CN111965372B - 免疫球蛋白e检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学免疫领域，提供了一种免疫球蛋白E检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括试剂R1和试剂R2；试剂R1由缓冲液、稳定剂、保护剂、表面活性剂、防腐剂组成；试剂R2由缓冲液、稳定剂、保护剂、防腐剂、聚苯乙烯乳胶微球‑免疫球蛋白E抗体复合物组成；所述试剂R2中，聚苯乙烯乳胶微球由150nm～220nm和270nm～400nm的两种不同粒径的微球组成。试验表明本发明所述试剂盒稳定性好、抗干扰能力强、保存期长、检测结果准确性高、线性检测范围宽，比较容易在临床进行推广。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫领域，特别涉及一种检测免疫球蛋白E的免疫比浊试剂盒及其制备方法。
背景技术
1966年，瑞典学者Johansson和日本学者石坂夫妇首先自豚草过敏患者血清中分离到IgE，并证明了IgE为过敏反应的介质。免疫球蛋白是由浆细胞所产生能与相应抗原特异性结合的球蛋白，IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋白，主要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌，为亲细胞抗体，引起I型超敏反应。免疫球蛋白E是一类具有δ链的亲同种细胞抗体，是参与过敏性鼻炎、过敏性哮喘和湿疹等发病机制调节的主要抗体。过敏原进入机体诱导产生特异性IgE，IgE结合到肥大细胞和嗜酸性粒细胞，使机体进入对该过敏原特异致敏状态。当过敏原再次接触时，与细胞膜上的IgE受体结合引起一系列生化反应，继而释放出诸如组织胺等各种与过敏反应和炎症有关的生物活性介质。正常人群IgE水平由于受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，以致各家报道的正常值相差甚远。成人血清IgE水平约在20～200IU/ml之间，一般认为大于333IU/ml(800ng/ml)时为异常升高。IgE增高相关的常见疾病：变态反应性疾病、寄生虫感染、病毒感染、自身免疫性疾病。IgE降低一般认为意义不大。
对于IgE检测，现有检测方法主要有定量检测方法和定性检测方法，定量检测方法有酶联免疫法、化学发光法、高效液相色谱分析、放射免疫分析法等。其中放射免疫分析法存在放射线辐射和污染等问题；高效液相色谱分子法需要的设备复杂且昂贵，难以适应常规临床化学实验室；而酶联免疫法和化学发光法在临床上比较常用；酶联免疫法的操作过程复杂，需要较多时间；免疫化学发光法具有灵敏度高的优点，可以满足临床IgE测定需求，但是需要配套专门仪器使用，价格昂贵不利于医院推广；定性方法主要有免疫层析法，此方法不能给出定量数据。
免疫球蛋白E胶乳免疫比浊法检测试剂盒基于样本中的IgE与包被于胶乳颗粒的特异性抗IgE抗体相结合，引起凝集反应。凝集反应的浊度高低与样本中IgE浓度成正比。该方法是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可同时测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的免疫球蛋白E免疫比浊法检测试剂稳定性不好，准确度和线性范围也不高，因而限制了其在临床上的推广应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种免疫球蛋白E免疫比浊法检测试剂盒，该试剂盒与常规的试剂盒相比，稳定性和线性范围比常规的检测试剂盒要好，抗干扰性及精密度水平高，有利于试剂在临床上的推广应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测免疫球蛋白E的免疫比浊试剂盒，所述试剂盒包括：
R1试剂，包括：HEPES缓冲液10～12g/L；NaCl 14～16g/L；增凝剂8～10g/L；表面活性剂1.0～2.0g/L；EDTA 1.5～2.5g/L；防腐剂1.0～2.0ml/L；
R2试剂，包括：缓冲液和抗体包被的胶乳微球。
在本发明的一些具体实施方案中，R2试剂中所述抗体包被的胶乳微球为聚苯乙烯乳胶微球-免疫球蛋白E抗体复合物；
所述聚苯乙烯乳胶微球由150nm～220nm和270nm～400nm的两种不同粒径的微球组成；150nm～220nm的微球与270nm～400nm的微球的质量比为1～1.25：1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚苯乙烯乳胶微球由200nm和300nm两种粒径微球组成，200nm的微球与300nm的微球的质量比为1～1.25：1。
在本发明的一些具体实施方案中，R1试剂中所述表面活性剂为吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚两者的混合物；其中，吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚的质量比为(1～2)：(1～5)。
在本发明的一些具体实施方案中，R1试剂包括HEPES缓冲液12g/L；稳定剂NaCl15g/L；增凝剂PEG8000 9.0g/L；表面活性剂吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚1.0g/L，其中，吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚的体积比为1：1；稳定剂EDTA2.0g/L；防腐剂Proclin300 1.0g/L。
在本发明的一些具体实施方案中，R2试剂中所述缓冲液包括MOPS缓冲液，pH为6.0～7.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述MOPS缓冲液的pH为6.6。
在本发明的一些具体实施方案中，所述增凝剂包括PEG8000、蔗糖中的一种或两者的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体包被的胶乳微球需经过42℃老化处理17～19h。
在本发明的一些具体实施方案中，还包括标准品；所述标准品浓度依次为：1200、600、240、120、60IU/mL。
本发明还提供了检测免疫球蛋白E的免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)试剂R1的制备：
按配方称取HEPES、牛血清白蛋白、聚乙二醇8000、氯化钠、吐温20、Brij-35、EDTA、Proclin300于洁净容器中，加去离子水搅拌30min，使其充分溶解，调节pH至8.00；加入去离子水定容至1L，过滤得R1。
2)试剂R2的制备：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球按照质量比(1～1.25)：1分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为6.6～7.0。
步骤6：将上述R2放置42℃水浴锅中老化处理17～19h即得最终R2试剂。
在本发明的一些具体实施方案中，检测免疫球蛋白E的免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)试剂R1的制备：
按配方称取12.0gHEPES、5.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、1.0g吐温20、1.0gBrij-35、2.0gEDTA、1.0gProclin300于洁净容器中，加去离子水搅拌30min，使其充分溶解，调节pH至8.00；加入去离子水定容至1L，过滤得R1。
2)试剂R2的制备：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为6.6。
步骤6：将上述R2放置42度水浴锅中老化处理18h即得最终R2试剂。
在本发明的一些具体实施方案中，检测免疫球蛋白E的免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)试剂R1的制备：
按配方称取12.0gHEPES、2.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、1.0g吐温20、2.0gBrij-35、2.0gEDTA、1.0gProclin300于洁净容器中，加去离子水搅拌30min，使其充分溶解，调节pH至8.00；加入去离子水定容至1L，过滤得R1。
2)试剂R2的制备：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为7.0。
步骤6：将上述R2放置42度水浴锅中老化处理17h即得最终R2试剂。
在本发明的一些具体实施方案中，检测免疫球蛋白E的免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)试剂R1的制备：
按配方称取12.0gHEPES、2.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、2.0g吐温20、5.0gBrij-35、2.0gEDTA、1.0gProclin300于洁净容器中，加去离子水搅拌30min，使其充分溶解，调节pH至8.00；加入去离子水定容至1L，过滤得R1。
2)试剂R2的制备：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为6.6。
步骤6：将上述R2放置42度水浴锅中老化处理19h即得最终R2试剂。
本发明的有益效果包括但不限于：
1)本发明采用胶乳免疫比浊法，通过优化反应体系，试剂R1采用多种稳定剂，优化各稳定剂的配比；试剂R2采用较优pH及处理方式，显著改善了试剂的稳定性。
2)优选的表面活性剂复配，显著增强了试剂的抗干扰能力及精密度。
本发明采用创新之处如下：
1)使用表面活性剂吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚使其试剂抗干扰能力更强。
2)对R2试剂进行42度老化处理17-19h使其试剂稳定性加强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示不同浓度IgE校准品的含量及其吸光度建立的标准曲线图；
图2示本发明IgE检测试剂盒与对照试剂盒检测结果的相关性关系图；
图3示本发明试剂盒IgE浓度检测值与理论值的线性关系图。
具体实施方式
本发明公开了一种检测免疫球蛋白E的免疫比浊试剂盒及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的检测免疫球蛋白E的免疫比浊试剂盒及其制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明所述试剂盒
1)试剂R1的制备：
按配方称取12.0gHEPES、5.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、1.0g吐温20、1.0gBrij-35、2.0gEDTA、1.0gProclin300于洁净容器中，加去离子水搅拌30min，使其充分溶解，调节pH至8.00；加入去离子水定容至1L，过滤得R1。
2)试剂R2的制备：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为6.6。
步骤6：将上述R2放置42度水浴锅中老化处理18h即得最终R2试剂。
实施例2本发明所述试剂盒
1)试剂R1的制备：
按配方称取12.0gHEPES、2.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、1.0g吐温20、2.0gBrij-35、2.0gEDTA、1.0gProclin300于洁净容器中，加去离子水搅拌30min，使其充分溶解，调节pH至8.00；加入去离子水定容至1L，过滤得R1。
2)试剂R2的制备：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为7.0。
步骤6：将上述R2放置42度水浴锅中老化处理17h即得最终R2试剂。
实施例3本发明所述试剂盒
1)试剂R1的制备：
按配方称取12.0gHEPES、2.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、2.0g吐温20、5.0gBrij-35、2.0gEDTA、1.0gProclin300于洁净容器中，加去离子水搅拌30min，使其充分溶解，调节pH至8.00；加入去离子水定容至1L，过滤得R1。
2)试剂R2的制备：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为6.6。
步骤6：将上述R2放置42度水浴锅中老化处理19h即得最终R2试剂。
对比例1
一种IgE检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述R1试剂包括以下组分：12.0gHEPES、5.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、1.0gProclin300；
所述R1试剂的制备方法包括：
按所需量称取HEPES缓冲液、聚乙二醇8000、氯化钠以及防腐剂Proclin300，放入到搅拌器中搅拌均匀后调整pH值；加去离子水至1L，搅拌均匀后过滤处理，即得R1。
对比例2
一种IgE检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述R1试剂包括以下组分：12.0gHEPES、5.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、1.0g吐温20、1.0gProclin300；
所述R1试剂的制备方法包括：
按所需量称取HEPES缓冲液、聚乙二醇8000、氯化钠、吐温20以及防腐剂Proclin300，放入到搅拌器中搅拌均匀后调整pH值；加去离子水至1L，搅拌均匀后过滤处理，即得R1。
对比例3
一种IgE检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述R1试剂包括以下组分：12.0gHEPES、5.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、1.0g吐温20、2.0gEDTA、1.0gProclin300；
所述R1试剂的制备方法包括：
按所需量称取HEPES缓冲液、聚乙二醇8000、氯化钠、吐温20、EDTA以及防腐剂Proclin300，放入到搅拌器中搅拌均匀后调整pH值；加去离子水至1L，搅拌均匀后过滤处理，即得R1。
对比例4
一种IgE检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述R1试剂包括以下组分：12.0gHEPES、5.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、2.0g吐温20、1.0gProclin300；
所述R1试剂的制备方法包括：
按所需量称取HEPES缓冲液、聚乙二醇8000、氯化钠、吐温20以及防腐剂Proclin300，放入到搅拌器中搅拌均匀后调整pH值；加去离子水至1L，搅拌均匀后过滤处理，即得R1。
对比例5
一种IgE检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述R1试剂包括以下组分：12.0gHEPES、5.0g牛血清白蛋白、9.0g聚乙二醇8000、15.0g氯化钠、1.0gBrij-35、1.0gProclin300；
所述R1试剂的制备方法包括：
按所需量称取HEPES缓冲液、聚乙二醇8000、氯化钠、Brij35以及防腐剂Proclin300，放入到搅拌器中搅拌均匀后调整pH值；加去离子水至1L，搅拌均匀后过滤处理，即得R1。
对比例6
一种IgE检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述R2试剂在制备过程中未进行老化处理；
所述R2试剂的制备方法：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为6.6。
对比例7
一种IgE检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述R2试剂最终pH为7.2。
所述R2试剂的制备方法：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为7.2。
步骤6：将上述R2放置42度水浴锅中老化处理18h即得最终R2试剂。
对比例8
一种IgE检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述R2试剂最终pH为7.5。
所述R2试剂的制备方法：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为7.5。
步骤6：将上述R2放置42度水浴锅中老化处理18h即得最终R2试剂。
对比例9
一种IgE检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述R2试剂最终pH为8.0。
所述R2试剂的制备方法：
步骤1：将200nm和300nm两种粒径的羧基化聚苯乙烯乳胶微球分别加入到10mmol/L MES缓冲液使其浓度为8.3mg/ml；
步骤2：向上述乳胶微球中分别加入4mg/mlEDC，室温下搅拌反应0.5h；
步骤3：将IgE抗体A、B用pH7.0的MOPS缓冲液溶解稀释至0.3mg/ml，然后将抗体A、B稀释液分别加入到上述活化后的聚苯乙烯乳胶微球中，室温搅拌反应3h；
步骤4：加入浓度为10％的牛血清白蛋白终止反应，室温搅拌0.5h；将得到的反应液离心，弃去上清液，得到沉淀物；
步骤5：用20mmol/L MOPS缓冲液分散沉淀物，再加入0.2g BSA、0.01g叠氮钠、0.6g蔗糖搅拌均匀；将两组胶乳混合均匀得R2，pH为8.0。
步骤6：将上述R2放置42度水浴锅中老化处理18h即得最终R2试剂。
效果例
本发明实施例1-3所述试剂盒性能评定结果水平基本一致，以实施例1-3制备的试剂盒为例对相关性、线性范围、精密度、抗干扰性、稳定性等相关性能进行验证。
(1)标准曲线制定
以上实施办法的试剂用东芝Toshiba 120FR全自动生化仪进行测试，测试波长为572nm，取样本或校准品4uL，再加入160uL的试剂R1，37℃恒温5min，然后加入80uL试剂R2，20s后读取吸光度A1，37℃孵育5min后读取吸光度A2，则反应吸光度ΔA＝A2-A1；首先使用标准品进行多点定标，并用样条函数进行计算得到定标曲线，如图1所示。
(2)相关性实验：
以市场上获得认可的一种准确度优异的免疫球蛋白E试剂盒作为对照组，实施例的试剂盒作为实验组进行对比实验，对50个样本进行检测，检测的结果如表1。在检测低值样本时，与对照试剂相比，出现0值的概率要低于对照试剂，因此分析灵敏度更高。
以市面上对照试剂盒测试结果为横坐标自变量，以本发明试剂盒测试结果为纵坐标应变量，做线性回归曲线，得实施例1回归方程为Y＝0.9823X+12.786，线性相关系数R＝0.9981；实施例2回归方程Y＝0.979X+12.184，线性相关系数R＝0.9979；实施例3回归方程Y＝0.9869X+14.2，线性相关系数R＝0.9985；线性关系良好，测试结果可以有效作为临床检验。实施例1相关性曲线见图2。
表1相关性实验检测结果(单位：IU/mL)
| 样本号 | 对照试剂 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 样本号 | 对照试剂 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 1 | 291 | 309 | 305 | 312 | 26 | 690 | 706 | 700 | 711 |
| 2 | 234 | 247 | 243 | 248 | 27 | 12 | 25 | 26 | 23 |
| 3 | 1034 | 1012 | 1011 | 1015 | 28 | 9 | 32 | 30 | 33 |
| 4 | 1081 | 1088 | 1086 | 1090 | 29 | 9 | 9 | 11 | 13 |
| 5 | 246 | 253 | 250 | 256 | 30 | 35 | 55 | 52 | 47 |
| 6 | 854 | 876 | 876 | 879 | 31 | 196 | 212 | 215 | 210 |
| 7 | 252 | 258 | 255 | 261 | 32 | 5 | 23 | 23 | 26 |
| 8 | 539 | 543 | 544 | 548 | 33 | 32 | 49 | 47 | 50 |
| 9 | 817 | 802 | 798 | 810 | 34 | 0 | 12 | 15 | 17 |
| 10 | 484 | 511 | 512 | 515 | 35 | 0 | 8 | 12 | 15 |
| 11 | 294 | 299 | 298 | 302 | 36 | 44 | 61 | 60 | 65 |
| 12 | 526 | 504 | 500 | 510 | 37 | 37 | 44 | 46 | 43 |
| 13 | 478 | 492 | 493 | 495 | 38 | 90 | 88 | 86 | 92 |
| 14 | 340 | 324 | 320 | 330 | 39 | 0 | 13 | 15 | 18 |
| 15 | 277 | 263 | 259 | 269 | 40 | 0 | 11 | 14 | 18 |
| 16 | 210 | 215 | 214 | 218 | 41 | 0 | 18 | 20 | 21 |
| 17 | 276 | 292 | 290 | 298 | 42 | 61 | 81 | 78 | 80 |
| 18 | 758 | 737 | 730 | 745 | 43 | 114 | 129 | 125 | 122 |
| 19 | 235 | 234 | 228 | 240 | 44 | 21 | 40 | 43 | 39 |
| 20 | 187 | 182 | 178 | 190 | 45 | 6 | 14 | 16 | 13 |
| 21 | 277 | 294 | 290 | 296 | 46 | 5 | 20 | 24 | 21 |
| 22 | 190 | 218 | 212 | 215 | 47 | 1 | 15 | 8 | 9 |
| 23 | 211 | 224 | 221 | 229 | 48 | 110 | 132 | 130 | 125 |
| 24 | 246 | 224 | 226 | 235 | 49 | 39 | 45 | 42 | 47 |
| 25 | 481 | 502 | 499 | 506 | 50 | 145 | 152 | 150 | 155 |
(3)线性实验：
用高低值样品混合(等差)成11个稀释浓度样本，每个样本测2次取均值。正常样本混合为低值样本11IU/mL，将IgE高值样本1186IU/mL添加到混合正常样本中作为线性高值；将高低值样本按比例混合成11个等差稀释样本。线性测定结果见表2。以理论IgE浓度作为横坐标自变量X，以实际测试值作为纵坐标应变量Y求出线性回归方程，计算线性回归相关系数r，结果显示实施例1线性回归方程为Y＝0.9713X+6.6794，其相关系数r＝0.9996；实施例2线性回归方程为Y＝0.9698X+6.5893，其相关系数r＝0.9997；实施例3线性回归方程为Y＝0.9753X+6.6804，其相关系数r＝0.9996；表明本发明在线性范围11IU/mL—1200IU/mL内相关性较好。
表2线性范围分析结果
实施例1线性范围曲线如图3。
(4)精密度检测
分别取IgE浓度高低两支血清样本，各连续测试20次，计算其变异系数，实施例精密度结果见表3，对比例1-3精密度结果见表4。从表3-4的实验结果可以看出，R1试剂中加入表面活性剂可以明显提高试剂的精密度，且加入稳定剂EDTA与表面活性剂在提高精密度上有协同作用。
表3实施例1-3精密度检测结果
表4对比例1-3精密度检测结果
(5)抗干扰检测
将临床正常病人血清分成两份，一份添加最高浓度的干扰物质，另一份添加等量的溶剂，将添加和不添加干扰物的样本做3个梯度的等差稀释，每个样本检测三次，颠倒检测顺序，计算测值的偏差。评价实施例抗干扰能力，结果如表5。评价对比例1-2，4-5抗干扰能力，结果如表6。
表5实施例1-3抗干扰检测结果
表6对比例1-2，4-5抗干扰检测结果
结果表明，本发明试剂盒对于三个浓度梯度的胆红素、血红蛋白、脂肪乳、维生素C、肝素钠干扰物质的抗干扰性都在±5％以内，具有较强的抗干扰性能。而对比例1-2，4-5而言，抗血红蛋白及肝素钠干扰的能力均超过10％，抗干扰性差。以上实验结果表明，表面活性剂的添加可以明显提升试剂抗干扰能力，且表面活性剂吐温20与Brij35具有协同作用，共同使用可以更显著地提升试剂抗干扰能力。
(6)稳定性测试
对本发明试剂盒进行开瓶稳定性和长期稳定性测试。取本发明试剂盒于测试仪器上定标，开瓶后在2-8℃环境下贮存30天，30天后对浓度分别为150IU/ml和400IU/ml的血清样本进行开瓶稳定性测试，计算开瓶30天后测试结果偏差值，结果见表7。对对比例6试剂进行开瓶稳定性测试，计算开瓶30天测试结果偏差值，结果见表8。
表7实施例1-3开瓶稳定性测定结果
表8对比例6开瓶稳定性测定结果
取本发明试剂盒于测试仪器上定标，在2-8℃环境下密封贮存18个月，分3月、6月、9月、12月、18月对浓度分别为150IU/ml和400IU/ml的血清样本进行长期稳定测试，计算开瓶18月后测试结果偏差值，结果见表9。对对比例7-9试剂进行长期稳定性测试，结果见表9。
表9实施例1与对比例7-9长期稳定性测定结果(单位：IU/mL)
表7-8结果表明，开瓶30天后，本发明试剂盒对150IU/ml和400IU/ml的血清样本的测试偏差均在3％以内，稳定性良好。而对比例6开瓶30天后测血清样本测定偏差超过10％，其稳定性很差。试剂经过42度老化处理之后，开瓶稳定性得到显著提升。
表9结果显示，开瓶18个月后，本发明试剂盒对150IU/ml和400IU/ml的血清样本的测试偏差分别为-3.3％和-2.0％，稳定性良好。相比对比例7-9稳定性有较明显提升，R2试剂pH降低有利于试剂长期稳定性。
值得注意的是，本发明实施例与对比例的区别在于：本发明实施例均采用双表面活性剂，而对比例1无添加表面活性剂，对比例2-5采用不同含量单表面活性剂；表面活性剂的添加作用在于提高试剂的抗干扰能力及精密度，测试结果表明：双表面活性剂体系可显著提高IgE检测试剂盒的抗干扰能力。本发明实施例对R2试剂均采用42度老化处理，而对比例6对R2试剂未进行42度老化处理；本发明实施例R2试剂最终pH为6.6/7.0，而对比例7-9所采用pH大于7.0，测试结果表明：42度老化处理对试剂的开盖稳定性有显著的提升；R2试剂pH降低有利于试剂长期稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种检测免疫球蛋白E的免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
R1试剂，包括：HEPES缓冲液10～12g/L；NaCl 14～16g/L；增凝剂 8～10g/L；表面活性剂1.0～2.0g/L；EDTA 1.5～2.5g/L；防腐剂Proclin300 1.0 g/L；
R2试剂，包括：缓冲液和抗体包被的胶乳微球；
R2试剂中所述抗体包被的胶乳微球为聚苯乙烯乳胶微球-免疫球蛋白E抗体复合物；
所述聚苯乙烯乳胶微球由150nm～220nm和270nm～400nm的两种不同粒径的微球组成；150nm～220nm的微球与270nm～400nm的微球的质量比为1~1.25：1；
R1试剂中所述表面活性剂为吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚两者的混合物；其中，吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚的质量比为（1~2）：（1~5）；
R2试剂中所述缓冲液包括MOPS缓冲液，pH为6.0~7.0；
所述增凝剂包括PEG8000、蔗糖中的一种或两者的混合物；
所述抗体包被的胶乳微球需经过42℃老化处理17~19h。
2.如权利要求1所述的免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述聚苯乙烯乳胶微球由200nm和300nm两种粒径微球组成，200nm的微球与300nm的微球的质量比为1~1.25：1。
3.如权利要求2所述的免疫比浊试剂盒，其特征在于，R1试剂包括HEPES缓冲液12g/L；稳定剂NaCl 15g/L；增凝剂PEG8000 9.0g/L；表面活性剂吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚1.0g/L，其中，吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚的体积比为1：1；稳定剂EDTA2.0g/L；防腐剂Proclin3001.0 g/L。
4.如权利要求3所述的免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述MOPS缓冲液的pH为6.6。
5.如权利要求1至4任一项所述的免疫比浊试剂盒，其特征在于，还包括标准品；所述标准品浓度依次为：1200、600、240、120、60IU/mL。
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