CN106896227A - 一种髓过氧化物酶检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种髓过氧化物酶检测试剂盒，本试剂盒采用免疫比浊法检测血液中的髓过氧化物酶，属于临床体外检测试剂技术领域。本发明试剂盒包括试剂R1和试剂R2。通过将试剂R1与试剂R2中的缓冲液更换为pH 7.4的HEPES缓冲液，同时采用新的表面活性剂聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物，提高了试剂盒的稳定性，线性范围较好，试剂的准确度也较好，有利于在市场中进一步的推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种髓过氧化物酶免疫比浊法检测试剂盒。
背景技术
髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是一种重要的含铁溶酶体，存在于髓系细胞（主要是中性粒细胞和单核细胞）的嗜苯胺蓝颗粒中，是髓细胞的特异性标志，随着对MPO研究的深入，人们发现MPO基因多态性导致个体对一些疾病易感性的差异，与人类多种疾病的发生、发展密切相关，因此越来越受到国内外学者的重视。髓过氧化物酶是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一。MPO的合成是粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并贮存于嗜天青颗粒内，外界刺激可导致中性粒细胞聚集，释放髓过氧化物酶。在成熟的粒细胞中，MPO是含量最丰富的糖蛋白，约占外周血多形核中性粒细胞（PMNs）内总蛋白质含量的5%，血液中95%的MPO来源于PMNs。MPO以3种亚形存在于髓系细胞中，分别为MPOⅠ、Ⅱ、Ⅲ。3种亚型主要是重链有差异，轻链的差异较小，导致它们在相对分子质量及疏水性等方面不同，3种亚型在功能上的差异还不明确，有待进一步研究。
MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞的功能和活性状态。髓过氧化物酶是一种既与天然免疫防御有关，又与组织损伤有关的酶，它参与多种疾病的发生，如白血病、阿尔茨海默病、血管炎和动脉粥样硬化等。许多研究发现，MPO不仅能杀灭吞噬于细胞内的微生物，而且可释放到细胞外，破坏多种靶物质，如肿瘤细胞、血小板、NK细胞、原虫、毒素等，对机体产生和调节炎症反应等多方面发挥作用。研究发现MPO有促进动脉粥样硬化病变形成的作用，MPO通过产生自由基和多种反应性物质，促进斑块形成和不稳定性增加，加速动脉粥样硬化进展，进而引起多种并发症如急性冠脉综合征。急性冠脉综合征是由冠状动脉斑块破裂、血栓形成导致急性或亚急性心肌缺血的临床综合症。炎症反应伴随斑块形成是该综合症发生发展的主要病理机制。髓过氧化物酶在炎症发生时由中性粒细胞释放入血，因此定量测定血液中髓过氧化物酶含量可一定程度上反映机体炎症反应的状态与严重程度，用于辅助诊断急性冠脉综合症的发生与发展。
胶乳增强免疫比浊法，是从免疫凝集实验发展而来一种高灵敏度、可用于全自动生化分析仪的简便快速免疫分析方法，从而使待检测物质的分子量和含量上突破了原有免疫透射比浊法的局限性。以其高特异性、高灵敏度、线性范围宽泛和高度自动化被大量应用于临床检验中。
鉴于此，本发明提供一种用胶乳免疫比浊法检测髓过氧化物酶的试剂盒，优化其反应体系，使其操作简单、重复性好、稳定性好、可进行批量样本全自动化检测，从而消除上述背景技术中缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性好的用于检测髓过氧化物酶的试剂盒，该试剂盒采用胶乳免疫比浊法。该试剂盒与常规的试剂盒相比，稳定性和线性范围比常规的检测试剂盒要好有利于试剂在临床上的推广应用。
本发明的基本原理如下：采用羊抗人髓过氧化物酶抗体致敏的胶乳颗粒，与待测样品中髓过氧化物酶在液相中相遇，立即形成不溶性抗原-抗体复合物，并形成一定浊度。浊度高低反应样品中髓过氧化物酶的含量，通过与同样处理的校准品比较，即可计算出样品中髓过氧化物酶含量。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种髓过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1和试剂R2。试剂组成如下：试剂R1组成为50mmol/L pH 7.4的HEPES缓冲液、1% 聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物、2mmol/LEDTA-Na2、50mmol/L氯化钠、10mmol/L叠氮钠；试剂R2组成为50mmol/L pH 7.4的HEPES缓冲液、2mg/mL羊抗人髓过氧化物酶抗体、0.2%胶乳颗粒、1% 聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物、10mmol/L甘露醇、10mmol/L叠氮钠。
所述的一种髓过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于试剂R1缓冲液为25℃，pH为7.4的HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。
所述的一种髓过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于试剂R2缓冲液为25℃，pH为7.4的HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。
所述的一种髓过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，所述的表面活性剂为聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物。
所述的一种髓过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，所述的胶乳颗粒直径为150-250nm的聚苯乙烯。
所述的一种髓过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，使用全自动生化分析仪采用终点法进行测定，检测主波长为600nm。
所述的一种髓过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2在使用时的比例为R1：R2=3：1。
本发明的试剂盒在具有双试剂功能的全自动生化分析仪上进行，其具体使用方法如附图1所示。
加入生理盐水、样本或校准品9μl，再加入225μl 的R1试剂预孵育5min，之后再加入75μl的R2试剂，30s后读取吸光度A1，反应5min后读取吸光度A2，并计算ΔA。
本发明的有益效果：
1）采用新的缓冲体系，改善了试剂的稳定性；
2）采用新的表面活性剂聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物，增强了试剂的稳定性和抗干扰能力，而且不会对试剂的准确度产生影响；
3）试剂的准确度和稳定性良好，价格便宜，使用方便，有利于该试剂在市场中进一步的推广。
附图说明
图1为全自动生化分析仪操作说明；
图2为两种试剂的相关性曲线图；
图3为两种试剂效期稳定性曲线图；
图4为实施例1试剂与市场认可的髓过氧化物酶检测试剂对比检测结果；
图5为实施例1试剂线性相关验证实验检测结果；
图6为实施例1试剂稳定性验证实验检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
一种常规的髓过氧化物酶检测试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。
其中试剂R1组成为：
pH 7.4 HEPES缓冲液 50mmol/L
聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物 1%
EDTA-Na2 2mmol/L
氯化钠 50mmol/L
叠氮钠 10mmol/L
试剂R2组成为：
pH 7.4的HEPES缓冲液 50mmol/L
羊抗人髓过氧化物酶抗体 2mg/mL
胶乳颗粒 0.2%
聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物 1%
甘露醇 10mmol/L
叠氮钠 10mmol/L
本实施例所述试剂R1和试剂R2，配置时需先配制缓冲液，调到适当pH值后，再添加其它物质。本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用终点法进行测定，操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品9μl，再加入225μl 的R1试剂预孵育5min，之后再加入75μl的R2试剂，30s后读取吸光度A1，反应5min后读取吸光度A2，并计算ΔA。
ΔA＝A2- A1
髓过氧化物酶含量（ng/mL）＝（∆A测定÷∆A标准）×C标准。
测定：检测样本吸光度变化 ∆A标准：标准品吸光度变化
实施例2
准确度验证试验：将实施例1的髓过氧化物酶检测试剂作为实验组，市场上获得认可的一种准确度好、稳定性好的髓过氧化物酶检测试剂作为对照组进行检测，对20个临床血清样本进行检测，检测结果如图4所示。获得了两种试剂的相关性曲线（如图2所示），结果表明，两组试剂盒的相关系数为0.9980，说明两者相关性比较好。证明本发明试剂盒添加及更改的组分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。
实施例3
线性相关性验证试验：选取髓过氧化物酶含量为1200ng/mL的高值样本，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，浓度依次为1200ng/mL、960ng/mL、720ng/mL、480ng/mL、240ng/mL、0ng/mL。分别利用实施例1试剂及对照组试剂进行检测，每个浓度的样本分别测定三次，分别取平均值，检测结果如图5所示。
如上图所示，实施例1与对照组试剂检测结果相关系数均大于0.990，且实施例1试剂检测结果的相关系数略大于对照组试剂检测结果的相关系数，这表明本发明试剂具有更好的线性相关性。
实施例4
稳定性验证实验：在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测实施例1及对照组试剂的稳定性。每月1号分别用两组试剂测定同一混合血清样本，测定三次取平均值，检测数据如图6所示。
实验结果显示，实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而对照组试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存10个月后开始不稳定，如图3所示，说明本发明试剂更换缓冲液及表面活性剂后稳定性增强。
综上所述，本发明提供的髓过氧化物酶检测试剂盒，试剂R1与试剂R2中的缓冲液更换为pH 7.4的HEPES缓冲液，同时采用新的表面活性剂聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物，提高了试剂盒的稳定性，线性范围较好，试剂的准确度也较好。因此，本发明提供的髓过氧化物酶检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。
Claims (1)
1.一种髓过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1和试剂R2，试剂组成如下：
试剂R1组成为：50mmol/L pH为7.4的HEPES缓冲液、1% 聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物、2mmol/L EDTA-Na2、50mmol/L氯化钠、10mmol/L叠氮钠；试剂R2组成为：50mmol/L pH为7.4的HEPES缓冲液、2mg/mL羊抗人髓过氧化物酶抗体、0.2%胶乳颗粒、1% 聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物、10mmol/L甘露醇、10mmol/L叠氮钠。
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