WO2023173239A1 - 细胞分选方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种可提高细胞分选的精准度与捕捉纯度的细胞分选方法，包括以下步骤。提供血液样品。对血液样品进行离心，以获取含有目标细胞与非目标细胞的细胞混合物。加入荧光标记物至细胞混合物，使荧光标记物与目标细胞结合。加入水胶溶液使细胞混合物与水胶溶液混合，形成混合溶液。将混合溶液加入至阵列晶片的细胞井中，细胞混合物中的目标细胞与非目标细胞以大致单层的方式平铺于所述细胞井的底部。使混合溶液固化。进行荧光影像分析，挑选出与荧光标记物结合后发出荧光的目标细胞，以分离所挑选的目标细胞。

Description

细胞分选方法 技术领域
本发明涉及一种细胞分选方法，尤其涉及一种透过使用阵列晶片与水胶溶液来筛选捕捉非贴附(non-adhesive)细胞的细胞分选方法。
背景技术
血液样本中如循环肿瘤细胞(CTCs)、胎儿有核红血球(FnRBCs)、干细胞等皆为典型的稀少细胞(rare cells)，可应用于医疗、检测分析等领域，诸如辅助癌症预后分析、产前检测或病毒感染检测分析等应用。由于此类稀少细胞的数量极为稀少且为非贴附细胞(non-adhesive)(即悬浮型细胞)，因此，开发一套具高纯度、高细胞回收率、高效率或低细胞损害等特性之细胞分选平台为目前致力于努力的方向。
发明内容
本发明是针对一种细胞分选方法，可有效提高细胞分选的精准度与捕捉纯度，且同时具有低细胞损害的效果。
根据本发明的实施例，细胞分选方法包括以下步骤。提供血液样品。对血液样品进行离心，以获取含有目标细胞与非目标细胞的细胞混合物。加入荧光标记物至细胞混合物，使荧光标记物与目标细胞结合。加入水胶溶液使细胞混合物与水胶溶液混合，形成混合溶液。将混合溶液加入至阵列晶片的细胞井中，细胞混合物中的目标细胞与非目标细胞以大致单层的方式平铺于所述细胞井的底部。使混合溶液固化。进行荧光影像分析，挑选出与荧光标记物结合后发出荧光的目标细胞，以分离所挑选的目标细胞。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述的水胶溶液包含温感型水胶溶液，且进行荧光影像分析步骤在使混合溶液固化步骤之后进行。使混合溶液固化步骤包括进行降温过程而固化混合溶液，固定目标细胞与非目标细胞的位置，然后，进行荧光影像分析，定位出发出荧光的目标细胞的所述位置，以挑选出与荧光标记物结合后发出荧光的目标细胞。。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述的温感型水胶溶液的重量为100重量％，温感型水胶溶液包括3重量％至5重量％的明胶。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述的水胶溶液包含光感型水胶溶液，且进行荧光影像分析步骤在使混合溶液固化步骤之前先进行。进行荧光影像分析步骤包括：进行荧光影像分析，以定位出发出荧光的第一区域与未发出荧光的第二区域。使混合溶液固化步骤包括：对第一区域照射紫外光，使位于第一区域的混合溶液固化，以固定目标细胞。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述分离所挑选的目标细胞的方法包括以下步骤。对第一区域照射紫外光之后，移除位于第二区域未固化的所述混合溶液。然后，利用吸取器从第一区域吸取被固定的目标细胞。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述的水胶溶液包含光感型水胶溶液，且进行荧光影像分析步骤在使混合溶液固化步骤之前先进行。进行荧光影像分析步骤包括：进行荧光影像分析，以定位出发出荧光的第一区域与未发出荧光的第二区域。使混合溶液固化步骤包括：对第二区域照射紫外光，使位于第二区域的混合溶液固化。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述分离所挑选的目标细胞步骤包括：对第二区域照射紫外光之后，利用吸取器从第一区域吸取未固化的混合溶液以获得目标细胞。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述的光感型水胶溶液的重量为100重量％计，光感型水胶包括10重量％至20重量％的聚乙二醇二丙烯酸酯以及0.1重量％至1重量％的光启始剂。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述的细胞混合物中的细胞为非贴附型细胞，包括单核淋巴细胞、循环肿瘤细胞、胎儿有核红血球、血小板或其组合。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述的目标细胞为胎儿有核红血球，荧光标记物包括带有第一荧光物质的抗CD147抗体与带有第二荧光物质的抗CD71抗体。加入荧光标记物至细胞混合物的步骤包括：加入抗CD147抗体与抗CD71抗体，以使抗CD147抗体与抗CD71抗体结合至目标细胞，其中第一荧光物质不同于第二荧光物质。
在根据本发明的实施例的细胞分选方法中，上述的荧光标记物更包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚，以结合至目标细胞。
基于上述，在本发明一实施例的细胞分选方法中，借由将细胞混合物以大致 单层的方式平铺于细胞井的底部的方式，可使目标细胞与非目标细胞在细胞井的法线方向上不会重叠；接着，透过固化含有水胶溶液的混合溶液的方式，可使目标细胞和/或非目标细胞固定于细胞井的底部；然后，透过荧光影像分析的方式，可定位出与荧光标记物结合后发出荧光的目标细胞，进而可从细胞混合物中精准地挑选并分离出目标细胞。借此，可使本实施例的细胞分选方法可提升细胞分选的精准度与捕捉纯度，以降低细胞损害并达到高细胞回收率的效果。
附图说明
包含附图以便进一步理解本发明，且附图并入本说明书中并构成本说明书的一部分。附图说明本发明的实施例，并与描述一起用于解释本发明的原理。
图1为本发明实施例的细胞分选方法的部分流程示意图；
图2A与图2B为本发明实施例的细胞自组装阵列晶片的示意图；
图3为本发明实施例的使用温感型水胶溶液的细胞分选方法的流程示意图；
图4为本发明实施例的使用光感型水胶溶液的细胞分选方法的流程示意图；
图5为本发明实施例的细胞分选方法中所使用光感型水胶溶液时照光所设计使用的光罩的示意图；
图6A为本发明实施例的细胞混合物混合温感型水胶溶液后的细胞存活率试验结果；
图6B为以本发明实施例的细胞分选方法抽取分离后所获得的细胞存活率试验结果。
附图标记说明
10：血浆；
20：细胞混合物；
25：混合溶液；
30：细胞/单核球分离液；
40：红血球；
100：细胞自组装阵列晶片；
110：上板；
120：下板；
130：孔槽；
132：细胞井；
134：蒸散槽；
140：间隙；
S：血液样品；
C1：目标细胞；
C2：非目标细胞；
PP：自动吸取器；
MEM：过滤膜；
LL：光。
具体实施方式
现将详细地参考本发明的示范性实施例，示范性实施例的实例说明于附图中。只要有可能，相同元件符号在图式和描述中用来表示相同或相似部分。
图1为本发明实施例的细胞分选方法的流程示意图。图2A与图2B为本发明实施例的细胞自组装阵列晶片的示意图。
请参照图1中的(A)，自检测对象取得生理样品(例如血液样品S)来提供作为检验样品。检测对象类如为人类或哺乳类，血液样品S例如是全血，但并不以此为限。
接着，请参照图1中的(B)，对所提供的血液样品S进行离心，以获取细胞混合物20，所分离得到的细胞混合物20含有本案实施例所预定分离的目标细胞C1与非目标细胞C2。细胞混合物20中的细胞主要例如为非贴附型细胞(即悬浮细胞)，且例如是包括单核淋巴细胞、循环肿瘤细胞(CTCs)、胎儿有核红血球(FnRBCs)、部分血小板或其组合。其中，依照某些实施例，目标细胞C1可包括例如胎儿有核红血球，非目标细胞C2可包括例如单核淋巴细胞、循环肿瘤细胞及/或血小板等。依照某些实施例，目标细胞C1可包括例如循环肿瘤细胞，非目标细胞C2可包括例如单核淋巴细胞、胎儿有核红血球及/或血小板等，但不以此为限。
具体来说，例如可利用Ficoll-Paque TM细胞/单核球分离液(以聚蔗糖(Ficoll)及酰胺碘苯甲酸钠(sodium diatrizoate)依比例配制成密度为1.077g/ml之溶液)将血液中的组分依据密度梯度进行分层，操作步骤大致如下：先将Lymphoprep TM滴入Leucosep离心管过滤膜MEM下方。接着，将血液样品S缓慢地沿离心管壁倒入，并以800×g(RCF，相对离心力)离心15分钟。此时，血液样本S会 因为离心和Lymphoprep TM溶液密度的作用产生分层，如图1B所示，由下到上(即离心管的底端至顶部)依序可为红血球40、细胞/单核球分离液30、细胞混合物20以及血浆(plasma)10。在本实施例中，细胞混合物20可位在过滤膜MEM上方。
接着，请参照图1中的(C)，抽取分离出细胞混合物20至微量离心管，并加入荧光标记物至细胞混合物20中，以使荧光标记物与细胞混合物20中的目标细胞C1结合。也就是将目标细胞C1进行荧光染色。具体来说，将离心管中过滤膜MEM上方的液体(包括细胞混合物20与血浆10)转移至另一全新的离心管，并以300×g离心10分钟，使细胞混合物20中的细胞沉积至离心管底部。接着，移除上清液，并加入1毫升(ml)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)使细胞混合物20中的细胞重新悬浮(resuspend)后，取出的部分悬浮液(约5微升(μl))进行细胞计数，且将剩余的悬浮液以400×g离心6分钟，以使细胞混合物20中的细胞沉积至离心管底部。接着，进行两阶段的荧光染色，第一阶段的荧光染色例如是对细胞的表面抗原进行染色，而第二阶段的荧光染色例如是对细胞的细胞核进行染色，且例示步骤大致如下：首先，移除上清液，加入100μl的PBS使细胞混合物20中的细胞重新悬浮后，加入第一阶段的荧光标记物并避光30分钟，以使第一阶段的荧光标记物与细胞混合物20中的特定细胞结合。接着，加入1ml的PBS，以400×g离心6分钟后移除上清液，以移除未与细胞表面抗原结合的第一阶段的荧光标记物。而后，加入100μl的PBS使细胞混合物20中的细胞重新悬浮后，加入第二阶段的荧光标记物并避光10分钟，以使第二阶段的荧光标记物与细胞混合物20中的所有细胞的细胞核结合。接着，加入1ml的PBS，以400×g离心6分钟并移除上清液，以移除未与细胞结合的第二阶段的荧光标记物。
举例来说，当目标细胞C1为胎儿有核红血球时，第一阶段的荧光标记物可包括带有第一荧光物质的抗CD147抗体与带有第二荧光物质的抗CD71抗体，第二阶段的荧光标记物可例如是4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)。其中第一荧光物质例如是荧光异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate，FITC)，具有激发波长Ex:482±25nm/发射波长Em:531±40nm之荧光波段，其被激发后发出绿色荧光。第二荧光物质例如是藻红素(phycoerythrin，PE)，具有激发波长Ex:554±23nm/发射波长Em: 624±40nm之荧光波段，其被激发后发出橘黄色荧光。DAPI具有激发波长Ex:357±44nm/发射波长Em:475±28nm之荧光波段，其被激发后发出蓝色荧光。抗CD147抗体与抗CD71抗体分别结合至胎儿有核红血球的表面抗原CD147与表面抗原CD71，而DPAI则结合至细胞核。其中第一荧光物质不同于第二荧光物质，且第一阶段的荧光标记物也不同于第二阶段的荧光标记物，特别是各荧光标记物分别具有不同的荧光发光波长范围。
举例来说，当目标细胞C1为循环肿瘤细胞时，第一阶段的荧光标记物可包括带有第一荧光物质的抗EpCAM抗体，第二阶段的荧光标记物可包括Hoechst33342。其中第一荧光物质例如是FITC，具有激发波长Ex:482±25nm/发射波长Em:531±40nm之荧光波段，其被激发后发出绿色荧光。Hoechst 33342具有激发波长Ex:357±44nm/发射波长Em:475±28nm之荧光波段，其被激发后发出蓝色荧光。抗EpCAM抗体结合至循环肿瘤细胞的表面抗原EpCAM，而Hoechst 33342则结合至细胞核。此处，各荧光标记物分别具有不同的荧光发光波长范围。
特别说明的是，在一些实施例中，第一阶段的荧光染色可更包括对非目标细胞C2的表面抗原进行荧光染色。举例来说，当目标细胞C1为循环肿瘤细胞时，第一阶段的荧光标记物可包括带有第二荧光物质的抗CD45抗体，其中第二荧光物质例如是PE，具有激发波长Ex:554±23nm/发射波长Em:624±40nm之荧光波段，其被激发后发出橘黄色荧光。抗CD45抗体为结合至出白血球(即非目标细胞C2)的表面抗原CD71，可用来标记出白血球的位置。因此，在后续的荧光影像分析定位出目标细胞C1所在的位置的步骤时，发出橘黄色荧光的区域可视为被排除的区域，借此设计，可更精准定位出目标细胞C1所在的位置。
接着，请同时参照图1中的(C)、图1中的(D)、图2A与图2B，荧光染色之后，加入水胶溶液使细胞混合物20与水胶溶液混合，以形成混合溶液25。接着将混合溶液25以定量添加填入到阵列晶片100的细胞井132中，使细胞混合物20中的目标细胞C1与非目标细胞C2以大致单层的方式平铺于所述细胞井132的底部，也就是说，目标细胞C1与非目标细胞C2在细胞井132的法线方向上不会重叠。
在本发明实施例中，所使用水胶溶液可例如是温感型水胶溶液或光感型水胶溶液，但不以实施例所述为限。温感型水胶溶液为在特定温度下会固化或液化的 水胶溶液。在本实施例中，以温感型水胶溶液的重量为100重量％计，温感型水胶溶液为将明胶(gelatin)溶于水中所配制而成之含3重量％至5重量％明胶(gelatin)的水胶溶液，但不以此为限。较佳的，温感型水胶溶液包括3.5重量％的明胶。本实施例的温感型水胶溶液于特定温度下(例如：37℃或室温下)可融化为液态，并于低温(如4℃)下固化为固态。
光感型水胶溶液为在特定波长的光照下会固化的水胶溶液。在本实施例中，以光感型水胶溶液的重量为100重量％计，光感型水胶溶液包括10重量％至20重量％的聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate；PEGDA)与0.1重量％至1重量％的光启始剂(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate；LAP)，但不以此为限。较佳的，光感型水胶溶液包括15重量的聚乙二醇二丙烯酸酯与0.5重量％的光启始剂。本实施例的光感型水胶溶液，经波长405纳米(nm)的UV光照射约15秒后，可固化为固态。
阵列晶片可例如是细胞自组装阵列晶片(SACA Chip)100，如图2A与图2B所示。细胞自组装阵列晶片100是由上下两片PC射出成形之塑料110、120夹合而成，上板110具有八组孔槽130，下板120为具有亲水性且抗细胞沾黏涂层之平面，且于上板110与下板120之间具有约5μm的间隙140。其中，每个孔槽130由一个细胞井132与四个蒸散槽134组成，细胞井132的孔径约7毫米(mm)。
具体来说，在本实施例中，先配置水胶溶液(可例如是温感型水胶溶液或光感型水胶溶液)，并加入适量的水胶溶液以重新悬浮带有荧光标记物的细胞混合物20中的细胞，形成混合溶液25。接着，将混合溶液25加入细胞井132，此时液体会从间隙140流到蒸散槽134，透过结构驱动的流场及重力场，使细胞向下及向左右两侧沉降、排列。由于间隙140小于细胞尺寸，因此细胞不会流出细胞井132。只要每个细胞井132内的细胞不超出极限值(约5x 10 5个细胞)，细胞可铺平成单一致密层，如图2B所示，可有效提升后续细胞的影像辨识率、降低误判机率、进而提升分选时之纯度。相对地，传统孔盘(例如是96孔槽的孔盘)的上下板之间不具有间隙，因此当混合溶液25加入孔槽后，液体仅能存放于孔槽中，容易发生细胞堆栈。细胞堆栈会可能造成后续影像辨识的困难度，致使不易挑选出目标细胞，进而降低细胞分选的准确度及纯度。
接着，使混合溶液25固化，挑选出与荧光标记物结合后发出荧光的目标细 胞C1，以分离所挑选的目标细胞C1。值得注意的是，在本发明中，依据所选用的水胶溶液类型(温感型水胶溶液或光感型水胶溶液)，所采用的固化手段不同，而后续的混合溶液固化、细胞选取等步骤顺序等也会有所不同，以下将分别描述。
接续前述图1的流程，图3的所示流程为本发明实施例的使用温感型水胶溶液的细胞分选方法的流程示意图。
请同时参考图1中的(D)与图3中的(A)，所使用水胶溶液为温感型水胶溶液，在液态的状态下注入到阵列晶片100的细胞井132中而细胞会以大致单层的方式平铺分布，之后，进行降温过程以固化细胞井132中的混合溶液25，使细胞井132中的混合溶液25内的所有目标细胞C1与所有非目标细胞C2都被固定住，进而使所有目标细胞C1与非目标细胞C2在细胞井中的位置也被固定。详细来说，降温过程可例如是将混合溶液25放入4℃的环境(例如冷藏库)中约5至10分钟，使混合溶液25呈现黏稠的状态，所谓混合溶液25会呈现黏稠状态表示液体黏性变大而其流动性降低，而混合溶液25内的目标细胞C1与非目标细胞C2也被固定住，这有利于后续目标细胞C1与非目标细胞C2位置的精准定位与抓取。
接着，请参考图3中的(B)，进行荧光影像分析，以自动化的影像分析方式，定位出发出荧光的目标细胞的位置。详细来说，将含有混合溶液25的阵列晶片100放上影像分析机台，荧光影像分析可例如是透过荧光影像分析系统，针对机台上含有混合溶液25的阵列晶片100，进行x-y-z轴的校准，确认整个阵列晶片100位置正确，且得以精准定位细胞与阵列晶片的细胞井相对位置。接着，针对实施例中所使用的各种不同荧光标记物，以各种不同的特定的荧光激发波段(所谓特定的荧光激发波段乃是指针对特定的荧光标记物会使用与其相对应的荧光激发波段)，进行荧光扫描的拍摄，并且将不同荧光波段拍摄的影像进行叠图，以进一步确认目标细胞C1的位置。举例来说，当目标细胞C1为胎儿有核红血球，且荧光标记物为带有第一荧光物质的抗CD147抗体、带有第二荧光物质的抗CD71抗体以及DAPI时，目标细胞C1所在位置为第一荧光物质被激发后的荧光、第二荧光物质被激发后的荧光以及DAPI被激发后的荧光之三者同时重叠的位置(如图3中的(B)所示的圈选处)。当目标细胞C1为循环肿瘤细胞，且荧光标记物为带有第一荧光物质的抗EpCAM抗体、带有第二荧光物质的抗CD45抗体以及Hoechst 33342时，目标细胞C1所在位置为第一荧光物质被激发 后的荧光重叠于Hoechst 33342被激发后的荧光，且不重叠于第二荧光物质被激发后的荧光的区域。
接着，请参考图3中的(C)，挑选出与荧光标记物结合后发出荧光的目标细胞C1。详细来说，挑选目标细胞C1的方法可例如是根据叠图的影像，利用计算机可程序化之电动单细胞撷取注液系统的自动化吸取器PP，通过固定流率(例如是20微升/分钟(μl/min))的定量吸液来获取目标细胞C1，借此可实现单细胞撷取的功能，同时具有降低分选容液连带的背景噪声与污染的效果。至此，已完成使用温感型水胶溶液的细胞分选。
接续前述图1的流程，图4为本发明实施例的使用光感型水胶溶液的细胞分选方法的流程示意图。图5为本发明实施例的细胞分选方法中所使用光感型水胶溶液时照光所设计使用的光罩的示意图。
请同时参考图1中的(D)与图4中的(A)，所使用水胶溶液为光感型水胶溶液，在液态的状态下注入到阵列晶片的细胞井中而细胞会以大致单层的方式平铺分布，之后，进行荧光影像分析，以定位出具有目标细胞C1的第一区域与具有非目标细胞C2的第二区域。详细来说，可例如是透过荧光影像分析系统，针对实施例中所使用的各种不同荧光标记物，以各种不同的特定的荧光激发波段(所谓特定的荧光激发波段乃是指针对特定的荧光标记物会使用与其相对应的荧光激发波段)，进行荧光扫描拍摄，并且将不同荧光波段拍摄的影像进行叠图，以确认第一区域与第二区域。举例来说，当目标细胞C1为胎儿有核红血球，且荧光标记物为带有第一荧光物质的抗CD147抗体、带有第二荧光物质的抗CD71抗体以及DAPI时，第一区域为第一荧光物质被激发后的荧光、第二荧光物质被激发后的荧光以及DAPI被激发后的荧光之三者同时重叠的区域(三重荧光重叠区)，而剩余区域则定义为第二区域。也就是说，以荧光扫描重叠结果，来判定目标细胞C1的位置并定义其范围为第一区域。当目标细胞C1为循环肿瘤细胞，且荧光标记物为带有第一荧光物质的抗EpCAM抗体、带有第二荧光物质的抗CD45抗体以及Hoechst 33342时，第一区域为第一荧光物质被激发后的荧光重叠于Hoechst 33342被激发后的荧光，且不重叠于第二荧光物质被激发后的荧光的区域，而其他剩余区域则为第二区域。
接着，请参照图4中的(B)与图5，对第一区域照射紫外光，使位于第一区域的混合溶液25固化，以固定目标细胞C1。具体而言，对第一区域照射特定 波长的光LL(例如紫外光)以使位于第一区域的混合溶液25固化并固定目标细胞C1的方法例如是：搭配上述第一区域与第二区域的位置来设计光罩(如图5所示，光罩的开口对应第一区域)。接着，将光罩放置于阵列晶片100的细胞槽132上方并使用波长405nm的紫外光照射15秒，使紫外光透过光罩的开口照射第一区域，致使位于第一区域的混合溶液25因曝光而固化。此时，由于第二区域被光罩遮挡而不会暴露于紫外线下，因此位于第二区域的混合溶液25则持续保持液态。
接着，请参照图4中的(C)与图4中的(D)，移除位于第二区域的未固化的混合溶液25。接着，利用自动吸取器PP从第一区域吸取被固定的目标细胞C1，完成目标细胞C1的筛选与分离。基本上完成本发明实施例的使用光感型水胶溶液的细胞分选。
当所使用水胶溶液为光感型水胶溶液时，除了前述实施例，在另外实施例中也可透过固化不同区域而同样达到细胞分选的目的。在细胞分选方法其他实施例中，固化水胶溶液与挑选目标细胞的方法也可例如包括以下步骤：进行荧光影像分析，以定位出具有目标细胞的第一区域与具有非目标细胞的第二区域。接着，对第二区域照射紫外光，使位于第二区域的混合溶液固化，以固定非目标细胞。而后，利用吸取器从第一区域吸取未固化的混合溶液以获得目标细胞。
详细来说，对第二区域照射紫外光以使位于第二区域的混合溶液固化并固定非目标细胞的方法例如是：搭配上述第一区域与第二区域的位置来设计光罩，并使光罩的开口对应于第二区域。接着，将光罩放置于阵列晶片的细胞槽上方并使用波长405nm的紫外光照射15秒，使紫外光透过光罩的开口照射第二区域，致使位于第二区域的混合溶液因曝光而固化。此时，由于第一区域被光罩遮挡而不会暴露于紫外线下，因此位于第一区域的混合溶液则持续保持液态。挑选目标细胞的方法可例如是利用自动化吸取器以流率20μl/min从第一区域吸取未被固定的目标细胞，而完成目标细胞的筛选与分离。
图6A为本发明实施例的细胞混合物混合温感型水胶溶液后的细胞存活率试验结果。图6B为以本发明实施例的细胞分选方法抽取分离后所获得的细胞存活率试验结果。图6A-6B中左边为细胞白光影像照，可显示显微视野下的所有细胞。右边为碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色结果，可染色标记出死亡细胞。由图6A可知，本发明所使用的温感型水胶溶液几乎不会造成细胞的死亡，平均 存活率可达96％。由图6B可知，本发明的细胞分选方法是透过固化手段(例如是降温固化)搭配影像分析，精准地分辨筛选出目标细胞然后各别准确地吸取目标细胞，温和的细胞分选方式几乎不会造成目标细胞的死亡，平均存活率可高达96％。
透过使用温感型水胶溶液或光感型水胶溶液来固化混合溶液的方式，可以固定目标细胞或/及非目标细胞于容器中，因此可针对非贴附型细胞进行细胞的分选。而且，透过使用温感型水胶溶液或光感型水胶溶液来固化混合溶液与其中的细胞，进一步固定目标细胞(或/及非目标细胞)于容器中的位置，因此于荧光影像辨识时，可准确定位目标细胞，针对特定目标细胞进行辨识筛选，且透过分区照光的方式，更可进一步提高细胞分选的精准度。此外，以自动吸取器吸取细胞的方式，可降低溶液连带背景噪声之污染，因此相对于其他分离技术可具有更高的捕捉纯度。再者，由于水胶溶液具备生物兼容性，且由于光固化时所需的光源剂量低、细胞捕获设备的低剪切力且不会使用化学、蛋白酶释放细胞等特点，因而可使捕捉到的细胞具有极高的细胞存活率，致使分选的细胞得以进行后续分析、培养等应用。借此，可使本实施例的细胞分选方法可以为高效率、高纯度且易于操作的非贴盘细胞分选技术，并且具备细胞培养、分离领域等应用价值，如：单细胞基因组学和蛋白质组学、细胞异质性等。
综上所述，在本发明实施例的细胞分选方法中，借由将细胞混合物以大致单层的方式平铺于细胞井的底部的方式，可使目标细胞与非目标细胞在细胞井的法线方向上不会重叠；接着，透过固化含有水胶溶液的混合溶液的方式，可使目标细胞和/或非目标细胞固定于细胞井的底部；然后，透过荧光影像分析的方式，可定位出与荧光标记物结合后发出荧光的目标细胞，进而可从细胞混合物中精准地挑选并分离出目标细胞。借此，可使本实施例的细胞分选方法可提升细胞分选的精准度与捕捉纯度，以降低细胞损害并达到高细胞回收率的效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (11)

  1. 一种细胞分选方法，其特征在于，包括：
    提供血液样品；
    对所述血液样品进行离心，以获取含有目标细胞与非目标细胞的细胞混合物；
    加入荧光标记物至所述细胞混合物，使所述荧光标记物与所述目标细胞结合；
    加入水胶溶液使所述细胞混合物与所述水胶溶液混合，形成混合溶液；
    将所述混合溶液加入至阵列晶片的细胞井中，所述细胞混合物中的所述目标细胞与所述非目标细胞以大致单层的方式平铺于所述细胞井的底部；
    使所述混合溶液固化；以及
    进行荧光影像分析，挑选出与所述荧光标记物结合后发出荧光的所述目标细胞，以分离所挑选的所述目标细胞。
  2. 根据权利要求1所述的细胞分选方法，其特征在于，所述水胶溶液包含温感型水胶溶液，且进行荧光影像分析步骤在使所述混合溶液固化步骤之后进行，其中使所述混合溶液固化步骤包括进行降温过程而固化所述混合溶液，固定所述目标细胞与所述非目标细胞的位置，然后，进行荧光影像分析，定位出发出荧光的所述目标细胞的所述位置，以挑选出与所述荧光标记物结合后发出荧光的所述目标细胞。
  3. 根据权利要求2所述的细胞分选方法，其特征在于，以所述温感型水胶溶液的重量为100重量％，所述温感型水胶溶液包括3重量％至5重量％的明胶。
  4. 根据权利要求1所述的细胞分选方法，其特征在于，所述水胶溶液包含光感型水胶溶液，且进行荧光影像分析步骤在使所述混合溶液固化步骤之前先进行，其中进行荧光影像分析步骤包括：
    进行荧光影像分析，以定位出发出荧光的第一区域与未发出荧光的第二区域，且
    其中使所述混合溶液固化步骤包括：
    对所述第一区域照射紫外光，使位于所述第一区域的所述混合溶液固化，以固定所述目标细胞。
  5. 根据权利要求4所述的细胞分选方法，其特征在于，分离所挑选的所述 目标细胞步骤包括：
    对所述第一区域照射紫外光之后，移除位于所述第二区域未固化的所述混合溶液；以及
    利用吸取器从所述第一区域吸取被固定的所述目标细胞。
  6. 根据权利要求1所述的细胞分选方法，其特征在于，所述水胶溶液包含光感型水胶溶液，且进行荧光影像分析步骤在使所述混合溶液固化步骤之前先进行，其中进行荧光影像分析步骤包括：
    进行荧光影像分析，以定位出发出荧光的第一区域与未发出荧光的第二区域，且
    其中使所述混合溶液固化步骤包括：
    对所述第二区域照射紫外光，使位于所述第二区域的所述混合溶液固化。
  7. 根据权利要求6所述的细胞分选方法，其特征在于，分离所挑选的所述目标细胞步骤包括：
    对所述第二区域照射紫外光之后，利用吸取器从所述第一区域吸取未固化的所述混合溶液以获得所述目标细胞。
  8. 根据权利要求4或6所述的细胞分选方法，其特征在于，以所述光感型水胶的重量为100重量％计，所述光感型水胶包括：
    10重量％至20重量％的聚乙二醇二丙烯酸酯；以及
    0.1重量％至1重量％的光启始剂。
  9. 根据权利要求1所述的细胞分选方法，其特征在于，所述细胞混合物中的细胞为非贴附型细胞，包括单核淋巴细胞、循环肿瘤细胞、胎儿有核红血球、血小板或其组合。
  10. 根据权利要求1所述的细胞分选方法，其特征在于，所述目标细胞为胎儿有核红血球，所述荧光标记物包括带有第一荧光物质的抗CD147抗体与带有第二荧光物质的抗CD71抗体，且加入荧光标记物至所述细胞混合物的步骤包括：
    加入所述抗CD147抗体与所述抗CD71抗体，以使所述抗CD147抗体与所述抗CD71抗体结合至所述目标细胞，其中所述第一荧光物质不同于所述第二荧光物质。
  11. 根据权利要求10所述的细胞分选方法，其特征在于，所述荧光标记物 更包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚，以结合至所述目标细胞。
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