CN104685359B - 胶乳凝集抑制免疫测定 - Google Patents

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Abstract

本发明的问题是提供一种能够避免导致没有应该在凝集抑制LTIA中发生的凝集的非特异反应的方法。本发明提供一种避免胶乳凝集抑制测试中的非特异反应的方法，所述通过在一种或多种选自由聚氧乙烯‑聚氧丙烯嵌段共聚物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯和多价季胺聚合物化合物组成的组中的化合物存在下进行胶乳凝集抑制测定来进行。

Description

胶乳凝集抑制免疫测定
技术领域
本发明涉及在胶乳浊度免疫测定(latex turbidimetric immunoassay)中避免由血液样品中的某种组分引起的非特异反应的方法和在所述方法中使用的试剂(试药，reagent)。
背景技术
胶乳浊度免疫测定(下文也称为LTIA)是通过使用抗原或抗体被固定至其的胶乳粒子(抗原或抗体固定化胶乳粒子(antigen-or antibody-immobilized latex particle，固定抗原或抗体的胶乳粒子))来测量测试物质(被分析物(analyte))的方法，并且被广泛用于临床检查领域。通过LTIA测量作为被分析物的抗原(被分析物抗原)的方法大体上被分类为通过抗被分析物抗体固定化胶乳粒子和被分析物抗原之间的反应而形成夹心型免疫复合物，从而从与免疫复合物的形成相关的胶乳粒子的凝集水平来测量被分析物(抗原)的方法(下文也称为夹心LTIA)，和引起抗原固定化胶乳粒子和测试样品中的抗原(被分析物)彼此竞争以使免疫复合物的形成在所述胶乳粒子和抗体之间被抑制，从而从与免疫复合物的形成的抑制相关的胶乳粒子的凝集抑制水平来测量被分析物(抗原)的方法(下文也称为凝集抑制LTIA)。
在LTIA中，常见的是，即使被分析物不存在于测试样品如血清中，但由于测试样品中的某种组分所致，不应该发生的抗原或抗体固定化胶乳粒子的凝集确实发生了，相反，应该发生的凝集没有发生也是常见的。这被称为非特异反应并且已知引起多种测量误差。
用于避免非特异反应的一种已知方法是将多种物质加入到反应体系的技术。
专利文件1描述了这样的一种方法，其中将无机硼化合物与缓冲体系联合加入样品溶液，作为用于在夹心LTIA中用于去除非特异浊度(与非特异凝集同义)的方法。然而，该方法是去除使用抗体固定化胶乳粒子的测定中不应该发生的凝集发生的方法并且不是能够处理没有在凝集抑制LTIA中应该发生的凝集的方法。
在通过凝集抑制LTIA测量血液样品的情况下，由于血液样品中的某种组分的作用，即使该血液样品不含有被分析物，也仅在一些情况下获得比在通过使用不含有血液组分的缓冲溶液作为测试样品进行测量时获得的凝集程度更低的凝集程度。备选地，在一些情况下，凝集的程度(吸光度)在用缓冲溶液和用含有血液组分的缓冲溶液稀释用于测试样品中的被分析物的浓度校准的标准物质(下文也称为浓度校准用标准物质)的情况之间不一致和不相同。然而，如上所述，甚至在目前，尚未确立用于避免破坏在凝集抑制LTIA中应该发生的凝集的非特异反应的方法，并且需要开发新的方法。
引用列表
专利文献
专利文件1：日本未审公开的专利公开号64-044855
发明概述
技术问题
本发明的一个目的是提供一种能够避免破坏在凝集抑制LTIA中应该发生的凝集的非特异反应的方法。
解决问题的方案
作为深入研究以解决凝集抑制LTIA中的问题的结果，本发明的发明人已发现，通过向用于稀释浓度校准用标准物质的缓冲液中初始加入一种或多种用于避免非特异反应的化合物(避免非特异反应化合物)，所述化合物选自由聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(下文也称为POE-POP嵌段共聚物)、聚氧乙烯烷基醚(下文也称为POE烷基醚)、聚氧乙烯脂肪酸酯(下文也称为POE脂肪酸酯)和多价季胺聚合物化合物组成的组，可以降低通过对本身作为测试样品的缓冲液进行测量获得的凝集程度和通过对不含有被分析物的血液样品进行测量获得的凝集程度之间的差异，从而完成本发明。
本发明具有以下构成。
<1>一种避免胶乳凝集抑制测试(latex agglutination inhibition test)中的非特异反应的方法，所述方法包括在一种或多种选自由聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯和多价季胺聚合物化合物组成的组中的化合物存在下进行胶乳凝集抑制测定。
<2>根据<1>所述的方法，其中所述非特异反应是破坏当测试样品中不存在被分析物时应该发生的凝集的非特异反应。
<3>根据<1>或<2>所述的方法，其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物由式(I)表示：
HO(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)cH (I)
(其中a、b和c表示任意整数并且a+c被确定为表示具有4至200个单元的平均聚合度的环氧乙烷，而b被确定为表示具有5至100个单元的平均聚合度的环氧丙烷)。
<4>根据<1>或<2>所述的方法，其中所述聚氧乙烯烷基醚由式(II)表示：
R1O(C2H4O)nH (II)
(其中R1表示碳数为8至20的烷基基团(所述烷基基团可以是伯或仲烷基并且可以在所述烷基基团中具有一个或多个双键)并且n表示7至40的任意整数)。
<5>根据<1>或<2>所述的方法，其中所述聚氧乙烯脂肪酸酯由式(III)表示：
R2COO(C2H4O)nR3 (III)
(其中R2表示碳数为16至18的烷基基团(所述烷基基团可以具有一个或多个双键)并且n表示170至180的任意整数，而R3表示氢原子或R2COO基团)。
<6>根据<1>或<2>所述的方法，其中所述多价季胺聚合物化合物是聚凝胺(polybrene，(商)1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)(CAS号：CB1327317)。
<7>一种用于胶乳凝集抑制测试的试剂(reagent，试药)，其中一种或多种选自由聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯和多价季胺聚合物化合物组成的组中的化合物包含在以下(1)至(4)中的任意一种或多种中：
(1)浓度校准用标准物质(concentration calibration-standard substance),
(2)含有抗被分析物抗体的溶液,
(3)含有抗原化胶乳粒子(antigen-immobilized latex particle)的溶液，和
(4)用于溶解或稀释所述浓度校准用标准物质的溶液。
<8>根据<7>所述的试剂，其用于测量人血液样品中的替考拉宁(teicoplanin)。
<9>一种用于在胶乳凝集抑制测试中避免非特异反应的化学剂(agent，化学试剂)，所述化学剂包含一种或多种选自由聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯和多价季胺聚合物化合物组成的组中的化合物作为活性成分。
发明的有益效果
本发明提供一种避免破坏在凝集抑制LTIA中应该发生的凝集的非特异反应的方法。本发明使得能够通过凝集抑制LTIA精确地测量血液样品中的被分析物。
附图简述
[图1]图1示出了当浓度校准用标准物质通过不含有人血清组分的缓冲液稀释时的校准曲线(×)、当添加有被分析物的人血清通过不含有人血清组分的缓冲液稀释时的校准曲线(○)和当添加有被分析物的人血清通过没有添加被分析物的人血清稀释时的校准曲线(▲)。
[图2]图2是对含有本发明的避免非特异反应化合物的浓度校准用标准物质-稀释溶液的组成的研究结果的示意图。
[图3]图3示出了当浓度校准用标准物质通过本发明的浓度校准用标准物质-稀释溶液稀释时的校准曲线(×)和当添加有被分析物的人血清通过没有添加被分析物的人血清稀释时的校准曲线(▲)。
实施方案描述
(避免非特异反应化合物)
本发明的避免非特异反应化合物可以是一种或多种选自由以下各项组成的组中的化合物：POE-POP嵌段共聚物、POE烷基醚、POE脂肪酸酯和多价季胺聚合物化合物。
本发明的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(POE-POP嵌段共聚物)具有由以下式(I)表示的结构：
[化学式1]
HO(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)cH (I)
(其中a、b和c表示任意整数并且并且a+c被确定为表示具有4至200个单元的平均聚合度的环氧乙烷(下文也称为EO)，而b被确定为表示具有5至100个单元的平均聚合度的环氧丙烷(下文称为PO))。
含有在本发明中使用的POE-POP嵌段共聚物的商业产品的具体实例可以是归类到在通常以名称“Pluronic(注册商标)”销售的非离子型表面活性剂中的“F”的产品，或以名称“Epan(注册商标)”销售的非离子型表面活性剂。
POE-POP嵌段共聚物被描述为多种类型的成分指示的成分并且可以确认成分指示之间的同一性或相似性；然而，即便对于具有相同名称的商业产品，成分指示中的数值也可能不完全匹配。这是聚合物的特性并且本领域技术人员显然理解。
商业产品的更多具体实例连同可确认的成分指示(1)和(2)一起列出。
Pluronic F77：
(1)聚氧乙烯含量是70％，聚氧丙烯分子量为约2306
(2)EO数—PO数：(52×2)—35
Pluronic F87：
(1)聚氧乙烯含量是70％，聚氧丙烯分子量为约2644
(2)EO数—PO数：(62×2)—39
Pluronic F88：
(1)聚氧乙烯含量是80％，聚氧丙烯分子量为约2644
(2)EO数—PO数：(97×2)—39
Pluronic F68：
(1)聚氧乙烯含量是80％，聚氧丙烯分子量为约1967
(2)EO数—PO数：(75×2)—30
Epan 485：
(1)聚氧乙烯含量是85％，聚氧丙烯分子量为约1200
(2)EO数—PO数：(80×2)—21
Epan 680：
(1)聚氧乙烯含量是80％，聚氧丙烯分子量为约1750
(2)EO数—PO数：(84×2)—30
Epan 785：
(1)聚氧乙烯含量是85％，聚氧丙烯分子量为约2000
(2)EO数—PO数：(140×2)—34
Epan 750：
(1)聚氧乙烯含量是50％，聚氧丙烯分子量为约2000
(2)EO数—PO数：(23×2)—34
在这些产品中，Pluronic F88和Pluronic F68也在日本准药物成分标准2006(Japanese Standards of Quasi drug Ingredients 2006)中列出。
本发明的聚氧乙烯烷基醚(POE烷基醚)具有由以下式(II)表示的结构：
[化学式2]
R1O(C2H4O)nH (II)
(其中R1表示碳数为8至20碳数的烷基基团(所述烷基基团可以是伯烷基或仲烷基并且可以在所述烷基基团中具有一个或多个双键)并且n表示7至40的任意整数)。
含有在本发明中使用的POE烷基醚的商业产品的具体实例可以是归类到通常以名称“NIKKOL(注册商标)”销售的非离子型表面活性剂中的“BT”、“BC”或“BO”的产品。
商业产品的更具体实例将连同可确认的成分指示(3)和(4)一起列出。
NIKKOL BC40TX：
(3)聚氧乙烯十六烷基醚
(4)R1：碳数16，n：40
NIKKOL BO10TX：
(3)聚氧乙烯油烯基醚
(4)R1：碳数18，n：10
NIKKOL BT-7：
(3)聚氧乙烯烷基醚
(4)R1：碳数12至14(仲烷基)，n：7
NIKKOL BT-9：
(3)聚氧乙烯烷基醚
(4)R1：碳数12至14(仲烷基)，n：9。
本发明的聚氧乙烯脂肪酸酯(POE脂肪酸酯)具有由以下式(III)表示的结构：
R2COO(C2H4O)nR3 (III)
(其中R2表示碳数为16至18碳数的烷基基团(所述烷基基团可以具有双键)并且n表示170至180的任意整数，而R3表示氢原子或R2COO基团)。
含有在本发明中使用的POE脂肪酸酯的商业产品的具体实例可以是归类到通常以名称“Noigen(注册商标)”销售的非离子型表面活性剂中的“DS”的产品。
商业产品的更具体实例将连同可确认的成分指示(5)和(6)列出：
Noigen DS-601.
(5)聚氧乙烯二硬脂酸酯
(6)R1：碳数17，n：175
多价季胺聚合物化合物可以是聚凝胺(polybrene)(CAS号：CB1327317)。
在这些产品中，优选Pluronic F88、NIKKOL BT-7和NIKKOL BT-9。
本发明的避免非特异反应化合物可以通过加入到一种或多种用于进行凝集抑制LTIA的试剂中来使用，所述试剂如浓度校准用标准物质(所谓的校准剂(calibrator，校准物))、含有抗被分析物抗体的溶液、含有抗原固定化胶乳粒子的溶液和用于溶解或稀释浓度校准用标准物质的溶液。优选将所述避免非特异反应化合物加入到浓度校准用标准物质中。
依据当三种组分，即浓度校准用标准物质、抗被分析物抗体和抗原固定化胶乳粒子，共存于反应体系中时的浓度(反应体系中的终浓度)而言，所述避免非特异反应化合物的优选浓度是0.003至0.078％(v/v，同样适用于以下)，更优选为0.006至0.034％，并且特别优选为0.007至0.024％。
本发明的避免非特异反应化合物可以与通常用于LTIA的缓冲液、蛋白质、盐、防腐剂等混合并使用，其程度为本发明的效果不受影响并且可以保证作为制剂的性能。
(缓冲液)
缓冲液，例如，优选为在接近中性pH，优选pH 6.5至7.8，更优选pH6.8至7.5具有缓冲作用的缓冲液(磷酸盐缓冲液、Good's缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和通过组合多种缓冲液获得的通用缓冲液)。这些缓冲液中的缓冲剂的浓度优选为0.1mM至1M，更优选为1mM至800mM，并且特别优选为5mM至500mM。
从保证作为制剂的性能的角度，例如，如果抗原是如在之后描述的实施例中的替考拉宁，则在分子中具有胺结构的缓冲剂(例如，Tris)是不优选的，因为对替考拉宁的保存稳定性的不期望作用。不同于本发明的避免非特异反应化合物的组分可以在考虑到各个被分析物的特性下，通过实验等来选择。
(蛋白质)
蛋白可以包括，但不限于，牛血清白蛋白(BSA)和酪蛋白。这些蛋白质用于改善抗体或抗原固定化胶乳粒子的保存稳定性的目的，或用于从血液样品近似引入到反应体系中的蛋白质组分的浓度并使得反应环境均一的目的。
(盐)
盐可以包括，但不限于，氯化钠和氯化钾。
(防腐剂)
防腐剂可以包括，但不限于，抗微生物剂如氧氟沙星(ofloxacin)和叠氮化钠(sodium azide)。
(测定)
使用本发明的避免非特异反应化合物的凝集抑制LTIA的测定可以通过使用胶乳竞争方法实施，在所述方法中，抗原固定化胶乳粒子的凝集程度依赖于测试样品中被分析物的浓度而降低，并且被分析物可以通过光学或电化学地观察所产生的凝集的水平来测量。光学观察的方法可以是利用光学设备测量散射光强度、吸光度或透射光强度的方法。
(测试样品/被分析物)
待使用本发明的避免非特异反应化合物通过胶乳凝集抑制测定测量的测试样品是血液样品如血清和血浆。测试样品中的被分析物(检测对象)可以是小分子抗原如肽抗原和半抗原，和基于肽的抗生素如替考拉宁、阿贝卡星(arbekacin)和万古霉素(vancomycin)，合成的抗菌剂如氧氟沙星，以及来源于蛋白(egg white)和豆的变应原是优选用于竞争性免疫测定的被分析物。这些物质中，替考拉宁是优选的。
(抗体)
在本发明中使用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明的抗体可以是完全抗体分子或具有抗原-抗体反应活性的抗体的功能片段，并且可以是通过对常见动物(如小鼠、山羊和绵羊)进行免疫学操作获得的抗体或通过使用基因重组技术以及嵌合抗体获得的抗体。抗体的功能片段包括，例如，F(ab')2和Fab'，其是具有抗原-抗体反应活性的片段。这些抗体功能片段可以通过用蛋白水解酶(例如，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶)处理如上文所述获得的抗体来制备。这些抗体可以或可以不被固定至胶乳粒子。
(胶乳粒子(latex particle,乳胶颗粒))
在本发明中使用的胶乳粒子可以由聚苯乙烯、苯乙烯-苯乙烯磺酸酯共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚氯乙烯丙烯酸酯等制成。考虑到测试样品中被分析物的浓度或测量设备的检测灵敏度，适当地选择具有0.1μm至0.4μm的平均粒径的胶乳粒子。
(抗原固定化胶乳粒子)
在本发明中使用的抗原固定化胶乳粒子中，依据待被固定化的抗原的特性，可以适当地选择物理吸附(疏水键合)方法或化学结合方法作为用于固定化抗原的方法。在物理吸附(疏水键合)方法中，可以通过其中聚半抗原(polyhapten)被形成用于吸附的方法来固定化抗原，并且，在化学结合方法中，可以通过将结合官能团如马来酰亚胺基团引入到抗原中，或者如果抗原具有糖，通过利用糖使抗原结合至胶乳粒子表面的结合官能团来固定化抗原。
(凝集抑制LTIA试剂)
可以以(但不限于)以下典型使用的形式中的任意一种来提供含有本发明的避免非特异反应化合物的凝集抑制LTIA试剂。
(1)浓度校准用标准物质(有时称为校准剂等)
(2)含有针对被分析物的抗体的溶液(有时称为抗体溶液，第一试剂溶液等)
(3)抗原固定化胶乳粒子的溶液(有时称为胶乳试剂溶液，第二试剂溶液等)
(4)用于溶解或稀释浓度校准用标准物质的溶液(有时称为校准剂稀释溶液等)
这些形式中，如果本发明的避免非特异反应化合物包含在浓度校准用标准物质(1)中，所述试剂可以直接以溶液的形式提供，或可以在包含本发明避免非特异反应化合物之后借助于冷冻干燥等固化。所述试剂可以在不含本发明的避免非特异反应化合物的情况下提供，以便当使用时，所述物质可以通过含有本发明的避免非特异反应化合物的缓冲液等重构(reconstitute)或稀释。含有本发明的避免非特异反应化合物的缓冲液等可以以名称浓度校准用标准物质(校准剂)稀释溶液、样品稀释溶液等提供，并且对应于上述(4)的形式。
如果本发明的避免非特异反应化合物包含在含有针对被分析物的抗体的溶液(2)或抗原固定化胶乳粒子的溶液(3)中，则所述试剂可以作为含有本发明的避免非特异反应化合物的溶液提供。
注意，上述(1)至(4)项可以彼此独立地提供，或可以在试剂盒等的情况下集中地提供，只要(1)至(4)项在进行凝集抑制LTIA时连续使用。
实施例
<比较例1>在用不含有人血清组分的缓冲液和用不含有被分析物的人血清稀释浓度校准用标准物质的情况下的校准曲线之间的比较
1.试剂
(1)替考拉宁(由Sigma Aldrich生产)
(2)从没有施用替考拉宁的人获得的血清(汇集100个人的血清，下文称为基础血清)
(3)浓度校准用标准物质-稀释溶液(下文称为标准物质-稀释溶液)：通过使用容量瓶，将百分之五(5％)BSA-PBS(pH 7.2)、0.002％氧氟沙星、一个PBS片(DULBECCO's PBS片(-)(由DS Pharma Biomedical生产))、5g的BSA(Probumin(商标)Reagent Grade(k)(由MILLIPORE生产))和2mg的氧氟沙星用水稀释到100mL，以制备标准物质-稀释溶液。
当制备所述PBS片的100mL溶液时，获得以下组成：
800mg的NaCl，20mg的KCl，115mg的磷酸氢二钠(无水)，和磷酸二氢钾(无水)。
(4)抗替考拉宁抗体溶液(含有2.8mg/mL抗替考拉宁绵羊多克隆抗体和0.5％BSA，pH 7.0，下文称为抗体溶液)
(5)替考拉宁敏化胶乳试剂溶液(Teicoplanin-sensitized latex reagentsolution)(pH 7.2，下文称为胶乳试剂溶液)。
2.方法
将替考拉宁用标准物质-稀释溶液以0、5、10、25、50和100μg/mL稀释并用作校准剂。通过使用添加了110μg/mL替考拉宁的基础血清和没有添加替考拉宁的基础血清或标准物质-稀释溶液，来制备替考拉宁的十个系列稀释液(0，11，22，33，44，55，66，77，88，99和110μg/mL)，并分别用作模拟的样本溶液1或模拟的样本溶液2。在组合2.4μL的校准剂，模拟的样本溶液1，或模拟的样本溶液2与180μL的抗替考拉宁抗体溶液之后，将这些溶液在37℃混合5分钟。接着，混合60μL的胶乳试剂溶液并在1分钟后(吸光度I)、1分20秒后(吸光度II)、3分钟后(吸光度III)和3分20秒后(吸光度IV)在37℃测量在700nm处的吸光度。获得在[吸光度II和吸光度I的平均值]与[吸光度IV和吸光度III的平均值]之间的差值并将其定义为吸光度变化量(下文称为dabs)。
3.结果
结果示于图1中。通过用没有添加替考拉宁的基础血清稀释获得的模拟的样本溶液1(▲)表明，基础血清自身(替考拉宁浓度，0μg/mL)的dabs低于具有0μg/mL的替考拉宁浓度的校准剂(标准物质-稀释溶液自身)的dabs并且低于在11至110μg/mL浓度范围内的校准剂(×)和模拟的样本溶液2(○)二者的dabs，并且因此，怀疑存在由于某种血清组分导致的非特异反应。
<实施例1>用于筛选避免非特异反应化合物的研究
1.试剂
(1)从没有施用替考拉宁的人获得的血清(基础血清)
(2)抗替考拉宁抗体溶液(抗体溶液)
(3)替考拉宁-敏化胶乳试剂溶液(胶乳试剂溶液)
对于上述(1)至(3)项，使用与比较例1相同的那些试剂。
(4)10％BSA-2×PBS(pH 7.0)
通过使用容量瓶，将一个PBS片和5g的BSA用水稀释到50mL，以制备10％BSA-2×PBS。
(5)用于筛选的化合物
所述化合物列于表1中。
(a)Blocking N101和N102(二者均由NOF CORPORATION生产)。Blocking N101和N102是用于免疫学测量的阻断试剂，主要由合成的聚合物制成。
(b)Epan 750(POE-POP嵌段共聚物，由Dai-ichi Kogyo Seiyaku生产)
(1)聚氧乙烯含量是50％，聚氧丙烯分子量为约2000
(2)EO数—PO数：(23×2)—34
(c)Pluronic L34(POE-POP嵌段共聚物，由ADEKA生产)
(1)聚氧乙烯含量是40％，聚氧丙烯分子量为约870
(2)EO数—PO数：(7×2)—15
(d)Pluronic F68(POE-POP嵌段共聚物，由ADEKA生产)
(e)Noigen DS601(POE脂肪酸酯，由Dai-ichi Kogyo Seiyaku生产)
(f)NIKKOL BC40TX(POE烷基醚，由Nikko Chemicals生产)
(g)NIKKOL BO-10TX(POE烷基醚，由Nikko Chemicals生产)
(h)NIKKOL BT-7(POE烷基醚，由Nikko Chemicals生产)
(i)NIKKOL BT-9(POE烷基醚，由Nikko Chemicals生产)
(j)PEG6000(H(OCH2CH2)nOH，平均分子量：7300至9300，由Wako Pure ChemicalIndustries生产)
(k)甘露醇(由KISHIDA CHEMICAL生产)
(l)聚凝胺(polybrene)(由Sigma Aldrich生产)
(m)肝素钠(由Sigma Aldrich生产)
2.方法
将二点四(2.4)μL的基础血清或2.4μL的测试溶液1(通过以1:1的体积比将10％BSA-2×PBS与以表1中描述的终浓度的两倍浓度制备的用于筛选的化合物混合所获得的溶液)与180μL的抗体溶液组合，并在37℃混合5分钟。接着，混合60μL的胶乳试剂溶液并在1分钟后(吸光度I)、1分20秒后(吸光度II)、3分钟后(吸光度III)和3分20秒后(吸光度IV)在37℃测量在700nm处的吸光度。获得[吸光度II和吸光度I的平均值]与[吸光度IV和吸光度III的平均值]之间的差值并且将其定义为dabs。当从下式(A)获得负的差值时，确定所述化合物是有效的：
(基础血清的dabs)-(测试溶液1的dabs)...式(A)。
将通过加入纯水代替所述避免非特异反应化合物所获得的溶液用作对照。
3.结果
Pluronic F68、Noigen DS601、NIKKOL BC40TX、NIKKOL BO-10TX、NIKKOL BT-7和NIKKOL BT-9被确定为是有效的并被定义为避免非特异反应化合物。因为与基础血清的差值，Epan 750和聚凝胺也被定义为避免非特异反应化合物候选物。
[表1]
类型 终浓度 dabs 与血清的差值
血清 0.4788 0.0000
对照 0.5129 0.0341
Blocking N101 1/2 0.5068 0.0280
Blocking N102 1/2 0.5257 0.0469
Epan 750 5％ 0.4872 0.0084
Pluronic L34 5％ 0.5114 0.0326
Pluronic F68 5％ 0.4371 -0.0417
Noigen DS601 0.5％ 0.4430 -0.0358
NIKKOL BC40TX 5％ 0.3476 -0.1312
NIKKOL BO-10TX 5％ 0.4296 -0.0492
NIKKOL BT-7 5％ 0.4070 -0.0718
NIKKOL BT-9 5％ 0.4245 -0.0543
PEG6000 5％ 0.5441 0.0653
甘露醇 5％ 0.5088 0.0300
聚凝胺 5mg/mL 0.4989 0.0201
肝素 5mg/mL 0.5100 0.0312
注：在表1描述的终浓度中，“1/2”表示当商业产品的未稀释溶液被定义为1时的稀释程度(两倍稀释)。
<实施例2>避免非特异反应化合物(候选物)的有效浓度范围的研究-1
关于有效浓度范围，研究了从实施例1的结果减少的避免非特异反应化合物候选物。
1.试剂
(1)从没有施用替考拉宁的人获得的血清(基础血清)
(2)抗替考拉宁抗体溶液(抗体溶液)
(3)替考拉宁敏化胶乳试剂溶液(胶乳试剂溶液)
对于上述(1)至(3)项，使用与比较例1中相同的那些试剂。
(4)10％BSA-2×PBS(pH 7.0)
(5)避免非特异反应化合物(候选物)
所述化合物列在表2中。
(a)Epan 485(POE-POP嵌段共聚物，由Dai-ichi Kogyo Seiyaku生产)
(b)Pluronic F68
(c)Pluronic F88
(d)Noigen DS601
(e)NIKKOL BT-7
(f)NIKKOL BT-9
(g)聚凝胺(Polybrene)
2.方法
将二点四(2.4)μL的基础血清或2.4μL的测试溶液2(以1:1的比例将10％BSA-2×PBS与以在表2中描述的终浓度的两倍浓度制备的加合化合物混合而获得的溶液)与180μL的抗体溶液混合并在37℃混合5分钟。接着，将60μL的胶乳试剂溶液混合并在1分钟后(吸光度I)、1分20秒后(吸光度II)、3分钟后(吸光度III)和3分20秒后(吸光度IV)在37℃测量在700nm处的吸光度。获得[吸光度II和吸光度I的平均值]与[吸光度IV和吸光度III的平均值]之间的差值并将其定义为dabs。当从下式(B)获得95％到105％的比值时，确定所述化合物是有效的：
(基础血清的dabs)/(测试溶液2的dabs)…式(B)。
3.结果
Pluronic F68、Pluronic F88、Noigen DS601、NIKKOL BT-7、NIKKOL BT-9和聚凝胺被确定为是有效的。当终浓度增加时，认为Epan 485也是有效的。根据上述，这些化合物被确定为避免非特异反应化合物。
[表2]
注：空白表示未进行测试。
<实施例3>避免非特异反应化合物的浓度范围的研究-2
1.试剂
(1)从没有施用替考拉宁的人获得的血清(基础血清)
(2)抗替考拉宁抗体溶液(抗体溶液)
(3)替考拉宁敏化胶乳试剂溶液(胶乳试剂溶液)
对于上述(1)至(3)项，使用与比较例1和2相同的那些试剂。
(4)10％BSA-2×PBS(pH 7.0)
(5)避免非特异反应化合物
(a)Pluronic F88
(b)NIKKOL BT-9
2.方法
将二点四(2.4)μL的基础血清以及测试溶液3(通过以1:1的比例将10％BSA-2×PBS与以表3中描述的终浓度的两倍浓度制备的加合化合物混合所获得的溶液)与180μL的抗体溶液组合并在37℃混合5分钟。接着，混合60μL的胶乳试剂溶液并在1分钟后(吸光度I)、1分20秒后(吸光度II)、3分钟后(吸光度III)和3分20秒后(吸光度IV)在37℃测量在700nm处的吸光度。获得[吸光度II和吸光度I的平均值]与[吸光度IV和吸光度III的平均值]之间的差值并将其定义为dabs。
通过一元回归分析计算导致来自下式(C)的最小比值的浓度。
(基础血清的dabs)/(测试溶液3的dabs)…式(C).
3.结果
Pluronic F88在1.75％产生与基础血清的最小差异。NIKKOL BT-9在2.5％产生与基础血清的最小差异。
[表3]
<参考例1>缓冲组成的研究
1.试剂
(1)从没有施用替考拉宁的人获得的血清(基础血清)
(2)抗替考拉宁抗体溶液(抗体溶液)
(3)替考拉宁敏化胶乳试剂溶液(胶乳试剂溶液)
对于上述(1)至(3)项，使用与比较例1和2相同的那些试剂。
(4)避免非特异反应化合物
Pluronic F88
2.方法
制备以下六种测试溶液4。
BSA 0％，PB-
该溶液通过使用容量瓶称量并稀释1.75g的氯化钠、0.7g的Pluronic F88和2mg的氧氟沙星至100mL而获得。
BSA 5％，PB-
该溶液通过使用容量瓶称量并稀释1.75g的氯化钠、0.7g的Pluronic F88、5g的BSA和2mg的氧氟沙星至100mL而获得。
BSA 10％，PB-
该溶液通过使用容量瓶称量并稀释1.75g的氯化钠、0.7g的Pluronic F88、10g的BSA和2mg的氧氟沙星至100mL而获得。
BSA 0％，PB+
该溶液通过使用容量瓶称量并稀释一个PBS片、0.7g的Pluronic F88和2mg的氧氟沙星至100mL而获得。
BSA 5％，PB+
该溶液通过使用容量瓶称量并稀释一个PBS片、0.7g的Pluronic F88、5g的BSA和2mg的氧氟沙星至100mL而获得。
BSA 10％，PB+
该溶液通过使用容量瓶称量并稀释一个PBS片、0.7g的Pluronic F88、10g的BSA和2mg的氧氟沙星至100mL而获得。
将二点四(2.4)μL的基础血清以及所述六种测试溶液4与180μL的抗体溶液组合，并在37℃混合5分钟。接着，混合60μL的胶乳试剂溶液并在1分钟后(吸光度I)、1分20秒后(吸光度II)、3分钟后(吸光度III)和3分20秒后(吸光度IV)在37℃测量在700nm处的吸光度(吸光度I–IV)。获得[吸光度II和吸光度I的平均值]与[吸光度IV和吸光度III的平均值]之间的差值并将其定义为dabs。通过下式(D)计算比值以确认缓冲组成的影响：
(基础血清的dabs)-(测试溶液4的dabs)…式(D).
3.结果
结果显示于图2。证实PBS改善本发明的避免非特异反应化合物的作用。另一方面，BSA不影响避免非特异反应化合物的作用。
如上所述，从比较例1、实施例1至3和参考例1的结果，证实所述POE-POP嵌段共聚物、POE烷基醚、POE脂肪酸酯和多价季胺聚合物化合物使得能够避免导致没有凝集(其应在凝集抑制LTIA中发生)的非特异反应。
证实了本发明的避免非特异反应化合物具有非常规的特性，即添加到浓度校准用标准物质(校准剂)中允许所述化合物发挥其作用。
<实施例4>在用含有本发明的避免非特异反应化合物的缓冲液和用不含有被分析物的人血清稀释浓度校准用标准物质的情况下的校准曲线之间的比较
1.试剂
(1)替考拉宁(由Sigma Aldrich生产)
(2)从没有施用替考拉宁的人获得的血清(下文称为基础血清)
(3)浓度校准用标准物质-稀释溶液(下文称为标准物质-稀释溶液)：5％BSA-PBS(pH 7.2)，0.002％氧氟沙星，0.7％Pluronic F88
(4)抗替考拉宁抗体溶液(抗体溶液)
(5)替考拉宁敏化胶乳试剂溶液(胶乳试剂溶液)
2.方法
将替考拉宁用标准物质-稀释溶液以0、5、10、25、50和100μg/mL稀释并用作校准剂。通过使用以110μg/mL添加替考拉宁的基础血清和没有添加替考拉宁的基础血清制备替考拉宁的十个系列稀释液(0，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100μg/mL)，并用作模拟的样本溶液3。将二点四(2.4)μL的校准剂或模拟的样本溶液3与180μL的抗替考拉宁抗体溶液组合，并在37℃混合5分钟。接着，混合60μL的胶乳试剂溶液并在1分钟后(吸光度I)、1分20秒后(吸光度II)、3分钟后(吸光度III)和3分20秒后(吸光度IV)在37℃测量在700nm处的吸光度。获得[吸光度II和吸光度I的平均值]与[吸光度IV和吸光度III的平均值]之间的差值并将其定义为dabs。
3.结果
结果显示于图3。通过用没有添加替考拉宁的基础血清稀释获得的模拟的样本溶液3(▲)和校准剂(×)在0至110μg/mL的浓度范围内的所有替考拉宁浓度下就dabs而言是相同的。根据上述，确认了本发明的效果。
工业实用性
本发明提供能够避免导致没有凝集(其在凝集抑制LTIA中应发生)的非特异反应的方法。本发明使得能够通过凝集抑制LTIA精确测量血液样品中的被分析物。

Claims (2)

1.一种用于胶乳凝集抑制测定的试剂，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物包含在以下(1)中：
(1)浓度校准用标准物质，其使用不含有人血清组分的缓冲溶液稀释，
其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物由式(I)表示：
HO(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)cH (I)
其中a、b和c表示任意整数，并且a+c被确定为表示具有4至200个单元的平均聚合度的环氧乙烷，而b被确定为表示具有5至100个单元的平均聚合度的环氧丙烷。
2.根据权利要求1所述的试剂，其用于测量人血液样品中的替考拉宁。
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