CN106290822A - D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用，D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法优化化学交联方法，将聚苯乙烯微球的羧基在低pH条件下活化，与高pH条件溶解的抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，在低温下偶联12～24h，既保证了抗体的偶联效率，同时极大程度的降低了活化剂对抗体活性的破坏。采用本发明方法制备的免疫胶乳微球制成的胶乳增强免疫比浊法D‑二聚体测定试剂盒具有灵敏度高、定量准确、重复性好、性质稳定的特点，最低检测低限可达0.01mg/L，可应用于全自动生化分析仪或凝血分析仪，操作快速、简单，从检测至采集结果只需5～10分钟，具有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫诊断领域，具体地指一种D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用。
背景技术
D-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，是一个特异性的纤溶过程标记物。
血浆D二聚体测定是了解继发性纤维蛋白溶解功能的一个试验。现有技术采用的胶乳增强免疫比浊法检查原理为：抗D-D单克隆抗体包被于胶乳颗粒上，受体血浆中如果存在D-二聚体，将产生抗原-抗体反应，乳胶颗粒发生聚集现象。
1977年Sternberg创建了速率散射比浊法，是以测定的溶液对光的散射程度来判断样品中抗原的含量。一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物可导致光散射，散射强度与抗原抗体免疫复合物的含量成正比。但免疫比浊法由于检测灵敏度达不到临床的要求，于是出现了胶乳增强免疫比浊法。其基本原理是首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现胶乳凝集。单个胶乳颗粒的大小在入射光波长之内，光线可透过。当两个以上胶乳颗粒凝集可阻碍光线透过，使透射光减少，其减少程度与胶乳凝集的程度成正比，亦与抗原成反比。
现有技术中常采用聚苯乙烯微球偶联抗体，得到用于检测的胶乳试剂，但偶联效率普遍偏低，只有60～80％，且偶联时碳化二亚胺类活化剂对抗体活性破坏较大，导致产品成品率低。
发明内容
本发明的目的就是要克服现有D-二聚体免疫胶乳微球制备方法产品成品率低的缺陷，提供一种偶联效率高、偶联后抗体活性影响小的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及由采用该D-二聚体免疫胶乳微球的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒。
为实现上述目的，本发明所提供的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法，步骤如下：
1)准备粒径范围200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4～0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；
2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005～0.02mg/mL之间，得到FDP单抗溶液，储存于2～8℃备用；
5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后2～8℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球。
优选地，所述步骤3)中震荡活化条件为：4℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min。
优选地，所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时，4℃震荡16h，震荡速度为50r/min。
本发明还提供了一种胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，包括D-二聚体检测试剂R1和D-二聚体检测试剂R2；
所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.01～13％稳定剂1、10～200mM的缓冲液1、1～6％的促凝剂1、0.02～0.1％的防腐剂1；
所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为：0.01～23％稳定剂2、1～5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、10～200mM的缓冲液2、0.02～0.1％的防腐剂2、0.05～5％的赋形剂2；
所述D-二聚体检测试剂R2的制备方法为：
1)准备粒径范围200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4～0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；
2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液，
3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005～0.02mg/mL之间，得到FDP单抗溶液，储存于2～8℃备用；
5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后2～8℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球；
6)向D-二聚体免疫胶乳微球中加入含有稳定剂2和缓冲液2的封闭液，震荡得到胶乳溶液；
7)胶乳溶液离心，去上清液，以除去其中残留的活化剂，然后加入防腐剂2至贮存浓度，超声分散，即得。
优选地，所述稳定剂1选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述缓冲液1选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述促凝剂1选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖中的一种；
所述防腐剂1选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述稳定剂2选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述缓冲液2选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述防腐剂2选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种。
所述赋形剂2选自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种；
进一步优选地，所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、pH7.4的100～200mM Tris、0.02～2％的PEG、0.05％的NaN3；
所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、2～6％蔗糖、1～5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.05％的NaN3；
或所述D-二聚体检测试剂R1和所述D-二聚体检测试剂R2中0.05％的NaN3替换为0.1％的Proclin 300。
进一步地，上述试剂盒还包括D-二聚体校准品，其各组分及含量为：0.01～13％的校准品稳定剂、20mg/L的D-二聚体、10～200mM的校准品缓冲液、0.02～0.1％的校准品防腐剂、0.05～5％的校准品赋形剂。
优选地，所述校准品稳定剂选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述校准品缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述校准品防腐剂选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述校准品赋形剂选自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种。
进一步优选地，所述D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.05％的NaN3；
或所述D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.1％的Proclin 300。
优选地，上述试剂盒的技术方案中，所述步骤3)中震荡活化条件为：4℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min。
优选地，上述试剂盒的技术方案中，所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时，4℃震荡16h，震荡速度为50r/min。
优选地，上述试剂盒的技术方案中，所述步骤6)中震荡条件为：25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min。
本发明的有益效果：
(1)本发明方法制备的D-二聚体免疫胶乳微球时优化化学交联方法，将聚苯乙烯微球的羧基在低pH条件下活化，与高pH条件溶解的抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，在低温下偶联12～24h，既保证了抗体的偶联效率，同时极大程度的降低了活化剂对抗体活性的破坏。
(2)本发明D-二聚体免疫胶乳微球的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒具有灵敏度高、定量准确、重复性好、性质稳定的特点，最低检测低限可达0.01mg/L。
(3)本发明试剂盒具有较强的特异性。本实验中使用的是针对不同抗原表位的单克隆抗体，极大提高了反应时的特异性。
(4)可应用于全自动生化分析仪或凝血分析仪，操作快速、简单，从检测至采集结果只需5～10分钟，具有较好的临床应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
本发明所提供的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法如下：
1、准备粒径240nm的聚苯乙烯微球，浓度为10％，取用2ml；聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.5％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液，溶液的体积是40mL；
2、以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加80μL，4℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4、将DD单克隆抗体(市售DD单克隆抗体DD2和DD41，两者的终浓度≤10mg/mL)在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.008mg/mL，得到FDP单抗溶液，溶液的体积是40mL，储存于4℃备用；
5、将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续5min，两者的混合液呈中性，之后4℃震荡16h，震荡速度为50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球1。
实施例2
本发明所提供的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法如下：
1、准备粒径200nm的聚苯乙烯微球，浓度为10％，取用2ml；聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液，溶液的体积是50mL；
2、以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加80μL，8℃震荡活化1h，震荡速度为30r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4、将DD单克隆抗体(市售DD单克隆抗体DD2和DD41，两者的总浓度≤10mg/mL)在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.02mg/mL，得到FDP单抗溶液，溶液的体积是40mL，储存于4℃备用；
5、将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4min，两者的混合液呈中性，之后8℃震荡12h，震荡速度为30r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球2。
实施例3
本发明所提供的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法如下：
1、准备粒径400nm的聚苯乙烯微球，浓度为10％，取用2ml；聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液，溶液的体积是40mL；
2、以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加84μL，2℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4、将DD单克隆抗体(市售DD单克隆抗体DD2和DD41，两者的总浓度≤10mg/mL)在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005mg/mL，得到FDP单抗溶液，溶液的体积是40mL，储存于4℃备用；
5、将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4min，两者的混合液呈中性，之后2℃震荡24h，震荡速度为50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球3。
实施例4
以实施例1制备的D-二聚体免疫胶乳微球1为原料，制备胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒。其各组分如下：
D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.8％BSA、0.5％NaCl、200mM Tris(pH＝7.4)、0.02％PEG6000、0.05％NaN3；
D-二聚体检测试剂R2中各组分的及含量为：0.4％BSA、6％蔗糖、1mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、25mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH＝7.4)、0.05％NaN3；
D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.8％BSA、0.5％NaCl、6％蔗糖、0.1％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、25mmol/L的甘氨酸缓冲液、0.05％NaN3。
其中，D-二聚体检测试剂R2的制备步骤如下：
1、向80mL的D-二聚体免疫胶乳微球1的溶液中加入40mL封闭液，25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min，得到胶乳溶液；封闭液组分为：3％w/v的BSA、100mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH＝8.5不含防腐剂)。
2、胶乳溶液以15000r/min离心15～25min，去掉上清液，然后加入含有NaN3成分的贮存液至贮存浓度，超声分散即得。
实施例5
以实施例1制备的D-二聚体免疫胶乳微球1为原料，制备胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒。其各组分如下：
D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.4％BSA、0.9％NaCl、100mM Tris(pH＝7.4)、2％PEG8000、0.1％Proclin 300；
D-二聚体检测试剂R2中各组分的及含量为：0.6％BSA、2％蔗糖、2mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、50mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH＝7.4)、0.1％Proclin 300；
D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4％BSA、0.9％NaCl、2％蔗糖、0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、50mmol/L的甘氨酸缓冲液、0.1％Proclin 300。
其中，D-二聚体检测试剂R2的制备步骤如下：
1、向80mL的D-二聚体免疫胶乳微球1的溶液中加入40mL 封闭液，25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min，得到胶乳溶液；封闭液组分为：3％w/v的BSA、100mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH＝8.5不含防腐剂)。
2、胶乳溶液以15000r/min离心30～45min，去掉上清液，然后加入含有Proclin300成分的贮存液至贮存浓度，超声分散即得。
实施例6
以实施例1制备的D-二聚体免疫胶乳微球1为原料，制备胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒。其各组分如下：
D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：3％BSA、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.9％的NaCl、1％的Tween-20、1％的丙三醇、10mM的磷酸盐缓冲液(PBS)、100mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(Hepes)、1％的PEG6000、0.02％的硫柳汞；
D-二聚体检测试剂R2中各组分的含量为：10％的丙三醇、0.05％葡萄糖、1mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、10mM的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液(Mopso)、0.04％的硫柳汞；
D-二聚体校准品中各组分的含量为：1％的Tween-20、10％的丙三醇、0.05％葡萄糖、20mg/L的D-二聚体、200mM的硼酸盐缓冲液(BBS)、0.04％的硫柳汞；
其中，D-二聚体检测试剂R2的制备步骤如下：
1、向80mL的D-二聚体免疫胶乳微球1的溶液中加入40mL封闭液，25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min，得到胶乳溶液；封闭液中含葡萄糖、丙三醇和3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液(Mopso)。
2、胶乳溶液以15000r/min离心30～45min，去掉上清液，然后加入含有硫柳汞成分的贮存液至贮存浓度1mg/mL，超声分散即得。
实施例7
以实施例1制备的D-二聚体免疫胶乳微球1为原料，制备胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒。其各组分如下：
D-二聚体检测试剂R1中各组分的含量为：5mM乙二胺四乙酸二钠、10％的丙三醇、50mmol/L的甘氨酸缓冲液、6％的硫酸葡聚糖、0.08％的NaN3；
D-二聚体检测试剂R2中各组分的含量为：0.9％的NaCl、3％BSA、50mM乙二胺四乙酸二钠、1％的Tween-20、10％的丙三醇、3％甘露醇、2％海藻糖、5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、110mM的Tris、0.05％的Proclin 300；
D-二聚体校准品中各组分的含量为：1％的NaCl、3％甘露醇、2％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、50mM的磷酸盐缓冲液(PBS)、0.02％的NaN3；
其中，D-二聚体检测试剂R2的制备步骤如下：
1、向100mL的D-二聚体免疫胶乳微球1的溶液中加入50mL封闭液，25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min，得到胶乳溶液；封闭液中含NaCl、BSA、乙二胺四乙酸二钠、Tween-20、丙三醇、甘露醇、海藻糖、及Tris。
2、胶乳溶液以15000r/min离心30～45min，去掉上清液，然后加入含有Proclin300成分的贮存液至贮存浓度5mg/mL，超声分散即得。
试验例
一、D-二聚体免疫胶乳微球偶联效率及活性检测
(1)准备4份50mg的CRP多克隆抗体及4份粒径120nm的聚苯乙烯胶乳颗粒，三份采用实施例1～3所提供的制备方法，制得D-二聚体免疫胶乳微球1～3；
(2)另一份采用现有D-二聚体免疫胶乳微球的制备方法，制得对照D-二聚体免疫胶乳微球；
对照D-二聚体免疫胶乳微球的制备方法步骤如下：
1)取1ml的表面带有羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒(颗粒直径240nm)用50mM的pH＝6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至10ml，终浓度为1％w/v。
2)再加入0.5％w/v的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.5％w/v的硫代N羟基琥珀酰胺进行活化胶乳，37℃水浴1小时。
3)离心，去上清液(含残留活化交联剂)，用2-吗啉乙磺酸缓冲液清洗一遍，再加入50mg的DD单克隆抗体进行交联反应，37℃水浴4小时，即得。
(3)对D-二聚体免疫胶乳微球1～3和对照D-二聚体免疫胶乳微球分别离心分离，以收集上清中未偶联的抗体，然后再对上述微球分别加入封闭液，封闭胶乳表面残留活化位点。
针对上述免疫乳胶微球的检测试验如下：
1、通过在封闭前离心分离未偶联的抗体，采用BCA蛋白浓度测定法得到未偶联抗体的质量，即可求出偶联效率，得到实施例1～3的制备方法偶联效率分别为95、86、90％，而现有制备方法的偶联效率为75％。
2、通过酶联免疫吸附法检测上述已封闭的免疫胶乳微球的抗体效价，计算得出D-二聚体免疫胶乳微球1～3的活性分别为1:640、1:610、1:600，对照D-二聚体免疫胶乳微球的活性为1:40。
上述试验证明本发明方法既保证了抗体的偶联效率，同时极大程度的降低了活化剂对抗体活性的破坏。
二、试剂盒在生化分析仪上的应用
1、将实施例4中的D-二聚体校准品配置成5个浓度梯度和一个空白对照，采用透射比浊蛋白分析仪进行检测，检测步骤为：将15ul的各校准品分别加入到装有150ul的D-二聚体检测试剂R1试剂和搅拌子的比色杯中，将比色杯放入检测口，仪器自动检测到比色杯，再加入150ul D-二聚体检测试剂R2试剂加入到比色杯中，仪器自动搅拌混匀10s，测定吸光度OD1，反应1min后，测定吸光度OD2，仪器自动计算吸光度的差值：ΔOD＝OD2-OD1。每个浓度检测5次，测得的各浓度校准品的ΔOD的平均值作纵坐标，相应的浓度作横坐标，制作浓度-吸光度差值校准曲线，通过excel计算得到曲线方程为Y＝0.1646X-0.0034。
2、然后放入待测品1人的血浆，测定得到其吸光度差值ΔOD，然后根据上述浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到待测品1中D-二聚体的浓度。
3、同一份人血待测品1稀释10倍，然后采用实施例4的试剂盒进行检测，测定得到其吸光度差值，然后根据上述浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到人血待测品1稀释100倍后，其中D-二聚体的浓度。
重复上述人血待测品1检测5次，所得的结果见下表1
表1人血待测品中CRP浓度检测重复试验
测定的数值偏小，是会导致CV值偏大.
4、同一份人血待测品1再采用实施例5～7的试剂盒进行检测，测定得到其吸光度差值，然后根据各个试剂盒的浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到待测品1中D-二聚体的浓度，重复5次取平均值，并计算Cv％，所得的结果见下表2。
表2不同试剂盒针对同一人血待测品检测试验
| 试剂盒实施例编号 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 |
| 人血待测品中DD浓度 | 0.78mg/L | 0.82mg/L | 0.93mg/L | 0.71mg/L |
| Cv％ | 4.33％ | 4.79％ | 4.52％ | 4.98％ |
上述试验表明，本发明的试剂盒最低检测低限可达0.01mg/L，灵敏度高、定量准确、重复性好、性质稳定。
Claims (10)
1.一种D-二聚体免疫胶乳微球制备方法，步骤如下：
1)准备粒径范围200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4～0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；
2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005～0.02mg/mL之间，得到FDP单抗溶液，储存于2～8℃备用；
5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后2～8℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球。
2.根据权利要求1所述的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法，其特征在于：所述步骤3)中震荡活化条件为：4℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min。
3.根据权利要求1或2所述的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法，其特征在于：所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时，4℃震荡16h，震荡速度为50r/min。
4.一种胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：包括D-二聚体检测试剂R1和D-二聚体检测试剂R2；
所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.01～13％稳定剂1、10～200mM的缓冲液1、1～6％的促凝剂1、0.02～0.1％的防腐剂1；
所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为：0.01～23％稳定剂2、1～5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、10～200mM的缓冲液2、0.02～0.1％的防腐剂2、0.05～5％的赋形剂2；
所述D-二聚体检测试剂R2的制备方法为：
1)准备粒径范围200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4～0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；
2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液，
3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005～0.02mg/mL之间，得到FDP单抗溶液，储存于2～8℃备用；
5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后2～8℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球；
6)向D-二聚体免疫胶乳微球中加入含有稳定剂2和缓冲液2的封闭液，震荡得到胶乳溶液；
7)胶乳溶液离心，去上清液，以除去其中残留的活化剂，然后加入防腐剂2至贮存浓度，超声分散，即得。
5.根据权利要求4所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：
所述稳定剂1选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述缓冲液1选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述促凝剂1选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖中的一种；
所述防腐剂1选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述稳定剂2选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述缓冲液2选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述防腐剂2选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述赋形剂2选自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种。
6.根据权利要求4所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：
所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、pH7.4的100～200mM Tris、0.02～2％的PEG、0.05％的NaN3；
所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、2～6％蔗糖、1～5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.05％的NaN3；
或所述D-二聚体检测试剂R1和所述D-二聚体检测试剂R2中0.05％的NaN3替换为0.1％的Proclin 300。
7.根据权利要求4～6任一项所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括D-二聚体校准品，其各组分及含量为：0.01～13％的校准品稳定剂、20mg/L的D-二聚体、10～200mM的校准品缓冲液、0.02～0.1％的校准品防腐剂、0.05～5％的校准品赋形剂。
8.根据权利要求7所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：
所述校准品稳定剂选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述校准品缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述校准品防腐剂选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述校准品赋形剂选自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种。
9.根据权利要求7所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：
所述D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.05％的NaN3；
或所述D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.1％的Proclin 300。
10.根据权利要求4所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：所述步骤6)中震荡条件为：25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min。
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Denomination of invention: Preparation method and application of D-dimer immuno latex microspheres Effective date of registration: 20191202 Granted publication date: 20180619 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN KING DIAGNOSTIC TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2019420000035 |
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Date of cancellation: 20211203 Granted publication date: 20180619 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN KING DIAGNOSTIC TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2019420000035 |
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Denomination of invention: Preparation and application of D-dimer immune latex microspheres Effective date of registration: 20211215 Granted publication date: 20180619 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN KING DIAGNOSTIC TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021420000140 |
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Date of cancellation: 20230106 Granted publication date: 20180619 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN KING DIAGNOSTIC TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021420000140 |
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Denomination of invention: Preparation and application of D-dimer immune latex microspheres Effective date of registration: 20230109 Granted publication date: 20180619 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN KING DIAGNOSTIC TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023420000011 |
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Granted publication date: 20180619 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN KING DIAGNOSTIC TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023420000011 |
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