CN105044352A - 一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂盒，包括固定在同一容器内的冻干R1试剂和R2试剂，冻干R1试剂和R2试剂是由液态R1试剂和R2试剂加入赋形剂和防护剂冻干而成；其中液态R1试剂为含PEG的缓冲液，液态R2试剂为抗人转铁蛋白多克隆或配对单抗偶联的胶乳、或者抗人转铁蛋白多克隆抗体或配对单抗偶联的胶体金。本发明检测时操作方便，节约时间，同时便于运输和保存，解决了寒冷地区的运输问题和增加了试剂的稳定性。
Description
技术领域
本发明免疫比浊领域，具体涉及一种蛋白检测试剂盒及其制备的工艺。
背景技术
转铁蛋白(Transferrin,Tf)是肝脏合成的结合金属的糖蛋白,电泳分类为β1-球蛋白,主要生理功能是运输铁,属急时相反映蛋白。Tf在正常情况下不能通过肾小球滤过膜，早期肾损伤时肾小球基底膜内外疏松层硫酸肝素糖蛋白含量减低,使负电荷位点明显减少,使带负电荷(PI＝5.7)的循环中分子蛋白Tf自肾小球滤过膜滤过,出现在尿液中。尿液Tf检测的临床意义:是早期肾小球损伤的指标之一,主要反映肾小球滤过膜电荷选择屏障受损。
尿转铁蛋白作为判断肾功能损伤的重要指标已受到广泛重视，测定方法包括放射免疫法、ELASA法等。应用较多的是免疫比浊法，基本上能满足临床需要。这是一种灵敏、简便、快速的测定方法，易于在常规实验室中广泛应用。
目前国内外市场上的用于比浊法检测的试剂盒绝大多数是液态的双试剂；由于冻融会影响试剂中的R2的性能，使产品失活，也未见有冻干的试剂，因此在冬天北方地区的试剂运输或保存产生较大问题；同时临床上越来越多的医院专业科室或基层医院均希望生产厂家提供POCT试剂和仪器，这样能尽早获得检测数据，及时对患者进行诊治；其中即用型POCT试剂特别受到广大医生的青睐，然而即用型免疫比浊试剂由于其空间占地较大，实验室无法提供足够的冷藏空间保存试剂，因此临床上迫切希望能解决免疫比浊试剂的运输和保存问题。
同时由于试剂间的相互干扰，临床上一直使用双试剂，没有解决单试剂的问题；单试剂将使操作步骤更简单，减少时间。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂及其制备方法。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明的一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂，包括固定在同一容器内的冻干R1试剂和R2试剂，冻干R1试剂和R2试剂是由液态R1试剂和R2试剂加入赋形剂和防护剂冻干而成；其中液态R1试剂为含PEG的缓冲液，液态R2试剂为抗人转铁蛋白多克隆或配对单抗偶联的胶乳、或者抗人转铁蛋白多克隆抗体或配对单抗偶联的胶体金。
进一步地，所述赋形剂和防护剂均为是海藻糖、蔗糖、果糖、甘露醇、PEG、PVP、丙三醇、乙二醇、氨基酸中的有机化合物中的任意一种或任意组合。
进一步地，所述容器为可直接用于检测的比色杯。
进一步地，所述赋形剂和防护剂的加入量为质量百分比浓度为0.1％～20％。
进一步地，所述液态R1试剂和R2试剂比例为任意比例。
进一步地，所述液态R1试剂和R2试剂加入指示剂。
上述的尿转铁蛋白免疫比浊试剂盒的制备方法，其制备步骤为：
1)在液态R1和R2试剂中分别加入赋形剂和防护剂；
2)将上述液态R1和R2试剂混合均匀后放入-80℃冰箱冷冻过夜，再打开冷冻真空干燥机冷冻20小时冻干，装于容器中即可。
上述的尿转铁蛋白免疫比浊试剂的另一种制备方法，其制备步骤为：
1)在液态R1和R2试剂中分别加入赋形剂和防护剂；
2)将将上述液态R1和R2试剂分别冷冻成形并取出冷冻，打开冷冻真空干燥机，冷冻20小时；
3)最后分装固定于容器中。
有益效果：本发明相对于现有技术而言，具备以下优点：
1)本发明解决了免疫比浊试剂的运输问题，使试剂冻干成形，虽然冻干对蛋白和抗体保存而言是本领域的常规技术，但是冻干后能够保护蛋白和抗体的活性不受影响，这是现有技术中并没有给出相应的技术方案，由于本发明中的蛋白或抗体是偶联到纳米胶乳微球或胶体金上，纳米胶乳微球或胶体金不能冷冻是这是本领域技术人员所公认的，因为其冷冻后会发生破乳而影响产品性能，而本发明彻底解决了纳米胶乳微球或胶体金冷冻后会发生破乳而影响产品性能的技术问题。
2)本发明使得R1和R2试剂在室温下保存，共处一个容器而不发生相互干扰，在临床检验中减少了操作步骤和操作时间，同时试剂由于经过冷冻干燥，有利于产品保存，液态试剂需要在冰箱2-8度保存，保存期通常为1年，经过验证本发明的试剂在室温下保存6个月以上未发生变化，同时在低温条件(低于0度)下储存或运输一个月不会影响产品性能。
附图说明
图1是实施例1所示的胶乳冻干散点图(单位mg/L)。
图2是实施例2所示的胶乳冻干散点图(单位mg/L)。
图3是实施例3所示的胶乳冻干散点图(单位mg/L)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1：
一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂盒的制备方法，其制备步骤为：
1)在液态R1和R2试剂中分别加入20％蔗糖，0.1％甘氨酸；其中，R1试剂为PEG的缓冲液，R2试剂为抗人转铁蛋白多克隆抗体的胶乳；
2)将上述液态R1和R2试剂混合均匀后放入冷冻过夜，再打开冷冻真空干燥机冷冻20小时冻干，封膜后置-20℃保存1个月装于容器中。
然后将上述尿转铁蛋白免疫比浊试剂盒检测，其检测步骤如下：
1、打开仪器预热15分钟，测量样本前，将试剂定标卡放置于特定蛋白分析仪的指定区域内，按照仪器的定标操作说明操作后，再进行样本检测(此时可将卡移除)。
2、将试剂从贮存的地方取出；
3、打开封口膜，取500ul去离子水，置于检测杯中，轻柔摇晃使试剂分散均匀，然后加入5ul样本，再次轻柔摇晃混匀。混匀的时间在5秒以内，放入定标后的特定蛋白检测仪内；
4、仪器自动检测出尿转铁蛋白检测结果。
其检测结果如下：
(一)重复性
在重复性条件下，用BECKMAN的测试试剂盒，重复测试至少10次(n≥10)，分别计算测量值的平均值和标准差(s)。按公式(1)计算变异系数(CV)，所得结果的精密度(变异系数，CV)≤10.0％。
| 精密度 | 靶值1 |
| 1 | 10.3 |
| 2 | 11.1 |
| 3 | 10.5 |
| 4 | 10.6 |
| 5 | 10.2 |
| 6 | 10.5 |
| 7 | 9.89 |
| 8 | 9.99 |
| 9 | 10.01 |
| 10 | 10.2 |
| Mean | 10.329 |
| SD | 0.34 |
| CV | 3.3％ |
(二)线性范围
用接近于线性范围上限的高浓度样品和接近或等于线性范围下限的低浓度样品(5％生理盐水)，将高值(H)样本、低值(L)样本按1L、0.75L+0.25H、0.50L+0.50H、0.25L+0.75H、1H关系各自配置混合，形成5个浓度水平的等间距样本。分别测试试剂盒，每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。使用统计学分析软件(如Excel、SPSS)进行线性回归分析,以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量，求出线性回归方程和相关系数(R)。将稀释浓度(xi)代入线性回归方程，计算yi的估计值及yi与估计值的绝对偏差和相对偏差。
| 相对浓度 | 1 | 2 | 3 | mean | 绝对偏差 | 相对偏差 |
| 0.3 | 0.31 | 0.32 | 0.38 | 0.33 | -0.003 | -0.99％ |
| 4.73 | 4.76 | 4.68 | 4.81 | 4.75 | -0.007 | -0.15％ |
| 9.15 | 9.24 | 9.16 | 9.15 | 9.183 | 0.018 | 0.21％ |
| 13.575 | 14.05 | 13.98 | 13.05 | 13.6 | 0.116 | 0.86％ |
| 18 | 17.64 | 17.92 | 18.12 | 17.89 | -0.09 | -0.53％ |
如图1所示，检测结果表明，冻干后的试剂在-20℃下存储一个月，其产品性能并没有下降。
实施例2：
一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂盒的制备方法，其制备步骤为：
1)在液态R1试剂中加入10％海藻糖，在液态R2中加入2％甘露醇、0.1％乙二醇、0.1％甘氨酸混合液，其中液态R1试剂为PEG的缓冲液，R2试剂为抗人转铁蛋白胶配对单抗偶联的乳；
2)将上述液态R1和R2试剂分别冷冻成形并取出冷冻，打开冷冻真空干燥机，冷冻10小时封，膜后置于室温放置6个月；
3)最后分装固定于容器中。
然后将上述尿转铁蛋白免疫比浊试剂盒检测，其检测步骤如下：
1、打开仪器预热15分钟，测量样本前，将试剂定标卡放置于特定蛋白分析仪的指定区域内，按照仪器的定标操作说明操作后，再进行样本检测(此时可将卡移除)。
2、将试剂(其中R2试剂是多抗偶联的胶乳，R1加1％海藻糖，R2加2％甘露醇和甘氨酸，两者分别冻成小球，冷冻干燥10小时，封膜后置于室温放置6个月)，从贮存的地方取出；
3、打开封口膜，取500ul去离子水，置于检测杯中，轻柔摇晃使试剂分散均匀，然后加入2ul样本，再次轻柔摇晃混匀，混匀的时间在5秒以内，放入定标后的特定蛋白检测仪内；
4、仪器自动检测出尿转铁蛋白检测结果。
其检测结果如下：
(一)
线性范围:单位mg/L
| 相对浓度 | 1 | 2 | 3 | 平均值 | 绝对偏差 | 相对偏差 |
| 0.11 | 0.1 | 0.12 | 0.12 | 0.11 | 0.05 | |
| 1.02 | 0.99 | 1.05 | 1.01 | 1.02 | (0.03) | 3.3％ |
| 2.05 | 2.01 | 1.99 | 2.06 | 2.02 | 0.03 | 1.6％ |
| 3.99 | 3.95 | 4.06 | 4.1 | 4.04 | 0.10 | 2.4％ |
| 5.93 | 5.9 | 6.01 | 5.99 | 5.97 | 0.05 | 0.8％ |
| 7.87 | 7.85 | 7.95 | 7.99 | 7.93 | (0.09) | 1.1％ |
测量精密度:单位mg/L
| 序号 | 靶值1(0.97) | 靶值2(3.99) |
| 1 | 1.00 | 4.02 |
| 2 | 0.99 | 4.27 |
| 3 | 1.08 | 4.04 |
| 4 | 1.03 | 4.34 |
| 5 | 1.09 | 3.97 |
| 6 | 1.08 | 4.27 |
| 7 | 1.06 | 4.27 |
| 8 | 0.93 | 3.96 |
| 9 | 1.06 | 3.96 |
| 10 | 1.05 | 4.01 |
| 平均值 | 1.03 | 4.10 |
| SD | 0.05 | 0.16 |
| CV | 5.22％ | 4.02％ |
通过图2所示，检测结果表明，冻干后的试剂在室温下存储六个月，其产品性能并没有下降。
实施例3：
一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂盒的制备方法，其制备步骤为：
1)在液态R1试剂和液态R2混合均匀，其中液态R1试剂为PEG的缓冲液，R2试剂为抗人转铁蛋白多克隆抗体胶体金；
2)将上述液态R1和R2试剂分别滴入加总量的质量百分比10％甘油、10％甘氨酸以及0.1％PVP后中成形并取出冷冻，打开冷冻真空干燥机，冷冻10小时封，膜后置于37度冰箱中放置15天；
3)最后分装固定于容器中。
然后将上述尿转铁蛋白免疫比浊试剂盒检测，其检测步骤如下：
1.打开仪器预热15分钟，测量样本前，将试剂定标卡放置于特定蛋白分析仪的指定区域内，按照仪器的定标操作说明操作后，再进行样本检测(此时可将卡移除)。
2.将试剂从贮存的地方取出；
3.打开封口膜，取600ul去离子水，置于检测杯中，轻柔摇晃使试剂分散均匀，然后加入2ul样本，再次轻柔摇晃混匀。混匀的时间在5秒以内，放入定标后的特定蛋白检测仪内；
4.仪器自动检测出尿转铁蛋白检测结果。
其检测结果如下：
一)重复性
在重复性条件下，用BECKMAN的测试试剂盒，重复测试至少10次(n≥10)，分别计算测量值的平均值和标准差(s)。按公式(1)计算变异系数(CV)，所得结果的精密度(变异系数，CV)≤10.0％。
| 精密度 | 靶值1 |
| 1 | 10.3 |
| 2 | 10.2 |
| 3 | 10.4 |
| 4 | 9.89 |
| 5 | 9.99 |
| 6 | 10.15 |
| 7 | 10.26 |
| 8 | 10.45 |
| 9 | 10.21 |
| 10 | 10.14 |
| Mean | 0.16 |
| SD | 10.19 |
| CV | 1.5％ |
(二)线性范围
用接近于线性范围上限的高浓度样品和接近或等于线性范围下限的低浓度样品(5％生理盐水)，将高值(H)样本、低值(L)样本按1L、0.75L+0.25H、0.50L+0.50H、0.25L+0.75H、1H关系各自配置混合，形成5个浓度水平的等间距样本。分别测试试剂盒，每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。使用统计学分析软件(如Excel、SPSS)进行线性回归分析,以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量，求出线性回归方程和相关系数(R)。将稀释浓度(xi)代入线性回归方程，计算yi的估计值及yi与估计值的绝对偏差和相对偏差。
| 相对浓度 | 1 | 2 | 3 | mean | 绝对偏差 | 相对偏差 |
| 0.3 | 0.31 | 0.34 | 0.34 | 0.33 | 0.001 | -0.02％ |
| 4.73 | 4.65 | 4.68 | 4.78 | 4.70 | -0.031 | -0.66％ |
| 9.15 | 9.26 | 9.18 | 9.05 | 9.16 | 0.034 | 0.38％ |
| 13.575 | 13.68 | 14.02 | 13.15 | 13.61 | 0.088 | 0.65％ |
| 18 | 17.64 | 17.89 | 18.02 | 17.85 | -0.077 | -0.43％ |
如图3所示，检测结果表明，冻干后的试剂在37℃下存储15天，其产品性能并没有下降。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂，其特征在于：包括固定在同一容器内的冻干R1试剂和R2试剂，冻干R1试剂和R2试剂是由液态R1试剂和R2试剂加入赋形剂和防护剂冻干而成；其中液态R1试剂为含PEG的缓冲液，液态R2试剂为抗人转铁蛋白多克隆或配对单抗偶联的胶乳、或者抗人转铁蛋白多克隆抗体或配对单抗偶联的胶体金。
2.根据权利要求1所述的尿转铁蛋白免疫比浊试剂，其特征在于：所述赋形剂和防护剂均为是海藻糖、蔗糖、果糖、甘露醇、PEG、PVP、丙三醇、乙二醇、氨基酸中的有机化合物中的任意一种或任意组合。
3.根据权利要求1所述的尿转铁蛋白免疫比浊试剂，其特征在于：所述容器为可直接用于检测的比色杯。
4.根据权利要求1所述的尿转铁蛋白免疫比浊试剂，其特征在于：所述赋形剂和防护剂的加入量为质量百分比浓度为0.1％～20％。
5.根据权利要求1所述的尿转铁蛋白免疫比浊试剂，其特征在于：所述液态R1试剂和R2试剂比例为任意比例。
6.根据权利要求1或6所述的尿转铁蛋白免疫比浊试剂，其特征在于：所述液态R1试剂和R2试剂加入指示剂。
7.一种根据权利要求1～7任一项所述的尿转铁蛋白免疫比浊试剂的制备方法，其特征在于：其制备步骤为：
1)在液态R1和R2试剂中分别加入赋形剂和防护剂；
2)将上述液态R1和R2试剂混合均匀后冻干，装于容器中即可。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述的尿转铁蛋白免疫比浊试剂的制备方法，其特征在于：其制备步骤为：
1)在液态R1和R2试剂中分别加入赋形剂和防护剂；
2)将上述液态R1和R2试剂分别冷冻成形并取出冷冻；
3)最后分装固定于容器中。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151111 |