CN111239418A - 一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ana的试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents

一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ana的试剂盒及其制备使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2；反应缓冲液R1包括缓冲液、无机盐、增浊剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂；胶乳试剂R2包括至少五种通过ANA抗原与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在胶乳保存液中的ANA抗原标记的胶乳微球；其中，每个胶乳试剂组成液中采用的ANA抗原种类均不同。本发明还提供了一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒的制备使用方法。本发明的优点在于：可以使用全自动生化分析仪检测ANA，并且操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响。

Description

一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒及其制备使 用方法
技术领域
本发明涉及医学和生物检测试剂制备领域，尤其涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
自身免疫是机体免疫系统对自身成分发生免疫应答，产生低水平的抗体和致敏淋巴细胞的现象；自身免疫疾病(autoimmune disease，AID)则是由机体自身产生的抗体或致敏淋巴细胞破坏、损伤自身的组织和细胞成分，导致组织损害和器官功能障碍的原发性免疫性疾病，是目前世界上主要的致残性疾病之一。其分类可以归为：①器官特异性，病变局限于特定的器官；②全身性：病变见于多种组织和器官两大类；具有反复发作、慢性迁延、遗传倾向、女性多发等特点。对于自身免疫性疾病的诊断，除症状和体征外，免疫学实验室检查十分重要，而抗核抗体(Autoantibody To Nuclear Antigen，ANA)是AID的重要标志物，是抗核酸(Nucleic acid)和核蛋白(Nucleoprotein)抗体的总称，可分为1、抗DNA抗体；2、抗组蛋白抗体；3、抗非组蛋白抗体；4、抗核仁抗体。对于抗核抗体的检测有助于疾病的诊断：如类风湿性关节炎、干燥综合征、白塞病、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化等，可以观察疾病活动度和治疗反应，研究发病机理。
目前，检测抗核抗体的方法有：间接免疫荧光法、免疫印迹法、酶联免疫法、胶体金法和化学发光法。国内现有9家公司注册的ANA检测试剂盒，胶乳增强比浊法目前还未见到注册上市。相比较比浊法，免疫荧光法需要使用荧光显微镜，酶联免疫法需要用到酶标仪，化学发光法需要使用昂贵的化学发光仪，胶体金法不能定量检测。而基于胶乳增强免疫比浊法测定的ANA试剂盒，可以使用全自动生化分析仪检测ANA，操作简便、检测速度快，并且精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响，在临床使用上具体极大的优势。
据此，目前急需一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒及其制备使用方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种可以使用全自动生化分析仪检测ANA，并且操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒及其制备使用方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2；
所述反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：缓冲液2-10g/L，无机盐5-30g/L，增浊剂10-50g/L，防腐剂0.1-2.5g/L，稳定剂10-50g/L，表面活性剂0.5-3.0mL/L，溶剂为纯化水；
所述胶乳试剂R2包括至少五种通过ANA抗原与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在所述胶乳保存液中的ANA抗原标记的胶乳微球；所述胶乳保存液包括的成分及相应含量为：缓冲液5-20g/L，无机盐5-15g/L，稳定剂20-100g/L，防腐剂0.1-2.5g/L，表面活性剂1-5mL/L，溶剂为纯化水；其中，每个所述胶乳试剂组成液中采用的ANA抗原种类均不同。
作为本发明的优选方式之一，在所述反应缓冲液R1中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述增浊剂为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或多种；
所述防腐剂为叠氮钠、Proclin300和硫柳汞中的一种；
所述稳定剂为BSA、蔗糖和海藻糖中的一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，在所述胶乳保存液中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述稳定剂为BSA、蔗糖和海藻糖中的一种或多种；
所述防腐剂为叠氮钠、Proclin300和硫柳汞中的一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述反应缓冲液R1与胶乳保存液的pH为7.0-9.0。
作为本发明的优选方式之一，所述通过ANA抗原与胶乳微球偶联而成的各胶乳试剂组成液中，胶乳微球的粒径范围为75-300nm。
作为本发明的优选方式之一，所述胶乳试剂组成液中，胶乳微球与ANA抗原之间的v/w比为1：(5-6)。
作为本发明的优选方式之一，所述ANA抗原选自dsDNA、ssDNA、组蛋白、Nucleosome、Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La、U1-snRNP、Scl-70、Jo-1、Rib-P、PCNA、CENPB和AMA-M2抗原。
作为本发明的优选方式之一，所述胶乳试剂R2具体包括五种通过ANA抗原与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液；其中，各胶乳试剂组成液中采用的ANA抗原分别为U1-snRNP、Scl-70、Sm、CENPB、AMA-M2。
一种上述基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制反应缓冲液R1：
按照反应缓冲液R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得反应缓冲液R1；
(2)配制胶乳试剂R2：
①取固含量10％的聚苯乙烯胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心、去上清后用活化缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，并加入活化剂活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球；
②取ANA抗原，分别与活化胶乳微球混匀，并进行偶联，偶联时间2h，制取偶联后的胶乳微球；
③向上述偶联后的胶乳微球中加入封闭缓冲液进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清，并加入胶乳保存液重悬超声，制取各自的胶乳试剂组成液；然后，将制取的各胶乳试剂组成液混合，即得所需的胶乳试剂R2。
作为本发明的优选方式之一，在所述步骤①中，所述清洗缓冲液与活化缓冲液采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液；所述偶联缓冲液采用MES缓冲液；所述活化剂采用EDAC/NHS；在所述步骤③中，所述封闭缓冲液采用BSA、甘氨酸中的一种或多种，封闭时间1h。
一种上述基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：
(1)吸取25μL样本，加入225μL试剂R1，37℃孵育5min；
(2)再加入75μL试剂R2，混匀；
(3)37℃孵育30s后读取吸光值A1；再孵育4.5min，读取吸光值A2；最后，计算ΔA，ΔA＝A2-A1，根据ΔA测算样本中ANA含量。
作为本发明的优选方式之一，本发明中采用的ANA抗原均来源于本领域可直接购买得到的ANA纯化抗原。
本发明试剂盒用于检测人血清中ANA的含量，其反应原理如下：
本方法是胶乳颗粒增强免疫比浊法。将抗原结合到胶乳颗粒上，病人血清中的被测抗体在缓冲液中与胶乳表面的抗原结合，使胶乳颗粒彼此交联，致使溶液浊度增加。在一定范围内，在特定波长下检测其吸光度，反应液浊度与被测抗体的量呈线性相关，即其变化程度与样本中的ANA含量成正比。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)解决了现有市场上流通的检测ANA的胶体金法不能定量检测的缺点，并且使用全自动生化分析仪检测ANA，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好，检测结果不受操作影响，在临床使用上具体极大的优势；
(2)通过本发明制备方法制备出的试剂盒，可以同时提高检测的灵敏度和特异性，使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求；
(3)在胶乳增强免疫比浊法应用中，由于抗核抗体检测的特殊性，需要多个指标进行评估，故本发明筛选出最优的5种抗原(U1-snRNP、Scl-70、Sm、CENPB、AMA-M2)组合与胶乳分别进行偶联标记然后混合，具有更好的灵敏度和线性范围。
附图说明
图1是实施例6中本发明试剂盒的拟合曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2。
反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：甘氨酸缓冲液2g/L，氯化镁或氯化钾5g/L，聚乙二醇1000 10g/L，Proclin300 0.1g/L，BSA10g/L，吐温-20 0.5mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.0。
胶乳试剂R2包括五种通过ANA抗原与胶乳微球(75nm)偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在胶乳保存液中的ANA抗原标记的胶乳微球。其中，胶乳保存液包括的成分及相应含量为：甘氨酸缓冲液5g/L，氯化镁或氯化钾5g/L，BSA20g/L，Proclin300 0.1g/L，吐温-80 1mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.0。
进一步地，每个胶乳试剂组成液中采用的ANA抗原种类均不同，五种ANA抗原分别为dsDNA、ssDNA、组蛋白、Nucleosome、Sm/RNP。
进一步地，每个胶乳试剂组成液中，胶乳微球与ANA抗原之间的v/w比为1：5。
实施例2
本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2。
反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液或3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液10g/L，氯化锌或氯化钙30g/L，聚乙二醇2000或聚乙二醇600050g/L，硫柳汞2.5g/L，海藻糖50g/L，曲拉通X-100 3.0mL/L，溶剂为纯化水，pH 9.0。
胶乳试剂R2包括五种通过ANA抗原与胶乳微球(300nm)偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在胶乳保存液中的ANA抗原标记的胶乳微球。其中，胶乳保存液包括的成分及相应含量为：2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液或3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液20g/L，氯化锌或氯化钙15g/L，海藻糖100g/L，硫柳汞2.5g/L，曲拉通X-100 5mL/L，溶剂为纯化水，pH 9.0。
进一步地，每个胶乳试剂组成液中采用的ANA抗原种类均不同，五种ANA抗原分别为SSA/Ro、SSB/La、Jo-1、Rib-P、PCNA。
进一步地，每个胶乳试剂组成液中，胶乳微球与ANA抗原之间的v/w比为1：6。
实施例3
本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2。
反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液4.82g/L，氯化钠15.4g/L，聚乙二醇8000 27g/L，叠氮钠1g/L，蔗糖23.5g/L，吐温-80 1.9mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.4。
胶乳试剂R2包括五种通过ANA抗原与胶乳微球(125nm)偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在胶乳保存液中的ANA抗原标记的胶乳微球。其中，胶乳保存液包括的成分及相应含量为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液10.2g/L，氯化钠8.9g/L，蔗糖36g/L，BSA25g/L，叠氮钠1g/L，吐温-20 2.5mL/L，溶剂为纯化水，pH7.4。
进一步地，每个胶乳试剂组成液中采用的ANA抗原种类均不同，五种ANA抗原分别为U1-snRNP、Scl-70、Sm、CENPB、AMA-M2抗原。
进一步地，每个胶乳试剂组成液中，胶乳微球与ANA抗原之间的v/w比为1：5.5。
实施例4
本实施例的一种上述实施例中基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制反应缓冲液R1：
按照反应缓冲液R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得反应缓冲液R1。
(2)配制胶乳试剂R2：
清洗：量取固含为10％的胶乳微球各0.5mL分别加至5.0mL的清洗缓冲液中(用2个离心管)，20000转/分钟，离心30分钟，去上清，用5mL活化缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬后，进行超声。本步骤所用清洗缓冲液和活化缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
活化：量取2％的EDAC 0.2mL和4％NHS 0.2mL的活化剂加入到上述清洗好的胶乳微球中，混匀，对胶乳微球进行活化，活化时间0.5小时，活化温度37℃，；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球。本步骤所用偶联缓冲液为MES缓冲液。
偶联：取U1-snRNP、Scl-70、Sm、CENPB、AMA-M2五种筛选好的特异性强的ANA抗原分别与活化好的胶乳微球进行偶联，时间2小时，制取偶联后的胶乳微球；其中，胶乳微球与抗原的比例为：1:5/1:6(v/w比)，优选为1:5.5。
封闭：偶联时间结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，取5.0mL的封闭缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间1h，温度为37℃。本步所用的封闭缓冲液采用BSA、甘氨酸中的一种或多种，优选1％BSA。
定溶：封闭结束后，开始离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，加入40mL的胶乳保存液对胶乳微球进行重悬超声，然后定溶。将以上含5种标记好的微球的胶乳保存液按照U1-snRNP：Scl-70：Sm：CENPB：AMA-M25为4:3:1:1:1比例混合，即得所需的胶乳试剂R2。
实施例5
本实施例的一种上述实施中基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒的使用方法。
检测仪器：日立7180；
温度：37℃；
比色杯：1cm；
分析方法：两点终点法；
测光点：19-34；
主副波长：505/0nm；
样本量/R1/R2:25μL/225μL/75μL；
反应方向：(+)。
使用步骤：参见表1。
表1本发明试剂盒的使用步骤
Figure BDA0002404267820000101
校准方式为样条函数Spline。采用多点校准模式，用纯化水为零点，建立工作曲线。
计算方法：以校准品浓度对相应ΔA拟合校准曲线，样本浓度值通过校准曲线得出。
实施例6
本实施例用以评价上述实施中基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒的性能：
(1)线性相关性验证
线性相关系数：在[100.0RU/mL-2000.0RU/mL]范围内用接近线性区间下限的低值标本稀释接近线性区间上限的高值标本，混合成至少5个不同浓度(Xi)的标本，每个标本重复测定3次，分别计算测定结果的均值(yi)，见表2。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数r，所得结果应符合r≥0.9900的要求。
Figure BDA0002404267820000111
表2本发明试剂盒的线性相关性比对值
Figure BDA0002404267820000112
图1是本发明试剂盒的拟合曲线图，如图1所示，本试剂盒的直线拟合曲线为：y＝0.9894x+9.657，R2＝0.9997，R2>0.99，满足临床要求。
(2)精密度、重复性验证
重复性：在重复条件下，取(200.0±50.0)RU/mL和(600.0±100.0)RU/mL浓度的样本(质控品、校准品或其他定值样本)，用同一批号试剂重复测定10次，分别计算测定值的平均值和标准差，按公式(2)计算批内变异系数(CV)，所得结果CV应≤8.0％。
Figure BDA0002404267820000113
式中：SD为标准差，计算公式为
Figure BDA0002404267820000114
dn为同水平各次所测值的偏差，计算公式为
Figure BDA0002404267820000115
xn为同水平各次所测值；
Figure BDA0002404267820000121
为平均值，计算公式为
Figure BDA0002404267820000122
结果如表3所示。
表3本发明试剂盒的重复性检测结果总结表
Figure BDA0002404267820000123
由检测结果可以看出，低值样本的CV为1.1％，高值样本的CV为0.9％，均小于8％，满足临床要求。
(3)准确度验证
取高、低两个水平的质控品，按照说明书操作步骤进行测定，用同一批号试剂重复测定3次，测试结果记为(xi)，按公式(3)求出相对偏差(Bi)，3次结果均应符合测定值与质控品靶值相对偏差≤15.0％；如果3次结果中有2次符合要求，1次不符合要求，应重新连续测试20次，并分别按照公式(3)计算相对偏差(Bi)，当大于等于19次结果符合要求，准确度被验证，即符合测定值与质控品靶值相对偏差≤15.0％的要求。
Figure BDA0002404267820000131
式中：xi为测定结果；
T为靶值。
结果如表4所示。
表4本发明试剂盒的准确度检测结果总结表
Figure BDA0002404267820000132
从检测结果可以看出，低值质控的相对偏差为0.21％，高值质控的相对偏差为0.62％，均小于15％，故满足临床要求。
综上所述，本发明提供一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒及其制备使用方法，能有效的提升ANA检测试剂的灵敏度与特异性。本发明采用了多种ANA特异性强的抗原(如，U1-snRNP、Scl-70、Sm、CENPB、AMA-M2等)通过标记胶乳微球，偶联然后按照U1-snRNP：Scl-70、Sm：CENPB：AMA-M＝4:3:1:1:1混合在一起的技术来制备检测ANA试剂盒，实现了上全自动生化仪，自动检测，并有效提高试剂的灵敏度与特异性，具有极高的应用价值与广阔的市场前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，其特征在于，包括反应缓冲液R1和胶乳试剂R2；
所述反应缓冲液R1包括的成分及相应含量为：缓冲液2-10g/L，无机盐5-30g/L，增浊剂10-50g/L，防腐剂0.1-2.5g/L，稳定剂10-50g/L，表面活性剂0.5-3.0mL/L，溶剂为纯化水；
所述胶乳试剂R2包括至少五种通过ANA抗原与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在所述胶乳保存液中的ANA抗原标记的胶乳微球；所述胶乳保存液包括的成分及相应含量为：缓冲液5-20g/L，无机盐5-15g/L，稳定剂20-100g/L，防腐剂0.1-2.5g/L，表面活性剂1-5mL/L，溶剂为纯化水；其中，每个所述胶乳试剂组成液中采用的ANA抗原种类均不同。
2.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，其特征在于，在所述反应缓冲液R1中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述增浊剂为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或多种；
所述防腐剂为叠氮钠、Proclin300和硫柳汞中的一种；
所述稳定剂为BSA、蔗糖和海藻糖中的一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，其特征在于，在所述胶乳保存液中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述稳定剂为BSA、蔗糖和海藻糖中的一种或多种；
所述防腐剂为叠氮钠、Proclin300和硫柳汞中的一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液R1与胶乳保存液的pH为7.0-9.0。
5.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，其特征在于，所述通过ANA抗原与胶乳微球偶联而成的各胶乳试剂组成液中，胶乳微球的粒径范围为75-300nm。
6.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，其特征在于，所述胶乳试剂组成液中，胶乳微球与ANA抗原之间的v/w比为1：(5-6)。
7.根据权利要求1-6任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒，其特征在于，所述ANA抗原选自dsDNA、ssDNA、组蛋白、Nucleosome、Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La、U1-snRNP、Scl-70、Jo-1、Rib-P、PCNA、CENPB和AMA-M2抗原。
8.一种如权利要求1-7任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制反应缓冲液R1：
按照反应缓冲液R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得反应缓冲液R1；
(2)配制胶乳试剂R2：
①取固含量10％的聚苯乙烯胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心、去上清后用活化缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，并加入活化剂活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球；
②取ANA抗原，分别与活化胶乳微球混匀，并进行偶联，偶联时间2h，制取偶联后的胶乳微球；
③向上述偶联后的胶乳微球中加入封闭缓冲液进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清，并加入胶乳保存液重悬超声，制取各自的胶乳试剂组成液；然后，将制取的各胶乳试剂组成液混合，即得所需的胶乳试剂R2。
9.根据权利要求8所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤①中，所述清洗缓冲液与活化缓冲液采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液；所述偶联缓冲液采用MES缓冲液；所述活化剂采用EDAC/NHS；在所述步骤③中，所述封闭缓冲液采用BSA、甘氨酸中的一种或多种，封闭时间1h。
10.一种如权利要求1-7任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定ANA的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)吸取25μL样本，加入225μL试剂R1，37℃孵育5min；
(2)再加入75μL试剂R2，混匀；
(3)37℃孵育30s后读取吸光值A1；再孵育4.5min，读取吸光值A2；最后，计算ΔA，△A＝A2-A1，根据ΔA测算样本中ANA含量。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111596072A (zh) * 2020-06-11 2020-08-28 安徽大千生物工程有限公司 一种基于胶乳增强免疫比浊法测定pth的试剂盒及其制备使用方法
CN112051401A (zh) * 2020-08-28 2020-12-08 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种胃蛋白酶原的测定试剂盒
CN112763724A (zh) * 2020-12-26 2021-05-07 北京安图生物工程有限公司 同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒
CN114137223A (zh) * 2021-11-25 2022-03-04 安徽大千生物工程有限公司 一种快速测定igf-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒及其制备使用方法
WO2022100077A1 (zh) * 2020-11-12 2022-05-19 山东博科生物产业有限公司 一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4351824A (en) * 1981-02-05 1982-09-28 Icl Scientific Polystyrene latex reagents, methods of preparation, and use in immunological procedures
US4636479A (en) * 1983-04-20 1987-01-13 Cooper-Lipotech, Inc. Enhanced agglutination method and kit
CN1306212A (zh) * 2001-02-28 2001-08-01 崔京涛 检测脱氧核糖核蛋白抗体的免疫乳胶试剂及其制备与应用
US20030008410A1 (en) * 1995-03-13 2003-01-09 Hechinger Mark K. Immunoassay apparatus, kit and methods
CN104237525A (zh) * 2013-06-24 2014-12-24 北京美康生物技术研究中心有限责任公司 一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用
CN104833809A (zh) * 2015-05-05 2015-08-12 南京闻智生物科技有限公司 一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和检测方法
CN105021811A (zh) * 2015-07-27 2015-11-04 厦门拜尔杰生物科技有限公司 一种抗核抗体联合检测试剂盒及其检测方法
CN107727869A (zh) * 2017-10-12 2018-02-23 上海川至生物技术有限公司 一种测定血清中抗核抗体的试剂盒及其制备方法
CN108398551A (zh) * 2018-03-07 2018-08-14 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法
CN109324192A (zh) * 2018-11-14 2019-02-12 青岛大学 快速定量检测抗核抗体含量的检测方法
CN109613259A (zh) * 2018-12-20 2019-04-12 北京贝尔生物工程股份有限公司 一种高灵敏度、宽检测范围的人肝素结合蛋白测定试剂盒

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4351824A (en) * 1981-02-05 1982-09-28 Icl Scientific Polystyrene latex reagents, methods of preparation, and use in immunological procedures
US4636479A (en) * 1983-04-20 1987-01-13 Cooper-Lipotech, Inc. Enhanced agglutination method and kit
US20030008410A1 (en) * 1995-03-13 2003-01-09 Hechinger Mark K. Immunoassay apparatus, kit and methods
CN1306212A (zh) * 2001-02-28 2001-08-01 崔京涛 检测脱氧核糖核蛋白抗体的免疫乳胶试剂及其制备与应用
CN104237525A (zh) * 2013-06-24 2014-12-24 北京美康生物技术研究中心有限责任公司 一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用
CN104833809A (zh) * 2015-05-05 2015-08-12 南京闻智生物科技有限公司 一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和检测方法
CN105021811A (zh) * 2015-07-27 2015-11-04 厦门拜尔杰生物科技有限公司 一种抗核抗体联合检测试剂盒及其检测方法
CN107727869A (zh) * 2017-10-12 2018-02-23 上海川至生物技术有限公司 一种测定血清中抗核抗体的试剂盒及其制备方法
CN108398551A (zh) * 2018-03-07 2018-08-14 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法
CN109324192A (zh) * 2018-11-14 2019-02-12 青岛大学 快速定量检测抗核抗体含量的检测方法
CN109613259A (zh) * 2018-12-20 2019-04-12 北京贝尔生物工程股份有限公司 一种高灵敏度、宽检测范围的人肝素结合蛋白测定试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郭巍等: "检测抗核抗体早期诊断类风湿", 《中国实验诊断学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111596072A (zh) * 2020-06-11 2020-08-28 安徽大千生物工程有限公司 一种基于胶乳增强免疫比浊法测定pth的试剂盒及其制备使用方法
CN112051401A (zh) * 2020-08-28 2020-12-08 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种胃蛋白酶原的测定试剂盒
WO2022100077A1 (zh) * 2020-11-12 2022-05-19 山东博科生物产业有限公司 一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒
CN112763724A (zh) * 2020-12-26 2021-05-07 北京安图生物工程有限公司 同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒
CN114137223A (zh) * 2021-11-25 2022-03-04 安徽大千生物工程有限公司 一种快速测定igf-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒及其制备使用方法

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