000000012
pH值为7.2；
所述小粒径聚苯乙烯胶乳的粒径为20-80nm；
所述大粒径聚苯乙烯胶乳的粒径为150-200nm；
且所述小粒径聚苯乙烯胶乳或大粒径聚苯乙烯胶乳表面包被有变性IGG并修饰有8-氨基正辛酸。
2.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，试剂R1或试剂R2中，所述防腐剂各自独立地为叠氮钠。
3.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述渗透压保持剂为氯化钠。
4.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述增浊剂为聚乙二醇6000。
5.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，试剂R2中，所述第一保护剂选自下组：牛血清白蛋白、甘氨酸或其组合。
6.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，试剂R2中，第二保护剂选自下组：牛血清白蛋白、甘氨酸或其组合。
7.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，试剂R2中，所述第一渗透压保持剂选自下组：氯化钠、氯化钾或其组合。
8.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，试剂R2中，第二渗透压保持剂选自下组：氯化钠、氯化钾或其组合。
9.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述小粒径聚苯乙烯胶乳的制备方法如下：
(1)羧酸化聚苯乙烯胶乳的修饰：
在交联剂的作用下，将小粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳颗粒表面用8-氨基正辛酸修饰，从而得到表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳；
(2)聚苯乙烯胶乳与变性IGG的交联：
在交联剂的作用下，将上述步骤得到的表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳与变性IGG蛋白进行交联反应，从而得到表面包被有变性IGG的小粒径聚苯乙烯胶乳。
10.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述大粒径聚苯乙烯胶乳的制备方法如下：
(a)羧酸化聚苯乙烯胶乳粒子修饰：
在交联剂的作用下，将大粒径羧酸化聚苯乙烯胶乳颗粒表面用8-氨基正辛酸修饰，从而得到表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳溶液；
(b)聚苯乙烯胶乳与变性IGG的交联：
在交联剂的作用下，将上述步骤得到的表面经8-氨基正辛酸修饰后的聚苯乙烯胶乳与变性IGG蛋白进行交联反应，从而得到表面包被有变性IGG的大粒径聚苯乙烯胶乳。
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