CN103513021A - 含血液成分的试样的处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抑制对血液中存在的血细胞以外的细胞的损坏、并对红细胞和白细胞产生损坏的简便的处理方法。在一种实施方式中，涉及一种含有血液成分的试样的处理方法，包括混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A的液体，所述表面活性剂A为通式R1-O-（EO）n-R2（I）所表示的非离子性表面活性剂。在其他的方式中，涉及一种含血液成分的试样的处理方法，包括混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A和表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体，所述表面活性剂A为通式R1-O-（EO）n-R2（I）表示的非离子性表面活性剂，所述表面活性剂B对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性。

Description

含血液成分的试样的处理方法
技术领域
本公开涉及含血液的试样的处理方法、分离含血液的试样中的稀少细胞以及核酸的方法、CTC数测定方法、以及试剂盒。
背景技术
血液的细胞成分为红细胞、白细胞、血小板，但是血液中也稀少地存在除此以外的细胞。作为其中一个例子，可以举出血中循环肿瘤细胞/CTC（Circulating Tumor Cell）。认为癌的转移是由于癌细胞通过血管、淋巴管运送到体内的其他部位并增殖而引起的。并且，报告了血液中的CTC数与癌的转移的可能性以及预后是相关的，并且已知为了作为癌（尤其是乳癌等转移性癌）的诊断、预后诊断、以及治疗效果的预测或判定的指标，而测定血液中的CTC数的计数、CTC的核酸（Circulating Tumor cell；Evolving Evidence and Future Challenges.The oncologist2009；14；1070-1082）。
作为血液中的CTC的分离、检测技术，有如下方法：通过针对CTC特异性表面抗原的抗体来捕捉分离血液中的CTC的方法（特许3834326号、特开2007-178193）、利用了粘附的分离方法（WO2005/043121、WO2006/078994）、利用密度梯度的分离方法（特开2010―075073、WO95/20429）、利用过滤器的分离方法（WO2006/116327、WO2008/155398）、测定CTC的端粒酶活性的方法（WO2010/071114）、通过使用了低渗溶液的溶血的分离方法（WO2004/056978）、利用了流式细胞仪的方法（WO2008/057437）等。为了检测、定量、计数用上述分离的物质，进行PCR、利用了有亲和性的物质的核酸的测定，另外，进行组合了抗体、荧光染料的光学CTC的测定是一般的。
发明内容
发明要解决的问题
为了在含血液成分的试样中的稀少细胞活着的情况下分析，或者分离并培养，需要在不对所述稀少细胞产生大的损坏的情况下，高效地去除血液中的细胞成分（尤其是红细胞及白细胞）。
因此，本公开提供一种抑制对含血液成分的试样中的血细胞以外的细胞的损坏、并可迅速排除血细胞的简便的处理方法。另外，提供一种通过去除血细胞等来提高CTC的纯度从而可抑制CTC的计数、核酸测定时的噪声、并可进行CTC的检测的简便的处理方法、或者分离或检测方法。
用于解决问题的手段
本公开在一个方式中，涉及一种含血液成分的试样的处理方法，包括混合含血液成分的试样与含有表面活性剂A的液体，不使用固定剂，所述表面活性剂A为下述通式（I）表示的非离子性表面活性剂。
R1-O-（EO）n-R2   （I）
[所述式（I）中，R1为具有分支链的碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为23～50，R2为氢原子或碳数为1～3的烃基。]
本公开在又一方式中，涉及一种含血液成分的试样的处理方法，包括：混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A及表面活性剂B的液体、或含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体，所述表面活性剂A为下述通式（I）表示的非离子性表面活性剂，所述表面活性剂B对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性。
R1-O-（EO）n-R2   （I）
[所述式（I）中，R1为具有分支链的碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为23～50，R2为氢原子或碳数为1～3的烃基。]
本公开在又一方式中，涉及一种含血液成分的试样的处理方法，包括：混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A及表面活性剂B的液体、或含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体，所述表面活性剂A为聚氧乙烯辛基十二烷基醚（EO=23～50），所述表面活性剂B为对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性的非离子性表面活性剂，并且为从聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚（EO=8～22）、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它们的组合所组成的组中选择的非离子性表面活性剂。
本公开在又一方式中，涉及一种分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，包括：通过本公开涉及的处理方法处理含有血液成分的试样；以及从处理后的试样中分离或检测稀少细胞或核酸。
本公开在又一方式中，涉及一种测定含血液成分的试样中的CTC（循环肿瘤细胞）数或CTC的核酸的方法，包括：通过本公开涉及的处理方法来处理含有血液成分的试样；或者通过本公开涉及的分离或检测方法分离或检测血液成分中的稀少细胞或核酸。
本公开在又一方式中，涉及一种含血液成分的试样中的稀少细胞的分析方法，包括：在通过本公开涉及的处理方法处理含有血液成分的试样之后，通过包括细胞的动态观察或活性测定的方法进行分析。
本公开在又一方式中，涉及一种试剂盒，用于本公开涉及的处理方法、本公开涉及的分离或检测方法、本公开涉及的CTC数或CTC的核酸的测定方法、和/或本公开涉及的分析方法，所述试剂盒包含所述表面活性剂A和/或所述表面活性剂B。
发明效果
根据本公开，能够抑制对含有血液的试样中存在的血细胞以外的细胞的损坏，并溶解红细胞、对白细胞产生损坏。
附图说明
图1是示出表面活性剂No.2和表面活性剂No.1的混合物的混合比与癌细胞的生存率之间的关系的曲线图的一个例子；
图2是示出表面活性剂No.3和表面活性剂No.1的混合物的混合比与癌细胞的生存率之间的关系的曲线图的一个例子；
图3是对表面活性剂混合物的处理之后用离心分离回收的癌细胞进行培养的结果的显微镜观察照片的一个例子；
图4是显微镜观察对没有进行表面活性剂混合物的处理的（A）试样以及进行了表面活性剂混合物的处理的（B）试样进行过滤处理之后的试样的照片的一个例子；
图5是对含有经绿色荧光染色的癌细胞（SNU-1）和经蓝色荧光染色的白细胞的含癌细胞的血液试样进行了表面活性剂混合物的处理之后的荧光显微镜观察的结果的一个例子；
图6是对含有癌细胞（SNU-1）悬浮液或白细胞的含血液成分的试样进行了表面活性剂混合物的处理之后（A）的试样以及未进行表面活性剂混合物的处理（B）的试样进行库尔特式的流式细胞仪分析的结果的一个例子；
图7是对含有癌细胞（SNU-1）和白细胞的含有血液成分的试样进行了表面活性剂混合物的处理之后（A）的试样以及未进行表面活性剂混合物的处理（B）的试样用库尔特式的流式细胞仪分析后的结果的一个例子；
图8是示出对悬浮在生理盐水中的含癌细胞（SNU-1）或含有白细胞的含血液成分的试样用各种pH的表面活性剂混合物进行处理之后的生存率的曲线图的一个例子。
具体实施方式
预计今后循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell：CTC）等血液中的稀少细胞的分析会更加盛行，并需求更简便、损耗少的方法。10ml的血液中通常含有数百亿个红细胞、数千万个白细胞，CTC为0～数千个左右。因此，直接分析CTC时的技术问题很多，例如需要分离、浓缩等处理。因此，期待开发从血液中更高效和/或简便地浓缩分离CTC的技术。
利用了抗原抗体反应的分离方法中，存在使用附加了抗体的磁性颗粒和磁场来从血液中浓缩细胞的方法（特许3834326号、特开2007-178193）。但是，血液中密集存在阻碍抗体与目标细胞接触的血细胞，需要反应时间、细胞的回收时间。而且在血细胞的存在下，反应体积变大，每体积的试剂量也增加，因此花费成本。另外，在使用颗粒浓缩时，由于大量裹入血细胞因此纯度变低导致假阳性。并且在反复进行去除血细胞的洗浄时，有可能损失目标细胞。
利用粘附的分离方法（WO2005/043121、WO2006/078994）在血液存在下，血细胞、血小板堆积在一般的细胞培养用的培养皿或载体的底面上，因此，癌细胞不能与培养皿粘附不能分离癌细胞。因此，有将抗体等亲和性高的物质固定在培养皿或载体上来使细胞粘附的方法，但是这也同样需要细胞和具有亲和性的物质在底面接触，血细胞成了阻碍。因此，为了增加接触次数需要在载体侧的结构上下工夫并需要搅拌，结构上下的工夫、搅拌方法等增加了复杂性。
离心分离法中，血液中离心后从下面开始按红细胞层、白细胞层的顺序形成细胞层。很多癌细胞由于具有与白细胞密度和尺寸近似的密度和尺寸，因此多数白细胞混入癌细胞中，离心分离的纯度受到影响，导致假阳性。另外，由于各层非常接近，因此混入大量红细胞得不到高回收率和纯度。
通过密度梯度离心法进行的分离（特开2010-075073、WO95/20429）作为从血液中回收细胞的方法被通用。但是，利用了细胞密度的分离中，由于癌细胞和白细胞的单核细胞的大小和密度接近，因此单核细胞大量混入，导致假阳性。密度分离离心法过程繁杂，例如分离后必须在不扰乱液面的情况下回收细胞的层，以使分离后各层不混乱。
使用了过滤器的分离（WO2006/116327、WO2008/155398）是使用了稀少细胞的大小之差和血细胞的变形能力的分离，用于分离血细胞和癌细胞。大多数红细胞、白细胞通过过滤器，但是部分红细胞、白细胞残留在膜片上。另外，如果使用孔大小小于8μm的膜片的孔，则容易产生堵塞，相反为了提高血细胞通过过滤器的效率而增加滤过时的压力时，流速变大稀少细胞受到损坏，或者稀少细胞通过孔，从而回收率也下降。
血液1μL中存在数百万个红细胞、数千～1万个左右的白细胞，因此流式细胞仪一般不能直接计数。因此，需要添加去除红细胞的溶血剂，并且测定时为了检测各细胞而需要稀释。稀释10mL的血液，从数百亿个红细胞、数亿～数千个白细胞中对各细胞进行计数，分离癌细胞并对其进行计数是非常难的。至于电阻式，由于存在与癌细胞同等程度大小的白细胞，因此分离后混入大量白细胞，导致假阳性。
如此，对于检测、分离稀少细胞来说，现有的分离浓缩技术可以说由于血细胞的残留，在必要的灵敏度、效率和特异性方面不足。如果能进行试样中的血细胞的处理（分离、去除、排除等），则在使用了抗原抗体反应的分离中，能够在溶解后离心，在重新悬浊的少量体积的溶液中反应，由此缩短试剂成本和反应时间。另外，在利用了粘附的分离中，也能够使用培养用的培养皿，进行培养和粘附分离。另外，在使用了离心分离、密度梯度离心法的分离中，稀少细胞的回收变得容易。另外，在使用了过滤器的情况下，能够使分析容易。即，通过处理含有血液的试样中的血细胞，能够减少稀少细胞的计数和定量中的误差因素（假阳性），迅速进行测定。
另外，如果能够在含有血液的试样中的稀少细胞存活的情况下进行分析，或者分离培养，则能够更详细地分析、解析稀少细胞。另外，一般，在血细胞去除中用作溶血试剂的非离子表面活性剂的皂苷或Triton会破坏细胞，也会对癌细胞等稀少细胞产生损坏甚至致死，并且细胞被破坏。因此，一般在使用表面活性剂解析目标细胞的情况下，如WO2010/071114中所述，预先用甲醛、多聚甲醛之类的交联试剂（固定试剂）固定含有血液的试样中的稀少细胞之后再与溶血试剂反应。前述那样的甲醛、多聚甲醛之类的交联试剂通常经由游离的氨基形成分子间交联，由此来维持细胞膜、细胞结构。但是，虽然能够期待维持细胞的结构，但是通过该固定化操作而产生的稀少细胞的分离培养、观察、活性测定、药效评价等进一步的解析是困难的。
另外，WO2010/071114中记载的表面活性剂的浓度下不能直接溶解血液，会对癌细胞产生损坏。另外，很多白细胞也生存着。
在使用溶血试剂的情况下一般同时使用的固定剂即甲醛、多聚甲醛是剧毒物，因此有可能会对使用者的健康产生影响。虽存在WO2010/071114、WO2004/056978中记载的那样的通过氯化铵盐或低渗溶液去除血细胞的方法，但是这些方法由于反应条件中需要较大的稀释倍率，因此存在反应槽变大的问题。另外，由于没有表面活性剂等那样的溶解力，因此容易得到细胞片等凝集物。
本公开基于以下知识：在一个或多个实施方式中，通过使用对红细胞的溶解性和对细胞的损坏低的表面活性剂A，溶解红细胞并且能够抑制对血液中存在的稀少细胞的损坏。另外，本公开基于以下知识：在一个或多个实施方式中，当组合对红细胞的溶解性和对细胞的损坏高的表面活性剂B、以及对红细胞的溶解性和对细胞的损坏低的表面活性剂A来处理血液试样时，能够溶解红细胞并对白细胞产生损坏并且能够抑制对血液中存在的稀少细胞的损坏。另外，这些处理具有能够低成本进行的优点。
通过表面活性剂A抑制对血液中的稀少细胞的损坏并能够排除血细胞的详细机理并不清楚，但是可以如下考虑。从细胞的观点来看，细胞的骨格、膜的差异是重要因素。在体内循环的血细胞由于通过毛细血管等细胞的骨格容易变形，另外，细胞膜的磷脂双层的流动性大，磷脂的各疏水部之间的相互作用弱。因此当受到表面活性剂的作用时容易破坏。另一方面考虑稀少细胞与细胞角蛋白等特征性细丝状结构遍布细胞内并结合在细胞膜等上，另外，与血细胞相比脂质双层的流动性也小并且难以被破坏。另外，考虑从表面活性剂的观点看，表面活性剂与细胞膜上的蛋白质、胆固醇、磷脂相互作用，溶解细胞。表面活性剂A优选与磷脂的疏水基的结构接近，带有分支链的分子结构，另外，以疏水基和亲水基、例如烷基和环氧乙烷的附加数的平衡，来控制由于溶解力和亲水基对立体抑制的影响，由此在不破坏稀少细胞的情况下溶解血细胞。但是，本公开也可以不限定于这些机理地进行解释。
通过表面活性剂A和B的组合来抑制对血液中的稀少细胞的损坏并能够排除血细胞的详细机理并不清楚，但是可以如下考虑。通过在表面活性剂A中组合对血细胞溶解性高的表面活性剂B，表面活性剂A和B形成混合胶束，该混合胶束以一定比例在不干扰表面活性剂A对血细胞的选择性的情况下与血细胞选择性作用，通过表面活性剂B高的溶解性来迅速溶解接触的血细胞。即，考虑能够快速排除血细胞，由此进一步抑制对癌细胞的损坏。但是，本公开也可以不限定于这些机理地进行解释。
根据本公开的处理方法，能够抑制对含有血液的试样中的血细胞以外的细胞的损坏并简便地排除血细胞。因此，在一个或多个实施方式中，通过进行本公开的处理方法，例如，能够简便地进行血液中的稀少细胞、特别是CTC（循环肿瘤细胞）的分离、浓缩、测定、和/或培养、分析。另外，例如即使在进行CTC的染色、标记的情况下白细胞被染色，通过本公开的处理方法进行处理之后，白细胞也成了死细胞，或者由于受到损坏染色物等漏出到外面，降低了来自白细胞的信号（噪声）。因此，即使是使用了蓄积在细胞内的荧光物质、或利用代谢转变成荧光物质的物质、例如使用CellTracker（Green CMFDA/C7025invitrogen）的非特异性的染色方法，在一个或多个实施方式中，通过进行本公开的处理方法，也能够抑制CTC的检测、测定、观察等的假阳性。
[含血液成分的试样]
在本说明书中，“含有血液成分的试样”也可称为“含血液成分的试样”，是可应用本公开的处理方法的试样，可以举出血液、含有红细胞成分的血液来源物、血液或血液来源物混合存在的体液、以及由它们制备的试样等。“体液”在一个或多个实施方式中，可包括血液、淋巴液、腹水、胸膜液、髄液、唾液、尿、以及母乳。作为血液，可以举出从生物体采集的血液，作为所述生物体，可举出人或人以外的动物（例如，哺乳类）。作为含有红细胞成分的血液来源物，可以举出从血液分离或制备并含有红细胞成分的物质或者它们的稀释/浓缩物，例如含有去除了血浆的血细胞组分、血细胞浓缩物、血液或血细胞的冻干物、对全血进行了溶血处理的溶血试样、离心分离血液、自然沉降血液、洗浄血细胞、特定的组分等。它们当中，在不限定的一个或多个实施方式中，从简便且迅速的处理的观点以及抑制对血液中的稀少细胞的损坏的观点来说，优选血液或含有血细胞成分的源自血液的血细胞作为含有所述血液的试样。
在本说明书中，“血液中的稀少细胞”或“含有血液成分的试样中的稀少细胞”是指人或人以外的动物的血液中可含有的细胞成分（红细胞、白细胞、以及血小板）以外的细胞，包括肿瘤细胞和/或癌细胞。一般将血液中循环的肿瘤细胞或癌细胞称为CTC。作为血液中的稀少细胞数，一般在血液10ml中含有0～数千个。“血液中的稀少细胞”或“含有血液成分的试样中的稀少细胞”在一个或多个实施方式中，是指选自癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胎儿细胞、以及它们的组合所组成的组的细胞。另外，在本说明书中，作为分离或检测对象的“核酸”在一个或多个实施方式中，是选自血液成分中的RNA和DNA、癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮前驱细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、叶间干细胞、胎儿细胞的RNA和DNA、以及它们的组合所组成的组的核酸。
在本说明书中，“血细胞的排除”是指红细胞的溶血、和/或、白细胞的生长抑制。红细胞的溶解和白细胞的生长抑制例如能够用实施例的方法来确认。此外，在本说明书中，“白细胞的生长抑制”可包括白细胞的消灭（降低生存率）、溶解、和/或白细胞的增殖抑制。在一个或多个实施方式中，在含有血液的试样中，红细胞的溶血能够通过测定浊度的变化来观察。在一个或多个实施方式中，值会根据测定池的大小或多或少发生变化，但是也可以将值从初始浊度起达到1/2以下作为溶血的基准。具体地，将含有血液的试样30μl与试剂30μl混合，能够使用微孔板检测仪通过测定确认。例如，对于在所述条件下混合了血液和PBS或蒸馏水的溶液而言，以波长650nm的吸光度值计，初始浊度为2～1.5，溶血发生包括0.8以下、0.6以下或0.5以下。另外，在一个或多个实施方式中，在含有血液的试样中，白细胞的生长抑制包括将白细胞的生存率设定为50%以下、不足50%、40%以下、不足40%、或30%以下。
含有所述表面活性剂A的液体优选具有下述（1）的血细胞去除效果。
（1）用蒸馏水稀释规定量的血液，以使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光用吸光光度法测定的吸光度值为1以上且小于2，由此制备基准样品，
替代所述基准样品中的蒸馏水，使用含有2.5～5w/v%的所述表面活性剂A的液体来制备被检样品，
使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为1小时以内。
此外，对于含有所述表面活性剂A的液体而言，关于上述（1）的血细胞去除效果，使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间优选为60分钟以内，更优选40分钟以内，进一步优选30分钟以内。
含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体、或者、含有表面活性剂A的液体和表面活性剂B的液体或者这两种液体的混合物优选具有下述（2）的血细胞去除效果。
（2）用蒸馏水稀释规定量的血液，以使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光用吸光光度法测定的吸光度值为1以上且小于2，由此制备基准样品，
替代所述基准样品中的蒸馏水，使用含有2.5～5w/v%的所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体来制备被检样品，
使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定了的所述被检样品的吸光度值为所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为0.5小时以内。
此外，对于含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液、含有表面活性剂A的液体和含有表面活性剂B的液体或者这两种液体的混合物而言，关于上述（2）的血细胞去除效果，使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定了的所述被检样品的吸光度值变为所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间优选在30分钟以内，更优选在20分钟以内，进一步优选为15分钟以内。
此外，关于用于评价所述血细胞去除效果的所述被检样品，含有所述表面活性剂A的液体中的所述表面活性剂A的浓度例如为0.001w/v%～10w/v%。另外，含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液中的、所述表面活性剂A和所述表面活性剂B的总浓度例如为0.001w/v%～10w/v%。
在本说明书中，由n个要素组成的组的“它们的组合”可以包括所述群中2～n个要素的组合。
[表面活性剂A]
本公开的处理方法中使用的表面活性剂A为下述式（I）表示的非离子性表面活性剂。表面活性剂A单独、或者通过与对红细胞的溶解性更高的表面活性剂B组合，能够在维持对红细胞和白细胞的损坏的同时，抑制由表面活性剂B对血液中的稀少细胞的损坏。从缩短处理时间、进一步抑制对稀少细胞的损坏的观点来看，优选组合表面活性剂A和对红细胞溶解性更高的表面活性剂B（后述）。
R1-O-（EO）n-R2   （I）
[所述式（I）中，R1为具有分支链的碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为23～50，R2为氢原子或碳数为1～3的烃基。]
所述式（I）的R1从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为具有分支链的碳数为12～40的烃基，优选的是具有分支链的碳数为12～30的烷基。在一个或多个实施方式中，所述烃基和烷基的碳数从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选12～28，更优选的是14～26、进一步优选的是16～24、更进一步优选的是18～22、更进一步优选的是20。作为所述式（I）的R1的优选的实施方式，有异己基、异壬基、异癸基、异十二烷基、异十六烷基、己基癸基、己基十二烷基、己基十六烷基、辛基癸基、辛基十二烷基、辛基十六烷基、壬基癸基、壬基十二烷基、壬基十六烷基，从同样的观点来看，优选辛基十二烷基。所述式（I）的R2为氢原子或碳数为1～3的烃基，在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为氢原子或碳数为1～3的烷基，所述烷基在一个或多个实施方式中，为甲基、乙基、丙基或异丙基。从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，更优选下述式（II）作为所述式（I）。
Figure BDA00003381346200111
式（I）和（II）中的EO的平均附加摩尔数n在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为23～50，优选24以上，更优选25以上。另外，作为n的上限，从同样的观点来看，优选45以下，更优选40以下，进一步优选30以下，更为优选的是28以下。
所述表面活性剂A从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，在一个或多个实施方式中，为下述化学式（1）表示的非离子性表面活性剂。
Figure BDA00003381346200121
在一个或多个实施方式中，本公开的处理方法中使用的表面活性剂A的形态为含有表面活性剂A的液体，或者含有表面活性剂A和B的液体。含有表面活性剂A的液体，或者含有表面活性剂A和B的液体在一个或多个实施方式中，为含有表面活性剂A的水溶液、或者含有表面活性剂A和B的水溶液。水可使用蒸馏水、离子交换水或者超纯水等。所述水溶液在一个或多个实施方式中，也可以选择不抑制稀少细胞的生存率的缓冲液和/或pH。
[表面活性剂B]
本公开的处理方法中使用的表面活性剂B为溶解红细胞的能力比所述表面活性剂A溶解红细胞的能力高的非离子性表面活性剂。本说明书中，“红细胞的溶解”是指在与含有红细胞的试样混合的情况下产生溶血的现象，例如在以相同浓度和/或混合比处理的情况下到溶血为止的时间越短，可以判断为溶解红细胞的能力就越高。溶血是指，红细胞的细胞膜由于物理或化学、生物学等各种因素而损伤或溶解，血红蛋白等漏出至细胞外、红细胞死亡的现象。本公开的处理方法中使用的表面活性剂B在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选对白细胞的生长抑制的能力高于所述表面活性剂A对白细胞的生长抑制的能力。
表面活性剂B从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为非离子性表面活性剂，在一个或多个实施方式中，可以举出从聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚、聚氧乙烯烷基醚（EO=8～22）、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯以及它们的组合组成的组中选择的非离子性表面活性剂。
聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚型的表面活性剂B在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选下述式（III）表示的非离子性表面活性剂。
R3-O-（AO）m/（EO）n-R4   （III）
[所述式（III）中，R3为碳数为1～24的烷基，R4为氢原子或碳数为1～3的烷基，AO表示碳数为3～6的氧化烯基，EO表示氧乙烯基，m和n分别表示AO和EO的平均附加摩尔数。M为1～100的数，n为0～50的数，"/"表示AO基和EO基也能够不论顺序地、以随机或嵌段中的任一种方式附加。]
所述式（III）的R3在一个或多个实施方式中，可举出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基（月桂基）、十三烷基、十四烷基（肉豆蔻基）、十五烷基、十六烷基（鲸蜡基）、十七烷基、十八烷基（硬脂基）、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基（山嵛）、二十三烷基、二十四烷基等。所述式（III）的R4为氢原子或碳数为1～3的烃基，在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为氢原子或碳数为1～3的烷基，所述烷基在一个或多个实施方式中，为甲基、乙基、丙基或异丙基。所述式（III）中，作为AO，在一个或多个实施方式中，可举出聚氧乙烯聚氧丙烯、聚氧丁烯等。所述式（III）中，在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，m优选为1～60，更优选1～30。同样地，n优选1～50，更优选1～25。
所述式（III）的表面活性剂B在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚。在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，所述聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚的HLB值（亲水性-亲油平衡值）优选为10.0～18.0，更优选为12.0～15.0，进一步优选12.5～13.5。另外，从同样的观点来看，所述聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚的浊点（℃/2%水溶液）优选为34℃～88℃，更优选为40℃～75℃，进一步优选为50℃～60℃。
所述式（III）的表面活性剂B在一个或多个实施方式中，作为市售品，可举出作为EMALEX DAPE-207、EMALEX DAPE-210、EMALEXDAPE-212、EMALEX DAPE-215、EMALEX DAPE-220、EMALEXDAPE-230（以上，日本Emulsion公司制公司制）、Plurafac LF300、Plurafac LF400、Plurafac LF431、Plurafac LF711、PlurafacLF900、PlurafacLF901、Plurafac LF1300〔BASF Japan（株）制〕以及EMULGENLS-106、EMULGENLS-110、EMULGENLS114、EMULGENMS110〔花王（株）制〕；Wonder Surf RL-80、Wonder Surf RL-100、Wonder Surf RL-140、Wonder Surf S-800、Wonder Surf S-1000、Wonder Surf S-1400（以上，青木油脂公司制）、UNISAFE PKA-5015、UNISAFE PKA-5016、UNISAFEPKA-5017、UNISAFE LM-2（以上，日本油脂公司制）等。
聚氧乙烯烷基醚（EO=8～22）型的表面活性剂B在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选下述式（IV）表示的非离子性表面活性剂。
R5-O-（EO）n-R6   （IV）
[所述式（IV）中，R5表示碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为8～22，R6为氢原子或碳数为1～3的烃基。]
所述式（IV）的R5在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选具有分支链的碳数为12～40的烃基，更优选具有分支链的碳数为12～30的烷基。所述烃基和烷基的碳数在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选12～28，更优选14～26，进一步优选16～24，更进一步优选18～22，更进一步优选20。作为所述式（IV）的R5的优选的实施方式，可举出异己基、异壬基、异癸基、异十二烷基、异十六烷基、己基癸基、己基十二烷基、己基十六烷基、辛基癸基、辛基十二烷基、辛基十六烷基、壬基癸基、壬基十二烷基、壬基十六烷基，在一个或多个实施方式中，从同样的观点来看，优选辛基十二烷基。所述式（IV）的R6为氢原子或碳数为1～3的烃基，在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为氢原子或碳数为1～3的烷基，所述烷基在一个或多个实施方式中，为甲基、乙基、丙基或异丙基。从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，更优选下述式（V）作为所述式（IV）。
式（IV）和（V）中的EO的平均附加摩尔数n在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选10～22，更优选的是13～22，进一步优选的是15～21、更进一步优选的是18～21、更进一步优选的是20。
聚氧乙烯脂肪酸酯型的表面活性剂B在一个或多个实施方式中，为下述式（VI）表示的非离子性表面活性剂。
R7-COO-（EO）n-R8   （VI）
[所述式（VI）中，R7表示碳数为10～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为6～160，R8为氢原子或碳数为1～3的烃基。]
所述式（VI）的R7从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为碳数为10～40的烃基，在一个或多个实施方式中，为碳数为10～30的烷基。所述烃基和烷基的碳数在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为10～20、10～18、10～16或12。所述式（VI）的R8为氢原子或碳数为1～3的烃基，在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为氢原子或碳数为1～3的烷基，所述烷基在一个或多个实施方式中，为甲基、乙基、丙基或异丙基。所述式（VI）中的EO的平均附加摩尔数n从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，在一个或多个实施方式中，为6～20、8～18、10～16或12。所述式（VI）的表面活性剂B在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为聚氧乙烯（12）单月桂醇酯。
表面活性剂B在一个或多个实施方式中，为具有糖残基作为亲水性部分并具有脂肪链或烷基链作为疏水性部分的非离子性表面活性剂。
作为所述糖残基，无特别限定，例如可举出单糖、二糖、寡糖等糖残基。所述糖残基中的单糖的数量无特别限定，例如可以为1～20个的范围。作为所述单糖的糖残基无特别限定，例如可举出葡萄糖残基、半乳糖残基、甘露糖残基、硫代葡萄糖残基、阿拉伯糖残基、木糖残基、葡萄糖醛酸残基、氨基葡萄糖残基等。作为所述二糖的糖残基无特别限定，例可举出蔗糖残基（蔗糖残基）、乳糖残基、麦芽糖残基、硫代麦芽糖残基等，优选的是蔗糖残基。
作为所述脂肪链无特别限定，例如可举出脂肪酸残基、烷基等。作为所述脂肪酸残基，无特别限定，例如可以是饱和脂肪酸残基，也可以是不饱和脂肪酸残基。另外，所述脂肪酸残基例如可举出直链脂肪酸残基、分支脂肪酸残基、环状脂肪酸残基等，不特别限定。所述脂肪酸残基的碳数无特别限定，例如为4～28的范围，优选的是10～22的范围。作为所述饱和脂肪酸残基无特别限定，例如可举出发酸残基、月桂酸残基、肉豆蔻酸残基、十五烷基酸、棕榈酸残基、硬脂酸残基、花生酸残基、山酸残基等，这些例如优选癸酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、十八烷酰基、二十烷酰基、二十二烷酰基等酰基。作为所述不饱和脂肪酸残基无特别限定，例如可举出油酸残基、亚油酸残基等，这些例如优选cis-9-十八烷酰基、cis，cis-9，12-十八碳二酰基等酰基。作为所述脂肪酸残基，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选发酸残基、月桂酸残基。
作为所述烷基，无特别限定，例如可以是直链状烷基，也可以是分支状烷基。所述烷基的碳数无特别限定，例如也可以是1～18个的范围。作为所述烷基的具体例，无特别限定，例如可举出甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、sec-丁基、tert-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。
作为具有糖残基的非离子性表面活性剂的具体例，无特别限定，例如可举出蔗糖脂肪酸酯、烷基糖苷、烷基寡糖等。
作为所述蔗糖脂肪酸酯，无特别限定，例如可举出蔗糖酮酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖豆蔻酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯、蔗糖二十二酸酯、蔗糖油酸酯、蔗糖亚油酸酯等，优选蔗糖酮酸酯、蔗糖月桂酸酯。所述蔗糖脂肪酸酯例如可举出单酯、双酯、三酯等，无特别限定。作为所述蔗糖脂肪酸单酯无特别限定，例如可举出蔗糖单酮酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单豆蔻酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、蔗糖单硬脂酸酯、蔗糖单二十二酸酯、蔗糖单油酸酯、蔗糖单亚油酸酯等，优选蔗糖单酮酸酯、蔗糖单月桂醇酯。作为所述蔗糖脂肪酸双酯无特别限定，例如可举出蔗糖二酮酸酯、蔗糖二月桂酸酯、蔗糖二豆蔻酸酯、蔗糖二棕榈酸酯、蔗糖二硬脂酸酯、蔗糖二二十二酸酯、蔗糖二油酸酯、蔗糖二亚油酸酯等，优选蔗糖二酮酸酯、蔗糖二月桂酸酯。作为所述蔗糖脂肪酸三酯无特别限定，例如可举出蔗糖三酮酸酯、蔗糖三月桂酸酯、蔗糖三豆蔻酸酯、蔗糖三棕榈酸酯、蔗糖三硬脂酸酯、蔗糖三二十二酸酯、蔗糖三油酸酯、蔗糖三亚油酸酯等，优选蔗糖三酮酸酯、蔗糖三月桂酸酯。
所述蔗糖脂肪酸酯例如也可以是单酯、双酯、三酯等中的任一种，另外也可以是它们的混合物。所述蔗糖脂肪酸酯例如优选含有所述单酯，所述蔗糖脂肪酸单酯的比例无特别限定，例如为50～100重量%的范围，优选的是70～100重量%的范围。
作为所述烷基糖苷，无特别限定，例如可举出n-辛基-β-D-糖苷、n-十二烷基-β-麦芽糖苷、n-癸基-β-麦芽糖苷、n-辛基-β-D-麦芽糖苷、3-氧三癸基-α-D-甘露糖苷、n-庚基-β-硫代糖苷、n-壬基-β-D-硫代麦芽糖苷、n-辛基-β-D-硫代糖苷等。
在一个或多个实施方式中，本公开的处理方法中使用的表面活性剂B的形态为含有表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A和B的液体。含有表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A和B的液体，在一个或多个实施方式中，为含有表面活性剂B的水溶液或含有表面活性剂A和B的水溶液。水可以使用蒸馏水、离子交换水或超纯水等。所述水溶液在一个或多个实施方式中，也可以选择不抑制稀少细胞的生存率的缓冲液和/或pH。
所述非离子性界面活性A和B可以分别使用任一种，也可以同时使用两种以上。
[含血液成分的试样的处理方法]
本公开在一个或多个实施方式中，涉及一种含血液成分的试样的处理方法，包括：混合含有血液成分的试样、以及含有表面活性剂A和表面活性剂B。本公开涉及的含血液成分的试样的处理方法在一个或多个实施方式中，是抑制所述试样中可含有的稀少细胞的生存率降低并且溶解红细胞、和/或降低白细胞的生存率的处理方法。因此，本公开涉及的含有血液成分的试样的处理方法优选不使稀少细胞固定、或者不使用损害稀少细胞的生存的固定剂。本公开中，“固定”包括以接近活细胞、细胞小器官的结构存活时的方式不移动。因此，“不固定”在一个或多个实施方式中，可举出维持可发生形态变化的状态、和/或抑制变得形态不能变化。
所述固定剂包括交联试剂。所述交联试剂是指通过经由游离的氨基形成分子间交联而能够维持细胞膜、细胞的结构的试剂。作为所述固定剂的不限定的具体例，可举出甲醛、多聚甲醛、三恶烷、戊二醛等。另外，除交联试剂以外，可以举出丙酮等有机溶剂、甲醇或乙醇等醇等。
本公开涉及的含血液成分的试样的处理方法在一个或多个实施方式中，包括混合含有血液成分的试样和下述液体，所述液体是指含有表面活性剂A的液体、或者含有表面活性剂A和B的液体、或者含有表面活性剂A的液体和含有表面表面活性剂B的液体，该方法在不限定的一个或多个实施方式中，可举出向含有血液成分的试样添加含有表面活性剂A的水溶液、或者含有表面活性剂A和B的水溶液、或者含有表面活性剂A的水溶液和表面活性剂B的水溶液来混合。含有表面活性剂A的液体和含有表面活性剂B的液体的添加在一个或多个实施方式中，可以是先添加含有任一者的液体之后再添加含有另一者的液体的实施方式，也可以是同时添加两者的实施方式。其中，在混合含有血液成分的试样和表面活性剂A和B的方法的一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选快速均匀地混合含有血液成分的试样和表面活性剂A及B。
作为本公开的处理方法的温度，在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点、以及更简便且迅速的处理的观点来看，优选0～50℃，更优选4～40℃，进一步优选10～37℃。此外，所述温度优选是指使含有血液成分的试样与表面活性剂A反应或者与表面活性剂A及B反应时的温度。
本公开的处理方法在一个或多个实施方式中，优选在将含有血液成分的试样与表面活性剂A或者表面活性剂A及B混合之后，为了排除血细胞，而静置或搅拌规定时间。作为所述规定时间，在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点，以及从更简便并迅速的处理的观点来看，优选0～60分钟，更优选的是1～30分钟，进一步优选的是1～15分钟。
作为与含有血液成分的试样混合的表面活性剂B水溶液的浓度，在单独将所述表面活性剂B水溶液与含有血液成分的试样混合的情况下，为10～0.01w/v%，在室温25℃的条件下，当用一般的微孔板检测仪进行测定时，在与30μL含有血液成分的试样等量反应的情况下，优选为溶解红细胞以使在20分钟以内在650nm波长下吸光度达到0.8以下的量，更优选的是吸光度达到0.6以下，进一步优选为吸光度达到0.5以下的量。
作为与血液试样混合之前的所述表面活性剂B水溶液的浓度，在一个或多个实施方式中，在血液试样为血液的情况下，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点以及更简便且迅速的处理的观点来看，优选0.01～10w/v%，更优选的是0.01～5w/v%，进一步优选的是0.01～2.5w/v%。并且，作为混合血液试样和表面活性剂A及B时的所述表面活性剂B的最终浓度，在一个或多个实施方式中，在血液试样为血液的情况下，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点、及更简便且迅速的处理的观点来看，优选0.01～5w/v%，更优选的是0.01～1.25w/v%，进一步优选的是0.01～0.5w/v%。在血液试样为浓缩血液或稀释血液的情况下，能够将上述浓度作为参考值适当进行调节。在本公开中，w/v%为表示溶液100ml中溶质溶解了的重量（克）的单位。例如，在溶液100ml中溶解了5g溶质的情况下，记为5w/v%。
作为与血液试样混合之前的所述表面活性剂A水溶液的浓度，在一个或多个实施方式中，在血液试样为血液的情况下，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点、以及更简便且迅速的处理的观点来看，优选0.01～10w/v%，更优选的是0.05～5w/v%，进一步优选的是0.5～5w/v%。并且，作为将血液试样与表面活性剂A或者表面活性剂A及B进行了混合时的所述表面活性剂A的最终浓度，在一个或多个实施方式中，在血液试样为血液的情况下，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点及更简便且迅速的处理的观点来看，优选0.01～10w/v%，更优选0.05～5w/v%，进一步优选0.5～5w/v%。在血液试样为浓缩血液或稀释血液的情况下，能够将上述浓度作为参考值适当进行调节。
作为与血液试样混合的表面活性剂A与表面活性剂B的量比，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点看，能够适当调节，但在一个或多个实施方式中，表面活性剂A及表面活性剂B的混合的量比（A/B）（重量比）例如为50/50以上，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏的观点来看，优选60/40以上，更优选70/30以上，进一步优选80/20以上。另外，在一个或多个实施方式中，从迅速排除血细胞的观点来看，表面活性剂A及表面活性剂B的混合的量比（A/B）（重量比）优选低于100/0，更优选为99/1以下。因此，作为与血液试样混合的表面活性剂A和表面活性剂B的量，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，在一个或多个实施方式中，表面活性剂A及表面活性剂B的混合的量比（A/B）（重量比）例如为50/50以上且低于100/0，优选60/40～99/1，更优选为70/30～99/1，进一步优选为80/20～95/5。这里，“低于100/0”表示包含超过0的表面活性剂B的意思。
在与血液试样混合时的、表面活性剂A和表面活性剂B的合计浓度，在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏的观点来看，优选10w/v%以下，更优选的是5w/v%以下，进一步优选的是2.5w/v%以下，更进一步优选的是1.25w/v%以下，更进一步优选的是0.75w/v%以下。所述浓度的下限无特别限定，能够适当设定成能够排除血细胞的浓度，在一个或多个实施方式中，例如为0.002w/v%以上，0.02w/v%以上，或0.04w/v%以上。
根据含有血液成分的试样和形态，能够在表面活性剂溶液（选自含有表面活性剂A的水溶液、含有表面活性剂A和B的水溶液、以及含有表面活性剂B的水溶液所组成的组的水溶液，以下相同）中包含缓冲剂和渗透压调节剂。例如，在从血液中进行稀少细胞的分离之后去除混入的血细胞为目的而与所述表面活性剂反应的情况下，能够将公知的缓冲剂、渗透压剂在不对癌细胞造成损坏的程度添加到所述表面活性剂溶液中来制备。在一个或多个实施方式中，在血液中的稀少细胞悬浮于生理盐水或缓冲液等不含血清的溶液中的情况下，混合所述表面活性剂溶液之后的反应溶液的pH从抑制对血液中的稀少细胞的损坏的观点来看，优选5.0～9.0、5.5～8.4、6.0～8.4、5.5～8.0、6.0～8.0、6.0～7.7、6.0～7.5或6.0～7.4。在一个或多个实施方式中，可举出pH6～9、渗透压为0～400mOsm的所述表面活性剂。另外，在与含有血液成分的试样直接反应的情况下，在一个或多个实施方式中，可举出混合仅含表面活性剂的所述表面活性剂溶液，但是也可以举出将pH值调节至上述范围的方式。作为上述缓冲剂，无特别限定，例如，可举出磷酸生理缓冲液（PBS）、柠檬酸缓冲液、HEPES缓冲液、ADA（N-（2-乙酰胺基）亚氨基二乙酸）缓冲液、MES（2-吗啡啉乙磺酸）缓冲液、Bis-Tris（双-（2-羟乙基）亚氨基-三-（羟甲基甲烷））缓冲液、PIPES（哌嗪-1，4-双（2-乙磺酸））缓冲液、ACES（N-（2-乙酰胺基）-2-氨基乙磺酸）缓冲液、MOPSO（2-羟基3-吗啡啉丙磺酸）缓冲液、BES（N,N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸）缓冲液、HEPES（2-[4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸）缓冲液等。另外，作为渗透压调节剂，可以使用乙二醇、氯化钠等。另外，也可以使用公知的技术对从破坏的白细胞得到的核酸进行测定、分解处理、去除处理。
[血液中的稀少细胞或核酸的分离或检测方法]
进行本公开的处理方法之后的含有血液成分的试样为血液中的稀少细胞（如果存在）的损坏被抑制、并且红细胞溶解且白细胞受到生长抑制的状态。也可以从该状态的试样中分离或检测所述稀少细胞或核酸。因此，本公开在该方式中，涉及血液中的稀少细胞的分离或检测方法，包括：用本公开的处理方法处理含有血液成分的试样；以及从处理后的含有血液成分的试样中分离或检测所述稀少细胞或核酸。
所述稀少细胞的分离或检测在一个或多个实施方式中，能够使用从由利用了亲和性的分离、密度分离、离心分离、粘附分离、大小分离、流式细胞仪、电分离、磁场分离、播种至培养基、以及它们的组合组成的组中选择的方法等来进行。所述分离之前，也可以根据需要，为了降低溶液的粘度、密度的目的，而稀释通过本公开的处理方法而处理之后的含有血液成分的试样。此外，本公开的分离或检测方法在一个或多个实施方式中，可包括分离所述稀少细胞、和/或浓缩所述稀少细胞。
另外，本公开在其他的一个或多个实施方式中，涉及一种分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，包括：从含有血液成分的试样中分离含有稀少细胞或核酸的组分；用本公开的处理方法处理分离的所述组分；以及从处理后的组分中分离或检测所述稀少细胞或核酸。
作为所述使用了亲和性的分离方法，在一个或多个实施方式中，可举出使用固定了针对稀少细胞的表面抗原的抗体或探针的固定相（例如，颗粒或平板）来分离所述稀少细胞的方法。另外，作为利用了所述粘附的分离方法，在一个或多个实施方式中，可举出使用固定了与稀少细胞的表面粘附分子粘附的分子的固定相（例如，颗粒或平板）来分离所述稀少细胞的方法。作为利用了所述密度的分离方法，在一个或多个实施方式中，可举出通过各种密度梯度离心法依据稀少细胞的密度而进行分离。另外，作为所述离心分离，在一个或多个实施方式中，可举出使稀少细胞离心沉降地分离。作为所述大小分离，在一个或多个实施方式中，可举出通过使用具有适当的孔径大小的过滤器的滤过来分离稀少细胞。另外，作为所述流式细胞仪，在一个或多个实施方式中，可举出对稀少细胞的表面标记进行荧光标记和/或免疫染色，基于其信号进行分离。另外，在一个或多个实施方式中，也可以将进行了本公开的处理方法之后的含有血液成分的试样在培养基上培养，选择生长的细胞，由此分离。如此分离的稀少细胞可以供分析或进一步培养。另外，在一个或多个实施方式中，也可以将所述分离后的稀少细胞进一步根据电、磁性质来进行分离。通过使用与这些分离方法相适应的检测方法，能够检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸。作为检测方法，在一个或多个实施方式中可举出如下检测方法：其包括：使用从利用了放射性物质的检测方法、利用了发光现象的检测方法、利用了色素的检测方法、利用了磁性的检测方法、电检测方法、光学检测方法、以及它们的组合所组成的组选择的检测方法中附随的标记方法来进行标记。
另外，在本公开的一个或多个实施方式中，也可以针对实施了本公开的处理方法的含有血液成分的试样、和/或、含有通过以往的分离方法分离的稀少细胞的组分或去除了稀少细胞的组分，再进行本公开的处理方法和/或本公开的分离或检测方法。通过这些处理，能够提高稀少细胞的回收率，或者提高稀少细胞的纯度。
[对血液中的稀少细胞的标记处理]
在本公开的处理方法中，也可以同时进行对血液中的稀少细胞的标记处理。稀少细胞的标记对上述本公开的分离或检测方法、以及后述的CTC数测定方法有用，另外，也对分离后的稀少细胞的分析有用。因此，本公开的处理方法在一个或多个实施方式中，包括标记处理。另外，稀少细胞的标记在后述的CTC数测定方法有用，另外对分离后的稀少细胞的分析有用。因此，本公开的分离或检测方法在一个或多个实施方式中，包括标记处理。
所述标记处理例如可以通过将公知的标记试剂与稀少细胞接触来进行，典型地，可以通过将所述标记试剂与含有血液成分的试样混合来进行。将所述标记试剂与所述含有血液成分的试样混合的时机，可以在添加所述表面活性剂A和B之前，也可以同时，也可以之后，也可以在所述稀少细胞的分离之后。其中，从试剂的成本的观点，优选分离并浓缩后的时机。作为所述标记，无特别限定，在一个或多个实施方式中，可举出放射性标记、荧光染料标记、色素染色或标记、磁标记、电荷标记、以及它们的组合，可以通过与各自相适应的标记试剂来进行。
[含血液成分的试样中的稀少细胞的分析方法]
本公开在其他的方式中，可涉及含血液成分的试样中的稀少细胞的分析方法，包括在用本公开的处理方法处理含有血液成分的试样之后，通过包括细胞的动态观察或活性测定的方法来进行分析。
[CTC数测定方法]
已有血液中的CTC数与癌的转移的可能性及预后具有相关性的报告，并且已知为了作为癌的诊断、预后诊断、以及治疗效果的预测或判定的指标而测定血中CTC数。根据本公开的处理方法和/或本公开的分离或检测方法，能够抑制对作为稀少细胞的CTC的损坏并进行分离。另外，也可以测定CTC核酸。因此，本公开在其他的方式中，涉及所述含有血液成分的试样中的CTC数测定方法，包括：用本公开的处理方法处理含有血液成分的试样；和/或通过本公开的分离或检测方法从所述含有血液成分的试样中分离CTC。此外，CTC数的计测或CTC的核酸的测定，例如可以在进行了适当的标记处理之后通过用流式细胞仪进行分离的同时进行，也可以在显微镜下观察分离的细胞并计测。另外，从癌细胞的形态学的DNA或RNA的量的方面考虑，也可以基于荧光值进行测定。
[试剂盒]
本公开在另外的其他方式中，涉及一种试剂盒，用于本公开的处理方法、本公开的分离或检测方法、和/或本公开的CTC数测定方法，所述试剂盒包含所述表面活性剂A、或者表面活性剂A和B。本公开的试剂盒，在一个或多个实施方式中，还可以包括用于标记所述稀少细胞或CTC的标记试剂。作为所述标记试剂，能够使用上述的标记试剂。本公开的试剂盒在其他实施方式中，也可以包括记载了本公开的处理方法、本公开的分离或检测方法、和/或本公开的CTC数测定方法的使用说明书。本公开的试剂盒也可以包括不是与本公开的试剂盒一同包装提供所述说明书而是在网络上提供所述说明书的情况。
即，本公开可涉及以下的一个或多个实施方式：
[A1]一种含血液成分的试样的处理方法，包括：混合含有血液成分的试样和表面活性剂A；或者混合所述试样和含有所述表面活性剂A的液体，从抑制对稀少细胞的损坏的观点来看优选的是不选择性使用固定剂，所述表面活性剂A为下述通式（I）表示的非离子性表面活性剂：
R1-O-（EO）n-R2   （I）
[所述式（I）中，R1为具有分支链的碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为23～50，R2为氢原子或碳数为1～3的烃基。]
[A2]一种含血液成分的试样的处理方法，包括：混合含有血液成分的试样与表面活性剂A以及表面活性剂B；或者混合所述试样与含有所述表面活性剂A及所述表面活性剂B的液体或者含有表面活性剂A的液体及表面活性剂B的液体，从抑制对稀少细胞的损坏的观点来看优选不选择性使用固定剂，所述表面活性剂A为下述通式（I）表示的非离子性表面活性剂，所述表面活性剂B对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性，
R1-O-（EO）n-R2   （I）
[所述式（I）中，R1为具有分支链的碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为23～50，R2为氢原子或碳数为1～3的烃基。]
[A3]根据[A1]或[A2]所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂A为聚氧乙烯亚烷基醚（EO=23～50）。
[A4]根据[A2]或[A3]所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂B为从由聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚、聚氧乙烯亚烷基醚（EO=8～22）、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它们的组合组成的组中选择的非离子性表面活性剂。
[A5]根据[A2]至[A4]中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂B为下述通式（III）表示的非离子性表面活性剂。
R3-O-（AO）m/（EO）n-R4   （III）
[所述式（III）中，R3为碳数为1～24的烷基，R4为氢原子或碳数为1～3的烷基，AO表示碳数为3～6的氧化烯基，EO表示氧乙烯基，m和n分别为AO及EO的平均附加摩尔数。m为1～100的数，n为0～50的数。“/”表示AO基和EO基可以不论顺序地以随机或嵌段中的任一种方式附加。]
[A6]根据[A2]至[A5]中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，所述表面活性剂B为下述式（IV）表示的非离子性表面活性剂，
R5-O-（EO）n-R6   （IV）
[所述式（IV）中，R5表示碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为8～22，R6为氢原子或碳数为1～3的烃基。]
[A7]根据[A2]至[A6]中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，所述表面活性剂B为下述式（VI）表示的非离子性表面活性剂，
R7-COO-（EO）n-R8   （VI）
[所述式（VI）中，R7表示碳数为10～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为6～160，R8为氢原子或碳数为1～3的烃基。]
[A8]根据[A2]至[A7]中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，所述表面活性剂B为具有糖残基作为亲水性部分、具有脂肪链或烷基链作为疏水性部分的表面活性剂。
[A9]根据[A2]至[A8]中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂B为蔗糖月桂酸酯。
[A10]一种含血液成分的试样的处理方法，包括：混合含有血液成分的试样与表面活性剂A及表面活性剂B；或者混合所述试样与含有所述表面活性剂A和所述表面活性剂B的液体或者含有表面活性剂A的液体以及含有表面活性剂B的液体，从抑制对稀少细胞的损坏的观点看优选不使用固定剂，所述表面活性剂A为聚氧乙烯辛基十二烷基醚（EO=23～50），所述表面活性剂B为对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性的非离子性表面活性剂，并且为从由聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚（EO=8～22）、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它们的组合组成的组中选择的非离子性表面活性剂。
[A11]根据[A2]至[A10]中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂A和所述表面活性剂B的混合的量比（A/B）（重量比）为50/50以上且低于100/0。
[A12]根据[A1]至[A11]中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，含有所述表面活性剂A的液体具有下述（1）的血细胞去除效果：
（1）用蒸馏水稀释规定量的血液，以使使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的吸光度值为1以上且低于2，由此制备基准样品，替代所述基准样品中的蒸馏水而使用含有所述表面活性剂A的液体来制备被检样品，使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为1小时以内。
[A13]根据[A1]至[A12]中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体或者这两种液体的混合物具有下述（2）的血细胞去除效果：
（2）用蒸馏水稀释规定量的血液，以使使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的吸光度值为1以上且低于2，由此制备基准样品，替代所述基准样品中的蒸馏水而使用含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A的液体和含有表面活性剂B的液体或者这两种液体的混合物来制备被检样品，使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为0.5小时以内。
[A14]根据[A1]至[A13]中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，所述含血液成分的试样的处理方法是抑制所述试样可含有的稀少细胞的生存率降低并溶解红细胞，并且/或者降低白细胞的生存率的方法；
[A15]一种分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，包括：通过[A1]至[A14]中任一项所述的处理方法处理含有血液成分的试样；以及从处理后的试样中分离或检测稀少细胞或核酸。
[A16]一种分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，包括：从含有血液成分的试样中分离含有稀少细胞或核酸的组分；通过[A1]至[A14]中任一项所述的处理方法处理分离的所述组分；以及从处理后的组分中分离或检测稀少细胞或核酸。
[A17]根据[A15]或[A16]中任一项所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，其中，所述稀少细胞或核酸的分离包括：从使用亲和性的分离、密度分离、离心分离、粘附分离、大小分离、流式细胞仪、电分离、磁性分离、播种到培养基、以及它们的组合所组成的组中选择的方法来进行。
[A18]根据[A15]至[A17]中任一项所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，其中，所述稀少细胞是从癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胎儿细胞以及它们的组合所组成的组中选择的细胞。
[A19]根据[A15]至[A18]中任一项所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，其中，所述核酸是从血液成分中的RNA及DNA、癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胎儿细胞的RNA及DNA以及它们的组合所组成的组中选择的核酸。
[A20]根据[A15]至[A19]中任一项所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，包括：针对所述稀少细胞，使用检测方法中附随的标记方法来标记，所述检测方法是从利用了放射性物质的检测方法、利用了发光现象的检测方法、使用了色素的检测方法、利用了磁性的检测方法、电检测方法、光学检测方法、以及它们的组合所组成的组中选择的方法。
[A21]一种测定含有血液成分的试样中的CTC（循环肿瘤细胞）数或CTC的核酸的方法，包括：通过[A1]至[A14]中任一项所述的处理方法来处理含有血液成分的试样；或者通过[A15]至[A20]中任一项所述的分离或检测方法从含有血液成分的试样中分离或检测稀少细胞或核酸。
[A22]一种含血液成分的试样中的稀少细胞的分析方法，包括：在通过[A1]至[A14]中任一项所述的处理方法处理含有血液成分的试样之后，通过包括细胞的动态观察或活性测定的方法进行分析。
[A23]一种试剂盒，包含用于[A1]至[A14]中任一项所述的处理方法、[A15]至[A20]中任一项所述的分离或检测方法、[A21]所述的CTC数测定方法、和/或[A22]所述的分析方法的、所述表面活性剂A和所述表面活性剂B。
[A24]一种试剂盒，包含用于[A2]至[A14]中任一项所述的处理方法、[A15]至[A20]中任一项所述的分离或检测方法、[A21]所述的CTC数测定方法、和/或[A22]所述的分析方法的、所述表面活性剂A。
实施例
以下，通过实施例对本公开进行更详细的说明，但是这些仅为示例而已，本公开不限于这些实施例。
[1.通过聚氧乙烯辛基十二烷基醚（EO=25）进行的处理（实施例1、2）]
制备2.5w/v%的所述化学式（1）表示的聚氧乙烯辛基十二烷基醚（EO=25）（商品名：EMULGEN2025G，花王公司制，下述表1的表面活性剂No.1）的水溶液。测定了与该水溶液接触时的红细胞的溶解时间。另外，测定了与该水溶液接触10分钟之后（实施例1）或30分钟之后（实施例2）的白细胞的生存率、以及癌细胞的生存率。具体地，按下述的条件进行。
〔红细胞的溶解时间测定〕
作为含有红细胞的试样，使用了使用真空采血管（加入EDTA-2K）从健康人的静脉血中采集的血液。向96孔的微孔板分注含有所述血液的试样30μL，混合所述表面活性剂水溶液30μL并用吸量管搅拌5次，使反应溶液均匀并反应。用微孔板检测仪每一分钟测定吸光度。血液溶解，吸光度在650nm的波长下变为0.5以下时视为血液的溶解。将其结果示于下述表3中（实施例1和2）。在实施例1和2中，经过30分钟之后60分钟以内吸光度达到0.5。另一方面，替换所述表面活性剂水溶液而使用蒸馏水的比较例9即使经过了60分钟吸光度也没有达到0.5。此外，使用的微孔板检测仪为Thermo labsystems公司制的Thermo Labsystems MultiskanAscent35。
〔白细胞的损坏评价〕
白细胞是按照HetaSep协议（STEMCELL Technologies公司制）从新鮮血10ml中分离后悬浮在PBS（-）1ml中，并用1.5ml抛弃型微管（NICHIRYO/DSP-MC-15A，以下简称微量离心管）回收的。分离的白细胞和少量的红细胞使用氯化铵（STEMCELL社）按照附件去除红细胞，离心并回收白细胞，用PBS（-）洗浄，之后悬浮在含血清培养基中。将含血清培养基中的白细胞悬浮液50μL和所述表面活性剂水溶液50μL在1.5ml的微量离心管内混合，用吸量管搅拌5次左右使溶液均匀。之后，在室温23度下，静置10分钟～30分钟左右使之反应。之后，用吸量管搅拌该微量离心管的反应液，在分散细胞之后将50μL分注到另一微量离心管中，混合了0.4%台盼蓝染色液（Invitrogen公司）50μL。将其注入至血细胞计数板（细胞计数器板，改良Neubauer型177-112C/沃森公司制，以下简称血细胞计数板）并计测未被台盼蓝染色的活细胞。将替代试剂而添加了蒸馏水的反应液的细胞数作为100%，基于与所述表面活性剂水溶液反应后的10分钟之后（实施例1）和30分钟之后（实施例2）存活的细胞数求出了生存率。其结果示于下述表3。
〔对癌细胞的损坏评价〕
制备源自胃癌、乳癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌的SNU-1、MCF-7、SW620、PC3、NCI-358细胞使之达到2×106Cells/ml，并将其用作作为癌细胞试样。癌细胞的制备方法如下所述。将含血清培养基中的癌细胞悬浮液50μL和所述表面活性剂水溶液50μL添加到1.5ml的微量离心管内，用吸量管搅拌，使溶液均匀。之后，在室温23度下静置10分左右使之反应。之后，用吸量管搅拌加入微量离心管内的反应液，分散细胞之后，将50μL分注到另一微量离心管中，并混合了0.4%台盼蓝染色液（Invitrogen公司）50μL。将其注入血细胞计数板中并计测未被台盼蓝染色的活细胞。将替代试剂而添加了蒸馏水的反应液的细胞数作为100%，基于与所述表面活性剂水溶液反应后的10分钟之后（实施例1）和30分钟之后（实施例2）存活的细胞数求出了生存率。其结果示于下述表3。
（癌细胞的制备方法）
按照通常方法，将在TC培养皿Greiner公司）中培养的人乳腺上皮癌（细胞株名MCF-7：DS Pharma Biomedical公司Pharma Biomedical公司）、人结肠腺癌（细胞株名SW620：DSPharma Biomedical公司）、人前列腺癌（细胞株名PC3：DSPharma Biomedical公司）、人肺胞上皮癌（细胞株名NCI-H358：DSPharma Biomedical公司）的培养基上清液去除之后，用PBS（-）洗浄，再去除上清液之后，进行了胰蛋白酶（Invitrogen公司社）处理（37℃、3分钟）。向其中加入含血清培养基并回收至15ml离心管。将其用离心机（CR20F：日立）离心，去除了上清液。将其再次悬浮在含血清培养基中并回收。此外，作为浮游型的人胃癌细胞株（SNU-1：ATCC）不进行胰蛋白酶处理，而回收至15ml离心管中。将其离心之后，添加含血清培养基并悬浮回收。
如表3的实施例1和2所示，表面活性剂No.1（聚氧乙烯辛基十二烷基醚（EO=25））的水溶液能够溶解红细胞，并且能够比起癌细胞更选择性地使白血细胞生存率降低，该效果在与表面活性剂No.1接触后的30分后变显著。
[2.使用了两种表面活性剂的组合的处理（实施例3-7）]
使用下述表1所述的14种表面活性剂（花王公司制、Nacalai tesque公司制，同仁化学研究所公司制，Lion Akzo株式会社），设定下述表3所示的实施例3～7、比较例1～8的组合并制备了混合物。在实施例3～7、比较例1～8的表面活性剂混合物中，两个表面活性剂混合比（重量比）设为2：8（表面活性剂No.1为8成）。另外，所述表面活性剂混合物中的表面活性剂的合计浓度为2.5w/v%。比较例9是不使用表面活性剂的蒸馏水的例子。使用这些表面活性剂混合物，与实施例1同样地，测定与这些表面活性剂混合物接触时的红细胞的溶解时间，并测定了与这些表面活性剂混合物接触10分钟之后的白细胞的生存率、以及癌细胞的生存率。具体的条件除了将实施例1的表面活性剂水溶液换成所述表面活性剂混合物之外，与实施例1同样地进行。它们的结果示于表3。此外，下述表1的No.1～No.6的表面活性剂单独的2.5w/v%水溶液的红细胞溶解时间的测定结果示于表2。
表1
Figure BDA00003381346200321
※C后的数字表示碳数。
表2
No. 表面活性剂（试剂名或商品名） 制备浓度w/v% 到吸光度0.5的溶解时间（分钟）
1 2025G 2.5 30-60
2 MS-110 2.5 1
3 2020HA 2.5 2
4 LS-110 2.5 1
5 Emugen 2.5 2
6 蔗糖月桂酸酯 2.5 1
- 水 - 未达到
表3
Figure BDA00003381346200331
※实施例2为在与表面活性剂接触30分钟之后测定的结果。
※“-”表示未测定。
如表3所示，在仅使用了No.1的非离子性表面活性剂的实施例1和2中，能够溶解红细胞，另外与比较例1～8相比，维持了癌细胞的高生存率。在用No.1和No.2～No.6的表面活性剂混合物处理了的实施例3～7中，与实施例1相比红细胞的溶血时间缩短，另外与比较例1～8相比，对于至少一种癌细胞维持了高生存率。在以相同时间（10分）降低白细胞的生存率的点上，含有No.2～No.5的实施例3～6优于实施例1和7。在较高地维持更多种癌细胞的生存率的方面，实施例2～5和7优于实施例6，其中实施例3、4和7、尤其是实施例3和4优异。
[3.两种表面活性剂的混合比和癌细胞损坏的关系]
用10：0～0：10的混合比（重量比，表面活性剂的合计浓度为2.5w/v%）制备了表面活性剂No.2或No.3和表面活性剂No.1的混合物。使用这些混合物进行了对胃癌细胞（SNU-1）的损坏评价。损坏评价与上述同样地进行。即，在1.5ml的微量离心管内混合含血清培养基中的癌细胞悬浮液（2×106Cells/ml）50μL和所述混合物50μL，用吸量管搅拌5次左右使溶液均匀。之后，在室温23度下静置10分左右使之反应。反应后，用吸量管搅拌所述微量离心管内的反应液，分散细胞之后将50μL分注到1.5ml的微量离心管中，与0.4%台盼蓝染色液（Invitrogen公司）50μL混合。将其注入血细胞计数板并用倒置显微镜（奥林巴斯）对未被台盼蓝染色的活细胞进行了计数。将替代试剂而添加了蒸馏水的反应液的细胞数作为100%，基于与所述表面活性剂混合物的反应之后生存的细胞数求出生存率。表面活性剂No.2和表面活性剂No.1的混合物的结果示于图1，并且表面活性剂No.3和表面活性剂No.1的混合物的结果示于图2。
如图1和2所示，在表面活性剂No.2和No.3的混合比（重量比）超过50%的情况下，癌细胞的生存率显著下降。另外，表面活性剂No.1的混合比（重量比）超过50%时癌细胞的生存率显著上升，表面活性剂No.1的混合比（重量比）为60%以上时癌细胞的生存率提高更为显著。
[4.从含有含癌细胞的血液的试样中的癌细胞的粘附分离]
将作为乳癌细胞的MCF-7细胞用PBS（-）（Dulbecco PBS（-）/日水制药洗净细胞表面之后，通过胰蛋白酶处理（37℃、3分）剥离细胞，悬浮在含血清的培养基中。用血细胞计数板对细胞计数，以每一个含1×106个的方式加入离心管进行离心，去除上清液，之后添加血液1ml进行悬浮，如此制备了包含含癌细胞的血液的试样。向该包含含癌细胞的血液的试样1ml中混合实施例3或4的表面活性剂混合物（表面活性剂No.2或No.3与表面活性剂No.1的混合物、表面活性剂的合计浓度为2.5w/v%）1ml，用吸液管搅拌5次，反应10分钟。
血细胞在所述反应中溶解，反应溶液的密度上升。因此，在细胞的离心分离时，适量添加缓冲液降低密度后进行离心分离。具体地，向离心管中加入10ml反应物和缓冲液，通过离心机（CR20F/日立制）以1500rpm、室温（24℃）进行了3分钟的离心。去除上清液，在10ml的含血清培养基中悬浮，将细胞播种在10cmTC培养皿（Greiner）中，在5%、37℃的CO2恒温箱中保管。在24小时之后，进行培养基更换，再次在同一恒温箱中保管。60小时的照片和100时间后的生长状况的照片示于图3。如图3所示，能够使用实施例3或4的表面活性剂混合物从含有含癌细胞的血液的试样中回收癌细胞，并且所述癌细胞粘附在培养培养皿上并增殖。即，在所述反应处理和离心分离后可进一步分离和/或浓缩癌细胞。此外，在不进行所述反应处理而播种细胞的情况下，血细胞、血小板等血液成分产生干扰，癌细胞不能粘附，无法生长。
[5.含有荧光染色癌细胞的血液试样的过滤处理]
通过将预先荧光染色的癌细胞与血液混合而制备了含癌细胞的血液试样，并用表面活性剂混合物对其实施处理之后，使用过滤器滤过，观察了过滤器上回收的细胞。具体地，如下进行。
〔含癌细胞的血液试样〕
作为含有含癌细胞的血液的试样，准备添加了6000个左右的事先按下述步骤染色的胃癌细胞（SNU-1）的血液1ml。
（癌细胞的染色）
从培养液中回收与上述1同样地制备的癌细胞（SNU-1）之后，用离心机（CR20F/日立制）以1500rpm、室温（24℃）进行了3分钟的离心。去除上清液，添加PBS（-）并悬浮细胞。对悬浮在该PBS（-）中的细胞进行荧光染色。使用CellTracker（Invitrogen公司）作为染色试剂。CellTracker（Invitrogen公司）是也能够通过活细胞的细胞膜的试剂，与细胞内物质反应，转变成荧光物质。使CellTracker溶解在DMSO中以达到10mM，并使用以使得反应时的最终浓度达到0.5～0.25μM。在PBS（-）中反应30～40分钟。用发出绿色荧光的Cell Tracker（CellTracker GreenCMFDA/C7025）对癌细胞（SNU-1）进行了染色。
〔表面活性剂混合物〕
作为表面活性剂混合物，准备了实施例4的表面活性剂混合物（表面活性剂No.3和表面活性剂No.1的混合物，表面活性剂的合计浓度为2.5w/v%）。
〔过滤器〕
将
Figure BDA00003381346200351
孔径8μm的Nuclepore Track Etch膜片（GEHEALTHCARE公司）用Swinnex过滤器支架（Yamato科学：SX0001300）固定来制作了过滤器。将卸下了活塞的塑料注射器安装在过滤器支架上部。过滤器下部用硅胶管连接，将相反侧的顶端固定在废液瓶中使用。
〔过滤〕
向1ml的含有含所述癌细胞的血液的试样中混入实施例2的表面活性剂混合物1ml，用吸液管搅拌5次，反应10分钟。将反应物添加到连接在所述过滤器的上部的注射器中进行了过滤。之后，在血液全部通过过滤器之前安静地添加PBS（-）溶液，进行过滤器的洗净。之后，用4%的多聚甲醛/PBS缓冲液（和光纯药）固定30分左右。用显微镜观察固定在过滤器的膜片上的细胞。其结果示于图4B。此外，图4A是不进行使用表面活性剂混合物的处理而过滤了血液的情况的结果。
如图4所示，在进行了通过表面活性剂混合物的处理的图4B中，图4A中观察到的大量的血细胞基本观察不到。此外，在图4B中观察为圆形的是过滤器的孔。图4B中发亮的细胞是事前染色并混合进血液的癌细胞。能够确认到即使在与表面活性剂作用之后，血细胞也被破坏并且癌细胞被捕获至过滤器上。这表明残留在过滤器上的癌细胞的纯度变高，检测或者之后的解析变得容易。
以上的数据是通过利用表面活性剂混合物的处理，相对于该含有血液的试样中的稀少细胞（癌细胞）对稀少细胞以少的损坏破坏血细胞等，因此之后能够进行高纯度的粘附分离和培养、过滤器分离、荧光标记等，因此显示出能够对回收的稀少细胞（癌细胞）进行高精度的分析。
[6.含癌细胞的血液试样中的癌细胞可视化中的噪声去除]
将预先荧光染色的癌细胞与预先染色的白细胞混合来制备癌细胞含有血液试样，对其用表面活性剂混合物实施处理之后，进行荧光显微镜观察。具体地，在以下的条件下进行。
〔癌细胞含有血液试样的制备〕
与上述5同样地，制备用发绿色荧光的cell tracker（CellTracker GreenCMFDA/C7025）染色的癌细胞（SNU-1），制备用发蓝色荧光的celltracker（CellTracker Blue CMF2HC/C12881）染色的白细胞。以含血清培养基200μL中癌细胞为6700个、白细胞为1.4×106个的方式向微量离心管中添加癌细胞和白细胞，由此制备了含癌细胞的血液试样。将其每个30μL的注入至另一微量离心管中。
〔使用表面活性剂混合物的处理和荧光显微镜观察〕
将含癌细胞的血液试样按下述表4所示的条件进行了处理（实施例8-10和比较例10）。此外，记载的浓度为制备时的浓度，当与细胞悬浮液进行反应时，添加等量的30μL进行了混合。反应温度为室温（23℃）。反应后，加入培养基640μL，用离心机（日立制CF15D）以2500rpm分离了3分钟。再次用PBS（-）600μl悬浮，再次用所述离心机、在相同条件下进行离心。之后，悬浮在PBS（-）100μl中，将50μl分注至384板中。将其用Kubota公司的板离心机（M20484-A000）在400×g下进行了5分钟的离心，在下述表5的条件下进行了荧光显微镜观察。荧光显微镜察的结果示于图5。另外，对图5中的细胞数计数的结果示于表4。
表4
表5
Figure BDA00003381346200372
如图5和表4所示，在实施例8-10中，通过进行处理能够大幅降低白细胞的数量，显微镜观察时的噪声与比较例10相比大幅降低。
[7.利用流式细胞仪的检测和分离]
使用从10ml的血液中与上述1同样地分离了的白细胞。另外，癌细胞使用了SNU-1细胞。测定时使用了使用MoxiZ/ORFLO公司的电感带法（库尔特原理）的自动细胞计数器。电感带法是指，向细孔施加电流，并能够将电阻与通过该细孔中的粒子的体积成比例地变化作为电压脉冲等的变化进行测定并检测。对每个电压脉冲高进行计测处理，得到粒子的体积分布直方图。能够测定细胞的大小（体积）和数量。
将表面活性剂No.2和表面活性剂No.1的混合物以2：8混合比（重量比，表面活性剂的合计浓度为2.5w/v%）进行制备。使用这些表面活性剂混合物测定了胃癌细胞（SNU-1）和白细胞的粒度分布。在1.5ml的微量离心管内混合含血清培养基中的癌细胞悬浮液（1×105Cells/ml）或白细胞（3×105Cells/ml）50μL与所述表面活性剂混合物50μL，用吸量管搅拌5次左右使溶液均匀。之后，在室温23度下静置10分钟左右使之反应。反应后，用吸量管搅拌所述微量离心管内的反应液，分散细胞之后将75μL的该反应液注入MoxiZ专用的盒中来测定了粒度分布（实施例11）。作为比较例，替代所述表面活性剂混合物使用蒸馏水（比较例11）。
接着混合癌细胞+白细胞，制备细胞试样使其细胞数与上述细胞数相同。使所述细胞试样与实施例11同样地与所述表面活性剂混合物反应，并测定了粒度分布（实施例12）。作为比较例，替代所述表面活性剂混合物而使用蒸馏水（比较例12）。
测定后获得的数据能够作为CSV文件输出，对于在各大小处获得的数据，以7点简单移动平均进行了平滑。图6的A和B是使癌细胞和白细胞的各细胞的粒度分布数据重合了的结果。图7的A和B是混合了癌细胞和白细胞的悬浮液的粒度分布。
如图6和7所示，比较例11和12（图6B和图7B）中，细胞计数器中白细胞大的一侧的粒度分布和癌细胞小的一侧的粒度分布重合（图6B的“重合部分”和图7B）。因此难以进行白细胞和SNU-1的区分，若要回收SNU-1会混入很多白细胞。另一方面，实施例11（图6A及图7A）中重合的部分的白细胞溶解，重合或消失或变少。由于重合部分消失或减少，癌细胞的纯度变高。例如，通过回收具有用虚线（5.5（au））指示的溶解后的白细胞以上的大小的细胞，能够分离白细胞的分布和癌细胞的分布。如此，能够电气地判别大小并分离、检测任意的大小。另外，光学上，能够用荧光标记和散射光进行检测、分离。
[8.悬浮在生理盐水中的癌细胞及白细胞与表面活性剂混合物的pH的关系]
用各PBS（-）溶液制备以2:8的混合比（重量比，表面活性剂的合计浓度为2.5w/v%）含有表面活性剂No.2和表面活性剂No.1的表面活性剂混合物，使其达到pH4～pH10。使用这些表面活性剂混合物来进行对胃癌细胞（SNU-1）的损坏的评价。
损坏评价与上述同样地进行，除了将以前用含血清培养基悬浮的细胞本次用生理盐水悬浮之外。即，将生理盐水的癌细胞悬浮液（2×106Cells/ml）50μL和所述混合物50μL在1.5mL微量离心管内混合，用吸液管搅拌5次左右使溶液均匀。之后，在室温23℃下静置10分钟左右使其反应。反应之后，用吸液管搅拌所述微量离心管内的反应液，使细胞分散之后将50μL分注到另一1.5mL的微量离心管内，与0.4%台盼蓝染色液（Invitrogen）50μL混合。将其注入至血细胞计数板上使用倒置显微镜（奥林巴斯）对未被台盼蓝染色的活细胞进行计数。将替代试剂而添加了不含表面活性剂的PBS（-）的反应液的细胞数作为100%，基于与所述表面活性剂反应后的生存的细胞数求出生存率。
对于白细胞，也同样地用生理盐水悬浮（8.2×106Cells/ml），使之同样地反应。将替代表面活性剂混合物而添加了不含表面活性剂的PBS（-）的反应液的细胞数作为100%，基于与所述表面活性剂反应后的生存的细胞数求出生存率。
其结果示于图8和下述表6。如图8和表6所示，显示出从提高癌细胞的生存率的观点以及降低白细胞的生存率的观点来看，优选表面活性剂混合物的pH接近中性。
表6
Figure BDA00003381346200401
工业应用性
本公开在血液中的稀少细胞的回收、测定、分析的领域中有用，例如，在医学、药学的学术领域、和/或治疗、诊断等医疗领域中有用。

Claims (23)

1.一种含血液成分的试样的处理方法，包括：
混合含血液成分的试样与含有表面活性剂A及表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体；
所述表面活性剂A为下述通式（I）所示的非离子性表面活性剂，所述表面活性剂B对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性，
R1-O-（EO）n-R2   （I）
所述式（I）中，R1表示具有支链的碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为23～50，R2为氢原子或碳数为1～3的烃基。
2.一种含血液成分的试样的处理方法，包括：混合含有血液成分的试样与含表面活性剂A的液体，
不使用固定剂，
所述表面活性剂A为下述通式（I）表示的非离子性表面活性剂，
R1-O-（EO）n-R2   （I）
所述式（I）中，R1表示具有支链的碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为23～50，R2为氢原子或碳数为1～3的烃基。
3.根据权利要求1或2所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂A为聚氧乙烯亚烷基醚（EO=23～50）。
4.权利要求1或3所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，
所述表面活性剂B为从聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚、聚氧乙烯亚烷基醚（EO=8～22）、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它们的组合所组成的组中选择的非离子性表面活性剂。
5.根据权利要求1、3和4中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂B为下述通式（III）表示的非离子性表面活性剂，
R3-O-（AO）m/（EO）n-R4   （III）
所述式（III）中，R3为碳数为1～24的烷基，R4为氢原子或碳数为1～3的烷基，AO表示碳数为3～6的氧化烯基，EO表示氧乙烯基，m和n分别为AO及EO的平均附加摩尔数，m为1～100的数，n为0～50的数，“/”表示AO基和EO基也能够不论顺序地以随机或嵌段中的任一种方式附加。
6.根据权利要求1、3至5中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂B为下述式（IV）表示的非离子性表面活性剂，
R5-O-（EO）n-R6   （IV）
R5表示碳数为12～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为8～22，R6为氢原子或碳数为1～3的烃基。
7.根据权利要求1、3至6中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，所述表面活性剂B为下述式（VI）表示的非离子性表面活性剂，
R7-COO-（EO）n-R8   （VI）
所述式（VI）中，R7表示碳数为10～40的烃基，EO表示氧乙烯基，n为EO的平均附加摩尔数，为6～160，R8为氢原子或碳数为1～3的烃基。
8.根据权利要求1、3至7中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，所述表面活性剂B为具有糖残基作为亲水性部分、并具有脂肪链或烷基链作为疏水性部分的表面活性剂。
9.根据权利要求1、3至8中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂B为蔗糖月桂酸酯。
10.一种含血液成分的试样的处理方法，包括：
混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A及表面活性剂B的液体、或含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体，
所述表面活性剂A为聚氧乙烯辛基十二烷基醚（EO=23～50），
所述表面活性剂B为对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性的非离子性表面活性剂，并且为从聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚（EO=8～22）、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它们的组合所组成的组中选择的非离子性表面活性剂。
11.根据权利要求1和3至10中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂A和所述表面活性剂B的混合的量比（A/B）（重量比）为50/50以上且低于100/0。
12.根据权利要求2至11中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，含有所述表面活性剂A的液体具有下述（1）的血细胞去除效果：
（1）用蒸馏水稀释规定量的血液，以使使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的吸光度值为1以上且低于2，由此制备基准样品，
替代所述基准样品中的蒸馏水，使用含有2.5～5w/v%的所述表面活性剂A的液体来制备被检样品，
使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为1小时以内。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，
含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A的液体和含有表面活性剂B的液体具有下述（2）的血细胞去除效果：
（2）用蒸馏水稀释规定量的血液，以使使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的吸光度值为1以上且低于2，由此制备基准样品，
替代所述基准样品中的蒸馏水，使用含有2.5～5w/v%的所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体来制备被检样品，
使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为0.5小时以内。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述含血液成分的试样的处理方法是抑制所述试样可含有的稀少细胞的生存率降低并溶解红细胞，并且/或者降低白细胞的生存率的方法。
15.一种分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，包括：通过权利要求1至14中任一项所述的处理方法处理含有血液成分的试样；以及从处理后的试样中分离或检测稀少细胞或核酸。
16.根据权利要求15所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，其中，所述稀少细胞或核酸的分离或检测包括：通过从使用亲和性的分离、密度分离、离心分离、粘附分离、大小分离、流式细胞仪、电分离、磁性分离、播种至培养基、以及它们的组合所组成的组中选择的方法进行。
17.根据权利要求15或16所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，
所述稀少细胞是从癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胎儿细胞以及它们的组合所组成的组中选择的细胞。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，
所述核酸为从血液成分中的RNA及DNA、癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胎儿细胞的RNA及DNA、以及它们的组合所组成的组中选择的核酸。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞的方法，包括：
针对所述稀少细胞，使用下述检测方法中附随的标记方法来标记，所述检测方法是从利用了放射性物质的检测方法、利用了发光现象的检测方法、使用了色素的检测方法、利用了磁性的检测方法、电检测方法、光学检测方法、以及它们的组合所组成的组中选择的方法。
20.一种测定含血液成分的试样中的CTC（循环肿瘤细胞）数或CTC的核酸的方法，包括：通过权利要求1至14中任一项所述的处理方法处理含有血液成分的试样；或者通过权利要求15至19中任一项所述的分离或检测方法从含有血液成分的试样中分离或检测稀少细胞或核酸。
21.一种含血液成分的试样中的稀少细胞的分析方法，包括：在通过权利要求1至14中任一项所述的处理方法处理含有血液成分的试样之后，通过包括细胞的动态观察或活性测定的方法进行分析。
22.一种试剂盒，包含用于权利要求1至14中任一项所述的处理方法、权利要求15至19中任一项所述的分离或检测方法、权利要求20所述的CTC数测定方法、和/或权利要求21所述的分析方法的、所述表面活性剂A和所述表面活性剂B。
23.一种试剂盒，包含用于权利要求2至14中任一项所述的处理方法、权利要求15至19中任一项所述的分离或检测方法、权利要求20所述的CTC数测定方法、和/或权利要求21所述的分析方法的、所述表面活性剂A。
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