CN110716048A - 干性免疫比浊试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本文提供了一种制备干性免疫比浊试剂的方法，其包括1)将偶联有抗体的微球与水溶性成膜剂在溶液中混合；2)让步骤1)得到的混合液形成膜状物并进行干燥处理。通过该方法制备的干性免疫比浊试剂能够在常温稳定保存，复溶速度快，尤其适合于预保存在微流控试剂卡中。

Description

干性免疫比浊试剂及其制备方法和应用

技术领域

本文涉及用于免疫比浊检测的免疫比浊试剂，尤其是干性免疫比浊试剂。本文还涉及该干性免疫比浊试剂的制备方法和应用。

背景技术

免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法，在检测血液中的一些疾病诊断标志物方面有广泛应用。其基本原理是：当抗原与抗体在溶液中反应时，形成的可溶性复合物在促聚剂的作用下，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。免疫比浊法与传统生化反应相比，虽然都检测吸光度的变化，但反应原理完全不同，试剂性能也有很大差异。免疫比浊试剂为增加灵敏度，通常将抗体与乳胶等微球偶联。试剂条件变化会引起抗体致敏的微球非特异性聚集，导致引起结果偏差。

免疫比浊试剂通常是液体状态储存，未见商业化的干性免疫比浊法试剂出现。液体试剂需要2-8℃保存，并需要将不同组分分开(例如，常见的是将包含缓冲液的试剂1和包含抗体的试剂2分开保存)。在实际使用时，例如在做单人份检测时需要用多个试剂保存结构密闭保存液体试剂，还需要单独的反应腔和混合腔。传统的干燥方式如冻干、风干、真空低温干燥等方法主要是以水分的抽离为主要手段。去除水分后的抗体偶联微珠特别容易产生非特异性的凝集，这就破坏了以检测凝集为手段的比浊法的应用基础。在大多数情况下，偶联有抗体的微球用冻干等方式固化后再溶解即发生聚集，无法继续用于检测。

长期以来，研究者一直在探索制备干性免疫比浊试剂的方法。日本专利特開平11-258241中，描述了通过冷冻干燥方式制备用于检测HCV的乳胶试剂的方法，其方法包括添加分散稳定剂及抗氧化剂等方式，增加了冻干后乳胶颗粒的稳定性；但冻干后乳胶颗粒仍需要在0-8℃保存；公开号为CN107255727A的中国专利申请中描述了在赋形剂和保护剂存在下低温冻干以制备鸟转铁蛋白免疫比浊试剂的方法，其制备过程包括将包含抗体的试剂在-80℃冷冻过夜和在冷冻真空干燥机中冻干20小时。公开号为CN107255727A的中国专利申请中描述了在牛血清白蛋白、维生素C和甘氨酸存在下通过冻干来制备乳胶比浊冻干试剂的方法，其制备过程包括反复冻融以及惰性气体氛围中的密封。显然，这些制备方法都比较复杂，例如均需要冻干，且耗时都在10小时以上。对于后一方法，其制备的冻干试剂在检测前需要单独复溶15分钟。这些都导致制备成本高昂、耗时长和检测效率低下。另外，也未见这些专利申请者的干性试剂产品上市销售。

发明内容

一方面，本文提供了制备干性免疫比浊试剂的方法，其包括：

1)将偶联有抗体的微球与水溶性成膜剂在溶液中混合；

2)让步骤1)得到的混合液形成膜状物并进行干燥处理。

在一些实施方案中，所述微球为乳胶微球。

在一些实施方案中，所述水溶性成膜剂选自PVP、PVA、PEG、PEO及其组合。

在一些实施方案中，所述PVP的K值不大于90；所述PVA的醇解度不大于89％，聚合度不大于2300。

在一些实施方案中，所述PVP的K值范围为15至90；所述PVA的醇解度范围为65％至89％，聚合度范围为500至2300。

在一些实施方案中，所述成膜剂为PVA1788、PVA0580、PVPK30或PVPK15。

在一些实施方案中，所述偶联有抗体的微球在所述混合液中的浓度不高于2.5％(wt)。

在一些实施方案中，所述偶联有抗体的微球在所述混合液中的浓度为0.05％至0.5％(wt)，所述成膜剂在所述混合液中的浓度为0.5％至5％(wt)。

在一些实施方案中，步骤2)中干燥处理在模具中进行。

在一些实施方案中，步骤2)中干燥处理包括在37℃加热干燥2至3小时。

在一些实施方案中，步骤2)中干燥处理后形成的膜状物的厚度为5μm至530μm。

在一些实施方案中，步骤2)中干燥处理后形成的膜状物的厚度为50μm至300μm。

在一些实施方案中，步骤2)中所述膜状物通过喷雾干燥成型或超薄膜成型获得。

在一些实施方案中，所述抗体为抗CRP、抗D-Dimer或抗MALB抗体。

另一方面，本文提供了通过上述方法制备的干性免疫比浊试剂。

另一方面，本文提供了免疫检测试剂盒，其包括权利要求所述干性免疫比浊试剂。

另一方面，本文提供了微流控试剂卡，其包括所述干性免疫比浊试剂。

另一方面，本文提供了免疫比浊检测方法，其包括将全血、血清或血浆样品与所述干性免疫比浊试剂接触。

本文提供的干性免疫比浊试剂制备工艺简单，成本低，性能稳定，能够常温长期保存，检测效率高，具有较高的学术意义和商业价值。

附图说明

图1显示了实施例4中制备的CRP免疫比浊试剂成膜并复溶后的检测性能。

图2显示了实施例6中制备的D-Dimer免疫比浊试剂在成膜前后的检测性能对比。

图3采用不同成膜剂制备的免疫比浊试剂的检测性能对比。

图4显示了实施例8中制备的MLAB干性免疫比浊试剂的常温稳定性。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

本文中所用的“微球”指粒径在微米或纳米尺度的球状物。优选地，微球粒径在数纳米至数百纳米之间，例如约为50、100、150、200、250、300或350nm。微球的材质可以为乳胶，例如聚苯乙烯、聚己内酯，聚甲基苯烯酸甲酯，聚乳酸-羟基乙酸共聚物等。在一些情形下，也可以选用胶体金微球。

本文中所用的“偶联有抗体的微球”或“抗体偶联微球”指在表面附着有抗体分子的微球。可以让表面带有活性基团(如羧基或氨基)的微球直接与抗体分子反应而制备抗体偶联微球。或者在一些情形下，可以将抗体分子通过偶联物(小肽或小化合物分子)间接连接到微球表面。

本文中所用的“水溶性成膜剂”指具有成膜性能的亲水性有机聚合物。常用的成膜聚合物例如包括，但不限于，聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、羧甲基壳聚糖等中的一种或者几种的组合。该水溶性成膜剂应该在化学性质方面较为稳定，基本上不与抗体分子或其他可能与其接触的检测样品发生反应。除了易于成膜外，还希望这些水溶性成膜剂能够在水溶液中快速(2分钟以内)溶解。尤其是本发明的干性比浊试剂被用于自动检测设备中时，快速溶解有利于提高仪器检测效率。

涉及PVP时，所用“K值”指与PVP分子量相关的特征值。通常分子量越大，K值越大。K值例如可通过粘度法测定获得，或者可从具体PVP产品的生产厂家获得。

本文中所用的“膜”或“膜状物”指通过水溶性成膜剂形成的薄膜，其厚度通常比长度和宽度小得多。优选地，在干燥后，这些膜的厚度为5至530μm。更优选地，这些膜的厚度为50至300μm，例如80μm、100μm、120μm、150μm、170μm、200μm、230μm、250μm、或280μm。“膜”或“膜状物”的形成有利于快速干燥。在本发明的一些实施方案中，这种快速干燥可防止膜复溶后微球的聚集。另一方面，有利于对膜进行分割和定量。例如，在膜厚度已知的情况下，通过计算面积就可以准确确定所选取的膜的体积。溶液状态的成膜剂可以采用多种合适的方法形成膜状物，例如，采用吹塑法、流延法、静电纺丝法等。为了能够快速干燥，在本发明的一些优选的实施方案中，采用喷雾干燥成型或者超薄膜成型法来生成膜状物。相反，传统的流延法成膜厚，成膜时间长，容易造成局部微凝集，会影响终产品的稳定性。

本文所用的“干燥”指在成膜剂存在下液态的微球悬浮液逐渐丧失水分而形成固态物的过程。通常，在干燥过程中，80％以上的水分被去除。或者，优选地，90％、95％、99％以上或甚至100％的水分被去除。

本文中所用的“干性免疫比浊试剂”指基本上为固体状态的免疫比浊试剂，其含水量低于20％、15％、10％、5％、1％，或基本上无水分。在本发明的一些实施例中，“免疫比浊试剂”指含有与抗体偶联的微球但不含成膜剂的液体试剂，“干性免疫比浊试剂”或类似用语则指加入了成膜剂并经过成膜干燥的免疫比浊试剂，“复溶后的免疫比浊试剂”或类似用语指干性免疫比浊试剂经加水(或含水溶液)溶解后获得的试剂。在本发明的一些实施方案中，复溶所用的水(或含水溶液)的量基本上使得复溶所得液体试剂中微球浓度与成膜前不含成膜剂的免疫比浊试剂中的浓度相同。

下面将结合具体实施例对本发明进行详细说明。这些实施例仅用于解释本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，可按照本领域内的文献所描述的技术、条件或产品说明书进行操作。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可通过购买获得的常规产品。除非另有说明，以百分比表示的浓度为重量百分比(wt％)。

实施例1：干性乳胶试剂的制备

试剂1(含缓冲液的组分)制备：50mM的Tris-HCl缓冲液；防腐剂叠氮钠0.05％；0.1％的吐温-20

试剂2(含抗体偶联微球的组分，下文也称为免疫比浊试剂)制备：

1、乳胶微球活化：取粒径100nm、浓度为10％的羧基乳胶微球(日本JSR，P系列)1mL，用50mM，pH7.4的MES缓冲液稀释至15mg/mL浓度；逐滴加入EDC(终浓度为10mg/mL)溶液，混合均匀，室温搅拌反应1h活化；

2、抗体偶联：向活化后的乳胶微球试剂中加入CRP鼠单克隆抗体(杭州伊佰新)，混合均匀，使混合后的乳胶微球：抗体比例为10mg:1.5mg；37℃孵育3h；用50mM，pH7.4的MES缓冲液洗涤乳胶微球以除去多余抗体；再加入1％的牛血清白蛋白(BSA)封闭过夜；用50mM，pH7.4的MES缓冲液+0.1％吐温-20洗涤乳胶微球后，将乳胶微球悬浮于不同体积的50mM，pH7.4的MES缓冲液+0.1％吐温-20的溶液中，加入0.05％防腐剂叠氮钠，得到含不同乳胶微球浓度(0.05％-5％)的免疫比浊试剂。

免疫比浊试剂的成膜干燥：

干燥方式1：取一定量的免疫比浊试剂，加入适量的成膜剂溶液，混合均匀。取适量混合液体，加入1cm×1cm网格模具中，在37℃加热干燥2-3小时，形成干性膜。可通过调整加入模具中的液体体积，调整形成的干性膜的厚度。例如，取200μL混合液体(2％浓度的PVA1788，与乳胶微球浓度为1％的免疫比浊试剂等体积混合)加入1cm×1cm网格模具中，在37℃加热干燥2-3小时，形成干性膜的厚度约为100μm。

干燥方式2：取一定量的免疫比浊试剂，加入适量的成膜剂溶液，混合均匀。取适量混合液体，使用喷雾干燥方式，喷涂到一定面积上，37℃加热干燥2-3小时，形成干性膜。可通过调整单位面积上喷涂的试剂量，调整形成的干性膜的厚度。例如：取混合液体(2％浓度的PVA1788，与乳胶微球浓度为1％的免疫比浊试剂等体积混合)6mL，使用喷雾干燥方式，喷涂到5cm×6cm面积上，进行37℃喷雾干燥成膜。成膜后其1cm×1cm面积厚度约为100μm；试剂量相当于干燥方式1中1cm×1cm面积上200μL混合液的试剂量。

干燥试剂量与成膜厚度及完全溶解时间：

使用2％浓度的PVA1788，与乳胶微球浓度为1％的免疫比浊试剂等体积混合。接着按照干燥方式1，加入不同混合液体量进行干燥，制备干性膜，测量膜厚度，并用等体积(指与成膜前免疫比浊试剂的体积相同，以使得复溶后乳胶微球浓度恢复到1％浓度)的纯化水溶解，观测完全溶解时间。

表1混合液体量与膜厚度及完全溶解时间的关系

混合液体量

20μL

100μL

200μL

400μL

600μL

800μL

1mL

厚度

5μm

50μm

102μm

220μm

318μm

410μm

530μm

完全溶解时间

20s

45s

65s

75s

90s

160s

250s

结果可发现：调整加入的液体体积，可调整形成的干性膜的厚度，从5μm至530μm均可实现。厚度5μm时，完全溶解所需时间虽短，但由于厚度太薄，机械强度稍差；随着膜厚度增加，完全溶解所需时间也会增加，但机械强度会增加。综合考虑机械强度及完全溶解时间，膜厚度可选择50μm至300μm。

本实施例的干性免疫比浊试剂的制备工艺简单，工序时间短，干燥过程还可通过泵入洁净干燥空气来加速干燥。免疫比浊试剂干燥后形成稳定的膜结构，可以与模具分离，具有一定的机械强度，能够进行切割和转移；加等体积的水复溶后，观察到液体澄清透明，无聚集现象，并且能观测到胶体特有的丁达尔效应。

实施例2.乳胶微球浓度选择

按照实施例1中的描述，制备一系列含不同浓度乳胶微球的免疫比浊试剂，向其中加入等体积的5％浓度的成膜剂PVPK15溶液(Gobekie)，制备成不同浓度的乳胶微球混合液体。按实施例1中的干燥方式1，在每个1cm×1cm网格模具中加入200μL混合液体进行干燥成膜。观察成膜干燥情况、机械性能及加水复溶后的聚集情况。结果见表2。

表2免疫比浊试剂中乳胶微球浓度与干燥性能的关系

乳胶溶度浓度	干燥情况<sup>*</sup>	机械性能<sup>**</sup>	复溶后是否聚集<sup>***</sup>
				0.05％	可干燥	好	否
0.1％	可干燥	好	否
				0.5％	可干燥	好	否
1％	可干燥	好	否
				2％	可干燥	好	否
5％	可干燥	好	是

*可干燥：指干燥后，外观为固态，内部坚固且无流动性；不可干燥：指干燥后物料为液态，具有流动性，或非液态但内部为液体、凝胶或膏状；

**机械性能：好：指干燥后物料有一定韧性、可使用工具进行转移，转移过程物料形态不变、无物料损失；不好：指干燥后物料不可干燥、无韧性、干脆、易碎或不容易转移；

***复溶后不聚集：复溶后肉眼观察，液体澄清透明，无异物或沉淀，可观察到丁达尔效应；400倍显微镜观察无明显团聚，乳胶微球大小较均匀。

可见，当免疫比浊试剂中乳胶微球浓度小于5％时，干燥性能满足要求，且加水复溶后，无聚集现象发生。考虑到乳胶试剂检测性能及试剂成本，可选取0.1％-1％的乳胶微球浓度。用不同的成膜剂成膜有可能提高适合的乳胶微球浓度。但总体上，低浓度的乳胶微球浓度能够在固化和复溶过程中保持较好的分散性。

实施例3不同类型成膜剂的成膜效果

可用于成膜的材料有多种，本实施例选取不同类型的成膜剂：聚乙烯比咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚环氧乙烷、羧甲基壳聚糖、纤维素衍生物等进行干燥实验。

配制不同成膜剂的5％浓度的溶液，加入实施例1中制得的0.5％浓度的免疫比浊试剂。混合比例为：成膜剂溶液：免疫比浊试剂＝1:1(成膜剂终浓度为2.5％)；按实施例1中干燥方式1的描述，取200μL混合液体于37℃在模具上进行干燥，观察成膜性。结果见表3。

表3不同成膜剂的成膜性和成膜后性能

*剥离性判断标准：好：膜使用工具容易剥离，不粘模具；一般：膜不容易剥离，可剥离但有部分粘模具；差：膜无法剥离。

可以发现：使用PVP、PVA、聚环氧乙烷、部分纤维素衍生物都可以实现乳胶试剂的干燥，其中PVA和PVP、聚环氧乙烷效果较好。PVP系列中K值≤90效果较好；PVA系列中醇解度≤88％，聚合度≤2300效果较好。可达到溶解速度快，机械性能好，复溶不聚集的效果。

另外，我们发现，成膜前混合液体中成膜剂的浓度也会影响成膜性，例如成膜剂浓度高通常有利于成膜，但成膜剂浓度高不利于快速溶解(数据未示出)。综合考虑，可以选择成膜前混合液体中成膜剂的浓度范围在0.5％至5％。

实施例4成膜后试剂的检测性能

按照实施例1中描述的方法，制备偶联抗CRP抗体的免疫比浊试剂(乳胶微球含量0.1％)10mL，加入等体积的5％浓度的PVA0570成膜剂溶液10mL，混合均匀。按实施例1中干燥方式1，在每个1cm×1cm网格模具中加入200μL混合液体进行干燥成膜。成膜后取下，按照200μL免疫比浊试剂(即两片1cm×1cm面积的膜)/反应杯的量，放入一次性生化反应杯中，用于检测干性试剂膜的性能。

检测流程如下：取试剂1 200μL，加入血清样本4μL，充分混匀后加入到上述一次性反应杯中，充分混匀。用生化分析仪570nm下检测3min时吸光度的变化值，计算ΔA。分别测定10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、300.0mg/L浓度的样本，结果显示在图1中。结果显示，经过干燥，成膜后的干性比浊CRP检测试剂，其检测性能良好，线性R²＝0.9967，300mg/L浓度内无hook效应，可满足检测要求。

实施例5成膜后试剂稳定性

按照实施例1中描述的方法，制备偶联CRP抗体的乳胶比浊试剂(乳胶微球含量0.3％)50mL，加入等体积5％浓度的PVA0380成膜剂溶液50mL，混合均匀。按实施例1中干燥方式1，在每个1cm×1cm网格模具中加入200μL混合液体进行干燥成膜。随后检测制备的干性免疫比浊试剂(膜)的加速稳定性及常温放置稳定性。

每次检测前，取成膜后的干性免疫比浊试剂，加入等体积纯化水(指与成膜前免疫比浊试剂的体积相同，下同)溶解，得到均匀溶液。按普通检验流程操作，取试剂1200μL，加入血清样本4μL，充分混匀后在37℃温育5min，加入复溶后的免疫比浊试剂200μL，充分混匀。用5mm比色杯在570nm下检测5min吸光度的变化值，计算ΔA。分别测定0、5.0、20.0、400.0、160.0、320.0mg/L浓度的样本，结果如下表4和表5所示。

表4 CRP干性免疫比浊试剂37℃加速75天数据(时间-吸光度值)

浓度mg/L	5.0	20.0	40.0	160.0	320.0
						1天	0.1250	0.1555	0.2311	0.455	0.7813
7天	0.1235	0.1654	0.2258	0.4625	0.754
						16天	0.1183	0.1594	0.2262	0.4404	0.7399
23天	0.0959	0.1780	0.2165	0.4175	0.7665
						30天	0.1224	0.1641	0.2130	0.4439	0.7045
44天	0.1056	0.1702	0.2102	0.4539	0.8017
						59天	0.1031	0.1670	0.2238	0.4602	0.7760
75天	0.1151	0.1654	0.2201	0.4456	0.7579
						std	0.0108	0.0068	0.0072	0.0144	0.0293
ave	0.1136	0.1656	0.2208	0.4474	0.7602
						cv	9.511％	4.080％	3.254％	3.217％	3.856％

表5 CRP干性试剂常温保存及检测数据(时间-检测结果)

浓度mg/L	5.0	20.0	40.0	160.0	320.0
						0月	4.52	19.57	40.05	158.62	315.91
1月	4.78	20.21	38.59	162.47	330.48
						3月	5.21	20.19	40.86	161.52	329.15
6月	5.36	20.55	41.05	168.84	340.53
						9月	5.25	20.78	41.35	164.52	336.15
12月	5.45	21.68	42.12	165.36	334.21
						std	0.3642	0.7097	1.2212	3.5155	8.4737
ave	5.0950	20.4967	40.6700	163.5550	331.07
						cv	7.149％	3.462％	3.003％	2.149％	2.559％

可以看出，37℃加速75天，试剂检测性能无明显改变；常温稳定性检测到12个月时，高值CV＜5％，低值CV小于10％。

实施例6干性免疫比浊试剂提高反应灵敏度及信号响应值

按照实施例1中描述的免疫比浊试剂的制备方法，以D-Dimer鼠单克隆抗体(Yesen-bio)替换CRP单克隆抗体，制备乳胶微球含量为0.5％的用于检测D-Dimer的免疫比浊试剂。取制备好的检测D-Dimer的免疫比浊试剂，加入等体积5％浓度的PVA0580成膜剂溶液，混合均匀。按实施例1中干燥方式1，在每个1cm×1cm网格模具中加入200μL混合液体进行干燥成膜。

取成膜后的干性免疫比浊试剂，加入等体积纯化水溶解，可以得到均匀的溶液。按普通检验流程操作，取试剂1 300μL，加入血浆样本14μL，充分混匀后在37℃温育5min，加入复溶后的免疫比浊试剂100μL，充分混匀。以未进行成膜处理的免疫比浊试剂作为对照。用2mm比色杯在570nm下检测3min吸光度的变化值，计算ΔA/Δt。分别测定0、1.0、3.2、6.2mg/L浓度的样本，结果如表6和图2所示。

表6 D-Dimer免疫比浊试剂成膜前后检测性能

样本浓度mg/L	液体对照试剂ΔA/Δt(系列1)	干燥后复溶ΔA/Δt(系列2)
			0	0.000121	0.00015
1	0.002326	0.00412
			3.2	0.005327	0.011729
6.2	0.009385	0.021715

可以看到，免疫比浊试剂成膜后再溶解仍可以参与反应，对不同样本进行检测，样本浓度与吸光度变化仍呈线性关系，并且与未进行干燥成膜处理的试剂对比，线性斜率明显上升，这表示成膜后再溶解的试剂对样本的检测信号的浓度差异增大，高值区域检测信号上升，跟随浓度变化的信号变化幅度更大，检测结果更稳定。

随后我们研究了多种成膜剂对检测性能的影响。取制备好的检测D-Dimer的免疫比浊试剂，加入等体积的不同成膜剂5％浓度溶液，混合均匀，以上述方式于37℃进行干燥成膜。取成膜后的干性D-Dimer免疫比浊试剂(乳胶微球量相当于液体免疫比浊试剂100μL量)，加入100μL纯化水溶解，可以得到均匀的溶液。按照普通检验流程操作，取试剂1 300μL，加入样本14μL，充分混匀后在37℃温育5min，加入复溶后的免疫比浊试剂100μL充分混匀。用2mm比色杯在570nm下检测3min吸光度的变化值，计算ΔA/Δt。分别测定0、1.0、3.2、6.2mg/L浓度的样本，并与市售免疫比浊试剂(九强生物，双试剂乳胶免疫比浊法)和未经成膜处理的免疫比浊试剂(对照)进行比较，结果如表7和图3所示。

表7不同成膜剂对于检测反应的影响

由结果可见，使用成膜剂A时，制备的干性免疫比浊试剂再溶解后仍能反应，与原液体试剂对比，成膜剂A对免疫比浊反应基本无影响；而使用成膜剂B、C、D、E时，使不同浓度样本间的反应结果差值增大，可增加检测试剂的灵敏度。

我们对这种差异增大的原因进行推测，可能是由于成膜剂作为试剂组分溶解后，会改变试剂溶液的粘度，而粘度增加会促进乳胶颗粒的聚集，从而增加反应后试剂的响应值。成膜剂A溶解后，试剂的粘度基本不变，对于反应响应值则影响不大。

综合上述结果，我们认为：

在需要增加反应响应值时，可将含成膜剂的溶液粘度范围控制在5.0-50.0cps范围内较好。粘度太高反而不利于反应试剂的混合及反应。此时成膜剂材料选择例如可以为：PVP系列中，15≤K值≤90；PVA系列中，65％≤醇解度≤88％，500≤聚合度≤2300；

如果不需要增加反应响应值，则可选取低粘度的成膜剂，例如从醇解度<65％，聚合度<500的PVA系列中选择，对PVP则可从K值＜15的PVP中选择，例如PVPK12。实施例7试剂 成膜后加速稳定性

按实施例6第1段中的描述制备干性D-Dimer免疫比浊试剂，于37℃保存，在不同时间点测试其检测性能。在检测前加入等体积纯化水溶解，可以得到均匀的溶液。按普通检验流程操作，取试剂1 300μL，加入血浆样本14μL，充分混匀后在37℃温育5min，加入复溶后的免疫比浊试剂100μL，充分混匀。用2mm比色杯在570nm下检测3min吸光度的变化值，计算ΔA/Δt。分别测定0、1.0、3.2、6.2mg/L浓度的样本，结果如下表8所示。

表8 D-Dimer干性免疫比浊试剂的加速稳定性

从结果可见，干性免疫比浊试剂在37℃加速23天后仍保持活性。1.0mg/L、3.2mg/L、6.2mg/L样本的检测结果CV分别为10.56％、6.54％、7.25％，小于试剂允许的最大CV15％，可以认为干燥后试剂可以长时间保持活性及试剂检测稳定性。

实施例8干性尿微量白蛋白检测试剂制备

按照实施例1中描述的免疫比浊试剂的制备方法，将CRP单克隆抗体换成尿微量白蛋白(MALB)(瀚睿生物)的鼠单克隆抗体，制备用于检测MALB的免疫比浊试剂。

取制备好的免疫比浊试剂(乳胶浓度0.1％)40mL，加入等体积5％浓度的PVA0380成膜剂40mL，混合均匀。按实施例1中干燥方式1，在每个1cm×1cm网格模具中加入200μL混合液体进行干燥成膜。将干燥后形成的干性免疫比浊试剂放置于37℃加速或常温进行稳定性考察。定期取出干性比浊试剂进行检测。

检测前取干性免疫比浊试剂，加入等体积纯化水溶解，可以得到均匀的溶液。按普通检验流程操作，取试剂1 400μL，加入尿液样本10μL，充分混匀后在37℃温育5min，加入复溶后的免疫比浊试剂100μL充分混匀，用3mm比色杯在570nm下检测3min吸光度的变化值，计算ΔA。分别测定0、10.0、50.0、100.0、200.0、300.0mg/L浓度的样本，结果如表9(37℃加速)以及表10和图4(常温)所示。

表9 MALB干性免疫比浊试剂37℃加速84天的检测性能(浓度-吸光度值)

浓度mg/L	10	50	100	200	300
						11天	0.0321	0.0883	0.1268	0.1912	0.2580
13天	0.0366	0.0818	0.1259	0.2019	0.2544
						20天	0.0468	0.0967	0.1483	0.2082	0.2583
27天	0.0378	0.0961	0.1335	0.2069	0.2641
						34天	0.0372	0.0951	0.1428	0.1980	0.2652
41天	0.0351	0.0998	0.1513	0.2051	0.2580
						48天	0.0392	0.1002	0.1400	0.2120	0.2712
55天	0.0385	0.1070	0.1386	0.2199	0.2654
						84天	0.0354	0.0842	0.1410	0.2079	0.2727
std	0.004039493	0.008141116	0.008712124	0.0082021	0.006316447
						ave	0.037633333	0.094355556	0.138688889	0.205677778	0.263033333
cv	0.107338154	0.086281263	0.062817753	0.039878397	0.024013864

表10 MALB干性免疫比浊试剂常温稳定性结果(常温14个月，浓度-检测值)：

结果可以看出，成膜后的免疫比浊试剂干燥后，37℃加速84天时，试剂检测性能无明显改变；常温稳定性检测到14个月时，高值CV＜5％，低值CV小于10％；

在本研究中，我们出乎意料地发现水溶性高分子成膜剂(PVP、PVA、PEG等)可以用于免疫比浊试剂的干燥成膜，成膜后在干燥状态能够稳定保存，同时也更加适合运输。

在目前广泛采用的微流控等实验中，本发明的干性试剂更加适合预先加入检测结构中。例如，干性试剂可以按照单个人份在制备试剂卡时加入，无需在反应时再进行定量，也不需密闭的装置保存。本发明的干性免疫比浊试剂可以预先储存在反应腔中，和稀释后的样本直接反应，节省了液体储存和密闭需要的结构，操作更简单。当前市售的一些检测卡设计使用了液体试剂，每种液体试剂要么需要单独定量，要么需要用单独密闭的腔体存放，导致试剂卡结构复杂，在后续使用中还需要机械穿刺进行液体释放。这显然增加了结构设计和机械部件的要求，成本较高。

本发明的检测试剂成膜溶解后(完全溶解时间在2分钟以内)即可以参与反应，溶解过程并不影响试剂的性能，没有非特异性凝聚。也可以无需单独的溶解步骤，直接在反应中边溶解边反应，这极大地简化了操作步骤，提高了反应效率，反应时间和传统方法等同，但是减少了各个试剂的分步骤加入，操作更简单。此外，本发明的干性免疫比浊试剂在检测性能方面还能够增强信号，相对于现有市售液体检测试剂，其在检测结果方面更加稳定可靠。

总之，本发明的干性免疫比浊试剂制备工艺简单，成本低，性能稳定，能够常温长期保存，检测效率高，具有较高的学术意义和商业价值。

Claims (18)

1.一种制备干性免疫比浊试剂的方法，包括：

1)将偶联有抗体的微球与水溶性成膜剂在溶液中混合；

2)让步骤1)得到的混合液形成膜状物并进行干燥处理。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述微球为乳胶微球。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述水溶性成膜剂选自PVP、PVA、PEG、PEO及其组合。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述PVP的K值不大于90；所述PVA的醇解度不大于89％，聚合度不大于2300。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述PVP的K值范围为15至90；所述PVA的醇解度范围为65％至89％，聚合度范围为500至2300。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述成膜剂为PVA1788、PVA0580、PVPK30或PVPK15。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述偶联有抗体的微球在所述混合液中的浓度不高于2.5％(wt)。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述偶联有抗体的微球在所述混合液中的浓度为0.05％至0.5％(wt)，所述成膜剂在所述混合液中的浓度为0.5％至5％(wt)。

9.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中所述干燥处理在模具中进行。

10.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中所述干燥处理包括在37℃加热干燥2至3小时。

11.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中所述干燥处理所形成的膜状物的厚度为5μm至530μm。

12.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中所述干燥处理所形成的膜状物的厚度为50μm至300μm。

13.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中所述膜状物通过喷雾干燥成型或超薄膜成型获得。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体为抗CRP、抗D-Dimer或抗MALB抗体。

15.权利要求1至14中任一项所述的方法制备的干性免疫比浊试剂。

16.免疫检测试剂盒，其包括权利要求15所述的干性免疫比浊试剂。

17.微流控试剂卡，其包括权利要求15所述的干性免疫比浊试剂。

18.免疫比浊检测方法，其包括将全血、血清或血浆样品与权利要求15所述的干性免疫比浊试剂接触。

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