CN113917160A - 采用her2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法 - Google Patents

采用her2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，所述方法包括以下步骤：S1：采集乳腺癌患者的外周血，通过特制的纳米基底膜,使血液中的有核细胞全部平铺富集在纳米基底上固定并分离；S2：对细胞进行荧光标记后，利用高内涵扫描仪检测CTCs，进行计数和蛋白分析，如图1；S3：若存在，对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养；若不存在，重复步骤S1～S2；S4：筛选出的乳腺癌循环肿瘤细胞中加入HER2抗体共孵育；S5：检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。本发明方法操作简单，检测准确度高，可以避免假阴性等情况，提高对乳腺癌的排查准确度。

Description

采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性 方法
[技术领域]
本发明涉及分子生物学检验技术领域，具体是涉及一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌CTC的特异性方法。
[背景技术]
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是指由原发灶脱落，侵入血液循环的肿瘤细胞。进入循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡。只有极少数具有高度活力、高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。CTCs检测被看作液体活检，具有实时监测功能，是近30年来研究应用的仅有的几个新型肿瘤标志物之一，通过检测血液中的CTC数量可对肿瘤进行个体化治疗、疗效评估和复发监控。
人类表皮生长因子受体2(HER-2，又称C-erbB-2基因)定位于人染色体17q21，编码一种185ku的跨膜酪氨酸激酶受体，是表皮生长因子受体家族(EGFRs)之一。临床研究显示，HER-2基因扩增或过表达的患者肿瘤负荷大，淋巴结转移率高，激素受体阴性比例高，组织学分级低，肿瘤的增殖指数高，无进展生存期(PFS)和总生存时间(OS)缩短，是乳腺癌的独立预后因素，并且乳腺癌患者HER-2状态直接关系到靶向治疗药物的选择。检测方法有免疫组化、FISH等。
随着女性乳腺癌死亡率的逐年上升，乳腺癌已成为女性死亡的重要原因，目前现有技术中对乳腺癌的检测、预后判断等仍有一定的不足。此外，由于乳腺癌的病程是一个长期的过程，HER-2受体可能存在异质性。因此，为了更精准有效的检测排查乳腺癌，进而降低乳腺癌的死亡率，现需要一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的方法来解决改善这一问题。
[发明内容]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法。
本发明的技术方案是:一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，包括以下步骤：
S1：采集乳腺癌患者的外周血，富集并固定有核细胞；
S2：荧光标志物筛选乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验，检验其是否存在；
S3：若存在，对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养；若不存在，重复步骤S1～S2；
S4：筛选出的乳腺癌循环肿瘤细胞中加入HER2抗体共孵育；
S5：检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。
进一步地，步骤S1中具体为：(1)将培养皿置于等离子仪中灭菌清洗12min，开紫外灭菌超净台，用2％的APTES润洗培养皿表面，避光1小时，吸除APTES，用纯水清洗培养皿5-6次，将培养皿置于80℃烘箱烘干1小时；(2)全血裂解后，室温放置15min，期间均匀摇晃，200RCF离心5分钟，吸除上清，保留细胞，向离心管中加入2mL 1％FPBS，混匀后于200RCF离心5分钟，去上清；(3)加入1ml的FPBS混匀，将混匀的细胞加入经过处理的培养皿中，37℃恒温摇床培养45min，培养后将培养皿置于4℃冰箱中，静置10min；(4)吸除FPBS，向培养皿中加入4％甲醛后置于4℃静置10min；吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃10min；吸除甲醇，每次用2mL PBS清洗三次；且每次加入液体时，沿培养皿壁加入，避免将细胞冲起；通过氨基硅烷修饰具有纳米结构的聚苯乙烯基底，使基底覆盖上正电荷使剩余有核细胞全部平铺富集在纳米基底上固定，有核细胞主要是CTC和淋巴细胞。
进一步地，所述全血裂解的裂解液为红细胞裂解液。
进一步地，所述采集乳腺癌症患者外周血与红细胞裂解液按照1：(8-10)混合。
进一步地，步骤S2中具体为：(1)向培养皿中加入1mL 0.2％的脱脂奶粉，用PBS配置，4℃避光孵育30min，吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次；(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和3μL CD45，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min；(4)吸除DAPI，用2mL PBS清洗三次，加入1mL PBS，4℃保存；在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态学特征的为循环肿瘤细胞，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。
进一步地，步骤S4所述共孵育的条件为：避光孵育。
进一步地，步骤S5具体为：(1)向培养皿中加入1mL 5％的脱脂奶粉，用PBS配置，4℃避光孵育30min，吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次；(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和1μL anti-ErbB2，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，500μL封闭液加入2μL山羊Anti-Rabbit IgG二抗混匀后加入培养皿中室温孵育1h；(4)吸出抗体，PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min；(5)吸除DAPI，用2mL PBS清洗三次，加入1mL PBS，4℃保存；(6)在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI通道，观察通道表面荧光颜色，蓝色为DAPI(+)，红色则CK(+)，绿色则Her2(+)；当DAPI(+)/CK(+)/Her2(+)且满足一定形态学特征的则为Her2(+)CTC，对此类CTC进行计数；当DAPI(+)/CK(+)/Her2(-)且满足一定形态学特征的则为CTC，对此类CTC进行计数；通过计算Her2(+)CTC所占百分比检测Her2的表达量。
本发明的有益效果是:
(1)本发明采用采用HER2抗体免疫荧光法法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法对乳腺癌进行检测，操作简单，检测准确度高，避免假阴性结果，提高对乳腺癌的排查准确度。
(2)本发明的循环肿瘤细胞富集方法加入纳米基底膜，分离效果好，可以提高乳腺癌循环肿瘤细胞的数量，避免多次采集影响患者及增加工作人员工作难度。
(3)本发明对乳腺癌循环肿瘤细胞的鉴定方法通过DAPI、CK与CD45抗体联合鉴定乳腺癌循环肿瘤细胞，检测速度快且准确度高。
(4)本发明对乳腺癌循环肿瘤细胞HER2的表达情况通过DAPI、CK与Her2抗体及循环肿瘤细胞形态鉴定联合检测，检测速度快且结果准确。
(5)本发明的循环肿瘤细胞富集方法通过加入纳米基底膜，同时配合两个阶段的培养，可以显著提高乳腺癌循环肿瘤细胞的富集培养效果及细胞活性。
[附图说明]
图1是本发明为富集所有有核细胞到基底表面扫描检测CTCs图。
[具体实施方式]
下面结合具体实施方式来对本发明进行更进一步详细的说明，以更好地体现本发明的优势。
实施例1
一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，包括以下步骤：S1：采集乳腺癌症患者外周血8ml，并将采集的血样与裂解液按照1：8混合，室温混匀15min。200RCF离心5分钟，吸除上清，保留细胞。向离心管中加入2mL 1％FPBS，混匀后于200RCF离心5分钟，去上清；加入1ml的FPBS混匀，将混匀的细胞加入经过处理的培养皿中，37℃恒温摇床培养45min，培养后将培养皿置于4℃冰箱中，静置10min；吸除FPBS，向培养皿中加入4％甲醛后置于4℃静置10min。吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃10min。吸除甲醇，每次用2mL PBS清洗三次。
S2：对富集得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验，检验其是否存在，具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 0.2％的脱脂奶粉(用PBS配置)，4℃避光孵育30min。吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次。
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和3μL CD45，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜。
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min。
(4)吸除DAPI，用2mL PBS清洗三次，加入1mL PBS，4℃保存；
(5)显微镜下观察通道表面荧光颜色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态学特征的为循环肿瘤细胞。
S3：对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养；
S4：筛选出的乳腺癌循环肿瘤细胞中加入HER2抗体共孵育；
S5：检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况，具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 5％的脱脂奶粉(用PBS配置)，4℃避光孵育30min。吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次。
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和1μL anti-ErbB2，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜。
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，500μL封闭液加入2μL山羊Anti-Rabbit IgG二抗混匀后加入培养皿中室温孵育1h。
(4)吸出抗体，PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min。
(5)吸除DAPI，用2mL PBS清洗3次，加入1mL PBS，4℃保存。
(6)在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI通道，观察通道表面荧光颜色。蓝色为DAPI(+)，红色则CK(+)，绿色则Her2(+)。
当DAPI(+)/CK(+)/Her2(+)且满足一定形态学特征的则为Her2(+)CTC，对此类CTC进行计数。当DAPI(+)/CK(+)/Her2(-)且满足一定形态学特征的则为CTC，对此类CTC进行计数。通过计算Her2(+)CTC所占百分比检测Her2的表达情况，检测结果呈阳性。
实施例2
一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，包括以下步骤：S1：采集乳腺癌症患者外周血9ml，并将采集的血样与裂解液按照1：8混合，室温混匀15min。200RCF离心5分钟，吸除上清，保留细胞。向离心管中加入2mL 1％FPBS，混匀后于200RCF离心5分钟，去上清；加入1ml的FPBS混匀，将混匀的细胞加入经过处理的培养皿中，37℃恒温摇床培养45min，培养后将培养皿置于4℃冰箱中，静置10min；吸除FPBS，向培养皿中加入4％甲醛后置于4℃静置10min。吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃10min。吸除甲醇，每次用2mL PBS清洗三次。
S2：对富集得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验，检验其是否存在，具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 0.2％的脱脂奶粉(用PBS配置)，4℃避光孵育30min。吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次。
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和3μL CD45，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜。
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min。
(4)吸除DAPI，用2mL PBS清洗三次，加入1mL PBS，4℃保存；
(5)显微镜下观察通道表面荧光颜色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态学特征的为循环肿瘤细胞。
S3：对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养；
S4：筛选出的乳腺癌循环肿瘤细胞中加入HER2抗体共孵育；
S5：检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况，具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 5％的脱脂奶粉(用PBS配置)，4℃避光孵育30min。吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次。
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和1μL anti-ErbB2，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜。
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，500μL封闭液加入2μL山羊Anti-Rabbit IgG二抗混匀后加入培养皿中室温孵育1h。
(4)吸出抗体，PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min。
(5)吸除DAPI，用2mL PBS清洗3次，加入1mL PBS，4℃保存。
(6)在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI通道，观察通道表面荧光颜色。蓝色为DAPI(+)，红色则CK(+)，绿色则Her2(+)。
当DAPI(+)/CK(+)/Her2(+)且满足一定形态学特征的则为Her2(+)CTC，对此类CTC进行计数。当DAPI(+)/CK(+)/Her2(-)且满足一定形态学特征的则为CTC，对此类CTC进行计数。通过计算Her2(+)CTC所占百分比检测Her2的表达情况，检测结果呈阳性。
实施例3
一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，包括以下步骤：S1：采集乳腺癌症患者外周血10ml，并将采集的血样与裂解液按照1：9混合，室温混匀15min。200RCF离心5分钟，吸除上清，保留细胞。向离心管中加入2mL 1％FPBS，混匀后于200RCF离心5分钟，去上清；加入1ml的FPBS混匀，将混匀的细胞加入经过处理的培养皿中，37℃恒温摇床培养45min，培养后将培养皿置于4℃冰箱中，静置10min；吸除FPBS，向培养皿中加入4％甲醛后置于4℃静置10min。吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃10min。吸除甲醇，每次用2mL PBS清洗三次。
S2：对富集得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验，检验其是否存在，具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 0.2％的脱脂奶粉(用PBS配置)，4℃避光孵育30min。吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次。
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和3μL CD45，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜。
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min。
(4)吸除DAPI，用2mL PBS清洗三次，加入1mL PBS，4℃保存；
(5)显微镜下观察通道表面荧光颜色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态学特征的为循环肿瘤细胞。
S3：对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养；
S4：筛选出的乳腺癌循环肿瘤细胞中加入HER2抗体共孵育；
S5：检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况，具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 5％的脱脂奶粉(用PBS配置)，4℃避光孵育30min。吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次。
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和1μL anti-ErbB2，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜。
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，500μL封闭液加入2μL山羊Anti-Rabbit IgG二抗混匀后加入培养皿中室温孵育1h。
(4)吸出抗体，PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min。
(5)吸除DAPI，用2mL PBS清洗3次，加入1mL PBS，4℃保存。
(6)在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI通道，观察通道表面荧光颜色。蓝色为DAPI(+)，红色则CK(+)，绿色则Her2(+)。
当DAPI(+)/CK(+)/Her2(+)且满足一定形态学特征的则为Her2(+)CTC，对此类CTC进行计数。当DAPI(+)/CK(+)/Her2(-)且满足一定形态学特征的则为CTC，对此类CTC进行计数。通过计算Her2(+)CTC所占百分比检测Her2的表达情况，检测结果呈阳性。
实施例4
一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，包括以下步骤：S1：采集乳腺癌症患者外周血9ml，并将采集的血样与裂解液按照1：7混合，室温混匀15min。200RCF离心5分钟，吸除上清，保留细胞。向离心管中加入2mL 1％FPBS，混匀后于200RCF离心5分钟，去上清；加入1ml的FPBS混匀，将混匀的细胞加入经过处理的培养皿中，37℃恒温摇床培养45min，培养后将培养皿置于4℃冰箱中，静置10min；吸除FPBS，向培养皿中加入4％甲醛后置于4℃静置10min。吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃10min。吸除甲醇，每次用2mL PBS清洗三次。
S2：对富集得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验，检验其是否存在，具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 0.2％的脱脂奶粉(用PBS配置)，4℃避光孵育30min。吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次。
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和3μL CD45，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜。
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min。
(4)吸除DAPI，用2mL PBS清洗三次，加入1mL PBS，4℃保存；
(5)显微镜下观察通道表面荧光颜色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态学特征的为循环肿瘤细胞。
S3：对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养；
S4：筛选出的乳腺癌循环肿瘤细胞中加入HER2抗体共孵育；
S5：检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况，具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 5％的脱脂奶粉(用PBS配置)，4℃避光孵育30min。吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次。
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和1μL anti-ErbB2，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜。
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，500μL封闭液加入2μL山羊Anti-Rabbit IgG二抗混匀后加入培养皿中室温孵育1h。
(4)吸出抗体，PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min。
(5)吸除DAPI，用2mL PBS清洗3次，加入1mL PBS，4℃保存。
(6)在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI通道，观察通道表面荧光颜色。蓝色为DAPI(+)，红色则CK(+)，绿色则Her2(+)。
当DAPI(+)/CK(+)/Her2(+)且满足一定形态学特征的则为Her2(+)CTC，对此类CTC进行计数。当DAPI(+)/CK(+)/Her2(-)且满足一定形态学特征的则为CTC，对此类CTC进行计数。通过计算Her2(+)CTC所占百分比检测Her2的表达情况，检测结果呈阴性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：采集乳腺癌患者的外周血，富集并固定有核细胞；
S2：荧光标志物筛选乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验，检验其是否存在；
S3：若存在，对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养；若不存在，重复步骤S1～S2；
S4：筛选出的乳腺癌循环肿瘤细胞中加入HER2抗体共孵育；
S5：检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。
2.根据权利要求1所述的采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，步骤S1中具体为：
(1)将培养皿置于等离子仪中灭菌清洗12min，开紫外灭菌超净台，用2％的APTES润洗培养皿表面，避光1小时，吸除APTES，用纯水清洗培养皿5-6次，将培养皿置于80℃烘箱烘干1小时；
(2)全血裂解后，室温放置15min，期间均匀摇晃，200RCF离心5分钟，吸除上清，保留细胞，向离心管中加入2mL 1％FPBS，混匀后于200RCF离心5分钟，去上清；
(3)加入1ml的FPBS混匀，将混匀的细胞加入经过处理的培养皿中，37℃恒温摇床培养45min，培养后将培养皿置于4℃冰箱中，静置10min；
(4)吸除FPBS，向培养皿中加入4％甲醛后置于4℃静置10min；吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃10min；吸除甲醇，每次用2mL PBS清洗三次；且每次加入液体时，沿培养皿壁加入，避免将细胞冲起；
通过氨基硅烷修饰具有纳米结构的聚苯乙烯基底，使基底覆盖上正电荷使剩余有核细胞全部平铺富集在纳米基底上固定，有核细胞主要是CTC和淋巴细胞。
3.根据权利要求2所述的采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述全血裂解的裂解液为红细胞裂解液。
4.根据权利要求2所述的采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述采集乳腺癌症患者外周血与红细胞裂解液按照1：(8-10)混合。
5.根据权利要求1所述的采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，步骤S2中具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 0.2％的脱脂奶粉，用PBS配置，4℃避光孵育30min，吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次；
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和3μL CD45，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min；
(4)吸除DAPI，用2mL PBS清洗三次，加入1mL PBS，4℃保存；
在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态学特征的为循环肿瘤细胞，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。
6.根据权利要求5所述的采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，步骤S4所述共孵育的条件为：避光孵育。
7.根据权利要求1所述的采用HER2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，步骤S5具体为：
(1)向培养皿中加入1mL 5％的脱脂奶粉，用PBS配置，4℃避光孵育30min，吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mL PBS清洗3次；
(2)向500μL封闭液中加入1μL Anti-pan-cytokeratin和1μL anti-ErbB2，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；
(3)吸除抗体，用PBS清洗三次，500μL封闭液加入2μL山羊Anti-Rabbit IgG二抗混匀后加入培养皿中室温孵育1h；
(4)吸出抗体，PBS清洗三次，加入1mL DAPI，常温避光孵育30min；
(5)吸除DAPI，用2mL PBS清洗三次，加入1mL PBS，4℃保存；
(6)在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI通道，观察通道表面荧光颜色，蓝色为DAPI(+)，红色则CK(+)，绿色则Her2(+)；
当DAPI(+)/CK(+)/Her2(+)且满足一定形态学特征的则为Her2(+)CTC，对此类CTC进行计数；当DAPI(+)/CK(+)/Her2(-)且满足一定形态学特征的则为CTC，对此类CTC进行计数；通过计算Her2(+)CTC所占百分比检测Her2的表达量。
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