CN105063165A - 循环肿瘤细胞代谢活动检测方法和装置 - Google Patents

循环肿瘤细胞代谢活动检测方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供了循环肿瘤细胞代谢活动检测方法和装置。具体地，本发明提供了一种检测循环肿瘤细胞代谢活动的方法，包括步骤：(a)从外周血样品中富集分离循环肿瘤细胞CTC；(b)将循环肿瘤细胞置于微孔阵列芯片中；(c)对循环肿瘤细胞进行复苏处理；(d)在葡萄糖类似物存在下，培养所述的循环肿瘤细胞；和(e)检测所述循环肿瘤细胞对葡萄糖类似物的摄取情况，从而定性或定量地确定所述循环肿瘤细胞代谢活动和/或恶性程度。本发明方法不仅能够区分活的CTC与已处于凋亡状态的CTC，还能够识别具有高代谢活性的CTC并计数，可用于预测CTC的恶性程度，为后续有针对性的进行CTC测序提供线索。

Description

循环肿瘤细胞代谢活动检测方法和装置
技术领域
本发明涉及生物与医学检测领域。更具体地，本发明涉及人外周血中循环肿瘤细胞代谢活动的检测方法和装置。本发明方法和装置可对人外周血中捕获到的CTC进行代谢功能分型，并用于预测这些CTC的恶性程度。
背景技术
人外周血中的循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell,CTC)是指从肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。由于超过90％的癌症死亡是由转移造成的，而CTC是肿瘤转移的直接来源，因此从血液中分离CTC并对其进行分子检测越来越引起人们的重视。
目前对CTC的检测主要是对癌症患者外周血中的全体CTC进行计数，最具代表性的技术是目前唯一获得美国FDA批准的CellSearch系统，它被批准用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者外周血中CTC的。这一系统运用标记有针对EpCAM抗体的磁性颗粒对癌症患者7.5毫升血液中CTC进行捕获，然后通过细胞固定、透膜、以及三重的免疫荧光染色(DAPI、CK、CD45)，将DAPI+/CK+/CD45-且符合一定形态学标准的细胞定义为CTC并计数。临床试验(CristofanilliM,BuddT,EllisMJ,etal.N.Engl.J.Med.2004,351,781-791；RiethdorfS,FritscheH,MullerV,etal.Clin.CancerRes.2007,13,920-928；CohenSJ,PuntCJA,IannottiN,etal.J.Clin.Oncol.2008,26,3213-3221)发现转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌患者7.5毫升血液中检测到5个及以上的CTC预后较差，反之则预后较好，因此美国FDA在2004、2007与2008年分别批准CellSearch系统用于转移性乳腺癌、结直肠癌与前列腺癌的预后评估、无进展生存期和总生存期的预测，我国国家食品药品管理局在2012年8月批准CellSearch系统用于乳腺癌的预后评估。
然而，仅对全体CTC进行计数无法全面准确的反映肿瘤病灶当前的状态以及转移的风险，其原因在于研究发现CTC具有很大的功能异质性，相当一部分CTC处于凋亡状态，只有很小一部分CTC能够实现转移，这与临床上观察到的是一致的，因此临床上需要真正关注的是那一小部分具有高度活力与转移潜能的CTC。目前已有研究以活CTC(通过活细胞染料或分泌蛋白来确定细胞活性)数目或者活CTC占总CTC的比例为标志物进行临床研究探索CTC的应用领域，但细胞活性本身仍然与肿瘤细胞的恶性程度相关性较低,目前尚缺乏对CTC功能进行检测以确定CTC恶性程度与转移可能性的技术与设备。
因此，本领域迫切需要开发能够有效、快速地检测具有高度活性与恶性程度的CTC的技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效、快速地检测肿瘤患者血液中游离的CTC的恶性程度的方法以及检测设备。
在本发明的第一方面，提供了一种非诊断性地检测循环肿瘤细胞代谢活动的方法，包括步骤：
(a)从外周血样品中富集分离循环肿瘤细胞CTC，从而得到分离到的循环肿瘤细胞CTC；
(b)将上一步骤分离到的循环肿瘤细胞，置于微孔阵列芯片中，从而使得所述微孔阵列芯片的各个微孔中至多具有一个循环肿瘤细胞；
(c)对上一步骤中的循环肿瘤细胞进行复苏处理，从而获得经复苏处理的循环肿瘤细胞；
(d)在带有可检测标记物的葡萄糖类似物存在下，培养所述的经复苏处理的循环肿瘤细胞；和
(e)检测所述循环肿瘤细胞对所述带有可检测标记物的葡萄糖类似物的摄取情况，从而定性或定量地确定所述循环肿瘤细胞代谢活动和/或恶性程度。
在另一优选例中，对所述葡萄糖类似物的摄取量高，就表示该循环肿瘤细胞的恶性程度高。
在另一优选例中，在步骤(c)和(d)之间，还包括步骤：对经复苏处理的循环肿瘤细胞进行饥饿处理。
在另一优选例中，步骤(c)中，在复苏处理中，还包括加入针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体(如anti-CD45-FITC)以识别白细胞，从而将CTC与白细胞区分开。
在另一优选例中，步骤(c)中，在复苏处理中，还包括加入牛血清白蛋白对细胞、微孔芯片进行封闭，消除对2-NBDG的非特异性吸附。
在另一优选例中，步骤(c)中，在复苏处理中，加入死细胞染料(如EthD-1，ethdiumhomodimer-1)，从而识别出死细胞。
在另一优选例中，所述的饥饿处理是将所述循环肿瘤细胞置于低葡萄糖浓度或无葡萄糖的培养条件下，培养一段时间。
在另一优选例中，该饥饿处理的培养时间为1-60分钟，较佳地为2-30分钟，更佳地为5-20分钟。
在另一优选例中，所述的复苏处理包括选自下组的一种或多种：
(i)物理环境复苏，其中所述物理环境复苏是指低氧环境，即氧气体积分数低于10％；
(ii)化学环境复苏，其中所述化学环境是指在含有细胞因子的细胞培养液下培养，其中所述的细胞因子包括表皮生长因子、纤维细胞生长因子或其组合；
(iii)肿瘤细胞培养上清液复苏。
在另一优选例中，所述的可检测标记物包括化学修饰基团。
在另一优选例中，所述的可检测标记物包括荧光基团、生物素。
在另一优选例中，所述的带有可检测标记物的葡萄糖类似物为2-NBDG。
在另一优选例中，所述的外周血样品为来自哺乳动物(如人)的样品。
在另一优选例中，在步骤(a)中，从外周血中富集分离循环肿瘤细胞是通过免疫磁珠法进行分离，其中免疫磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体。
在另一优选例中，在步骤(a)中，通过鱼骨形芯片分离捕获法进行分离。
在另一优选例中，在步骤(a)中，使用图4所示结构的鱼骨形芯片进行分离。
在另一优选例中，在步骤(a)中从外周血样品中富集分离到的循环肿瘤细胞CTC的数量为n1；而在步骤(b)中，所述微孔阵列芯片的微孔数量为n2，并且n2/n1的比值≥10。
在另一优选例中，n2/n1的比值≥20，更佳地n2/n1的比值≥100。
在另一优选例中，在步骤(b)中，将步骤(a)获得的循环肿瘤细胞的悬浮液加到所述微孔阵列芯片，并施加磁场使所述循环肿瘤细胞进入微孔，从而保证葡萄糖摄取检测试验样本不丢失。
在另一优选例中，在步骤(e)中，先清洗去多余的所述葡萄糖类似物，然后根据被摄取进入循环肿瘤细胞的所述葡萄糖类似物的信号，表征该循环肿瘤细胞摄取葡萄糖的能力。
在另一优选例中，在所述清洗去多余的所述葡萄糖类似物的过程中，是在施加磁场的情况下进行，从而确保循环肿瘤细胞被固定在基底上从而不被洗脱。
在另一优选例中，在步骤(b)至(e)中，所述的循环肿瘤细胞的细胞表面结合有磁珠。
在另一优选例中，在另一优选例中，所述的分离到的循环肿瘤细胞CTC的表面结合有免疫磁珠。
在另一优选例中，在步骤(d)中，所述葡萄糖类似物与循环肿瘤细胞共培养的时间为2分钟至2小时，更佳地为5分钟至1小时。
在另一优选例中，在步骤(e)中，对摄取进入循环肿瘤细胞的葡萄糖类似物量的检测通过荧光信号或光谱信号。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的外周血样品是(i)未经任何处理的外周血样品；或(ii)未经去除红细胞处理和/或未经去除白细胞处理的外周血样品。
在另一优选例中，所述的外周血样品是经低速离心去除血小板和血浆的外周血样品。
在另一优选例中，在步骤(e)中，还包括：与参考值或标准曲线进行比较，从而定性或定量地确定所述循环肿瘤细胞代谢活动水平。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测循环肿瘤细胞代谢活动的装置，所述装置包括：
(a)鱼骨形芯片；
(b)微孔阵列芯片；
(c)第一容器，以及置于所述第一容器中的带有可检测标记物的葡萄糖类似物；
(d)任选的用于捕获循环肿瘤细胞的磁珠，所述磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体；和
(e)任选的磁场装置，所述磁场装置包括永久磁铁或电磁铁。
在另一优选例中，所述的装置还包括：
(f)第二容器，以及位于所述第二容器内的封闭剂(如牛血清白蛋白)。
在另一优选例中，所述的装置还包括：
(g)第三容器，以及位于所述第三容器内的用于区分循环肿瘤细胞和白细胞的抗体，例如针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体(如anti-CD45-FITC)。
在另一优选例中，所述的装置还包括：
(h)第四容器，以及位于所述第四容器内的用于识别死细胞的死细胞染料(如EthD-1，ethdiumhomodimer-1)。
在另一优选例中，所述的鱼骨型芯片具有以下结构：芯片设有一个入口和一个出口，通道呈连续的S型，宽度1±0.2mm，通道间间隔1±0.2mm，直边长30-70mm，一共5-15条直边。
在另一优选例中，所述的鱼骨型芯片具有以下结构特征：芯片的横截面呈现周期性的凹凸结构，由两层光刻胶构成，上层的鱼骨图形呈周期性排列，鱼骨宽度为125±20μm，水平夹角为45±5°，周期性间隔为75±10μm。
在另一优选例中，所述的磁珠的粒径为1-1000纳米，更佳地为10-500纳米。
在另一优选例中，所述的磁珠的粒径为1-1000微米，更佳地为10-500微米。
在另一优选例中，所述的磁珠的粒径为1-20毫米，更佳地为1-5毫米。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明一个实例中，微孔芯片CTC磁场捕获示意图。其中，图1A显示了CTC表面结合了抗体和磁球，施加磁场前，CTC分散在溶液中；施加磁场后，CTC在磁场的作用下，进入微孔CTC被分散在独立微孔中。图1B显示了微孔阵列芯片和被捕获的CTC细胞的示意图。
图2显示了本发明一个实例中，循环肿瘤细胞代谢活动检测方法试验流程图。
图3显示了本发明一个实例中，肺癌细胞系摄取2-NBDG后的荧光显微镜照片及其定量结果。NC(negativecontrol)为阴性对照。图中显示了各肺癌细胞系与2-NBDG共孵育20分钟后的荧光显微镜照片，其中阴性对照为H1650细胞与2-NBDG共孵育后的荧光显微镜照片。
图4显示了本发明一个实例中，鱼骨型芯片的设计示意图。其中，图4A显示了鱼骨型芯片的结构：芯片设有一个入口和一个出口，通道呈连续的S型，宽度1mm，通道间间隔1mm，直边长50mm，一共9条直边，芯片的横截面呈现周期性的凹凸结构，由两层50μm的SU8光刻胶制备而成，上层的鱼骨图形呈周期性排列，鱼骨宽度为125μm，水平夹角为45°，周期性间隔为75μm。图4B显示了制备好的鱼骨形芯片。图4C显示了在显微镜下芯片的放大观察图。
图5显示了在本发明一个实例中，对一IV期肺癌患者2毫升外周血中分离得到的5个具有2-NBDG摄取活性的CTC的荧光显微镜照片。其中，图5A为明场显微镜视野图；图5B为荧光场视野图，细胞摄取2-NBDG后发出绿色荧光。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种能够有效、快速地检测血液中极稀有的CTC的恶性程度的方法。本发明方法中，一方面尽可能保持CTC的活力，减少或避免在富集分离过程中对CTC的损失，另一方面通过特殊处理使得处于休眠状态的CTC转变为非休眠状态，进而通过测定细胞摄取葡萄糖的水平，从而高效、快速而准确地检测出具有高活力和/或转移潜能的CTC。在此基础上完成了本发明。
具体地，在本发明中，基于例如免疫磁珠等方法捕获CTC，并通过微控阵列芯片与磁场的使用避免在对CTC的代谢活性检测过程中由于更换溶液、清洗等操作导致CTC的损失或受损。此外，由于CTC的体外分离过程常造成其处于生长抑制、低代谢活性的状态，因此通过复苏处理等步骤营造恢复或促使CTC的生长增殖，进而使其恢复到较好的状态下进行葡萄糖摄取的检测，从而使得检测结果更准确和可靠。
术语
如本文所用，术语“2-NBDG”指(2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose)即(2-(N-(7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)，它是一种带有荧光标记的葡萄糖类似物。
循环肿瘤细胞CTC
循环肿瘤细胞(CTC，CirculatingTumorCell)是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。
在本发明中，适用于本发明方法的CTC细胞没有特别限制，可以是源自各种不同实体瘤的肿瘤细胞。代表性的例子包括(但并不限于)：肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。
肿瘤细胞的能量代谢途径主要是糖酵解，通过大量摄取葡萄糖快速产生ATP以及生物合成所需的物质，确保肿瘤细胞能够快速分裂与增殖。
检测方法和检测机理
本发明提供了一种检测外周血中稀有的循环肿瘤细胞葡萄糖摄取能力的方法。典型地，它包含如下步骤：
a.通过基于免疫磁珠的方法从外周血中富集分离循环肿瘤细胞，使分离到的循环肿瘤细胞表面结合有免疫磁珠；
b.将分离到的循环肿瘤细胞置于一定的细胞培养环境；
c.在上述细胞培养环境中加入经化学基团修饰的葡萄糖类似物，与循环肿瘤细胞共培养一段时间；
d.洗去多余的葡萄糖类似物，然后根据被摄取进入循环肿瘤细胞的葡萄糖类似物的信号表征该循环肿瘤细胞摄取葡萄糖的能力。
为了更好地理解本发明，本发明人提供以下机理供参考。然而，应理解，本发明的权利要求所限定的保护范围并不受该机理的限定。
在本发明中，根据肿瘤细胞摄取葡萄糖的能力大大高于正常细胞的生物学原理提供了一种体外检测CTC代谢活性，即葡萄糖摄取能力的方法。本发明方法的出发点就是将对经适当处理的CTC细胞进行摄取葡萄糖的成像检测，通过检测富集到的CTC摄取葡萄糖能力的强弱，对CTC进行代谢活性的功能分型，以区分活CTC与处于凋亡状态的CTC，以及识别具有高代谢活性的CTC，进而对CTC恶性程度进行鉴别。
在本发明方法中，技术上的挑战和难点主要在于：
(1)在CTC富集过程中需尽可能保持CTC的活性，减少在富集分离过程中对CTC的损伤。为此，本发明方法中宜避免采用如红细胞裂解、密度梯度离心等能导致化学、机械损伤的血液样本预处理方法；
(2)CTC在体外的分离过程对CTC存在一定损伤，使其处于生长抑制及低代谢活性的状态，因此为了更好的进行功能检测，需要营造有利于CTC正常生长增殖的细胞培养环境(包括物理环境、化学环境和生物环境)，尤其是模拟CTC在靶器官形成转移灶的体内微环境，使CTC能够恢复到较好的状态下进行后续的功能检测；
(3)CTC数量极少，可少至一个，因此在葡萄糖摄取检测的过程中需有机制确保极少数目的CTC不会丢失，而通过磁场约束、操纵CTC是一个理想的方法。
就CTC而言，其具有各种不同的表型、特征和代谢活动。在本发明中，所检测的是CTC的葡萄糖摄取能力。本发明人研究表明，CTC的葡萄糖摄取能力虽然是CTC代谢活动的一种，但是却与CTC的活性与恶性程度密切相关，可以更合理地反映CTC细胞的活力和/或恶性程度。
与此相反，目前其他检测CTC的方法主要围绕CTC的数目、基因突变、蛋白标志物等进行，并非对CTC实际功能的直接表征，因此难以有效区分活的CTC与处于凋亡状态的CTC，难以表征CTC之间的功能异质性，难以鉴定具有高度活性与恶性的CTC子群。
在本发明中，通过特殊的复苏处理和饥饿处理，使得本发明方法可以高效、准确地检测出具有高活力和/或转移潜能的CTC。
体外分离得到CTC的复苏处理
在本发明方法中，一个关键步骤是对通过体外分离得到的CTC的复苏处理。
一种代表性的方法是用肿瘤细胞培养物的上清培养液对分离的CTC进行复苏处理。
在本发明中，复苏处理的时间没有特别限制，通常为2-72小时，较佳地为4-48小时，更佳地为12-36小时。
在另一优选例中，在复苏处理中，可以选择肺成纤维细胞的条件培养液。
在另一优选例中，在复苏处理中，可以选用添加了生长因子的基础培养基。代表性的细胞因子包括(但并不限于)：表皮生长因子(EGF)、纤维细胞生长因子(basicFGF)、或其组合。通常，各生长因子的浓度为5-100ng/ml，更佳地为10-50ng/ml。
一种代表性的人工配置的复苏培养基是由细胞培养液RPMI-1640、表皮生长因子(EGF，20ng/ml)、纤维细胞生长因子(basicFGF，20ng/ml)以及补充剂B-27(购自LifeTechnologies公司)(1：50稀释)共同组成的培养液。
CTC的饥饿处理
在本发明优选方法中，对于经复苏处理后的CTC细胞宜进行饥饿处理。
虽然饥饿处理可能对于某些CTC细胞可能不是必须的，但是本发明的研究发现，饥饿处理对于绝大多数(或可能所有)的CTC细胞而言，都有助于提高检测的准确性。
在本发明中，进行饥饿处理时，宜将分离的CTC细胞置于低葡萄糖浓度或无葡萄糖的培养条件下，培养一段时间。
在本发明中，该饥饿处理的培养时间通常为1-60分钟，较佳地为2-30分钟，更佳地为5-20分钟。
此外，所述的低葡萄糖浓度指饥饿处理时的葡萄糖浓度M1远低于该CTC细胞(或其对应的肿瘤细胞)正常培养条件下葡萄糖浓度M0，通常M1/M0≤1/2，较佳地≤1/5，更佳地≤1/10。
在本发明中，当饥饿处理时的葡萄糖浓度M1远低于该CTC细胞(或其对应的肿瘤细胞)正常培养条件下葡萄糖浓度M0的1/50或更低(M1/M0≤1/50，较佳地≤1/100)时，可视为在无葡萄糖的培养条件下培养。
本发明的结果表明，经饥饿处理后，分离的CTC细胞对于葡萄糖类似物(如2-NBDG)，有更一致和更可比较的吸收，因此使得检测结果更可靠。
其他处理
本发明的研究表明，凋亡细胞是不会摄取2-NBDG的，活细胞会摄取2-NBDG，而且越恶性的肿瘤细胞其摄取越快越多。
然而，死细胞一般细胞膜表面破损，荧光的2-NBDG会扩散进去，从而导致也有荧光，所以事先对死细胞的封闭就比较重要，能够避免2-NBDG扩散进死细胞后的非特异性吸附，从而提高检测灵敏度和准确性。
因此，在本发明中，在另一优选例中，在复苏处理中，还包括加入牛血清白蛋白对细胞、微孔芯片进行封闭，消除对2-NBDG的非特异性吸附。
在另一优选例中，在复苏处理中，还包括加入针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体(如anti-CD45-FITC)以识别白细胞，从而将CTC与白细胞区分开。
在另一优选例中，在复苏处理中，加入死细胞染料(如EthD-1，ethdiumhomodimer-1)，从而识别出死细胞。
检测装置
本发明还提供了一种用于检测循环肿瘤细胞代谢活性的装置。
典型地，本发明装置包括：
(a)CTC捕获“鱼骨形”芯片；
(b)微孔阵列芯片；
(c)第一容器，以及位于所述第一容器内的带有可检测标记物的葡萄糖类似物(如2-NBDG)；
(d)任选的用于捕获循环肿瘤细胞的磁珠，所述磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体；和
(e)任选的磁场装置，所述磁场装置包括永久磁铁或电磁铁。
在另一优选例中，所述的装置还包括选自下组的一个或多个组成部分：
(f)第二容器，以及位于所述第二容器内的封闭剂(如牛血清白蛋白)；
(g)第三容器，以及位于所述第三容器内的用于区分循环肿瘤细胞和白细胞的抗体，例如针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体(如anti-CD45-FITC)
(h)第四容器，以及位于所述第四容器内的用于识别死细胞的死细胞染料(如EthD-1，ethdiumhomodimer-1)。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明方法可以低成本的、快速、准确地检测极少数目的CTC的葡萄糖摄取能力并对其进行功能分型。本发明方法不仅能够对具有活性的CTC进行计数，而且能够识别具有高度活性与恶性的CTC，为进一步的针对这些CTC进行分子检测提供基础。
(b)本发明通过微控阵列芯片与磁场操纵确保了极少数目的CTC在整个代谢活性检测过程中不被丢失，这是稀有细胞检测的瓶颈所在。
(c)本发明提供了一种针对CTC功能的表征手段。CTC的重要性在于它不但代表了原位肿瘤病灶，同时也是肿瘤血行转移的直接来源，而CTC本身却存在着巨大的功能异质性，即使这些CTC具有相似的基因组特征。直接对CTC进行功能表征有助于了解原发肿瘤的状态以及评估CTC的转移潜能。本发明提供了针对CTC代谢活性的简单、廉价、可靠的表征手段，并可对CTC进行代谢活性的分型，以便于计数具有高代谢活性的CTC并对其进行进一步的分子检测，如基因组、表观基因组的检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料
在实施例中，所有培养基、细胞系、抗体、磁珠等均为市售购得。
实施例1
极少数目细胞的葡萄糖类似物摄取检测
提供一微孔阵列PDMS芯片，其结构如图1所示。
取表面结合免疫磁球的肺癌细胞A549、H1650、H1975各30个，分别悬于约200微升PBS中，置于所述的微孔阵列PDMS芯片(图1)中，通过操纵磁场确保每个细胞均进入并固定在微孔中。
如图2所示，使用不含葡萄糖的细胞培养液RPMI-1640孵育细胞10分钟，从而对各肿瘤细胞进行饥饿处理。然后，加入含2-NBDG(浓度为0.3mM)的细胞培养液RPMI-1640继续孵育细胞20分钟。孵育结束后，在冰上用4℃的PBS充分、反复清洗细胞，同时施加磁场确保细胞被固定在微孔中，最后在显微镜下对芯片上的细胞进行明场与荧光成像。
结果如图3显示。在整个检测过程中，由于磁场的约束，细胞并未损失。检测结果显示，具有EGFR突变的H1650细胞与H1975细胞相对于EGFR野生型的A549细胞显示了更高的2-NBDG葡萄糖类似物的摄取能力，具有统计学意义。这一检测结果与以下情况基本相符：具有主要癌基因突变或抑癌基因失活的细胞往往伴随了代谢通路的上调，从而导致代谢活性的升高。
此外，与H1975细胞相比，H1650细胞的2-NBDG葡萄糖类似物的摄取能力更高(但未达到统计上显著的程度)。这一检测结果提示，H1650细胞具有更高的2-NBDG葡萄糖类似物与H1650细胞中抑癌基因PTEN失活存在一定相关性。
实施例2
外周血中CTC的葡萄糖类似物摄取检测
本实施例中，方法包括以下步骤：
(1)对于2毫升肺癌患者(自愿者)的外周血样本，首先低速离心(200g)5分钟除去上层的富血小板血浆，剩余细胞用Hank平衡盐溶液(HBSS)重悬至2毫升，并加入一组生物素标记的抗体(针对的抗原分别为EpCAM,EGFR,HER2,MUC1。各抗体的最终浓度为1μg/mL)共孵育1小时，多余抗体通过离心(300g，5分钟)去除，然后加入链霉亲和素标记的磁球(0.8微米)共孵育30分钟，多余磁球通过离心(300g，5分钟)去除，将细胞重悬在5毫升的HBSS中，形成经预处理的样本。
(2)提供一鱼骨型芯片，其结构如图4所示。
(3)对于所述鱼骨型芯片的微通道，用10％山羊血清与3％牛血清白蛋白混合溶液封闭一小时以避免细胞的非特异性吸附，再将5毫升上述处理后的细胞悬液通过恒流注射泵以5mL/h的流速通入芯片通道，并在芯片上方设置向上的磁场，从而实现在流动过程中动态捕获CTC。结束后用HBSS以10mL/h的流速清洗芯片5分钟以除去非特异性吸附的细胞，然后撤去磁场将CTC收集在约200微升的液体中，其中除了CTC还包括极少数目非特异性捕获的白细胞。
(4)将上述约200微升细胞悬液置于微孔阵列PDMS芯片中，芯片上的纳米孔事先用0.1％的I型胶原蛋白在37℃孵育2小时使其表面吸附有胶原蛋白，然后通过操纵磁场确保每个细胞均进入并固定在微孔中。
(5)在微控芯片上加入人工配置的复苏培养基(细胞培养液RPMI-1640、20ng/ml表皮生长因子EGF、20ng/ml纤维细胞生长因子basicFGF、1：50稀释的补充剂B-27)，置于37度、3％氧气浓度的细胞培养箱中培养24小时，然后用加了牛血清白蛋白的复苏培养基(细胞培养液RPMI-1640、20ng/ml表皮生长因子EGF、20ng/ml纤维细胞生长因子basicFGF、1：50稀释的补充剂B-27、1％牛血液白蛋白BSA)孵育30分钟起到封闭的作用。
(6)芯片上的CTC培养结束后，使用不含葡萄糖的细胞培养液RPMI-1640孵育细胞10分钟，使其饥饿，然后加入含2-NBDG(浓度为0.3mM)的细胞培养液RPMI-1640继续孵育细胞20分钟。
(7)孵育结束后，在冰上用4℃的PBS充分、反复清洗细胞，同时施加磁场确保细胞被固定在纳米孔中。
(8)在显微镜下对芯片上的细胞进行明场与荧光成像。
结果如图5所示，有5个CTC检测到了较强的荧光信号，呈现了对2-NBDG的快速摄取，而白细胞则没有可检测到荧光信号，即对2-NBDG的摄取。这些CTC在后续的单细胞测序均检测到了KRAS突变。
对比例1
重复实施例2，其中使用的外周血样本为来自同一肺癌患者(自愿者)的同一批次的外周血样本。不同点在于，省略步骤(5)的芯片上培养过程，直接进行步骤(6)的饥饿与2-NBDG摄取实验。
结果：检测不到可区别于背景的来自细胞的荧光信号，即刚经过体外分离的CTC的生长增殖受到抑制，代谢活性大大降低，以至于难以检测。
实施例3
重复实施例2，其中使用的外周血样本为来自同一肺癌患者(自愿者)的同一批次的外周血样本。不同点在于，在步骤(5)中，将肺癌细胞H1650培养皿中的上层条件培养液与肺成纤维细胞培养皿中的上层条件培养液按照1:1的比例组成新的条件培养液用于微控芯片中CTC的培养。
结果获得了与实施例2中相似的结果，有6个CTC检测到了明显的荧光信号。
实施例4-6
重复实施例2，不同点在于：
在实施例4中，在复苏处理中，还包括加入封闭剂牛血清白蛋白对细胞、微孔芯片进行封闭，消除对2-NBDG的非特异性吸附(实施例4)；
在实施例5中，在复苏处理中，还包括加入针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体(如anti-CD45-FITC)以识别白细胞，从而将CTC与白细胞区分开；
在实施例6中，在复苏处理中，加入死细胞染料(如EthD-1，ethdiumhomodimer-1)，从而识别出死细胞。
结果同样获得了与实施例2中相似的结果，实施例4-6中分别有5、6和5个CTC检测到了明显的荧光信号。
此外，由于在这些实施例4-6中添加了封闭剂牛血清白蛋白、针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体、和死细胞染料，因此挑选CTC细胞更为方便，也更不容易将CTC细胞与无关细胞混淆。
讨论
目前，在临床上通过使用可被肿瘤细胞吞噬或吞食的放射性物质，通过放射性物质的PET成像可用于显示肿瘤的部位、形态、大小、数量及肿瘤内的放射性分布，临床上主要用于恶性肿瘤的诊断及良、恶性的鉴别诊断、临床分期、评价疗效及监测复发等。
然而，肿瘤存在很大的异质性，例如一侧肿瘤的突变很可能不同于另一侧，临床上以上取样的时候一般都取相对较恶性的组织来测序。CTC也有同样的问题，如果CTC比较多，那么混在一起测序时，恶性CTC的信号就可能被稀释或淹没，或因为灵敏度不够导致测不出来。因此，从CTC细胞中简便高效地选出最有代表性或恶性程度高的CTC就成为一个难题。
本发明基于具有荧光基团的葡萄糖类似物与相应的方法、装置来检测血液中极为稀有的CTC的葡萄糖摄取能力，从而可对CTC进行代谢功能的分型，从而有效选出最有代表性或恶性程度高的CTC。
本发明针对数目极少的肿瘤患者外周血中的CTC(一般1-1000个)进行葡萄糖摄取检测，其原理是检测CTC对经标记的葡萄糖类似物的摄取能力，而该葡萄糖类似物与正常葡萄糖有类似的代谢途径(尤其是在摄取环节非常相似)。此外，肿瘤细胞代谢的特点用高水平的有氧糖酵解替代正常组织细胞的氧化磷酸化。由于糖酵解的效率较低，因为肿瘤细胞需要摄取大量葡萄糖。
本发明主要包括三方面的的技术挑战：(1)在对数目极少的CTC进行葡萄糖类似物摄取检测时需确保CTC不被丢失；(2)从肿瘤患者外周血样本中富集分离CTC的过程需确保对CTC活性的损伤非常小；(3)由于CTC在体外的分离过程对其存在一定损伤，使其处于生长抑制及低代谢活性的状态，因此需将CTC置于合适的细胞培养环境使其恢复原有的代谢活性。
本发明通过经标记的葡萄糖类似物来定量检测稀有肿瘤细胞的葡萄糖摄取能力，如荧光基团标记的D型葡萄糖类似物2-NBDG，它具有与D型葡萄糖相似的代谢途径，通过葡萄糖转运蛋白(GLUT)进入细胞内，然后其C-6位置被己糖激酶磷酸化。研究已显示，相比于良性细胞，2-NBDG可被恶性肿瘤细胞快速摄取，因此是一种检测恶性肿瘤细胞的光学标志物。在对稀有肿瘤细胞进行短暂的葡萄糖“饥饿”后，将其与2-NBDG共孵育一段时间后，用冰PBS清洗后通过荧光显微镜检测细胞摄取2-NBDG后发出的荧光信号。
对于技术挑战1，即对数目极少(少至一个)的稀有细胞进行检测时，需确保在检测过程中细胞不会丢失。因此，本发明所采用的方法是首先通过偶联特异性抗体的免疫磁球将CTC从血液样本中分离出来，然后CTC悬液加到一个微孔阵列(见图1)上并适当施加磁场使所有与磁球结合的CTC在磁场作用下均进入微孔，而微孔的数目(数千个)远远大于CTC的数目，从而确保没有微孔内至多只有一个CTC，且在检测过程中CTC被磁场限制在微孔中，不会因加入试剂或者清洗步骤而丢失。
对于技术挑战2，即从肿瘤患者外周血样本中富集分离CTC的过程需确保对CTC活性的损伤非常小。通过红细胞裂解以及密度梯度离心对血液进行预处理的方法对其他细胞存在一定损伤，需避免采用。本发明将免疫磁球与微流控芯片技术相结合能够直接在不事先去除红细胞或白细胞的情况下直接从血液中分离CTC。但是，血浆和部分血小板可以事先通过低速离心除去，剩余的细胞需重悬在含有葡萄糖的平衡溶液中，如Hank平衡盐溶液(Hank’sBalancedSaltSolution，HBSS)或者细胞培养基。
对于技术挑战3，即体外分离过程对CTC存在一定损伤，使其处于生长抑制及低代谢活性的状态，需将CTC置于合适的细胞培养环境确保其能够恢复原有的代谢活性，其核心在于能够有效模拟体内肿瘤的微环境。这种微环境可能包括物理微环境如低氧气浓度，化学微环境如各种生长因子、补充剂以及三维培养基等，生物微环境如与CTC共培养的“饲养”细胞或包含“饲养”细胞分泌物的上清液等。这里的“饲养”细胞包括与CTC同组织来源的肿瘤细胞或成纤维细胞，它们可以来自细胞系或患者组织样本。一般来说，没有统一的CTC培养方法，不同来源的CTC可以采用不同的培养方式，以便获得最佳的培养效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种非诊断性地检测循环肿瘤细胞代谢活动的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)从外周血样品中富集分离循环肿瘤细胞CTC，从而得到分离到的循环肿瘤细胞CTC；
(b)将上一步骤分离到的循环肿瘤细胞，置于微孔阵列芯片中，从而使得所述微孔阵列芯片的各个微孔中至多具有一个循环肿瘤细胞；
(c)对上一步骤中的循环肿瘤细胞进行复苏处理，从而获得经复苏处理的循环肿瘤细胞；
(d)在带有可检测标记物的葡萄糖类似物存在下，培养所述的经复苏处理的循环肿瘤细胞；和
(e)检测所述循环肿瘤细胞对所述带有可检测标记物的葡萄糖类似物的摄取情况，从而定性或定量地确定所述循环肿瘤细胞代谢活动和/或恶性程度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)和(d)之间，还包括步骤：对经复苏处理的循环肿瘤细胞进行饥饿处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的饥饿处理是将所述循环肿瘤细胞置于低葡萄糖浓度或无葡萄糖的培养条件下，培养一段时间。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复苏处理包括选自下组的一种或多种：
(i)物理环境复苏，其中所述物理环境复苏是指低氧环境，即氧气体积分数低于10％；
(ii)化学环境复苏，其中所述化学环境是指在含有细胞因子的细胞培养液下培养，其中所述的细胞因子包括表皮生长因子、纤维细胞生长因子或其组合；
(iii)肿瘤细胞培养上清液复苏。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物包括化学修饰基团。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，从外周血中富集分离循环肿瘤细胞是通过免疫磁珠法进行分离，其中免疫磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中从外周血样品中富集分离到的循环肿瘤细胞CTC的数量为n1；而在步骤(b)中，所述微孔阵列芯片的微孔数量为n2，并且n2/n1的比值≥10。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，先清洗去多余的所述葡萄糖类似物，然后根据被摄取进入循环肿瘤细胞的所述葡萄糖类似物的信号，表征该循环肿瘤细胞摄取葡萄糖的能力。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)至(e)中，所述的循环肿瘤细胞的细胞表面结合有磁珠。
10.一种用于检测循环肿瘤细胞代谢活动的装置，其特征在于，所述装置包括：
(a)鱼骨形芯片；
(b)微孔阵列芯片；
(c)第一容器，以及置于所述第一容器中的带有可检测标记物的葡萄糖类似物；
(d)任选的用于捕获循环肿瘤细胞的磁珠，所述磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体；和
(e)任选的磁场装置，所述磁场装置包括永久磁铁或电磁铁。
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