CN104833809A - 一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和检测方法，属于疾病的诊断和检测技术领域。本发明一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括稀释液、胶乳制剂、空白液、校准品和质控品；其中所述的胶乳制剂中含有分别偶联了抵抗素单克隆抗体以及抵抗素多克隆抗体的不同粒径大小的羧基化的聚苯乙烯胶乳。使用本发明的方法分别对抵抗素单克隆抗体和抵抗素的多克隆抗体进行标记后，得到的大粒径胶乳可以提高检测灵敏度，小粒径胶乳可以拓宽线性范围，因此，本发明的复合胶乳制剂既可以提高检测灵敏度，又可拓宽检测线性范围，对抵抗素的检测来说具有检测快速、敏感度高、特异性强和准确性好等优点。

Description

一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明公开了一种胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和检测方法，特别涉及一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和检测方法，本发明属于疾病的诊断或检测技术领域。

背景技术

抵抗素(resistin)是2001年Steppan等在小鼠脂肪细胞中发现的一种新的细胞因子，因它有降低胰岛素敏感性的作用，故将其命名为抵抗素。它属于抵抗素样分子家族(resistin-like molecules，RELMs)分泌型蛋白质家族成员。

人类抵抗素是一种12.5kDa的蛋白质，其前体含有108个氨基酸，分泌到血液的抵抗素有两种状态，即六聚体和三聚体。它参与了炎症反应，与一些细胞因子、炎症介质、粘附分子相互作用，能促进IL-6、IL-12等炎性细胞因子的合成和释放。抵抗素具有类似炎症因子的蛋白分子结构,与单核巨噬细胞的功能有关，能影响多形核白细胞的趋化运动和氧化爆发，导致患者免疫功能紊乱，在免疫炎症反应中发挥重要作用。抵抗素作为一种前炎性分子，在机体出现炎症的情况下呈高水平表达状态。

正常条件下人血清抵抗素的含量极低，约为14pg/ml(运用高效液相色谱分析)，在机体出现炎症的情况下，机体血液中抵抗素的含量急剧升高至60-350ng/ml。该指标主要用于溃疡性结肠炎、消化性溃疡急性穿孔及机体内脂肪的沉积的实时监测。

许多临床研究证明，抵抗素在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值，与目前所应用的诊断指标相比，抵抗素在鉴别诊断以急症腹痛为主诉的疾病及严重炎症方面提供了额外的信息。随着临床实践性研究的不断深入，临床数据的不断积累，抵抗素将作为一个全身性炎症及以急症腹痛为主诉的疾病辅助和鉴别诊断的常规指标将成为共识，并将得到广泛的应用。

目前，在国内市场上还不存在能够对抵抗素进行定量测定的检测方法和相应的试剂盒。本发明通过胶乳增强免疫比浊法对患者血清中抵抗素水平的定量检测，实现对以急症腹痛为主诉的常见疾病溃疡性结肠炎、消化性溃疡急性穿孔等的早期排查，同时也可实现机体内脂肪的沉积的实时监测，为临床医生做出及时合理的诊断提供辅助工具。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，本发明所建立的用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒采用免疫比浊法，以乳胶增强免疫比浊法为测定原理可实现对抵抗素的快速且准确的检测。

本发明的第二个目的是提供了上述测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法。

本发明的第三个目的是提供了测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒的检测方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，所述的试剂盒包括稀释液、胶乳制剂、空白液、校准品和质控品；其中所述的胶乳制剂中含有分别偶联了抵抗素单克隆抗体以及抵抗素多克隆抗体的不同粒径大小的羧基化的聚苯乙烯胶乳。

其中，上述偶联了抵抗素单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的粒径为50-80nm，偶联了抵抗素多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的粒径为150-200nm。

其中，上述稀释液为含有2M NaCl，2％(w/w)PEG20000，0.5％(w/w)BSA，0.1％(w/w)proclin-300的0.05M pH＝8.4的Tris-HCl缓冲液。

其中，上述空白液为0.05M PBS磷酸缓冲液。

其中，上述校准品包括抵抗素浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L的校准品。

其中，上述的质控品中抵抗素的浓度为0.21-0.29μg/L。

上述的用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括以下步骤：1)稀释液配制；2)胶乳制剂的配制；3)标准品稀释液的配制；4)标准品的配制；5)校准品及质控品配制；6)胶乳颗粒稀释；7)将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装组装成试剂盒。

其中，上述胶乳制剂的配制方法如下：1)羧基化的聚苯乙烯胶乳活化；2)偶联了抵抗素单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备；3)偶联了抵抗素多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备；4)将两种胶乳溶液进行混合。

用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1)试剂配置：试剂开瓶即用，缓冲液及乳液试剂在测定前要充分混匀；

2)先加入稀释液试剂，再加入全血样本，37℃反应5min后加入胶乳试剂读取OD570的检测数据；

3)结果计算：以人抵抗素重组蛋白浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L的校准品做标准曲线，样品中的抗原浓度通过标准曲线读出。

有益效果：本发明的方法分别对抵抗素单克隆抗体和抵抗素的多克隆抗体进行标记后，得到的大粒径胶乳和小粒径胶乳，提高了抵抗素的检测的精确性、准确性、检测速率、敏感度及敏感度。

附图说明

图1为使用本发明的校准品制备得到的标准曲线。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

本发明实施例所涉及主要材料及试剂的购买来源：

抵抗素抗原购自杭州启泰生物；抵抗素抗体货号A90847Hu01，购买自上海武昊经贸有限公司

EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、proclin-300购自SIMGA；聚苯乙烯胶乳购自美国Bangs；其他的无机盐试剂及PEG20000，羧甲基纤维素钠等均购自国药试剂。

实施例1 一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备

1、试剂配置

1.1、稀释液R1配制

配方：0.05M Tris-HCl缓冲液，含有2M NaCl，2％(w/w)PEG20000，5％(w/w)BSA，0.1％(w/w)proclin-300，pH＝8.4。

1.2、胶乳试剂R2的配制

(1)羧基化的聚苯乙烯胶乳活化

10mg/ml的羧基化的聚苯乙烯胶乳1ml中加入50mM，PH6.1MES溶解的1mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和10mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混匀活化60min，离心19750rpm弃去上清，并用50mM PBS重悬；按照上述方法分别制备得到了粒径为50-80nm和150-200nm活化后的羧基化的聚苯乙烯胶乳，本实验中所用的胶乳的粒径分别为60nm和150nm；

(2)偶联了抵抗素单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备

将1mg抵抗素单克隆抗体加入2ml浓度为10mg/ml的粒径为60nm胶乳溶液中，室温混匀4h，4℃19750rpm离心15min，收集上清液备用，加入含有5mg BSA的50mM PBS，室温混匀2h；4℃19750rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸，充分混匀30min；4℃19750rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复融胶乳；

(3)偶联了抵抗素多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备

将1mg抵抗素多克隆抗体加入2ml浓度为10mg/ml的粒径为150nm的胶乳溶液中，室温混匀4h，4℃19750rpm离心15min，收集上清液备用，加入含有2.5mgBSA的50mMPBS，室温混匀2小时；4℃19750rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸，充分混匀30min；4℃8000rpm离15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复融胶乳；

所述的缓冲液为含有1％(w/w)BSA，0.05％(v/v)吐温，0.1％(w/w)海藻糖、0.1g/L羧甲基纤维素钠，0.1％(w/w)NaN₃的0.05M Tris-HCL缓冲液，pH＝7.4。

(4)将两种粒径的胶乳试剂进行体积比1：1混合，充分混匀后备用。

1.3、标准品稀释液的配制

0.05M PBS缓冲液

1.4、标准品的配制

以进口的罗氏公司抵抗素标准品为基准，使用混合后的胶乳试剂连续测试20次后取平均值，然后使用标准品稀释液稀释抵抗素(购自杭州启泰生物)与罗氏公司标准品一致。

1.5、校准品及质控品配制

取大小合适的容器7个，使用标准稀释液稀释含有人降钙素原重组蛋白的标准品配制浓度点依次为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L的校准品各点，以及人抵抗素重组蛋白浓度为0.21-0.29μg/L的质控品，各浓度点要使依次加入的原料浓溶液混匀。

质控品的目的：在校准完成以后，首先测试质控品，其浓度应在标示的范围之内，如超出则认为试剂盒定标不成功或者试剂盒失效。

2、确定稀释倍数

取抗体标记剩余上清液体分别用OD260和OD280测量其吸光度值，利用测量结果并根据一下公式计算剩余上清液中抗体的浓度和标记效率；最后根据标记抗体量确定稀释倍数。

抗体浓度＝1.45*A280-0.74*A260

标记抗体量＝标记总蛋白量-上清中蛋白量

标记效率＝(标记总蛋白量-上清中蛋白量)/标记总蛋白量*100％

通过测量计算出单克隆抗体标记量为0.886mg，故标记效率为88.6％；

通过测量计算出多克隆抗体标记量为0.459mg，故标记效率为91.8％。

3、胶乳颗粒稀释

按照抗体过量原则，根据已定所需标记抗体浓度用缓冲液对标记的抗体进行稀释。对浓缩胶乳颗粒进行1：8、1：9、1：10三个比例进行稀释，分别测量配置完成的校准品，以线性最好且线性范围最大的稀释比例为最佳，通过检测选择的为1：10的比例进行稀释。

4、分装

将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装，贴上标签后，置于2～8℃保存。经检验合格后，将配制好的校准品和质控品分装到1ml塑料瓶中，1.0ml/瓶。本发明试剂盒的主要组成成份如表1所示：

表1本发明试剂盒的主要组成成份

组成	装量	主要成分
			稀释液R1	25mL/瓶	TRIS缓冲液
胶乳试剂R2	5mL/瓶	抗人抵抗素的乳胶溶液
			空白液	1mL/瓶	0.05M PBS缓冲液
校准品	1mL/瓶*6	抵抗素抗原原料
			质控品	1mL/瓶	抵抗素抗原原料
说明书	1份

储存条件及有效期：试剂盒应在2-8℃下干燥保存，贮存时避免重压并应防潮、避光、避热；有效期：12个月。

5、对本发明试剂盒的检测灵敏度和线性范围的测定

分别使用本发明的复合胶乳试剂和单一粒径的胶乳试剂对10个样本中的高中低浓度的抵抗素标准品进行了测定，选用的抵抗素浓度分别为300ng/ml，140ng/ml，75ng/ml，每个浓度检测10次，将所得结果进行比较，确定本试剂盒的准确度和精密度，得到的检测结果如下表2：

从表2数据可以看出，本发明的复合胶乳制剂既可以提高检测灵敏度，又可拓宽检测线性范围，可实现对抵抗素快速准确的检测。

实施例2 实施例一试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，保存6个月后，测定试剂盒的各项指标，发现均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存6个月以上。

实施例3 本发明实施例1试剂盒的检测方法

采用免疫比浊法，以乳胶增强免疫比浊法为测定原理。样品中的抵抗素与标记了抵抗素抗体的乳胶颗粒发生特异性的抗原抗体反应，形成免疫复合物，从而引起吸光度的变化，此吸光度的变化与样品中的抵抗素浓度呈正比。用已知浓度的抵抗素标准品制作工作曲线，从该曲线上即可计算出样品中的抵抗素含量，本发明的校准品制备得到的标准曲线如图1所示，在校准完成以后，首先测试质控品，其浓度在标示的范围(0.20-0.30μg/L)之内，试剂盒有效。

1、适用仪器：东芝(TBA-40FR)、迪瑞(CS-T300)、劳拉(FAITH-1000)、奥林巴斯(AU-1000)、迈瑞(BS-200)、上海合意CB178血液分析仪等生化分析仪。

2、样本要求：病人标本无需特殊处理，采用常规医用技术收集全血标本即可进行检测。待测血清如在24小时之内使用，可于2～8℃保存，若需长期存放应保存在-20℃以下，并避免反复冻融。

3、检验方法：

4.1试剂配置：试剂开瓶即用，缓冲液及乳液试剂在测定前要充分混匀；

4.2试验条件：

血液标本：3μl

稀释液R1：200μl；胶乳试剂R2：50ul；主波长：570nm；反应温度：37℃。

方法：先加入R1试剂200ul，再加入全血样本3μl，37℃反应5min后加入R2试剂50ul读取OD570的检测数据。

4.3结果计算：以人抵抗素重组蛋白浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L的校准品做标准曲线，样品中的抗原浓度通过标准曲线读出。

5、对消化性急性溃疡穿孔的病情进行诊断

诊断结果如下表3.

表3不同临床活动程度及治疗前后消化性溃疡急性穿孔患者血清resistin含量

根据临床试验结果，结合文献研究，本发明试剂盒采用以下的诊断指标，本评价以1-10X作为评价消化性溃疡急性穿孔程度：

抵抗素浓度<10.00μg/L，为非重症患者，不建议使用抗生素，严重程度为1X；

10.00μg/L<抵抗素浓度<20.00μg/L，很可能为轻度消化性溃疡急性穿孔，严重程度为2-4X；

20.0μg/L<抵抗素浓度<25.0μg/L，很可能为中度消化性溃疡急性穿孔，严重程度为5-6X；

25.00μg/L<抵抗素浓度<30.00μg/L几乎可以确认为重度消化性溃疡急性穿孔，严重程度为8-10X。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括稀释液、胶乳制剂、空白液、校准品和质控品；其中所述的胶乳制剂中含有分别偶联了抵抗素单克隆抗体以及抵抗素多克隆抗体的不同粒径大小的羧基化的聚苯乙烯胶乳。

2.根据权利要求1 所述的用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述偶联了抵抗素单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的粒径为50-80nm，偶联了抵抗素多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的粒径为150-200nm。

3.根据权利要求1 所述的用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述稀释液为含有2M NaCl，2％（w/w）PEG20000，0.5%（w/w）BSA，0.1%（w/w）proclin-300 的0.05M pH=8.4的 Tris-HCl 缓冲液。

4.根据权利要求1 所述的用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述空白液为0.05M PBS 磷酸缓冲液。

5.根据权利要求1 所述的用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述校准品包括抵抗素浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L 的校准品。

6.根据权利要求1 所述的用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的质控品中抵抗素的浓度为0.21-0.29μg/L 。

7.权利要求1~6任一项所述的用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：1）稀释液配制；2) 胶乳制剂的配制；3）标准品稀释液的配制；4）标准品的配制；5）校准品及质控品配制；6）胶乳颗粒稀释；7）将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装组装成试剂盒。

8.根据权利要求7所述的用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述胶乳制剂的配制方法如下：1）羧基化的聚苯乙烯胶乳活化；2）偶联了抵抗素单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备；3）偶联了抵抗素多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备；4）将两种胶乳溶液进行混合。

9.权利要求1~6任一项用于测定抵抗素的胶乳增强免疫比浊试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）试剂配置：试剂开瓶即用，缓冲液及乳液试剂在测定前要充分混匀；

2）先加入稀释液试剂，再加入全血样本，37℃反应5min后加入胶乳试剂读取OD570的检测数据；

3）结果计算：以人抵抗素重组蛋白浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L的校准品做标准曲线，样品中的抗原浓度通过标准曲线读出。