CN115856317A - 类风湿因子测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及类风湿因子测定试剂盒。本发明提供了酸性缓冲液在提高RF解离剂解离效果中的应用，以及类风湿因子试剂和/或试剂盒，相比现有试剂，显著提高了胶乳试剂的准确度。

Description

类风湿因子测定试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及类风湿因子测定试剂盒。

背景技术

临床上类风湿因子(RF)的增高可见于多种疾病，其中在类风湿关节炎患者中的阳性率最高，是诊断类风湿关节炎的血清学标志之一。

RF本质上是一种免疫球蛋白，属于一种自身免疫性抗体。据文献记载，其产生的原因可能是由于细菌、病毒、支原体等的持续感染，此时具有遗传易感性的个体在抑制性T细胞功能低下时，B细胞增殖活化，诱发正常IgG的分子结构改变，成为一种自身抗原，B细胞以此IgG为抗原，刺激浆细胞产生各类抗IgG的抗体，即RF。RF能识别变性IgG Fc段的CH2、CH3，与其形成免疫复合物，激活补体，引起组织损伤。RF阳性率在正常人2％，老年人5％，而类风湿性关节炎(RA)患者可高达80％。RF是RA患者体内发现的最有诊断价值的自身抗体。

目前测定RF常用的方法为胶乳免疫比浊法，其原理是通过制备一种包被有人类IgG的胶乳悬浮液，当含有类风湿因子的血清与此胶乳试剂混合时，抗原抗体特异性结合导致浊度升高，从而得到血清中RF的浓度。胶乳比浊法重复性好、反应速度快，而且易于自动化和标准化，目前应用比较广泛。但近年来市售的类风湿因子(RF)测定试剂盒大多存在临床比对准确度低的问题。其原因主要在于：血清中的RF主要以两种形式存在，一是游离的RF，二是与变性IgG形成免疫复合物，RF发生免疫复合物反应后，其结合位点被封闭，无法被常规胶乳免疫比浊法检出，此现象被称为隐匿性RF(HRF)，会使得测定值低于真实值，影响临床比对准确度。因此，如何满足高准确度成为了一个急需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了类风湿因子测定试剂盒，其具有准确性好的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了类风湿因子测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；

所述R1试剂包括缓冲液和RF解离剂；

所述R2试剂包括缓冲液、RF抗原标记的胶乳微球；

所述RF解离剂包括尿素或非离子表面活性剂。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒中所述非离子表面活性剂为TritonX-100或Tween 80。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述R1试剂的酸碱度为酸性。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述R1试剂还包括稳定剂、表面活性剂、盐、增敏剂或防腐剂中的一种或多种；

所述R2试剂还包括稳定剂、表面活性剂、糖类或防腐剂中的一种或多种。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述R1试剂中酸性的缓冲液包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液或磷酸盐缓冲液中的一种或多种。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述R2试剂中的所述缓冲液包括PB缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液中的一种或多种。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述稳定剂包括BSA、酪蛋白或脱脂奶粉中的一种或多种。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述表面活性剂包括Tween 20、Brij L23中的一种或二种。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述盐包括氯化钠、氯化镁、氯化铵或氯化钙中的一种或多种。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述增敏剂包括PEG6000、PEG8000或PEG20000中的一种或多种。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述防腐剂包括叠氮钠、Proclin 300、硫柳汞或BND-10中的一种或多种。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述糖类包括蔗糖、海藻糖或乳糖中的一种或多种。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述酸性缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述R2试剂中的所述缓冲液为HEPES缓冲液。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述RF解离剂为尿素。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述稳定剂为BSA。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述表面活性剂为Tween 20。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述盐为氯化铵。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述增敏剂为PEG20000。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述R1试剂中所述防腐剂为Proclin 300和BND-10。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述R2试剂中所述防腐剂为叠氮钠。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述糖类为海藻糖。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述尿素的浓度包括5M。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述R1试剂的pH值为4.0～6.0。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒的所述R1试剂中的缓冲液的pH值为4.0～6.0。

在本发明中的一些具体实施方案中，上述类风湿因子测定试剂盒中，以浓度计，所述R1试剂包括解离剂和：

以浓度计，所述R2试剂包括：

所述解离剂包括：

尿素 5M；或

Triton X-100 0.1％(w/w)；或

Tween 80 0.5％(w/w)；。

本发明的试剂有如下效果：

本发明采用特定的RF解离剂在酸性环境下，能有效地将测试样本中处于结合状态的RF从免疫复合物中分离出来，使这种隐匿性RF(HRF)更容易地被转换成游离状态的RF，从而实现了测试样本中RF含量的准确测定。

具体实施方式

本发明公开了类风湿因子测定试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为解决上述问题，本发明所公开的高灵敏度类风湿因子(RF)测定试剂盒在采用市售类风湿因子(RF)试剂盒相似基础配方的前提下，在试剂盒组分中利用酸性pH缓冲液提高了RF解离剂的解离效果，促进了测试样本中的RF从免疫复合物状态转为游离状态，从而实现了标本中RF含量的准确测定。

本发明所公开的高灵敏度、高准确度类风湿因子(RF)测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂：

所述R1试剂由缓冲液、BSA、Tween 20、盐、增敏剂、防腐剂组成，所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种；所述盐选自氯化钠、氯化镁、氯化铵、氯化钙中的一种；所述RF解离剂选自尿素、吐温80、Triton X-100中的一种；所述增敏剂选自PEG6000、PEG8000、PEG20000中的一种；所述防腐剂选自叠氮钠、Proclin 300、硫柳汞、BND-10中的一种。

所述R2试剂由缓冲液、RF抗原标记的大小粒径混合羧基胶乳微球、BSA、吐温20、糖类、防腐剂组成，所述缓冲液选自PB缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液中的一种；所述糖类选自蔗糖、海藻糖、乳糖中的一种；所述防腐剂选择叠氮钠、Proclin 300、硫柳汞、BND-10中的一种。

如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例：酸性环境下加解离剂对RF检出浓度的影响

pH值4.0～6.0时添加解离剂对RF检出浓度的影响如表1～3所示：

表1：R1试剂pH＝4.0时加入不同的解离剂后RF检出浓度

样本	对照试剂	尿素	Triton X-100	Tween 80	竞品试剂
						S1	4.8	5.6	5.4	5.3	5.2
S2	14.6	17.6	15.5	14.0	13.9
						S3	24.6	29.9	27.2	26.8	23.5
S4	41.5	56.7	50.1	48.8	42.3
						S5	110.8	135.8	121.0	125.3	115.6
p值	0.2341	0.0339	0.0251	0.0512	/

表2：R1试剂pH＝5.0时加入不同的解离剂后RF检出浓度

表3：R1试剂pH＝6.0时加入不同的解离剂后RF检出浓度

其中，对照试剂未加解离剂，尿素、Triton X-100和Tween 80处理组是在对照试剂的配方基础上分别添加5M尿素、0.1％Triton X-100和0.5％吐温80制备而成，竞品试剂为积水医疗类风湿因子检测试剂盒(胶乳免疫比浊法)，R1配方为甘氨酸缓冲液(pH 7.8)50mmol/L，pH为弱碱性，无解离剂。

具体的，对照试剂配方如表4所示(％均为质量百分数)：

表4

其中，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液在本实施例中与甘氨酸缓冲液效果相当；PB缓冲液或Tris缓冲液在本实施例中与HEPES缓冲液效果相当；酪蛋白或脱脂奶粉在本实施例中与BSA效果相当；Brij L23中在本实施例中与Tween 20效果相当；氯化钠、氯化镁或氯化钙在本实施例中与氯化铵效果相当；PEG6000或PEG8000在本实施例中与PEG20000效果相当；硫柳汞或BND-10在本实施例中与叠氮钠、Proclin 300效果相当；蔗糖或乳糖在本实施例中与海藻糖效果相当。

数据分析采用t检验成对双样本均值分析(该分析方法为现有的数据分析方法)，将不同配方的自研试剂测试结果与竞品试剂测试结果进行分析，若p值＜0.05，说明自研试剂测试结果显著高于竞品试剂，若p值>0.05，说明自研试剂测试结果与竞品试剂无显著差异。结果表明，尿素在酸性环境中均能提升RF检出浓度。

对比例：碱性环境加解离剂对RF检出浓度的影响

pH值8.0时添加解离剂对RF检出浓度的影响如表5所示，其中，竞品试剂为积水医疗类风湿因子检测试剂盒(胶乳免疫比浊法)。

表5：R1试剂pH＝8.0时加入不同的解离剂后RF检出浓度

样本	对照试剂	尿素	Triton X-100	Tween 80	竞品试剂
						S1	3.6	5.0	4.8	4.5	5.2
S2	12.0	12.8	11.6	11.3	13.9
						S3	20.1	20.8	20.3	20.5	23.5
S4	38.5	36.7	37.5	36.9	42.3
						S5	100.3	102.5	101.4	101.7	115.6
p值	0.0560	0.0615	0.0539	0.0459	/

当R1试剂pH值为碱性时，解离剂的加入对RF检出浓度无明显影响。实验证明在酸性条件下，添加尿素或非离子表面活性剂作为解离剂，能更有效地将处于结合状态的HRF从IgG中分离出来，使测试样本中的RF从免疫复合物状态转为游离状态，从而实现了标本中RF含量的准确测定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂；

所述R1试剂包括缓冲液和RF解离剂；

所述R2试剂包括缓冲液、RF抗原标记的胶乳微球；

所述RF解离剂包括尿素或非离子表面活性剂。

2.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的酸碱度为酸性。

3.如权利要求1所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述非离子表面活性剂为TritonX-100或Tween 80。

4.如权利要求1或2或3所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂还包括稳定剂、表面活性剂、盐、增敏剂或防腐剂中的一种或多种；

所述R2试剂还包括稳定剂、表面活性剂、糖类或防腐剂中的一种或多种。

5.如权利要求4所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中的缓冲液包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液或磷酸盐缓冲液中的一种或多种。

6.如权利要求4所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中的缓冲液包括PB缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液中的一种或多种。

7.如权利要求4所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括BSA、酪蛋白或脱脂奶粉中的一种或多种。

8.如权利要求4所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂包括Tween 20、Brij L23中的一种或二种。

9.如权利要求4所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述盐包括氯化钠、氯化镁、氯化铵或氯化钙中的一种或多种。

10.如权利要求4所述的类风湿因子测定试剂盒，其特征在于，所述增敏剂包括PEG6000、PEG8000或PEG20000中的一种或多种；和/或

所述防腐剂包括叠氮钠、Proclin 300、硫柳汞或BND-10中的一种或多种；和/或

所述糖类包括蔗糖、海藻糖或乳糖中的一种或多种。