CN108008125A - 一种适用于免疫磁珠的冻干工作液和免疫磁珠冻干品及其制备方法 - Google Patents

一种适用于免疫磁珠的冻干工作液和免疫磁珠冻干品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于免疫磁珠的冻干工作液，所述冻干工作液为冻干缓冲液、冻干保护剂和防腐剂的组合，所述冻干缓冲液、冻干保护剂与防腐剂的质量比为1~10:1~500:1；所述冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、硼酸‑硼砂缓冲液中的一种或多种组合；所述冻干保护剂包括糖类物质和聚合物，所述糖类物质与聚合物的质量比为0.1~20：1。本发明的一种免疫磁珠冻干剂，开发筛选冻干工作液，并将免疫磁珠与冻干工作液混合冷冻干燥，可以长期保存，具有稳定性好、易复溶等优点。

Description

一种适用于免疫磁珠的冻干工作液和免疫磁珠冻干品及其制 备方法
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种适用于免疫磁珠的冻干工作液和免疫磁珠冻干品及其制备方法。
背景技术
磁微粒是一种广泛应用于生物医学领域的顺磁性纳微米级复合粒子，多以 Fe3O4为内核，最外层是功能基团，如氨基、羧基、醛基、羟基、环氧基。免疫磁珠(Immunomagneticbeads，IMB)是由磁微粒和免疫配基(抗体、抗原、核酸、亲和素或生物素)通过共价偶联或物理吸附制成的免疫磁性微球，多应用于免疫分析、蛋白质纯化、核酸提取、细胞分离、靶向给药、环境监测等领域。基于免疫磁珠的磁微粒化学发光法已广泛应用于临床检测领域，该技术具有高灵敏度、高特异性、线性范围宽及无放射性污染等优点。
由于免疫配基的稳定性差或偶联效率低等原因，有些免疫磁珠效期较短，且对储存和运输条件要求较为苛刻，导致此类免疫磁珠稳定性差、准确度低等问题。
将免疫磁珠进行冷冻后，不仅能够长期保存，而且方便运输，但是在真空冷冻干燥的过程中，免疫磁珠的结构极易受到破坏，或免疫磁珠发生不可逆地聚集，使得免疫磁珠冻干剂不稳定，复溶后使用效果差。
发明内容
有鉴于此，为了解决上述问题，本发明提供了一种免疫磁珠冻干剂，可以长期保存，具有稳定性好、易复溶等优点。
为了达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：
一种适用于免疫磁珠的冻干工作液，所述冻干工作液包括冻干缓冲液、冻干保护剂和防腐剂，所述冻干缓冲液、冻干保护剂与防腐剂的质量比为 1～10:1～500:1；所述冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl buffer)、磷酸盐缓冲液(PBSbuffer)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES buffer)、硼酸-硼砂缓冲液中的一种或多种组合；所述冻干保护剂包括糖类物质和聚合物，所述糖类物质与聚合物的质量比为0.1～20：1。
优选地，所述冻干保护剂还包括多元醇，所述糖类物质与多元醇的质量比为0.1～20：1。
更加优选地，所述糖类物质为海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或其中的两种以上形成的组合。
优选地，所述聚合物为白蛋白，具体的为牛血清白蛋白(BSA)。
更加优选地，所述多元醇为甘露醇。
优选地，所述防腐剂为Proclin 300。
本发明还提供了一种免疫磁珠冻干品，其包括免疫磁珠冻干剂，所述免疫磁珠冻干剂由分散有免疫磁珠的如上所述的冻干工作液经冷冻干燥得到。
优选地，所述免疫磁珠为偶联有免疫配基的磁微粒，所述免疫配基为抗体、抗原、核酸、亲和素或生物素。
优选地，所述免疫磁珠冻干品还包括与所述免疫磁珠冻干剂独立包装、用于对所述免疫磁珠冻干剂进行复溶的复溶试剂，具体的，复溶试剂为纯化水。
本发明还提供了一种如上所述的免疫磁珠冻干品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)免疫磁珠的制备：首先将磁微粒用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)，或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)二者的组合物，或戊二醛进行活化；将活化后的磁微粒与免疫配基通过共价偶联制成所述的免疫磁珠；非活化的磁微粒与免疫配基通过物理吸附制成免疫磁性微球；
2)冻干工作液的制备：在冻干缓冲液的基础上，按比例添加冻干保护剂和防腐剂，充分溶解，并用0.22μm滤膜过滤处理；
3)冷冻干燥：将步骤1)中制备的所述免疫磁珠分散步骤2)中制备的所述冻干工作液，混合均匀后分装至冻干瓶，接着进行-60℃～-50℃预冻、-50℃～-40℃主冻干、-50℃～-40℃后冻干，最后经过封装工艺制成所述免疫磁珠冻干剂；
4)复溶试剂：将复溶试剂进行分装，与步骤3)中制备得到的所述免疫磁珠冻干剂共同组成所述免疫磁珠冻干品。
相较于现有技术，本发明的一种免疫磁珠冻干剂，开发筛选冻干工作液，并将免疫磁珠与冻干工作液混合冷冻干燥，可以长期保存，具有稳定性好、易复溶等优点。
附图说明
图1为实施例一中液态免疫磁珠的分散性；
图2为实施例一中免疫磁珠冻干并复溶后的分散性；
图3为实施例一中阴性对照的液态免疫磁珠的稳定性；
图4为实施例一中阳性对照的液态免疫磁珠的稳定性；
图5为实施例一中阴性对照的免疫磁珠冻干并复溶后的稳定性；
图6为实施例一中阳性对照的免疫磁珠冻干并复溶后的稳定性；
图7为实施例三中液态免疫磁珠的分散性；
图8为实施例三中免疫磁珠冻干并复溶后的分散性；
图9为实施例三中阴性对照液态免疫磁珠的稳定性；
图10为实施例三中阳性对照液态免疫磁珠的稳定性；
图11为实施例三中阴性对照免疫磁珠冻干并复溶后的稳定性；
图12为实施例三中阳性对照免疫磁珠冻干并复溶后的稳定性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明优选的实施方式进行详细说明。
实施例一
(1)免疫磁珠的制备(免疫配基为抗原)
首先将磁微粒用EDC组合NHS进行活化；将一定量的抗原加入到活化后的磁微粒中，通过共价偶联制成免疫磁性微球，即免疫磁珠。
(2)冻干工作液A的制备
配置0.01M PBS buffer，调节pH为7.4，在此基础上按冻干工作液的质量依次添加2％海藻糖，2％甘露醇，3％BSA，0.02％Proclin 300，溶解后定容，混匀，并用0.22μm滤膜过滤处理后得到冻干工作液A。
(3)冻干工作液B的制备
配置0.01M PBS buffer，调节pH为7.4，在此基础上按冻干工作液的质量依次添加1％海藻糖，1％甘露醇，3％BSA，0.02％Proclin 300，溶解后定容，混匀，并用0.22μm滤膜过滤处理后得到冻干工作液B。
(4)冻干工作液C的制备
配置0.01M PBS buffer，调节pH为7.4，在此基础上按冻干工作液的质量依次添加2％海藻糖，2％甘露醇，3％BSA，0.01％Proclin 300，溶解后定容，混匀，并用0.22μm滤膜过滤处理后得到冻干工作液C。
(5)冻干
首先将偶联抗原后的磁微粒试剂按照4mL/瓶进行分装，然后操作仪器按以下冻干曲线进行冻干，得到免疫磁珠冻干剂。
表1冻干工作液A、冻干工作液B和冻干工作液C的冻干曲线
(6)复溶
将步骤(5)中制备得到的免疫磁珠冻干剂，按4mL纯化水/瓶进行复溶。
实施例二
本实施例为对实施例一中制备的免疫磁珠(免疫配基为抗原)采用三种不同冻干工作液进行冻干的前后活性、分散性、稳定性等进行了一系列的对比。
(1)免疫配基为抗原的免疫磁珠在不同的冻干工作液中冻干前后活性的比较，结果见下表。
表2配基为抗原的免疫磁珠在不同的冻干工作液中冻干前后的活性
备注：NC：Negative Control(阴性对照)；PC：Positive Control(阳性对照)，上表中的数值均为发光值RLU。
从表2中可以看出，对于偶联有抗原的磁微粒，采用冻干工作液A进行冻干是较优选的方案。
(2)将配基为抗原的磁微粒在冻干工作液A中进行冻干，进行分散性和稳定性的评估，分散性结果见图1-2，稳定性见图3-6。
结果表明，实施例一中的液态免疫磁珠和进行冻干并复溶后的免疫磁珠的分散性相当，且冻干并复溶后的免疫磁珠的发光值比较平稳，代表其具有较好的稳定性。
(3)稳定性
冻干磁微粒复溶后在2～8℃环境中可稳定保存28天以上，结果见下表。
表3配基为抗原的免疫磁珠的稳定性测试数据
(4)批间差
连续3次冻干同批次免疫磁珠(免疫配基为抗原)，批间差≤10％，结果见下表。
表4配基为抗原的免疫磁珠的批间差测试数据
Control lot1 lot2 lot3 Ave. CV
NC1 30118 31457 26998 29524 8％
NC2 144629 137994 137847 140156 3％
PC1 900665 852843 783844 845784 7％
PC2 3610688 3926306 3890166 3809053 5％
实施例三
(1)免疫磁珠的制备(免疫配基为核酸)
首先将磁微粒与链霉亲和素进行偶联；同时用生物素标记核酸，之后将生物素化的核酸加入到偶联有链霉亲和素的磁微粒中，通过链霉亲和素和生物素的桥联作用制成免疫磁性微球，即免疫磁珠。
(2)冻干工作液D的制备
配置0.02M Tris-HCl buffer，调节pH为7.4，在此基础上按冻干工作液的质量依次添加1％海藻糖，1％甘露醇，3％BSA，0.02％Proclin 300，溶解后定容，混匀，并用0.22μm滤膜过滤处理后得到冻干工作液D。
(3)冻干工作液E的制备
配置0.05M Tris-HCl buffer，调节pH为7.4，在此基础上按冻干工作液的质量依次添加1％海藻糖，1％甘露醇，3％BSA，0.02％Proclin 300，溶解后定容，混匀，并用0.22μm滤膜过滤处理后得到冻干工作液E。
(4)冻干工作液F的制备
配置0.02M Tris-HCl buffer，调节pH为7.4，在此基础上按冻干工作液的质量依次添加1％海藻糖，1％甘露醇，3％BSA，0.01％Proclin 300，溶解后定容，混匀，并用0.22μm滤膜过滤处理后得到冻干工作液F。
(5)冻干
首先将偶联核酸后的磁微粒试剂按照4mL/瓶进行分装，然后操作仪器按以下冻干曲线进行冻干，得到免疫磁珠冻干剂。
表5冻干工作液D、冻干工作液E和冻干工作液F的冻干曲线
(6)复溶
将步骤(5)中制备得到的免疫磁珠冻干剂，按4mL纯化水/瓶进行复溶。
实施例四
本实施例为对实施例三中制备的免疫磁珠(免疫配基为核酸)采用三种不同冻干工作液进行冻干的前后活性、分散性、稳定性等进行了一系列的对比。
(1)配基为核酸的免疫磁珠在不同的冻干工作液中冻干前后活性的比较，结果见下表。
表6配基为核酸的免疫磁珠在不同的冻干工作液中冻干前后的活性
备注：NC：Negative Control(阴性对照)；PC：Positive Control(阳性对照)，上表中的数值均为发光值RLU。
从表6中可以看出，对于磁微粒偶联核酸的免疫磁珠，采用冻干工作液F 进行冻干是较优选的方案。
(2)将配基为核酸的磁微粒在冻干工作液F中进行冻干，进行分散性和稳定性的评估，分散性结果见图7-8，稳定性见图9-12。
结果表明，实施例三中的液态免疫磁珠和进行冻干并复溶后的免疫磁珠的分散性相当，且冻干并复溶后的免疫磁珠的发光值比较平稳，代表其具有较好的稳定性。
(3)稳定性
冻干磁微粒复溶后在2～8℃环境中可稳定保存28天以上，结果见下表。
表7配基为核酸的免疫磁珠的稳定性测试数据
(4)批间差
连续3次冻干同批次免疫磁珠(免疫配基为核酸)，批间差≤10％，结果见下表。
表8配基为核酸的免疫磁珠的批间差测试数据
Control lot1 lot2 lot3 Ave. CV
NC1 27705 28477 25197 27126 6％
NC2 105413 98465 89906 97928 8％
PC1 727224 670245 654829 684099 6％
PC2 2883000 3157853 3156471 3065775 5％
本发明经过开发及筛选冻干工作液，得到了一类适用于免疫磁珠的冻干工作液，并。利用真空冷冻干燥技术，优化冻干工艺，将免疫磁珠制备成免疫磁珠冻干剂和免疫磁珠冻干品。本发明可使免疫磁珠在真空冷冻干燥过程中不被损坏，冻干前后的活性收率约为95％。复溶后的免疫磁珠不存在聚集现象，在 2～8℃环境中可稳定保存28天以上。连续3次冻干同批次免疫磁珠，批间差≤10％。冻干工艺简单，很容易实现全自动化。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种适用于免疫磁珠的冻干工作液，其特征在于，所述冻干工作液包括冻干缓冲液、冻干保护剂和防腐剂，所述冻干缓冲液、冻干保护剂与防腐剂的质量比为1~10:1~500:1；所述冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液中的一种或多种组合；所述冻干保护剂包括糖类物质和聚合物，所述糖类物质与聚合物的质量比为0.1~20：1。
2.根据权利要求1所述的一种适用于免疫磁珠的冻干工作液，其特征在于，所述冻干保护剂还包括多元醇，所述糖类物质与多元醇的质量比为0.1~20：1。
3.根据权利要求2所述的一种适用于免疫磁珠的冻干工作液，其特征在于，所述糖类物质为海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或其中的两种以上形成的组合。
4.根据权利要求1或2所述的一种适用于免疫磁珠的冻干工作液，其特征在于，所述聚合物为白蛋白。
5.根据权利要求2所述的一种适用于免疫磁珠的冻干工作液，其特征在于，所述多元醇为甘露醇。
6.根据权利要求1所述的一种适用于免疫磁珠的冻干工作液，其特征在于，所述防腐剂为Proclin 300。
7.一种免疫磁珠冻干品，其包括免疫磁珠冻干剂，其特征在于，所述免疫磁珠冻干剂由分散有免疫磁珠的冻干工作液经冷冻干燥得到，冻干工作液采用权利要求1-6中任意一项权利要求所述的冻干工作液。
8.根据权利要求7所述的一种免疫磁珠冻干品，其特征在于，所述免疫磁珠为偶联有免疫配基的磁微粒。
9.根据权利要求8所述的一种免疫磁珠冻干品，其特征在于，所述免疫配基为抗体、抗原、核酸、亲和素或生物素。
10.一种如权利要求7所述的免疫磁珠冻干品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）免疫磁珠的制备：首先将磁微粒用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺，或1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺二者的组合物，或戊二醛进行活化；将活化后的磁微粒与免疫配基通过共价偶联制成所述的免疫磁珠；非活化的磁微粒与免疫配基通过物理吸附制成免疫磁性微球；
2）冻干工作液的制备：在冻干缓冲液的基础上，按比例添加冻干保护剂和防腐剂，充分溶解，并用滤膜过滤；
3）冷冻干燥：将步骤1）中制备的所述免疫磁珠分散于步骤2）中制备的所述冻干工作液，混合均匀后分装至冻干瓶，接着进行-60℃~-50℃预冻、-50℃~-40℃主冻干、-50℃~-40℃后冻干，即得所述免疫磁珠冻干剂。
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