CN117074692B - 一种关于脑脊液中肿瘤细胞her2抗原表达生物信息的识别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种关于脑脊液中肿瘤细胞HER2抗原表达生物信息的识别方法，包括如下步骤：第一步，采用细胞离心涂片收集器收集乳腺癌患者若干脑脊液样本以获取其中潜在的肿瘤细胞样本；第二步，将存在于乳腺癌患者脑脊液样本中的肿瘤细胞样本离心制作涂片；第三步，将涂片固定后的肿瘤细胞样本立即进行HER2免疫组化检测；第四步，将完成第三步免疫组化检测后的肿瘤细胞样本进行数据积分来进行关于HER2表达的生物信息的确认和量化，不同于组织病理基于肿瘤组织结构和定位检测HER2表达强度的方法，所述量化为计算不同染色程度的肿瘤细胞并分级后积分，积分值与生物信息的强弱呈正相关。

Description

一种关于脑脊液中肿瘤细胞HER2抗原表达生物信息的识别 方法

技术领域

本发明涉及医学分子生物学技术领域，特别涉及一种关于脑脊液中肿瘤细胞HER2抗原表达生物信息的识别方法。

背景技术

乳腺癌患者的生存期的不断延长，越来越多抗HER2靶向药物的应用使得HER2阳性乳腺癌患者的生存期延长最为明显，该类型好发脑转移，脑转移治疗失败后容易进展至脑膜转移，因此HER2阳性乳腺癌患者的脑膜转移发病率逐年升高。

乳腺癌脑膜转移确诊的金标准是脑脊液中找到肿瘤细胞，在此基础上进一步明确脑脊液中肿瘤细胞是否表达HER2抗原至关重要，可以为临床选择药物提供重要信息。由于乳腺癌异质性很强，例如：(1)HER2在乳腺癌原发灶中强表达，而在脑脊液的肿瘤细胞中可能低表达或不表达；(2)HER2在乳腺癌原发灶中低表达，而在脑脊液的肿瘤细胞中不表达；(2)HER2在乳腺癌原发灶中不表达，而在脑脊液的肿瘤细胞中有表达。若HER2表达则有机会使用抗HER2靶向药物，HER2强表达、低表达和不表达的灵敏度依次下降，因此，脑脊液中肿瘤细胞HER2抗原表达的生物信息能帮助在选择抗HER2靶向药物等数据应用上提供参考依据。

随着检测技术的发展，HER2的表达由传统的阳性阴性二分类演变为近年来衍生HER2低表达的新概念，在乳腺癌中，约45％～55％呈现HER2低表达状态，随着新型抗体偶联药物T-DXd在HER-2低表达乳腺癌患者中被确认有效，此类药物已然成为HER-2低表达晚期乳腺癌患者新的选择，目前国内药物临床应用可及，并且很多类似药物正在我国研发和进行临床研究，未来可选择的药物越来越多。

对于HER2检测来说，组织样本是比较理想的类型，既往的风险识别标准。但是，临床仍有未被满足的需求，例如对于脑膜转移癌患者而言，脑膜组织样本活检在临床上因创伤大和阳性率低几乎不被使用，而腰椎穿刺属于临床常用的一种检测手段，每次可获取5ml的脑脊液标本用于检测有无肿瘤细胞，而脑脊液中肿瘤细胞属于细胞学检测而并非传统的组织检测，受限于脑脊液的每次送检量5ml和脑脊液中从脑膜上脱落的肿瘤细胞数有限，考虑传统的方法往往只能够检测有无肿瘤细胞和粗粗的半定量(大量、少量或偶见)，无法获取更多信息。如何提高乳腺癌脑膜转移患者脑脊液中的肿瘤细胞收集效率及对HER2检测定性和半定量至关重要。

乳腺癌患者的脑脊液使用的细胞离心涂片收集器已经申请了实用新型专利(申请号2019211607497，申请日期2019-07-23，公布/公告号CN210953565U，公布/公告日期2020-07-07)，该细胞离心涂片收集器可以用于脑脊液中的肿瘤细胞收集，并且较传统方法能收集到更多肿瘤细胞，为HER2抗原免疫组化检测提供足够的肿瘤细胞。

本发明在此基础上收集到脑脊液足够的肿瘤细胞，只要用新的方法检测到脑脊液中的肿瘤细胞膜上存在HER2抗原的免疫组化表达，并进一步用新的方法量化HER2抗原表达，通过解决关于乳腺癌脑膜转移HER2是否表达和表达强度的迫切需求，为后续的数据使用提供参考依据。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种关于脑脊液中肿瘤细胞HER2抗原表达生物信息的识别方法。以克服现有技术存在的脑脊液样本取材量受限，肿瘤细胞收集数量有限(不像乳腺癌组织中的肿瘤细胞那么大量和集中)，乳腺癌HER2表达存在异质性的问题，提供一种可以量化的关于脑脊液中肿瘤细胞HER2抗原表达生物信息的识别方法。

为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：

一种关于脑脊液中肿瘤细胞HER2抗原表达生物信息的识别方法，包括如下步骤：

第一步，采用细胞离心涂片收集器乳腺癌患者若干脑脊液样本以获取其中潜在的肿瘤细胞样本；

第二步，将存在于所述乳腺癌患者脑脊液样本中的肿瘤细胞样本离心制作涂片_；

第三步，将涂片固定后的肿瘤细胞样本进行HER2免疫组化检测；

第四步，将完成所述第三步免疫组化检测后的肿瘤细胞样本进行数据积分来进行关于HER2表达的生物信息的确认和量化，所述量化为计算不同染色程度的肿瘤细胞并分级后积分，积分值的高低与HER2表达的生物信息的强弱呈正相关。

在本发明的一个优选实施例中，所述细胞离心涂片收集器为公告号CN210953565U所提及的细胞离心涂片收集器。

在本发明的一个优选实施例中，所述离心制作涂片具体为将所述乳腺癌患者脑脊液样本进行低速离心5-15分钟后去上清后得沉淀物制作待固定的涂片后进行二次低速离心后固定以形成固定涂片。

在本发明的一个优选实施例中，所述HER2免疫组化检测具体为如下步骤：

步骤一，采用预冷的有机溶剂对固定涂片进行固定10-20分钟后采用PBS缓冲液进行若干次涂片清洗；

步骤二，清洗后的涂片中加入一抗，所述一抗为兔抗人HER-2/neu免疫组化单克隆抗体；其后进行模拟人体温度的孵育；

步骤三，完成孵育后再进行若干次涂片清洗后进行DAB显色后采用复染剂进行复染后水洗；

步骤四，采用梯度乙醇脱水后的涂片中浸入二甲苯后采用中性树脂封片获得完成免疫组化检测后的肿瘤细胞样本，进行HER2表达的积分判断。

在本发明的一个优选实施例中，所述第四步中的数据积分具体为如下步骤：

对HER2的积分值采用中性粒细胞碱性磷酸酶的量化方式进行量化；

将完成免疫组化检测后的肿瘤细胞样本的染色反应程度进行分级，分为0、1+、2+、3+和4+五个等级；

并读取每个分级后的染色的肿瘤细胞数获得0级染色的肿瘤细胞数、1级染色的肿瘤细胞数、2级染色的肿瘤细胞数、3级染色的肿瘤细胞数和4级染色的肿瘤细胞数五个细胞数指标；

脑脊液中肿瘤细胞HER2阳性率计算如下：

在油镜下，计数视野中五个等级肿瘤细胞数作为分母，计数HER2为1+、2+、3+和4+的四个等级的肿瘤细胞数作为分子，乘以100％，即为脑脊液中乳腺癌细胞的HER2阳性率；

脑脊液中肿瘤细胞HER2的积分值的计算如下：

在油镜下，确定视野中每个细胞是否表达HER2,在此基础上记录每个细胞HER2表达的强度等级(0，1+，2+，3+，4+)，将HER2表达强度和该强度的肿瘤细胞个数相乘，其乘积计算结果即为HER2积分值。

本发明的有益效果在于：

本发明克服了由于脑脊液取材量受限(每次腰椎穿刺检测最多留取5ml脑脊液标本送检),即使其中的肿瘤细胞少(乳腺癌脑膜转移初期脑脊液中的肿瘤负荷小)，HER2表达本身存在异质性(乳腺癌成分复杂或转移灶HER2表达丢失)的问题，对肿瘤细胞中的HER2表达与否进行判断并量化有关脑脊液中HER2表达的生物信息。

本发明完全不同于现有技术当中普遍采用的组织病理基于肿瘤组织结构和定位的评估，由于脑脊液中的肿瘤细胞是分散的，因此，采用细胞表达HER2的百分比和每个细胞表达强度与细胞数乘积来评估强度具有独特性，评估脑脊液中HER2是否表达及量化具有科学性。

附图说明

图1为脑脊液中乳腺癌细胞膜表达HER2的示意图一(0级，图中蓝染的细胞)。

图2为脑脊液中乳腺癌细胞膜表达HER2的示意图二(1+级，图中最大的细胞)。

图3为脑脊液中乳腺癌细胞膜表达HER2的示意图三(2+级)。

图4为脑脊液中乳腺癌细胞膜表达HER2的示意图四(3+级，图中最左侧的细胞)。

图5为脑脊液中乳腺癌细胞膜表达HER2的示意图五(4+级)。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式来进一步描述本发明。

本发明的一种脑脊液中HER2抗原表达的检测方法，包括如下步骤：

第1步，利用CN210953565U所公开的细胞离心涂片收集器提高肿瘤细胞的收集效率：

受限于每次送检的脑脊液的总量≤5ml，进行最低下限数量的评估，最少获得20个肿瘤细胞，最多评估100个肿瘤细胞。

第2步，脑脊液的肿瘤细胞涂片：

将送检的5ml脑脊液122g低速离心10分钟,去上清液后留取1ml沉淀物，制备2张涂片，每张涂片有2个孔，每个孔加入250ul沉淀，2张涂片122g低速离心10分钟。整个过程注意防止脱片。

第3步，将脑脊液的肿瘤细胞涂片固定后立即进行HER2免疫组化检测：

1)将涂片采用固定液(4℃预冷的丙酮固定15分钟)固定后PBS(PH7.2的缓冲液)洗3次，每次5分钟；

2)加入一抗(兔抗人HER-2/neu免疫组化单克隆抗体；来源：兔细胞培养上清液；克隆号：MXR001，福州迈新生物技术开发有限公司生产)37℃蒸馏水孵育30分钟后中止；

3)PBS洗3次，每次5分钟，加入二抗37℃蒸馏水孵育30分钟后中止，PBS洗3次，每次5分钟，DAB显色5分钟后蒸馏水终止显色，苏木精复染2分钟，水洗；

4)梯度乙醇脱水(70％，80％，95％，95％，100％，100％)，浸入二甲苯后中性树脂封片，准备镜检。

第4步，计算HER2积分值，以量化HER2表达百分比和强度(参见表1和表2)：

(1)正常脑脊液包含的淋巴细胞或单核组织巨噬细胞膜不表达HER2，染色反应强度均为0；转移到脑脊液的乳腺癌细胞可呈阴性反应或阳性反应，染色强度依次为0或1+，2+，3+,4+。见图1-5。

(2)HER2阳性率的计算：在油镜下，计数视野中肿瘤细胞(特征是细胞核大、深染色和或存在分裂相)数，最少计数20个最多计数100个，作为分母，计数HER2为1+，或2+，或3+,或4+的肿瘤细胞数作为分子，乘以100％，即为脑脊液中乳腺癌细胞的HER2阳性率。

(3)HER2积分值的计算：在油镜下，确定视野中每个细胞是否表达HER2,在此基础上记录每个细胞HER2表达的强度(0，1+，2+，3+，4+)，将HER2表达强度和该强度的肿瘤细胞个数相乘，其乘积计算结果即为HER2积分值。

涂片1的数据如表1所示：

计算:脑脊液中肿瘤细胞HER2阳性率＝(4+8+6+12)÷40×100％＝75％,HER2积分值＝0×10+1×4+2×8+3×6+4×12＝86。

涂片2的数据如表2所示：

计算:脑脊液中肿瘤细胞HER2阳性率＝(20+10+5+5)÷100×100％＝40％,HER2积分值＝0×60+1×20+2×20+3×5+4×5＝75。

Claims (1)

1.一种用于识别脑脊液中肿瘤细胞HER2抗原表达生物信息的装置，其特征在于，所述装置包括：

获取模块，所述获取模块用于收集乳腺癌患者若干脑脊液样本以获取其中潜在的肿瘤细胞样本；所述收集采用细胞离心涂片收集器进行；

涂片制作模块，所述涂片制作模块用于将存在于所述乳腺癌患者脑脊液样本中的肿瘤细胞样本离心制作涂片；所述离心制作涂片为：将所述乳腺癌患者脑脊液样本进行低速离心5-15分钟，去上清后得沉淀物，制作待固定的涂片后进行二次低速离心，固定以形成固定涂片；

检测模块，所述检测模块用于将涂片固定后的肿瘤细胞样本立即进行HER2免疫组化检测；

所述HER2免疫组化检测为如下步骤：

步骤一，采用预冷的有机溶剂对涂片进行固定10-20分钟后采用PBS缓冲液进行若干次涂片清洗；

步骤二，清洗后的涂片中加入一抗，所述一抗为兔抗人HER-2/neu免疫组化单克隆抗体；其后进行模拟人体温度的孵育；

步骤三，完成孵育后再进行若干次涂片清洗，DAB显色后用蒸馏水终止显色，采用复染剂进行复染，然后水洗；

步骤四，采用梯度乙醇脱水后的涂片中加入二甲苯，然后采用中性树脂封片获得完成免疫组化检测后的肿瘤细胞样本，以进行HER2表达的积分判断；

所述装置还包括量化模块，所述量化模块用于将通过所述检测模块完成免疫组化检测后的肿瘤细胞样本进行数据积分来进行关于HER2表达的生物信息的确认和量化，所述量化为计算不同染色程度的肿瘤细胞并分级后积分，积分值的高低与HER2表达的生物信息的强弱呈正相关；所述量化模块中的数据积分为如下步骤：

对HER2的积分值采用中性粒细胞碱性磷酸酶的量化方式进行量化，以量化HER2表达百分比和强度；

将完成免疫组化检测后的肿瘤细胞样本的染色反应程度进行分级，分为0、1+、2+、3+和4+五个等级；

并读取每个分级后的染色的肿瘤细胞数获得0级染色的肿瘤细胞数、1级染色的肿瘤细胞数、2级染色的肿瘤细胞数、3级染色的肿瘤细胞数和4级染色的肿瘤细胞数五个细胞数指标；

脑脊液中肿瘤细胞HER2阳性率计算如下：

在油镜下，计数五个等级视野中肿瘤细胞作为分母，计数HER2为1+、2+、3+和4+的四个等级的肿瘤细胞数作为分子，乘以100%，即为脑脊液中乳腺癌细胞的HER2阳性率；

脑脊液中肿瘤细胞HER2的积分值的计算如下：

在油镜下，确定视野中每个细胞是否表达HER2,在此基础上记录每个细胞HER2表达的强度等级，所述强度等级包括0，1+，2+，3+和4+，将HER2表达强度和该强度的肿瘤细胞个数相乘，其乘积计算结果即为HER2积分值。