TWI691724B - 用於偵測流體樣本中之顆粒之裝置以及於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣的方法 - Google Patents

用於偵測流體樣本中之顆粒之裝置以及於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣的方法 Download PDF

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Abstract

本文中尤其提供用於分析樣本中之顆粒之方法及設備。於一些態樣中，該等顆粒可為分析物、細胞、核酸、或蛋白質，且可與標籤接觸，分配至等分試樣中，藉由分級裝置偵測，及單離。本文中提供之方法及設備可包括微流體晶片。於一些態樣中，該等方法及設備可用於定量樣本中之罕見顆粒，諸如癌細胞及其他罕見細胞，以達成疾病之診斷、預後、或治療。

Description

用於偵測流體樣本中之顆粒之裝置以及於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣的方法 交叉參考
本申請案主張2013年7月5日申請之美國臨時申請案第61/843,252號及2013年10月23日申請之第61/894,788號之權益，該等申請案係針對所有目的以其全文引用之方式併入本文中。
聯邦資助研究之相關聲明
本發明是在國家健康研究所(National Institutes of Health)頒發之CA147831下由政府支持進行。政府對本發明具有某些權力。
循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells；CTC)自原發腫瘤脫落進入血液中且係癌症轉移之一個重要態樣。已在諸如乳癌、肺癌、前列腺癌及胰腺癌之許多不同癌症類型中偵測到CTC。CTC之數量係直接與轉移性患者中之臨床結果相關聯，提供可有助於管理臨床照護的有價值的預後資訊。
本文中描述用於單離並分析顆粒及進行分析之方法、設備、系統及裝置。
於各種態樣中，提供於流體中識別存於分析物上之複數種標記的方法，其中該方法包括：(a)使用輻射源偵測來自第一標籤之訊號，其中該第一標籤係附著至與該分析物上之第一標記結合之第一結構；(b)基於該第一標籤的存在來分配該分析物；(c)減低該第一標籤 之訊號之強度；(d)使該分析物與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係附著至第二標籤；及(e)偵測該第二標籤。
於各種態樣中，提供用於偵測存於分析物上之複數種標記的方法，該方法包括：使該分析物與第一標籤接觸，其中該分析物包含第一標記及該第一標籤對該第一標記具有親和力；偵測由該第一標籤發射之第一訊號，其中該第一訊號的存在指示存在該第一標記；基於該第一訊號的存在來分配包含該分析物之流體；減低該第一訊號之強度；使該分析物與第二標籤接觸，其中該分析物包含第二標記及該第二標籤具有針對於該第二標記之親和力；及偵測由該第二標籤發射之第二訊號，其中該第二訊號的存在指示存在該第二標記。
於各種態樣中，提供用於自包含第一細胞類型及第二細胞類型之樣本單離細胞的方法，該等方法包括：(a)經由一組管件將樣本引入至微流體晶片中，其中該微流體晶片包括(i)至少一個與該組管件流體連接之通道；(ii)偵測器，其組態可以偵測該至少一個通道中之細胞之訊號；及(iii)至少一個與該至少一個通道流體連接之腔室；(b)使該樣本之一部分流經該偵測器；(c)使用該偵測器以偵測該樣本之該部分中該第一細胞類型之存在或不存在；(d)假若在該樣本之該部分中偵測到該第一細胞類型，則引導該樣本之等分試樣至該腔室中，其中該等分試樣包含該第一細胞類型；及(e)重複步驟(b)、(c)、及(d)，藉此單離該腔室中之多個等分試樣使得該腔室包含該樣本中該第一細胞類型總數之80%以上及該樣本中第二細胞類型總數之5%以下。
於各種態樣中，提供用於自樣本單離細胞的方法，該等方法包括：(a)引入樣本至微晶體晶片中，其中該樣本包含第一細胞類型及第二細胞類型，且其中該微流體晶片包括：通道；偵測器，其組態可以偵測該通道中所發射之訊號；與該通道流體連通之腔室；(b)使該樣本之一部分流動通過該通道，其中該部分包含複數個第一細胞類 型、複數個第二細胞類型、或其組合；(c)使用該偵測器來偵測該部分中該第一細胞類型之存在或不存在；(d)假若該第一細胞類型存於該部分中，則引導該部分至該腔室中；及(e)重複(b)、(c)、及(d)足夠多次使得該腔室包含存於該樣本中該第一細胞類型總數之80%以上及存於該樣本中該第二細胞類型總數之5%以下。
於各種態樣中，提供用於自衍生自流體之樣本分配表現特異性生物標記圖譜之細胞之設備，其中：該設備包括一組連接至具有至少一個通道及一腔室之微流體晶片之管件；及該設備可單離該腔室中之該等細胞，其中於單離後，該腔室包含該樣本中表現特異性生物標記圖譜之細胞總群體之80%以上及其中於單離後，該腔室包含樣本中表現不同生物標記圖譜之細胞總群體之5%以下。
於各種態樣中，提供識別存於分析物上之複數種標記的方法，其中該等方法包括：(a)藉由使該分析物流動於包含複數個微腔(micro-cavity)或微貼片(micro-patch)之基板之上來分配複數種分析物，其中大多數微腔或微貼片可裝納不多於一種分析物且其中該等微腔或微貼片位於微流體裝置中；(b)於該等微腔或微貼片中，使各分析物與可與第一標記結合之第一結構接觸，其中該第一結構係連接至第一標籤；(c)偵測來自該第一標籤之訊號；(d)減低該第一標籤之該訊號之程度；(e)使該分析物與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係連接至第二標籤；及(f)偵測該第二標籤。
於各種態樣中，提供用於偵測存於分析物上之複數種標記的方法，該等方法包括：藉由使流體於包含微腔或微貼片之基板上流動，在微腔或在微貼片中單離分析物，其中該流體包括該分析物；使該分析物與第一標籤接觸，其中該分析物包括第一標記，且其中該第一標籤對該第一標記具有親和力；偵測由該第一標籤發射之第一訊號，其中該第一訊號的存在指示存在該第一標記；減低該第一訊號之強度； 使該分析物與第二標籤接觸，其中該分析物包括第二標記，且其中該第二標籤對該第二標記具有親和力；及偵測由該第二標籤發射之第二訊號，其中該第二訊號的存在指示存在該第二標記。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之顆粒之系統，該系統包括：微流體晶片，其包括輸入通道、第一輸出通道、第二輸出通道、及定向流動通道；閥，其中該閥係可與該微流體晶片分離的，且其中：該閥調節該定向流動通道中之第一流體之流動；及該定向流動通道中該第一流體之流動引導第二流體自該輸入通道流動至該第一輸出通道、該第二輸出通道、或其組合；偵測器，其組態可以偵測由該輸入通道中該第二流體之一部分發射之訊號；及處理器，其組態可以基於該訊號來賦值給該部分；及操作該閥。於一些態樣中，該閥為電致動閥。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之顆粒之系統，該系統包括：(a)微流體晶片，其包含至少一個樣本輸入通道、至少一個定向流動通道、及至少兩個輸出通道，其中該至少一個定向流動通道與該樣本輸入通道交叉；(b)位於不為該微流體晶片之一部分之裝置上之電致動閥，其中該電致動閥係藉由控制與至少一個定向流動通道或該至少兩個輸出通道中至少一者交叉之輸入通道來控制流體之流動；(c)至少一個可偵測該流體樣本之等分試樣中之一或多種分析物之偵測器；及(d)可基於該等分試樣中之分析物之存在、不存在、同一性、組成、或量而為該等分試樣指示一個數值之處理器，其中該處理器係與該偵測器及該電致動閥連通。
於各種態樣中，提供於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣的方法，其中該等分試樣包含罕見顆粒，該等方法包括以下步驟：(a)偵測該等分試樣中該罕見顆粒之存在或不存在；(b)基於該罕見顆粒之存在或不存在而為該等分試樣指示一個數值；及(c)依據該指示 之數值，藉由打開電致動閥引導該等分試樣之流動，其中該電致動閥係位於於微流體晶片之外部之裝置上。於一些態樣中，該微流體晶片包括樣本輸入通道、至少兩個輸出通道、及至少一個定向流動通道，及其中該電致動閥控制該定向流動通道中流體之流動。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之罕見顆粒之裝置，該等裝置包括：輸入通道；第一輸出通道；第二輸出通道；偵測器，其組態可以偵測該流體樣本之一部分中之顆粒之存在或不存在；機制結構，其基於該顆粒之存在或不存在來引導該部分自該輸入通道流動至該第一輸出通道、該第二輸出通道、或其組合；及與該第一輸出通道流體連通之過濾器。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之罕見顆粒之裝置，該等裝置包括：(a)至少一個樣本輸入通道；(b)至少兩個輸出通道，其中該兩個輸出通道中之至少一者係與孔陣列流體連通；(c)至少一個可偵測該流體樣本之等分試樣中之一或多種罕見顆粒之偵測器；及(d)機制結構，其藉由引導包含該一或多種罕見顆粒之等分試樣流動通過第一輸出通道來分選該一或多種罕見顆粒。
於各種態樣中，提供用於進行分析之整合系統，該系統包括：包含顆粒之流體樣本，其中該顆粒包括標記；輸入通道；第一輸出通道；第二輸出通道；第一偵測器，其組態可以偵測該流體樣本之一部分中之顆粒之存在或不存在，該部分係配置在該輸入通道中；機制結構，其基於該顆粒之存在或不存在來引導該部分自該輸入通道流動至該第一輸出通道；微腔，其與該第一輸出通道流體連通且其組態可以捕集該顆粒；及第二偵測器，其組態可以偵測該微腔中該標記之存在或不存在。
引用參考
本說明書中提及之所有公開案、專利案、或專利申請案係以引 用之方式併入本文中，引用程度如同特定且個別地指明各個別公開案、專利案、或專利申請案以引用之方式併入般。
100:引入分析物至微流體裝置
110:視情況-進行eDAR
115:引導分析物至預備腔室
120:標記預備腔室中之分析物
125:輻射預備腔室中之分析物
130:偵測預備腔室中之分析物
135:減弱預備腔室中分析物上之標籤之訊號
140:視情況-重複複數個循環
150:分析來自標籤之訊號
155:偵測方案
160:載台
165:電腦及軟體
170:電荷耦合裝置(CCD)
175:輻射
180:光
190:雷射
200:eDAR設備
205:加壓氣體來源
215:緩衝液儲存槽
225:流體樣本儲存槽
230:通道
235:通道線
245:流體樣本入口
250:緩衝液入口
260:微流體晶片
270:過濾區
275:出口
280:廢棄物腔室
290:順序免疫染色及光漂白方法
300:流體樣本
310:微流體晶片載台
315:流體單分析物陣列
320:經捕集之個別分析物
325:視情況製備分析物
330:標記分析物
335:輻射分析物
340:偵測分析物上之標籤
345:處理或分析
350:偵測方案
355:載台
360:電腦及軟體
365:電荷耦合裝置(CCD)
370:光
375:輻射
380:雷射
本發明之新穎特徵以特殊性陳述於隨附申請專利範圍中。參照下文描述例示性實施例之實施方式當可更佳地明瞭本發明之特徵及優點，其中利用本發明之原理、及以下附圖：圖1為根據本發明之一個態樣之使用流體微流體晶片之免疫染色及光漂白之概述圖。
圖2為根據本發明之一個態樣之使用eDAR設備之免疫染色及光漂白之概述圖。
圖3為根據本發明之一個態樣之使用單分析物陣列之免疫染色及光漂白之概述圖。
圖4為根據本發明之一個態樣之eDAR之概述圖。
圖5繪示根據本發明一個態樣之eDAR微流體晶片之用於微製造的製程流程之一個實例。
圖6繪示八種例示性流體動力分選方案。
圖7顯示根據本發明之一個態樣之總體eDAR之微流體晶片及流體動力切換方案。
圖8描繪根據本發明一個態樣之藉由高速攝影機記錄之用於當前流體方案之切換時間之一個實例。
圖9顯示根據本發明之一個態樣之eDAR之特徵分析及分析性能。
圖10顯示根據本發明一個態樣之捕獲CTC之微狹縫及多色螢光成像。
圖11描繪根據本發明之一個態樣之「雙重捕獲」eDAR之一般結構。
圖12顯示血液流動之三種狀態之明視野影像。
圖13提供根據本發明一個態樣之順序免疫染色及光漂白測試之一般方案及程序。
圖14顯示根據本發明一個態樣之捕集於eDAR微流體晶片上之六種癌細胞之順序免疫染色及光漂白結果。
圖15描繪根據本發明一個態樣之曝露於不同功率之光源的經抗-EpCAM-PE標記之MCF-7細胞的光漂白曲線之一個實例。
圖16顯示根據本發明一個態樣之捕獲於eDAR上具有Her2+/MUC1-特性之四種癌細胞之螢光影像。
圖17為根據本發明一個態樣之單分析物陣列之圖式。
圖18為根據本發明一個態樣之具有捕集密度及尺寸之裝置之示意圖。
圖19描繪根據本發明一個態樣之平行流阻捕集阱。
圖20為用於建立一些本發明所述裝置之程序之示意圖。
圖21為根據本發明一個態樣之可用於製造平行流阻捕集阱之微製造方法之一個實例。
圖22描繪根據本發明一個態樣之串行流阻捕集阱及平行流阻捕集阱可收集、離散化、及讀取生物衍生之樣本的步驟。
圖23顯示根據本發明一個態樣之基於明視野及螢光顯微鏡之針對微孔及側腔之陣列之偵測及讀取方案。
圖24繪示根據本發明一個態樣之捕集生物顆粒/細胞陣列用於分析及釋放之順序。
圖25顯示根據本發明一個態樣之可藉由報告於本文中之方法分析之15種對照樣本及10種胰腺癌樣本之分佈。
圖26顯示根據本發明一個態樣之衍生自胰腺癌樣本之具有低上皮細胞黏著標記(EpCAM)表現之CTC叢。
本發明提供通常併與微流體設備使用用於偵測、分離及分析流體樣本(例如，血液)中之顆粒(例如，細胞)之方法、系統及裝置。該等顆粒可為罕見顆粒(例如，罕見細胞)。提供於本文中之許多微流體設備可用於進行對流體樣本之總體決策等分試樣分級法(Ensemble Decision Aliquot Ranking)(eDAR)，此容許在將流體樣本分成等分試樣後對該流體樣本進行分析。
於一些態樣中，eDAR設備可用於(i)偵測流體樣本之等分試樣中之罕見顆粒(例如，罕見細胞)之存在或不存在，(ii)根據罕見顆粒之存在或不存在，來分級該等分試樣，例如，藉由賦值諸如非零或歸零之術語給該等分試樣；及(iii)基於賦值的分級使用諸如流體動力切換方案之方案來引導該等分試樣之流動或收集。該等等分試樣可為待分析之流體樣本之總體積之一部分。於一些態樣中，等分試樣佔據三維空間及於該等分試樣中之顆粒可係隨機地分佈。
於一些態樣中，本發明提供用於以極高效率、敏感性及/或回收率在流體樣本上進行eDAR之設備及方法。例如，提供於本文中之eDAR設備可自流體樣本(例如，血液、全血、尿液等等)回收大於95%之特定罕見細胞類型。eDAR設備可以小於10%、小於5%、或甚至0%假陽性率地發揮作用。假陽性率可在許多個樣本，諸如，多於10個樣本、或多於15個樣本上。eDAR設備之速度亦可係極快速。例如，整個樣本可在小於25分鐘、小於20分鐘等等內進行處理。
通常，提供於本文中之eDAR設備包括微流體晶片，其包括(a)通道；(b)腔室；(c)過濾器；(d)偵測器，及/或(e)閥。微流體晶片可為較大系統之一部分，該較大系統亦包括(a)用於保持緩衝液之容器；(b)晶片外閥(例如，螺線管閥)；(c)光源及偵測器；(d)管件；(e)取樣埠；(f)數位處理器及/或其他特徵。過濾器及微狹縫或微孔(例如，微狹縫陣列)可用於進一步純化樣本。本文中，術語「微狹縫」及「微 孔」可互換使用，及微狹縫或微孔亦可包括柱陣列，其中該柱間間距係用於進行過濾。該柱間間距可為均等或不同。於一些態樣中，將樣本引入至eDAR設備，其接著依流體動力切換方案實施細胞之主動分選。該流體動力切換方案可包括具有特定幾何形狀之通道，如本文中之進一步論述。
於一些態樣中，本發明提供用於捕獲樣本中分析物群體(例如，罕見細胞)中之多於一種類型之分析物(例如，罕見細胞)、或多於一種子群體之分析物(例如，罕見細胞)之方法及設備。樣本可經複數種偵測試劑標記使得可偵測到複數種分析物(例如，罕見細胞)。例如，該樣本可為混合樣本及包含混合罕見細胞群體。該混合罕見細胞群體可尤其包括上皮細胞及間質細胞。於複數種偵測試劑中，一種偵測試劑可與上皮細胞上之上皮標記結合，而一種不同試劑與間質細胞上之間質標記結合。
混合樣本可在輸入通道引入至微流體晶片設備中。於該設備上之側通道可用於控制該混合樣本之流動之流體動力切換。可藉由兩個螺線管閥來控制該流體之流動使得複數種分析物係經分離進入微流體晶片之兩個不同區域。於一些態樣中，該等分析物係進一步於微流體晶片上純化，諸如藉由使流體通過過濾器或微狹縫陣列純化。該等分析物可在過濾器處收集或可於微狹縫陣列上收集。
本發明進一步提供一種用於可與eDAR耦合、或可與其他微流體裝置併用之染色及洗滌系統之方法。該染色及洗滌系統之方法可係線內(in-line)。該等線內染色及洗滌方法提供單離個別分析物(例如，細胞)及偵測生物標記之自動化製程。該方法亦可減低偵測分析物上之不同標記時所需之偵測試劑(例如，抗體)的量。該方法可進一步使該系統之死體積最小化。另外，該設備可包括避免引入氣泡至設備中之機制結構。
eDAR可結合特徵化及分析之下游方法。該等方法可包括罕見細胞之細胞及分子分析。於一些態樣中，免疫染色可用於確定罕見細胞上某些生物標記之表現。本文中描述用於免疫染色之半自動化方法及系統。
本發明進一步提供使用利用流體樣本之單分析物陣列之系統、方法及設備。單分析物陣列可包括複數個孔或微孔，其組態使得流體樣本中之不多於一種分析物將佔據特定孔。於一些態樣中，微孔可為微腔。單分析物陣列亦可包含複數個之貼片或微貼片，其組態使得流體樣本中之不多於一種分析物將佔據特定貼片。包含分析物之流體樣本可引入該陣列及該等分析物(例如，細胞)中及可經分配使得該裝置之微孔或微貼片之至少80%裝納不多於一種分析物。於一些態樣中，單分析物陣列可與微流體系統併用。於一些態樣中，該微流體系統可為eDAR裝置。
於一些態樣中，單分析物陣列涉及一種包括以下步驟之方法：隨著細胞呈液相輸送，容納或物理捕集單細胞，及遵循該相之流動路徑，轉換至物理界定之位置，及由於基於繼流動之力或表面黏著力所致而常駐在該界定之位置。於另一情況中，該等細胞係依序捕集，此乃因流體流動路徑就入口至出口而言連續。於另一情況中，多個流體流動路徑及相稱之多個單細胞係以平行方式進行捕集/封存，此乃因介於入口與出口之間之細胞可同時經過該許多個路徑。
述於本發明中之方法、系統、設備及裝置可用於生物及病理方面中用於分析物(例如，罕見細胞)之分離、濃縮、及/或單離之多種應用中。例如，一些應用可包括(但不限於)自流體(例如，體液)捕獲罕見細胞(例如，癌細胞、癌症幹細胞、瘧疾感染之紅血球、幹細胞、胎兒細胞、免疫細胞、感染之細胞)用於疾病之診斷及預後；單離單細胞寄生菌(例如，梨形鞭毛蟲屬(giardia)、隱孢子蟲屬 (cryptosporidium))用於水品質監測；單離受感染細胞(例如，淋巴細胞、白血球)用於監測疾病進展(例如，HIV、AIDS、癌症)；於母體血液中之胎兒細胞用於篩選(例如，疾病、遺傳畸形)；用於治療應用中之幹細胞；用於朊病毒相關(例如，狂牛)病症篩選之朊病毒感染之細胞；及其他。
於一個特定態樣中，罕見顆粒為罕見細胞。罕見細胞可係有核或無核。罕見細胞包括(但不限於)表現惡性表型之細胞；胎兒細胞(諸如，於母體周邊血液中之胎兒細胞)、腫瘤細胞(諸如，已自腫瘤脫落至血液或其他體液中之腫瘤細胞)；受病毒感染之細胞，諸如，受HIV感染之細胞、經所關注基因轉染之細胞；及存於遭受自體反應疾病折磨之個體周邊血液中之T-細胞或B-細胞之異常性亞型。
如本文所用，「總體決策」係指基於顆粒之總體或群組中特徵之存在或不存在之偵測所做出的決策。群組可包括至少3種顆粒、分析物及/或細胞。於一些態樣中，總體決策將基於包含複數種顆粒之流體樣本之等分試樣中單個獨特顆粒之存在或不存在來做出。重要地，基於單個顆粒之存在或不存在做出的總體決策將應用於整個等分試樣(換言之，應用於所有的存於等分試樣中之顆粒)。
如本文所用，「等分試樣」係指待分析之流體樣本之總體積之一部分。等分試樣可包含至少一種顆粒、分析物或細胞。等分試樣可包含顆粒、分析物或細胞之群組。等分試樣佔據三維空間及其中之顆粒隨機地分佈而不組織化。等分試樣具有有限深度，及顆粒可沿不具有識別層之該深度分佈。於本申請案之上下文中，等分試樣以其總體於不進行再分下進行分析。
如本文所用，詞語「分配流體」係指從流體樣本之總體積分離或以其他方式再引導流體之一部分或等分試樣。
於某些態樣中，等分試樣可由較大流體樣本之一部分，例如， 約1/2之流體樣本、或約1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、或更小之流體樣本組成。於某些態樣中，等分試樣可由(例如)約10%之流體樣本、或約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.001%、或更小之流體樣本組成。因此，待藉由提供於本文中之eDAR方法來研究或處理之流體可分為(例如)至少約2個等分試樣、或至少約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、175個、200個、225個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、600個、700個、800個、900個、1,000個、1,100個、1,200個、1,300個、1,400個、1,500個、1,600個、1,700個、1,800個、1,900個、2,000個、2,500個、3,000個、3,500個、4,000個、4,500個、5,000個、6,000個、7,000個、8,000個、9,000個、10,000個、20,000個、30,000個、40,000個、50,000個、60,000個、70,000個、80,000個、90,000個、100,000個、200,000個、300,000個、400,000個、500,000個、600,000個、700,000個、800,000個、900,000個、1,000,000個、2,000,000個、3,000,000個、4,000,000個、5,000,000個、6,000,000個、7,000,000個、8,000,000個、9,000,000個、10,000,000個、或更多個等分試樣。熟習此項技藝者當明瞭流體樣本將分配成之等分試樣之數目將取決於流體中預期之罕見顆粒之數目及流體樣本之總體積。
於某些態樣中，等分試樣可包含較大流體樣本之一部分(例如，1/2之流體樣本、或1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、或更小之流體樣本)。於某些態樣中，等分試樣可包含(例如)10%、或流體樣本之9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.001%、或更小之流體樣本。因此，待藉由 提供於本文中之eDAR方法研究或處理之流體可分為(例如)至少2個等分試樣、或至少3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、175個、200個、225個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、600個、700個、800個、900個、1,000個、1,100個、1,200個、1,300個、1,400個、1,500個、1,600個、1,700個、1,800個、1,900個、2,000個、2,500個、3,000個、3,500個、4,000個、4,500個、5,000個、6,000個、7,000個、8,000個、9,000個、10,000個、20,000個、30,000個、40,000個、50,000個、60,000個、70,000個、80,000個、90,000個、100,000個、200,000個、300,000個、400,000個、500,000個、600,000個、700,000個、800,000個、900,000個、1,000,000個、2,000,000個、3,000,000個、4,000,000個、5,000,000個、6,000,000個、7,000,000個、8,000,000個、9,000,000個、10,000,000個、或更多個等分試樣。熟習此項技藝者當明瞭流體樣本將分配成之等分試樣之數目將取決於流體中預期之罕見顆粒之數目及流體樣本之總體積。
於某些態樣中，等分試樣可具有(例如)介於約0.1nL及約10mL之間、或介於約1nL及約1mL之間、或介於約1nL及約100μL之間、或介於約1nL及約10μL之間、或介於約1nL及約1μL之間、或介於約1nL及約100nL之間、或介於約0.1nL及約10nL之間之體積。
於某些態樣中，等分試樣可具有(例如)介於0.1nL及10mL之間、或介於1nL及1mL之間、或介於1nL及100μL之間、或介於1nL及10μL之間、或介於1nL及1μL之間、或介於1nL及100nL之間、或介於0.1nL及10nL之間之體積。
如本文所用，術語「分級」係指藉由分類評估等分試樣之定量 性質、定性性質、或重要性。於一個態樣中，等分試樣可經分級為歸零(例如，在等分試樣中未偵測到罕見顆粒之情況下)或非零(例如，在等分試樣中偵測到至少一種罕見顆粒之情況下)。於一個態樣中，該分級可係二分。於其他態樣中，等分試樣可依照其他(例如)與等分試樣中罕見顆粒之濃度、等分試樣中罕見顆粒之同一性、等分試樣中複數種不同罕見顆粒間之同一性、及類似相關聯之類別分級。於此種方式中，任何數目之類別可基於(例如)介於約1及10之間、介於約11及20、介於約1及50之間、介於約51及100之間、介於約1及100之間、介於約101及201之間之濃度之範圍等等來賦值。於一些態樣中，類別之數目可基於(例如)介於1及10之間、介於11及20之間、介於1及50之間、介於51及100之間、介於1及100之間、介於101及201之間等等之濃度之範圍來賦值。該等分級可經賦值為對應於許多種預定定量或定性類別中一種之任意數目(例如，0、1、2、3、4、5等等)、或對應於等分試樣中罕見顆粒之數目或近似數目之實際值之數目。
如本文所用，術語「微流體晶片」可與術語晶片、流體晶片、微晶片或流體微晶片互換使用。
如本文所用，「電腦」係指至少一個數位處理器。數位處理器可為(但不限於)場可程式化閘陣列(field programmable gate array；FGPA)、特殊應用積體電路(ASIC)或即時(RT)處理器。
用於進行分析之裝置、設備及方法
述於本發明中之方法可用於從流體樣本單離及偵測分析物。於一些態樣中，該方法可包括使用第一標籤或第一組標籤來偵測分析物上之分子、減低由該等標籤發射之訊號及使用第二標籤或第二組標籤來偵測分析物上之另一組分子。於一些態樣中，該方法可使用自樣本分離出的分析物來進行。於一些態樣中，該方法可與微流體裝置組合。微流體裝置可用於自樣本單離分析物。於一些態樣中，稱為免疫 染色及漂白之方法可在用於自樣本單離分析物之微流體裝置上進行。
簡圖說明免疫染色及光漂白方法之一種例示性情況之概念圖顯示於圖1中。免疫染色及光漂白之該方法可在微流體裝置100上連同偵測方案155來進行。微流體裝置100可置於顯微鏡之在光源180及輻射源175上方或下方之載台160上。分析物可引入至微流體裝置100及eDAR可經進行110以自流體樣本單離分析物。單離的分析物可引導至預備腔室115，在預備腔室115分析物可留存達免疫染色及光漂白方法之持續時間。可使分析物與一或多種標籤接觸120。輻射源175可輻射分析物上之一或多種標籤125及可偵測130由該一或多種標籤發射之訊號。輻射源175可源自於雷射、或發光二極體(LED)、或雷射190。可使用光源180來減低135由標籤發射之訊號。於訊號之減弱135中，數位處理器(例如，電腦)及軟體165及電荷耦合裝置(charge-coupled device；CCD)170可用於偵測130由標籤發射之訊號之持續時間。於一些態樣中，標籤分析物曝露於照射源之曝露時間可持續直到由標籤發射之訊號被消除。步驟120、125、130及135包括一個免疫染色及光漂白之循環。可重複免疫染色及光漂白之循環140直到完成多個循環。光漂白135之最後回可或可不在最後一個循環中進行。於分析物之偵測130之後，最後一個循環可繼續進行以分析由標籤150發射之訊號。
簡圖說明可與免疫染色及光漂白方法290組合使用之eDAR設備200之一種例示性情況之概念圖顯示於圖2中。流體樣本儲存槽225及通道230可與流體樣本入口245連接。緩衝液儲存槽215可經通道線235與加壓氣體來源205連接。可將緩衝液入口250與流體樣本入口245連接。可將過濾區270與緩衝液入口250、流體樣本入口245、出口275及廢棄物腔室280連接。流體樣本可進入eDAR設備200及一種分析物或複數種分析物可捕集於過濾區270。過濾區可裝納複數個腔室，其中各腔室可裝納單一分析物。免疫染色及光漂白方法290可於 可裝納過濾區270之微流體晶片260之一部分上進行。
本發明提供一種用於可使用單分析物陣列來進行之順序免疫染色及光漂白之方法。單分析物陣列容許單分析物(例如，細胞)之封存、捕集、操縱、及偵測。通常，細胞係藉由自流體流動、重力、表面黏著力、化學力、或光學力產生的力而被捕集。於一些態樣中，單分析物陣列阱係利用可與捕集細胞結合(例如，共價結合、離子結合等等)之元素官能化。可使捕集之細胞與化學試劑接觸。化學試劑可為用於偵測外部分子、或穿透細胞膜及標記細胞內分子之標籤。經標記之細胞可經成像並進行進一步分析。
簡圖說明與免疫染色方法組合之單分析物陣列之一種例示性情況之概念圖顯示於圖3中。流體單分析物陣列315可為微流體晶片或結構之一部分且係置於微流體晶片載台310上。免疫染色方法可在流體單分析物陣列315上連同偵測方案350來進行。微流體晶片載台310可置於在光源370及輻射源375上方或下方之顯微鏡之載台355上。於流體樣本中之分析物可引入至流體單分析物陣列300。單離的分析物可引導至流體單分析物陣列315之一區域，在該區域中捕集的單分析物320可留存達免疫染色方法之持續時間。可使用可包括(但不限於)透化及/或固定之多種方法來製備325分析物。可使分析物與一或多種標籤接觸330。輻射源375可輻射於分析物上之該一或多種標籤335及可偵測由該一或多種標籤發射之訊號340。輻射源375可源自雷射380。分析物可進行進一步處理及分析345。數位處理器(例如，電腦)及軟體360、及電荷耦合裝置(CCD)365可用於偵測由標籤發射之訊號。
就順序免疫染色及光漂白而言，可使用光源370來減低由標籤發射之訊號。於訊號之減弱中，電腦及軟體360、及電荷耦合裝置(CCD)365可用於偵測由標籤發射之訊號之強度。經標記之分析物曝露於照射源之曝露時間可持續直到由標籤發射之訊號被消除。步驟 330、335、340及345包括一個免疫染色及光漂白之循環。可重複該等循環直到完成多個循環。
eDAR設備可用於識別並單離分析物(例如，罕見細胞)。eDAR可處理呈等分試樣之樣本及可藉由由流體動力切換方案控制之主動分選步驟收集通道或腔室中之罕見細胞。於本文中稱為微流體晶片之具有通道及腔室之「一體化微流體晶片」可用於分選罕見細胞。微流體晶片可部分地由功能性區域、微製造過濾器組成。eDAR可用於快速(例如，每1mL少於或等於12.5分鐘)地以高回收率(例如，大於或等於90%)及低假陽性率(例如，接近零)分析包含混合分析物群體之流體(例如，大於或等於1毫升之全血)。
微流體晶片之一般結構及eDAR之一實例組態描繪於圖7中。左下方通道可用於收集分選的等分試樣及可用於將其等轉移至接續之純化(例如，純化腔室)區域(例如，20,000個微狹縫)。以虛線盒標記之區域進一步描繪於圖7b至7d中。在未分級出陽性等分試樣情況下之一種實例流動條件顯示於圖7b中。血液流動可經切換至收集通道，及分選的等分試樣可由圖7c中之第二窗口獲得證實。圖7d顯示血液流動可在分選等分試樣之後切換回。
設備可具有若干種流速。該等流速可係指流體流動通過eDAR設備及附接至該設備之任何組件之速率。於一些態樣中，例示性流速可為小於約5μL/min、10μL/min、20μL/min、25μL/min、30μL/min、35μL/min、40μL/min、41μL/min、42μL/min、43L/min、44μL/min、45μL/min、46μL/min、47μL/min、48μL/min、49μL/min、50μL/min、51μL/min、52μL/min、53μL/min、54μL/min、55μL/min、56μL/min、57μL/min、58μL/min、59μL/min、60μL/min、61μL/min、62μL/min、63μL/min、64μL/min、65μL/min、66μL/min、67μL/min、68μL/min、69 μL/min、70μL/min、71μL/min、72μL/min、73μL/min、74μL/min、75μL/min、76μL/min、77μL/min、78μL/min、79μL/min、80μL/min、81μL/min、82μL/min、83μL/min、84μL/min、85μL/min、86μL/min、87μL/min、88μL/min、89μL/min、90μL/min、91μL/min、92μL/min、93μL/min、94μL/min、95μL/min、96μL/min、97μL/min、98μL/min、99μL/min、100μL/min、105μL/min、110μL/min、115μL/min、120μL/min、125μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min、160μL/min、170μL/min、180μL/min、190μL/min、200μL/min、225μL/min、250μL/min、275μL/min、300μL/min、350μL/min、400μL/min、450μL/min、500μL/min、600μL/min、700μL/min、800μL/min、900μL/min或1000μL/min。
於一些態樣中，流速可在約5μL/min至30μL/min、15μL/min至50μL/min、25μL/min至75μL/min、40μL/min至80μL/min、50μL/min至90μL/min、60μL/min至100μL/min、80μL/min至160μL/min、90μL/min至180μL/min、100μL/min至200μL/min、150μL/min至300μL/min、200μL/min至400μL/min、300μL/min至500μL/min、400μL/min至600μL/min、500μL/min至700μL/min、600μL/min至800μL/min、700μL/min至900μL/min或800μL/min至1000μL/min範圍內。
於一些態樣中，例示性流速可為小於5μL/min、10μL/min、20μL/min、25μL/min、30μL/min、35μL/min、40μL/min、41μL/min、42μL/min、43μL/min、44μL/min、45μL/min、46μL/min、47μL/min、48μL/min、49μL/min、50μL/min、51μL/min、52μL/min、53μL/min、54μL/min、55μL/min、56μL/min、57μL/min、58μL/min、59μL/min、60μL/min、61μL/min、 62μL/min、63μL/min、64μL/min、65μL/min、66μL/min、67μL/min、68μL/min、69μL/min、70μL/min、71μL/min、72μL/min、73μL/min、74μL/min、75μL/min、76μL/min、77μL/min、78μL/min、79μL/min、80μL/min、81μL/min、82μL/min、83μL/min、84μL/min、85μL/min、86μL/min、87μL/min、88μL/min、89μL/min、90μL/min、91μL/min、92μL/min、93μL/min、94μL/min、95μL/min、96μL/min、97μL/min、98μL/min、99μL/min、100μL/min、105μL/min、110μL/min、115μL/min、120μL/min、125μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min、160μL/min、170μL/min、180μL/min、190μL/min、200μL/min、225μL/min、250μL/min、275μL/min、300μL/min、350μL/min、400μL/min、450μL/min、500μL/min、600μL/min、700μL/min、800μL/min、900μL/min或100μL/min。
於一些態樣中，該流速可在5μL/min至30μL/min、15μL/min至50μL/min、25μL/min至75μL/min、40μL/min至80μL/min、50μL/min至90μL/min、60μL/min至100μL/min、80μL/min至160μL/min、90μL/min至180μL/min、100μL/min至200μL/min、150μL/min至300μL/min、200μL/min至400μL/min、300μL/min至500μL/min、400μL/min至600μL/min、500μL/min至700μL/min、600μL/min至800μL/min、700μL/min至900μL/min或800μL/min至1000μL/min範圍內。
設備可具有若干種分選效率。該分選效率可係指所關注分析物之回收率。於一些態樣中，一種例示性分選效率可為大於約5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、 65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。於一些態樣中，該分選效率可在約5%至30%、15%至50%、25%至75%、40%至80%、50%至90%或60%至100%範圍內。
於一些態樣中，一種例示性分選效率可為大於5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。於一些態樣中，該分選效率可在5%至30%、15%至50%、25%至75%、40%至80%、50%至90%或60%至100%範圍內。
eDAR設備可具有若干種回收率。該回收率可係指所關注分析物之回收率。於一些態樣中，該回收率可為大於約5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。於一些態樣中，回收率可在約5%至30%、15%至50%、25%至75%、40%至80%、50%至90%或60%至100%範圍 內。
於一些態樣中，該回收率可為大於5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
於一些態樣中，該回收率可在5%至30%、15%至50%、25%至75%、40%至80%、50%至90%或60%至100%範圍內。
於一些態樣中，eDAR設備或方法係用於使第一細胞類型與第二細胞類型分離。於一些態樣中，單離之樣本包含大於5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之第一細胞類型之總數。於一些態樣中，單離樣本包含小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、或90%之第二細胞類型之總數。
eDAR設備可包括配備有用於激發及偵測模式之輻射源(例如，雷射)之顯微鏡、光源(例如，光漂白)、計時器、管件、廢棄物收集裝 置、用於成像經標記之分析物(例如，細胞)之攝影機、控制流體流入及流出微流體晶片之泵、控制主動分選步驟之數位處理器及用於處理影像之數位處理器(例如，電腦系統)。該數位處理器可為電腦。
於一些態樣中，eDAR平台可包括用於捕獲多於一種分析物(例如，罕見細胞)之設備。「雙重捕獲」eDAR可自混合樣本分離多種罕見細胞。混合樣本(例如，流體樣本)可經偵測試劑標記及在主要通道進入「雙重捕獲」設備頂部。兩個側通道可用於控制混合樣本之流動之流體動力切換。於一些態樣中，該流動可使用兩個螺線管來控制。罕見細胞之兩種子群體可經分離並捕集於相同微流體晶片上之兩個不同過濾區域上。
於各種態樣中，提供用於從衍生自流體之樣本分配表現特異性生物標記圖譜之細胞之設備，其中：該設備包括一組連接至具有至少一個通道及腔室之微流體晶片之管件；及該設備可單離該腔室中之該等細胞，其中於單離後，該腔室包含表現特異性生物標記圖譜之樣本中細胞總群體之80%以上，且其中於單離後，該腔室包含表現不同生物標記圖譜之樣本中細胞總群體之5%以下。
於一些態樣中，表現特異性生物標記圖譜之細胞之單離發生在小於20分鐘內。於一些態樣中，該特異性生物標記圖譜係存於小於5%之流體之樣本中之該等細胞上。於某些態樣中，該流體為血液。於其他態樣中，該流體為全血分離物。又於其他態樣中，該流體為全血之有核細胞部分。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之顆粒之系統，該系統包括：微流體晶片，其包括輸入通道、第一輸出通道、第二輸出通道、及定向流動通道；閥，其中該閥係可與該微流體晶片分離的，及其中：該閥調節該定向流動通道中之第一流體之流動；及該定向流動通道中該第一流體之流動引導第二流體自該輸入通道流動至該第一輸 出通道、該第二輸出通道、或其組合；偵測器，其組態可以偵測由該輸入通道中該第二流體之一部分發射之訊號；及處理器，其組態為：根據該訊號為該部分指示一個數值；及操作該閥。於一些態樣中，該閥為電致動閥。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之顆粒之系統，該系統包括：(a)微流體晶片，其包括至少一個樣本輸入通道、至少一個定向流動通道、及至少兩個輸出通道，其中該至少一個定向流動通道與該樣本輸入通道交叉；(b)位於不是微流體晶片之一部分之裝置上之電致動閥，其中該電致動閥藉由控制與至少一個定向流動通道或該至少兩個輸出通道中之至少一者交叉之輸出通道來控制流體之流動；(c)至少一個可偵測流體樣本之等分試樣中之一或多種分析物之偵測器；及(d)可基於該等分試樣中之分析物之存在、不存在、同一性、組成、或量而為該等分試樣指示一個數值之處理器，其中該處理器係與該偵測器及該電致動閥連通。
於一些態樣中，該電致動閥為螺線管閥。於某些態樣中，該電致動閥控制流體在至少一個定向流動通道中之流動。於其他態樣中，該電致動閥通常係封閉及其中該電致動閥在接收到來自處理器之訊號之後打開。又於其他態樣中，該電致動閥通常係打開及其中該電致動閥在接收到來自處理器之訊號之後封閉。
於一些態樣中，該至少一個定向流動通道包括至少兩個埠及其中該電致動閥控制流體流動通過這兩個埠中之一者之流動。於某些態樣中，該電致動閥直接控制流體在至少一個定向流動通道中之流動。於一些態樣中，該電致動閥直接控制通道中之流體饋送至至少一個定向流動通道中之流動。於某些態樣中，該電致動閥直接控制流體在僅一個定向流動通道中之流動。於其他態樣中，該電致動閥直接控制流體在輸出通道中之流動。又於其他態樣中，該電致動閥直接控制通道 中之流體饋送至輸出通道中之流動。於一些態樣中，該電致動閥為壓電閥。
於一些態樣中，定向流動通道在接合處與輸出通道交叉。於某些態樣中，偵測器係位於不是輸出通道之至少一個通道上。於一些態樣中，該裝置包括證實性雷射。於某些態樣中，該證實性雷射係位於不是輸入通道之至少一個通道上。於其他態樣中，該系統包括第二偵測器。又於其他態樣中，至少一個通道係與過濾器流體連通。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之罕見顆粒之裝置，該等裝置包括：輸入通道；第一輸出通道；第二輸出通道；偵測器，其組態可以偵測流體樣本之一部分中之顆粒之存在或不存在；機制結構，其基於該顆粒之存在或不存在來引導該部分自該輸入通道流動至該第一輸出通道、該第二輸出通道、或其組合；及與該第一輸出通道流體連通之過濾器。於一些態樣中，該過濾器包括孔陣列。於某些態樣中，該陣列中各孔之最小尺寸係小於顆粒之最小尺寸。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之罕見顆粒之裝置，該裝置包括：(a)至少一個樣本輸入通道；(b)至少兩個輸出通道，其中該兩個輸出通道中之至少一者係與孔陣列流體連通；(c)至少一個可偵測流體樣本之等分試樣中之一或多種罕見顆粒之偵測器；及(d)藉由引導包含該一或多種罕見顆粒之等分試樣流動通過第一輸出通道來分選該一或多種罕見顆粒之機制結構。
於一些態樣中，該裝置包括第一輸出通道及第二輸出通道。於某些態樣中，若該等分試樣不包含罕見顆粒，則該機制結構引導該等分試樣流動進入該第二輸出通道。於某些態樣中，用於分選之機制結構包括電極、磁性元件、聲學元件、或電致動元件。
於一些態樣中，該孔陣列係配置在輸入通道及輸出通道之間。於某些態樣中，該孔陣列係在與輸入通道及輸出通道相同的平面中。 於其他態樣中，該孔陣列係配置於該第一輸出通道中。又於其他態樣中，該孔陣列係配置於與該第一輸出通道流體連通之腔室中。於一些態樣中，該孔陣列之組態使得該等罕見顆粒不可通過該等孔，但至少一種其他顆粒可通過該等孔。於某些態樣中，該孔陣列之組態使得該等罕見顆粒可通過該等孔，但至少一種其他顆粒不可通過該等孔。於其他態樣中，該孔陣列包含多於1000個孔。
於某些態樣中，該偵測器係選自由以下組成之群：攝影機、電子倍增器、電荷耦合裝置(CCD)影像感測器、光電倍增管(photomultiplier tube；PMT)、雪崩光電二極體(APD)、單光子雪崩二極體(SPAD)、矽光電倍增器(SiPM)、及互補金屬氧化物半導體(CMOS)影像感測器。
於各種態樣中，提供用於進行分析之整合系統，該等系統包括：包含顆粒之流體樣本，其中該顆粒包括標記；輸入通道；第一輸出通道；第二輸出通道；第一偵測器，其組態可以偵測該流體樣本之一部分中之顆粒之存在或不存在，該部分係配置於該輸入通道中；機制結構，其基於該顆粒之存在或不存在來引導該部分自該輸入通道流通至該第一輸出通道；微腔，其與該第一輸出通道流體連通且其組態可以捕集該顆粒；及第二偵測器，其組態可以偵測該微腔中標記之存在或不存在。
微流體晶片設計及製造
微流體晶片可經製造以提供作為有效之主動分選方案及接續之純化(例如，純化腔室)方案。該微流體晶片可由矽母板上之兩個層組成且可藉由一步式重複模製為聚二甲基矽氧烷(PDMS)來製造。該微流體晶片可藉由結合至玻璃基板製成成品。
於一些態樣中，矽母板可使用兩種光微影製程來製造(圖5)。該等特徵可使用標準軟體(例如，AutoCAD、Autodesk，加州聖瑞菲爾市)來設計，及可寫於鉻遮罩上。於該等情況中，正光阻微影及深反 應性離子蝕刻(DRIE)可用於形成第一層(圖5)。該第一層可為微過濾器特徵。於一些態樣中，正光阻(例如，AZ 1512)係藉由可包括DRIE製程之製程達成。DRIE製程可達成適用於各種特徵之深度(例如，4.5至5μm)。
於一些態樣中，eDAR微流體晶片特徵之第二層可使用負光阻(例如，SU-8-3050，來自MicroChem，馬薩諸塞州牛頓市)來製造，及該特徵之高度可進行控制(例如，50μm)。母板可使用(例如)十三氟-1,1,2,2-四氫辛基-1-三氯矽烷(Sigma-Aldrich，密蘇裡州聖路易斯)矽烷化。矽烷化母板及矽晶圓可塗佈未固化PDMS及經焙烤(例如，於70℃下焙烤2小時)。於一些態樣中，具有所欲微特徵之PDMS之構件可自矽母板剝離，且接著利用電漿氧化之標準製程與蓋玻璃片結合以完成eDAR微流體晶片之製造。
微流體晶片可包含包括染色區域、光漂白區域、成像區域之專用區域、及其他區域。於一些態樣中，該等區域可為用於至少一個目的之相同區域。於其他情況中，該等區域可為用於一個目的之不同區域。於其他情況中，該等區域可為用於至少一個目的之不同區域。各區域可用於多於一個目的。於一些態樣中，eDAR微流體晶片包括藉由標準微影方法製得之整合過濾區域。於一些態樣中，微流體晶片可具有兩個整合功能性區域，即eDAR分選區域及基於狹縫結構之過濾單元。
微流體晶片中之通道
提供於本文中之揭示內容描述一種用於偵測流體樣本中之分析物(例如，罕見顆粒)之設備，該設備包括：(a)至少一個第一輸入通道；(b)至少兩個出口通道；(c)至少一個可偵測生物流體之等分試樣中之一或多種罕見顆粒之偵測器；(d)用於引導該等分試樣之流動之機制結構；及(e)可基於該等分試樣中之罕見顆粒之存在、不存在、 同一性、組成、或量而為該等分試樣指示一個數值之分級裝置，其中數位處理器(例如，電腦)係與該偵測器及用於引導該等分試樣流動之機制結構連通。
於一些態樣中，提供於本文中之設備可包括經壁封閉且/或微製造於基板上之流動通道，具有設計以減小對分析物(例如，罕見細胞)之意外損傷至最低之特徵。減低對罕見細胞之意外損傷可減低會導致錯誤患者診斷或預後之假陰性率。該流動通道可進一步包括具有經流體動力設計以最小應力或損傷地排除生物細胞之孔之通道。該流動通道述於美國專利公開案號2007/0037172及2008/0248499中。在上述專利申請案中稱為具有一維(「1-D」)孔之通道之該等通道減低該等細胞在細胞排除製程中所遭受到的流體動力壓力及因此減低細胞裂解之可能性。具有1-D孔之通道可策略性地依照如美國專利公開案第2008/0318324號中所述之「洩流式過濾」組態配置在一個陣列中以進一步再引導、分配、緩衝、或分散流動，因此減低該等細胞在排除時刻所遭受到衝擊之力道。可使用UV-固化製程依照述於PCT/US2009/02426中之程序自醫療器材級別聚合物之生物相容性基板材料來製造封閉該流動通道之壁，使得eDAR設備可符合管理醫療器材製造之規章。
分選區域中之可用於引入流體進入分選界之主要通道可具有特定高度(例如，50μm)及特定寬度(例如，150μm)。於大多數情況中，其他通道(例如，四個)可具有特定高度(例如，50μm)及特定寬度(例如，200μm)。過濾單元中之狹縫結構基過濾器可具有特定高度(例如，5μm)及特定寬度(例如，5μm)。微流體晶片可包含多達及可包括50,000個狹縫之狹縫結構。
於一些態樣中，eDAR設備可進一步包括基於該分級來開道該等等分試樣之通道。該等通道可經抗凝血劑化合物、可優先與分析物 (例如，罕見生物顆粒)結合之化合物、可防止罕見生物顆粒黏聚之化合物或其組合處理。
於一些態樣中，提供於本文中之eDAR設備可包括複數個流動通道，包括一或多個輸入流動通道(例如，使等分試樣成為偵測體積之通道)及一或多個輸出通道(例如，將等分試樣自偵測體積帶走之通道)。於一些態樣中，如本文所提供之eDAR設備可包括至少約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、或更多個輸入通道及至少約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、或更多個輸出通道之組合。於一些態樣中，如本文所提供之eDAR設備可包括至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、或更多個輸入通道及至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、或更多個輸出通道之組合。於一些態樣中，該設備可包括多個與主要通道連接以注入其他流體來改變局部速度之流動通道。
於一些態樣中，流體係自為微流體晶片之一部分之通道遞送至與通道流體連通但在微流體晶片之外部之腔室。於一些態樣中，該腔室為小瓶。於其他態樣中，該腔室為單孔或孔盤中之孔。於其他態樣中，該腔室為微量離心管。於其他態樣中，該腔室為微量離心管，其 中該微量離心管為艾本德(Eppendorf)管。任何適宜之結構可用於小瓶及熟習此項技藝者可輕易地確定與本發明併用之適宜腔室。
於一些態樣中，流體係自通道遞送至經管或其他用於輸送流體之適宜結構與該通道流體連通之腔室。該管可包括藉由生物相容性聚合物構造之材料。於其他態樣中，該腔室可經毛細管諸如用於(例如)進行毛細管電泳之諸如熔融二氧化矽毛細管與通道流體連通。適於使通道與腔室流體連通之管件之其他類型為熟習此項技藝者所可輕易明瞭。
如本文所用，術語「與...流體連通」(及其變化形式)係指於組件之間存在流體路徑。成流體連通既不暗示也不排除任何中間結構或組件之存在。兩個組件可成流體連通，即使在一些實例中介於其等之間之路徑係阻斷且/或流體不在其等之間流動。因此，於存在流體連通之某些態樣中包含斷續性流體流動。
於一些態樣中，提供於本文中之設備可包含藉由由包括(但不限於)以下之材料製造的壁封閉之流動通道或腔室：聚合材料(聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚胺基甲酸酯-甲基丙烯酸酯(PUMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚對二甲苯、聚氯乙烯、氟乙基丙烯、熱塑聚碳酸酯(lexan)、聚苯乙烯、環狀烯烴共聚物、聚胺基甲酸酯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚己酸內酯、聚酮、聚鄰苯二甲醯胺、乙酸纖維素酯、聚丙烯腈、聚碸、環氧聚合物、熱塑性塑膠、氟聚合物、及聚偏二氟乙烯、聚醯胺、聚醯亞胺)、無機材料(玻璃、石英、矽、GaAs、氮化矽)、熔融二氧化矽、陶瓷、玻璃(有機)、金屬及/或其他材料及其組合。
於一些態樣中，壁材料可由多孔膜、編織或非編織羊毛纖維(諸如布或網格)、金屬(例如，不鏽鋼或蒙乃爾合金(Monal))、玻璃、 紙、或合成物(例如，尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯、聚對二甲苯、及各種聚酯)、燒結不鏽鋼及其他金屬、及多孔無機材料諸如氧化鋁、二氧化矽或碳製成。
於一些態樣中，提供於本文中之設備可包括已經化學或生物分子預處理之流動通道或腔室。例如，通道或腔室可經可防止或減低流體樣本中之分析物(例如，罕見顆粒或細胞)之締合之抗凝血劑化合物、可優先與分析物(例如，罕見顆粒或細胞)結合之化合物、或可防止或減低流體樣本中之分析物(例如，罕見顆粒或細胞)黏聚或聚集之化合物處理。
於一些態樣中，通道或腔室表面可藉由抗凝血劑化合物、可優先與循環腫瘤細胞結合之化合物、或可防止細胞黏連之化合物處理。
於一些態樣中，通道或腔室表面可經化學改性以增進潤濕或以助於吸附所選細胞、顆粒、或分子。表面改性化學品可包括(但不限於)矽烷，諸如三甲基氯矽烷(TMCS)、六甲基二矽氮烷(HMDS)、(十三氟-1,1,2,2-四氫辛基)三氯矽烷、氯二甲基辛矽烷、十八烷基三氯矽烷(OTS)或γ-甲基丙烯醯氧基丙基三甲氧基-矽烷；聚合物，諸如丙烯酸、丙烯醯胺、二甲基丙烯醯胺(DMA)、丙烯酸2-羥乙酯、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡咯啶酮(PVP)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚乙烯二醇(PEG)、環氧聚(二甲基丙烯醯胺)(EPDMA)、或PEG-丙烯酸單甲氧酯；表面活性劑，諸如普洛尼克(Pluronic)表面活性劑、聚(乙烯二醇)基(PEG)表面活性劑、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化十二烷基三甲基銨(DTAC)、溴化十六烷基三乙基銨(CTAB)、或聚凝胺(PB)；纖維素衍生物，諸如羥丙基纖維素(HPC)、或羥丙基甲基纖維素(HPMC)；胺(諸如乙胺、二乙胺、三乙胺、或三乙醇胺)、含氟化合物(諸如包含聚四氟乙烯(PTFE)之其等或鐵氟龍(Teflon))。
過濾
提供於本文中之eDAR設備可進一步包括過濾元件。於一些態樣中，過濾元件可呈以下之形式：微柱、微障壁、微衝擊器、微篩、具有小於生物顆粒之孔之通道、具有可防止生物顆粒進入孔但可讓流體繞過生物顆粒經孔繼續流動之孔之通道(「1-D通道」)、微珠、多孔膜、自壁突出之突部、黏著劑塗層、編織或非編織羊毛纖維(諸如布或網格)、金屬(例如，不鏽鋼或蒙乃爾合金)、玻璃、紙、或合成物(例如，尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯、聚對二甲苯、及聚酯)、燒結不鏽鋼或其他金屬、或多孔無機材料諸如氧化鋁、二氧化矽。
於一些態樣中，過濾元件中之孔陣列之組態使得諸如罕見顆粒或細胞之所關注顆粒可不通過該過濾元件之孔，而至少一種其他顆粒可通過該過濾元件之孔。於其他態樣中，過濾元件中之孔陣列之組態使得諸如罕見顆粒或細胞之所關注顆粒可通過該過濾元件之孔，而至少一種其他顆粒不可通過該過濾元件之孔。
於一些態樣中，eDAR微流體晶片可經製造成具有微狹縫(圖10a)。該等微狹縫可用於捕獲罕見細胞而不會滯留任何其他非特異性顆粒(例如，紅血球(RBC))。微狹縫之尺寸可改變。於一些態樣中，微狹縫之高度可為小於或等於約0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、75μm或100μm高。於一些態樣中，微狹縫之高度可在約0.1至5μm、1至10μm、5至15μm、10至30μm、15至40μm、20至50μm、30至75μm及50至100μm高之範圍內。於一些態樣中，微狹縫之寬度可為小於或等於約0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、75μm或100μm寬。於一些態樣中，微狹縫之寬度可在約0.1至5μm、1至10μm、5至15μm、10至30μm、15至40μm、20至50μm、30至75μm及50至100μm寬之範圍內。例如，微狹縫可具有5μm之高度及5μm之寬度(圖10b)。
於一些態樣中，微狹縫之高度可為小於或等於0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、75μm或100μm高。於一些態樣中，微狹縫之高度可在0.1至5μm、1至10μm、5至15μm、10至30μm、15至40μm、20至50μm、30至75μm及50至100μm高之範圍內。於一些態樣中，微狹縫之寬度可為小於或等於0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、75μm或100μm寬。於一些態樣中，微狹縫之寬度可在0.1至5μm、1至10μm、5至15μm、10至30μm、15至40μm、20至50μm、30至75μm及50至100μm寬之範圍內。
於一些態樣中，微流體晶片可經製造成具有100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、5000個、20,000個、30,000個、40,000個、或50,000個孔或微狹縫。於其他態樣中，微流體晶片可經製造成具有多於100個、多於200個、多於300個、多於400個、多於500個、多於600個、多於700個、多於800個、多於900個、多於1000個、多於5000個、多於20,000個、多於30,000個、多於40,000個、或多於50,000個孔或微狹縫。於一些態樣中，就具有較多個微狹縫之微流體晶片而言，壓力可能較低。例如，具有20,000個狹縫之eDAR微流體晶片在兩側緩衝通道上需要小於4psi之壓力以平衡流體動力切換製程。於一些態樣中，較低之跨微過濾器壓力可使得單離罕見細胞上之應力及單離罕見細胞之變形最小化。
微狹縫可用為過濾之來源。於一些態樣中，微狹縫可自容許分選而在成像期間不會導致像差之任何材料(例如，PDMS)來製造及將其與與成像系統併用之蓋玻片結合(圖10c與10d)。於一些態樣中，微狹縫可為微過濾器。
於一些態樣中，微狹縫之基於過濾目的之使用可改善捕集細胞之成像準確度及計數。於一些態樣中，微狹縫可提高捕集之罕見細胞上第二回標記之速度及效率。例如，兩種經抗-EpCAM-PE標記之癌細胞可捕集於微狹縫上(圖10e)。該等細胞可經固定、透化、及經抗-細胞角質蛋白-Alexa488、抗-CD45-Alexa700、抗-Her2-Alexa647及Hoechst標記。
流體動力分選
造成eDAR平台之特徵及性能之兩個關鍵因素為：(1)有效且主動分選方案及(2)接續之有效純化(例如，純化腔室)方案。微流體晶片及流體動力切換機制結構之分析性能可經最佳化以達成特定回收效率(例如，95%)、特定假陽性率(例如，0)及特定通過量(例如，4.8mL全血/小時)。
於一些態樣中，用於引導流動之機制結構引導包含罕見顆粒之等分試樣流動進入複數個出口通道中之一者中，此取決於該罕見顆粒之同一性、組成、或數量。用於引導等分試樣之流動之機制結構可係引導進入第一出口通道，假若該等分試樣包含罕見顆粒，或係引導進入第二出口通道，假若該等分試樣不包含罕見顆粒。
於一些態樣中，用於引導等分試樣之流動之機制結構可包括電極、磁性元件、聲學元件、電致動元件、電場、壓電閥、或磁場。於其他情況中，用於引導等分試樣之流動之機制結構可包括一或多個電致動閥或活塞，其中該等閥或活塞控制至少一個在第一接合處與第一輸入通道及兩個出口通道交叉之第一定向流動通道中液體之流動。
於一些態樣中，提供於本文中之設備可包括一或多個用於追蹤及/或操縱顆粒、等分試樣、或流體樣本之軌道或流動之電極。於一些態樣中，提供於本文中之設備可包括一或多個用於追蹤及/或操縱顆粒或等分試樣之總體或群組之軌道或流動之電極。於此情況中，電 極可基於諸如介電泳或電濕潤之現象來增進等分試樣之分離。
於其他情況中，提供於本文中之設備可進一步包括用於與磁性顆粒結合或經磁性顆粒結合之罕見顆粒(例如，細胞)之分離之磁性元件。於其他情況中，提供於本文中之設備可進一步包括用於與至少一種磁性顆粒結合或經至少一種磁性顆粒結合之罕見顆粒(例如，細胞)之總體或群組之分離之磁性元件。於一些態樣中，磁性元件可基於附著至顆粒或細胞之細胞或微米磁性或奈米磁性顆粒之磁性磁化率來增進等分試樣、顆粒、或細胞之分離。於一些態樣中，磁性元件可基於附著至至少一種顆粒或細胞之細胞或微米磁性或奈米磁性顆粒之磁性磁化率之來增進顆粒、或細胞之總體或群組之分離。
eDAR設備可具有位於收集側上之第二線共焦偵測窗以監測即時流體動力切換之效率。於一些態樣中，eDAR設備可與共焦成像配對。
於一些態樣中，流體動力切換可藉由螺線管及兩側緩衝液線之壓降來控制。螺線管可位於罕見細胞收集通道中。於一些態樣中，該螺線管係在左側的封閉位置及「陰性」等分試樣流動進入右側的廢棄物通道(圖4A)。當螺線管打開時，這兩個含有緩衝液之側通道之間之壓降將血液流動從廢棄物通道切換至收集側。這種切換可發生在少於10毫秒內(例如，2至3ms)以收集罕見顆粒(例如，細胞)。
於一些態樣中，可使用各種流體動力分選方案。本發明提供八種不同流體動力分選方案(圖6)。流體樣本(例如，血液)可從顯示為深黑色流動之主要通道注入。緩衝液(微流體晶片中之淺灰色)可在兩個側通道中流動，罕見細胞可經收集至左下方通道，及廢棄物可經引導至右下方通道。矩形區塊代表螺線管(參見「螺線管」)。螺線管可設置成常時打開(N.O.)或常時封閉(N.C.)，分別如深灰色或淺灰色區塊所示(圖6)。
微流體晶片之通道可在接合處交叉。於一些態樣中，一個通道在接合處與一個不同通道交叉。於一些態樣中，一個通道在接合處與多於一個不同通道交叉。於一些態樣中，一個通道在接合處與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個或100個不同通道交叉。於一些態樣中，多於一個通道在接合處與一個不同通道交叉。於一些態樣中，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95或100個不同通道在接合處與一個不同通道交叉。
微流體晶片之該等通道可不在接合處交叉。於一些態樣中，一個通道在微流體晶片上不為接合處之位置處與一個不同通道交叉。於一些態樣中，一個通道在微流體晶片上不為接合處之位置處與多於一個不同通道交叉。於一些態樣中，一個通道在微流體晶片上不為接合處之位置處與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個或100個不同通道交叉。於一些態樣中，多於一個通道在微流體晶片上不為接合處之位置處與一個不同通道交叉。於一些態樣中，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個或100個不同通道在微流體晶片上不為接合處之位置處與一個不同通道交叉。
螺線管及流動之調節
eDAR設備包括可控制流體之流動之螺線管及流體動力分選方案。於一些態樣中，螺線管可為活塞。例如，螺線管活塞為電致動螺線管閥之子組件。於一些態樣中，電致動閥可為壓電閥。於一些態樣中，螺線管活塞可藉由模製嵌於設備中。於一些態樣中，螺線管可為閥。例如，嵌入之螺線管活塞可改用經管件流體連通之螺線管閥替代。
於一些態樣中，eDAR設備可包含一個螺線管。於其他情況中，eDAR設備可包含多過一個螺線管。例如，eDAR設備可包含多於1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個或50個螺線管。於一些態樣中，至少一個螺線管可係打開。例如，一個打開螺線管可用於容許從微流體裝置之一個部分流動該微流體裝置之一個不同部分。於一些態樣中，多於1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個或50個螺線管可係打開。於一些態樣中，一個部分可為樣本進入點。於一些態樣中，一個部分可為廢棄物通道。於一些態樣中，一個部分可為分選腔室。於一些態樣中，至少一個螺線管可係常時打開(N.O.)。於一些態樣中，多於1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個或50個螺線管可係常時打開。
於一些態樣中，螺線管可係封閉。例如，封閉的螺線管可用於 防止從微流體裝置之一個部分流動至該微流體裝置之一個不同部分。於一些態樣中，至少一個螺線管可係封閉。於一些態樣中，多於1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個或50個螺線管可係封閉。於一些態樣中，一個部分可為樣本進入點。於一些態樣中，一個部分可為廢棄物通道。於一些態樣中，一個部分可為分選腔室。於一些態樣中，至少一個螺線管可係常時封閉(N.C.)。於一些態樣中，多於1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個或50個螺線管可係常時封閉。
於一些態樣中，螺線管可從打開切換成封閉。例如，可藉由封閉該打開之螺線管來防止從微流體裝置之一個部分流動至該微流體裝置之一個不同部分。於一些態樣中，至少一個螺線管可從打開切換成封閉。於一些態樣中，多於1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個或50個螺線管可從打開切換成封閉。於一些態樣中，一個部分可係樣本進入點。於一些態樣中，一個部分可為廢棄物通道。於一些態樣中，一個部分可為分選腔室。
於一些態樣中，螺線管可從封閉切換成打開。例如，可藉由打開該封閉之螺線管來容許從微流體裝置之一個部分流動至該微流體裝置之一個不同部分。於一些態樣中，至少一個螺線管可從封閉切換成打開。於一些態樣中，多於1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8 個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個或50個螺線管可從封閉切換成打開。於一些態樣中，一個部分可係樣本進入點。於一些態樣中，一個部分可為廢棄物通道。於一些態樣中，一個部分可為分選腔室。
於一些態樣中，流體微流體晶片之結構及可用於eDAR之流體動力分選之對應方案顯示於圖6中。當單一通道上存在出口或入口時，可標出螺線管之位置。例如，於圖6f中，第二螺線管之位置可為「中央廢棄物」，意指其係位於廢棄物收集通道之中央出口。在除了圖6g中所顯示之外之每個方案中，當可以偵測到「陽性」事件時，可以改變施加在螺線管上之DC電壓，以啟動分選，且在某一段時間期之後可返回至常態。於一些態樣中，可採用4個個別步驟來控制分選(例如，顯示於圖6g中之方案)。兩個螺線管均可封閉，及流體可流動至廢棄物通道。可以打開於收集側上之螺線管以進行切換步驟，來啟動分選。可以打開該另一個螺線管，以在收集細胞後進行回切換步驟。兩個螺線管可於流體流完全地切換回以恢復至常態後的相同時間點封閉。述於本文中之八種不同流體動力分選方案之流體配置及性能之概述示於表1(下方)中。於一些態樣中，可使用兩個螺線管(例如，顯示於圖6c、6e、及6g中之方案)。
Figure 103123208-A0305-02-0040-3
Figure 103123208-A0305-02-0041-2
於一些態樣中，可使用晶片外螺線管。就該方法之大多數情況而言，晶片外螺線管可係封閉。為打開晶片外螺線管，可施加電壓(例如，5V DC電壓)。晶片外螺線管可快速地打開(例如，少於或等於3毫秒)。在使用晶片外螺線管之情況下，可改良微流體晶片之製法及可將螺線管與微通道連接。於一些態樣中，可使用晶片上螺線管。就該方法之大多數情況而言，晶片上螺線管可係封閉。為打開晶片上螺線管，可施加電壓(例如，5V DC電壓)。晶片上螺線管可快速地打開(例如，少於或等於3毫秒)。在使用晶片上螺線管之情況下，可改變微流體晶片之製法及可將螺線管與微通道連接。
例如，於該方案中，使用晶片外螺線管。可使用注射泵將經標記之流體樣本注入至微流體晶片之頂部通道(圖7a)。緩衝液流動通過的兩個側通道可用於控制主動分選步驟。兩個埠係位於右側通道上，且兩者均係連接至加壓緩衝液來源。晶片外螺線管可接近分選接面連接至該埠以控制流體動力切換。使用晶片外螺線管之切換製程可係穩定且可在105個開-關循環期間維持穩定性。
於一些態樣中，線內螺線管可置於緩衝液線上以防止流體樣本與螺線管接觸。此可消除樣本衰減及跨污染之可能性。在使用eDAR設備及方法期間可於罕見細胞收集通道中存有恆定流量之緩衝液。晶片上螺線管可提高接續之純化(例如，純化腔室)步驟之效率且可防止形成細胞之聚集物。
於一些態樣中，eDAR設備中之流體之流動可藉由一種以下在偵測體積上游或下游者來調節：螺線管、閥、鼓泡、電場、磁場、光場、氣動壓力來源、固體顆粒、膜、不可混溶液滴、重力差、或可改變通道之表面張力之塗層。可隨細胞遍歷偵測體積停止、減速、或加速該流動。
於一些態樣中，可在偵測期間維持流體樣本流動通過流動通道之連續流動。於一些態樣中，個別等分試樣可不係物理分離，反之，可由光學偵測步驟及/或分選步驟界定。
例如，可引導流動至可用於收集廢棄物之通道中(圖7b)。在分選接面之後可存在兩個通道。左側通道可收集陽性等分試樣，將其等遞送至過濾及收集區域以達成進一步純化(例如，純化腔室)；右側通道係收集廢棄物(例如，陰性等分試樣)。於此情況中，在等分試樣經分級為「陰性」並保持封閉之情況下不對螺線管施加電壓(圖7b)。流動模式之改變可於編號1及3緩衝液來源之間之初始壓降之後發生(圖7a)。可藉由第一偵測窗偵測陰性事件。於此情況中，可對螺線管施加DC電壓(例如，5V)以從緩衝液儲存槽打開緩衝液流動(例如，編號2)。右側緩衝液通道之經減低之流動抗性可產生較高流速。流體流動可從右側推送至左側以收集陽性等分試樣(圖7c)。等分試樣可經收集且藉由第二偵測窗獲得證實。於一些態樣中，螺線管可經封閉以流體流動切換回至廢棄物收集通道(圖7d)。切換及回切換所需要的時間可為少於20毫秒，於一種例示性情況中，該時間在或介於2至3毫秒(表1 及圖8；訊框速率=1,918個訊框/秒)。於一些態樣中，使用的條件可重複多於105個開-關循環。
於一些態樣中，流動可藉由(例如)引發流體動力流體壓力之方法及裝置遞送，這種流動包括(但不限於)基於機械原理(例如，外部注射泵、氣動膜泵、振動膜泵、真空裝置、離心力、及毛細管作用)；電或磁原理(例如，電滲流動、電動泵壓電/超音波泵、鐵磁流體塞柱、電液動力泵、及磁流體動力泵)；熱力學原理(例如，氣泡生成/相位變化引起之體積膨脹)；表面潤濕原理(例如，電濕潤、化學、熱、及放射引發之表面張力梯度)來操作之其等。
又於其他情況中，流體可藉由由重力饋入、表面張力(例如毛細管作用)、靜電力(電動流動)、離心流動(配置於光碟上並旋轉之基板)、磁力(振動離子引起流動)、磁流體動力及真空或壓力差提供之流體驅動力來遞送或開道。
於一些態樣中，諸如其等關於用於引起流體動力流體壓力或流體驅動力之方法及裝置所列舉者之流體流動控制裝置可耦合至本發明標的之輸入埠或輸出埠。於一些態樣中，多個埠提供在入口及出口中之一者或兩者之處及一或多個埠係耦合至流體流動控制裝置。
通行時間(transit time)
分析物(例如，罕見細胞或循環腫瘤細胞(CTC))可從第一偵測窗流動至第二偵測窗。記錄第一窗中決策APD峰值與偵測到證實訊號之間之實耗時間可係分選分析物之通行時間。於一些態樣中，通行時間可改變。於一些態樣中，墊流速會影響通行時間。於一些態樣中，微通道之層流速會影響通行時間。於一些態樣中，體積流速可設為40μL/min(圖9b)。於一些態樣中，體積流速可為約1μL/min、2μL/min、3μL/min、4μL/min、5μL/min、6μL/min、7μL/min、8μL/min、9μL/min、10μL/min、11μL/min、12μL/min、13μL/min、 14μL/min、15μL/min、16μL/min、17μL/min、18μL/min、19μL/min、20μL/min、21μL/min、22μL/min、23μL/min、24μL/min、25μL/min、30μL/min、35μL/min、40μL/min、45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、或200μL/min。
於一些態樣中，流速可在約1μL/min至5μL/min、3μL/min至10μL/min、5μL/min至15μL/min、10μL/min至20μL/min、15μL/min至30μL/min、20μL/min至40μL/min、30μL/min至50μL/min、40μL/min至60μL/min、50μL/min至70μL/min、60μL/min至80μL/min、70μL/min至90μL/min、80μL/min至100μL/min、90μL/min至100μL/min或90μL/min至200μL/min範圍內。於其他情況中，體積流速可設為80μL/min(圖9b)。
於一些態樣中，體積流速可為1μL/min、2μL/min、3μL/min、4μL/min、5μL/min、6μL/min、7μL/min、8μL/min、9μL/min、10μL/min、11μL/min、12μL/min、13μL/min、14μL/min、15μL/min、16μL/min、17μL/min、18μL/min、19μL/min、20μL/min、21μL/min、22μL/min、23μL/min、24μL/min、25μL/min、30μL/min、35μL/min、40μL/min、45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、或200μL/min。
於一些態樣中，流速可在1μL/min至5μL/min、3μL/min至10μL/min、5μL/min至15μL/min、10μL/min至20μL/min、15μL/min至30μL/min、20μL/min至40μL/min、30μL/min至50μL/min、40μL/min至60μL/min、50μL/min至70μL/min、60μL/min至80 μL/min、70μL/min至90μL/min、80μL/min至100μL/min、90μL/min至100μL/min或90μL/min至200μL/min範圍內。較高之流速可用於達成較低之通行時間(圖9c)。
偵測
本發明提供一種用於使用可配備偵測系統之微流體晶片來進行eDAR之設備。於一些態樣中，偵測系統可包括線共焦偵測方案。於線共焦偵測方案中，使用一連串二向色鏡、圓柱形透鏡及光束分離器，兩個雷射來源(例如，488及633nm)形成偵測窗(例如，兩個)。該第一偵測窗可具有兩個同時重疊之雷射光束及可用於偵測來自經標記之罕見細胞(例如，CTC)之螢光訊號。該第二偵測窗可用於證實經分選之等分試樣中罕見細胞之同一性、或罕見細胞之不存在。該第二偵測窗可進一步用於監測分選效率。
於一些態樣中，可同時偵測到兩種罕見顆粒。可使各種罕見顆粒與獨特偵測試劑接觸及可藉由兩個偵測裝置中之一者來偵測各種偵測試劑。另外，其中該等偵測試劑包括螢光部分，可使用產生在對應於該等不同螢光部分之激發波長之不同波長之輻射之兩個詢問裝置(例如，兩個雷射)。可藉由兩個不同偵測裝置來偵測各別螢光輻射。於一些態樣中，該等偵測試劑可藉由螢光在不同波長下來區分。
於一些態樣中，可平行地偵測兩種或更多種罕見顆粒。例如，該方法可包括在eDAR設備之第一位置偵測第一罕見顆粒及在eDAR設備之第二位置偵測第二罕見細胞。於此情況中，存在第一及第二顆粒之等分試樣可在第一偵測步驟之後、在第二偵測步驟之後、或在兩個偵測步驟之後開道至新的位置。
於某些態樣中，偵測事件可以定期頻率發生。該頻率可能與偵測體積之尺寸及流體樣本之流速相關。特定設備之偵測體積可在0.1至100μL(例如，10μL)範圍內且包括該範圍之極限及流體樣本可以在 1至1000μL/秒(例如，100μL/秒)範圍內且包括該範圍之極限之速率通過該設備，可在每0.001至1秒(例如，0.1秒)一次之範圍內且包括該範圍之極限、或以在1至100Hz(例如，10Hz)範圍內且包括該範圍之極限之速率來偵測一種不同等分試樣。
於一些態樣中，設備之幾何形狀及意欲處理之流體之體積會影響該速率。例如，等分試樣可以在0.1kHz及100MHz之範圍內且包括該範圍之極限之速率遍歷偵測體積。於一些態樣中，該等等分試樣係以在10Hz及10MHz或10MHz範圍內且包括該範圍之極限之速率遍歷偵測體積。於一些態樣中，該等等分試樣可以在0.1kHz及100MHz或約100MHz範圍內且包括該範圍之極限、或在1kHz或約1kHz及10MHz或約10MHz範圍內且包括該範圍之極限之頻率、或在約1kHz及5MHz或約5MHz範圍內且包括該範圍之極限之頻率、或在1kHz或約1kHz及1MHz或約1MHz範圍內且包括該範圍之極限之頻率遍歷偵測體積。於一些態樣中，該等等分試樣遍歷偵測體積之該頻率可為至少約0.1kHz、或至少約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、或900kHz、或至少約1MHz、或至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100MHz。於一些態樣中，該等等分試樣遍歷偵測體積之頻率可為至少0.1kHz、或至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、或900kHz、或至少1MHz、或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100MHz。
於一些態樣中，來自流體樣本之等分試樣中分析物(例如，細胞)之總體的特徵之偵測可係同時或經時累積。例如，來自包含分析物之總體之大等分試樣的特徵之偵測可係同時。於同時模式中，顆粒可由可變速度之物流攜帶。於其他情況中，顆粒可由隨著其遍歷偵測體積時之穩流攜帶。
於各種態樣中，eDAR設備及方法容許同時地自複數種分析物(例如，複數種細胞)來偵測訊號。於一些態樣中，等分試樣係基於同時地自存於等分試樣中之複數種分析物偵測到的訊號來分級。
於其他情況中，本文中之方法係提供用於來自細胞總體之特徵可自為約單一細胞但多個細胞借助於流動遍歷偵測體積之小偵測體積經時發射(「累積」)之偵測。eDAR之累積模式係不同於自單一生物顆粒發射之連續訊號或訊框之時移重疊；單一生物顆粒之時移重疊不構成生物顆粒之總體。於同時及累積中，僅在已偵測到來自細胞總體之特徵之後來實施決策。
於一些態樣中，偵測器係選自由以下組成之群：攝影機、電子倍增器、電荷耦合裝置(CCD)影像感測器、光電倍增管(PMT)、雪崩光電二極體(APD)、單光子雪崩二極體(SPAD)、矽光電倍增器(SiPM)、及互補金屬氧化物半導體(CMOS)影像感測器。於一些態樣中，提供於本文中之eDAR設備可包括可追蹤所選細胞之運動或可計數存於等分試樣中之所選顆粒或細胞之光、電、聲或磁偵測器。
於一些態樣中，提供於本文中之設備或方法可併有以多種不同組態成像之螢光(單色或多色)顯微鏡，其中包括(但不限於)明視野、落射(epi)、共焦、反式、DIC(示差干涉差)、暗視野、Hoffman、或相差顯微鏡。
於一些態樣中，提供於本文中之設備可包括複數個偵測裝置，例如，至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、或更 多個偵測裝置。多個偵測裝置可用於進行(例如)本發明之方法，其中多於一種罕見顆粒或細胞存於流體樣本中，多於一種細胞標記係用於區分不同細胞類型，或多種偵測試劑係同時地進行偵測。於一些態樣中，該等偵測裝置可包括證實性雷射。例如，該證實性雷射可用於詢問經分選之等分試樣。於一些態樣中，藉由證實性雷射偵測到的經分選之等分試樣可為陽性等分試樣且在分選之後做保留處理。於一些態樣中，藉由證實性雷射偵測到的經分選之等分試樣可為陰性等分試樣且可在分選之後做棄置處理。例如，該證實性雷射可用作用於控制eDAR分選方案之準確度之第二偵測方法。
輻射源及裝置
本發明提供一種用於eDAR之可包括偵測裝置或成像裝置及分級裝置(例如，電腦)之設備。於一些態樣中，雷射(或多於一種雷射)可充作詢問裝置。具有光電二極體、光電倍增器、或攝影機之倒立顯微鏡可用為偵測裝置。遮罩可置於介於通道及偵測裝置之間之路徑中。
於一些態樣中，詢問裝置(例如，488nm固態二極體激升雷射及633nm HeNe雷射)可引導至倒立顯微鏡。這兩種雷射光束可使用圓柱形光學器件或繞射光學器件成形以形成在進入顯微鏡物鏡之前具有10：1縱橫比之準直橢圓光束。使用半波板及偏振光束分離器之組合，可調整各光束之強度，同時鏡獨立地操縱光以建立空間共定位激發區。來自生物顆粒之螢光可在輸入通過帶通濾光器之前藉由兩個二向色鏡分為三種波長譜帶及再聚焦至三個單光子雪崩二極體(SPAD)上。一個SPAD可收集在560至610nm波長範圍之螢光，第二SPAD可收集在645至700nm範圍之螢光，及第三SPAD可收集在500至540nm範圍之螢光。SPAD輸出係藉由計數器/計時器板引導至數位處理器(例如，電腦)及使用若干種演算法進行分析。
於一些態樣中，數位處理器接收來自偵測裝置之訊號繼而透過 演算法來分級等分試樣。數位處理器可基於分級值(例如，流體樣本中之罕見顆粒之存在、不存在、量、同一性、或組成)來引導等分試樣進入適宜之通道。eDAR可由一個、兩個、三個、四個、五個或六個偵測裝置及一個、兩個、三個、四個、五個或六個詢問裝置、或許多個偵測裝置及詢問裝置組成。
雙重捕獲eDAR
本發明進一步提供一種用於「雙重捕獲」eDAR之變型之設備。雙重捕獲設備可從混合流體之相同樣本分離得罕見細胞之兩種不同子群體。此可同時地在單一微流體晶片上進行。這兩種子群體可進一步分開地捕集於微流體晶片上之兩個不同區域。
微流體eDAR裝置之雙重捕獲變型之一般結構描繪於圖11中。樣本可經至少兩種與不同螢光標籤結合之不同抗體標記。例如，樣本(例如，血液)可經與與樣本中分析物上之標記(例如，上皮、抗-EpCAM-PE)結合之不同螢光團結合之第一標籤及與與樣本中分析物上之標記(例如，間質、抗-EGFR或抗-波形蛋白(vimentin))結合之不同螢光團結合之第二標籤標記，其中各螢光團可具有不同的發射波長(例如，FITC)。經標記之血液樣本可注入至微流體晶片中。可利用線共焦方案(如前述)來偵測表現EpCAM之罕見細胞及可於黃色通道中偵測到峰值。可啟動分選事件以收集顆粒等分試樣於收集通道(例如，收集通道#1)中。於一些態樣中，等分試樣可經分級為相對間質標記陽性接著可將罕見細胞分選於不同收集通道(例如，收集通道#2)中。罕見細胞之這兩種子群體可分開地捕集且富集於雙重捕獲eDAR微流體晶片上。
雙重捕獲eDAR設備可使用流體切換方案(圖11)。經標記之樣本可在頂部引入至主要通道中。緩衝液可流入兩個側通道中，使用兩個螺線管來控制血液流動之流體動力切換。於一些態樣中，可使用微狹 縫(如前述)建立雙重捕獲eDAR之過濾區域。CTC之兩個子群體可分離並捕集於相同微流體晶片上之兩個不同過濾區域。
雙重捕獲eDAR設備可包括螺線管。於一些態樣中，兩個螺線管可在等分試樣經分級為陰性時係封閉(圖12)。樣本會流至底部中心通道以收集作為廢棄物，假若壓力在兩個通道中平衡。於其他情況中，當等分試樣係經分級為僅相對這兩種標記中之一者(例如，上皮)陽性時，則螺線管#2可打開，讓樣本流入左側的收集通道中(圖12B)。於收集等分試樣之後，螺線管#2可再次封閉及使得該樣本流返回至中央通道。於一些態樣中，等分試樣可經分級為僅相對一種標記(例如，上皮)陽性及螺線管#1可打開，讓該樣本流至右側通道(圖12C)。於一些態樣中，雙重捕獲eDAR設備中這兩種類型分選事件之反應時間係極為快速(例如，小於或等於3毫秒)。
微流體晶片中之免疫染色及漂白
本發明提供一種使用微流體裝置之順序免疫染色及漂白方法之方案。該方法可使用引述於PCT WO 2010/120818中之eDAR設備、提供於本文中之設備、或其他為相關技藝中已知的設備。於一些態樣中，該方案可與eDAR耦合。於一些態樣中，該方案可與線內染色及洗滌系統耦合以最小化死體積；減少抗體的用量；避免引入氣泡；及使得單離、染色及漂白罕見細胞之製程自動化。
eDAR可用於捕獲分析物(例如，罕見細胞)。罕見細胞可富集於微流體晶片上之小區域(例如，腔室)。小區域可用於快速地成像經標記之細胞及減少試劑(例如，抗體、緩衝液等等)的用量至最少。微流體晶片可經設計成具有打開可進入結構。打開結構可容許單細胞之進一步處理(例如，拾取所關注細胞或遞送特定試劑至細胞)。
於一些態樣中，可藉由雷射偵測光束、體積流速、及分選速度之組合獲得虛擬等分試樣。基於該等因素，經標記之樣本可實質上分 為等分試樣(例如，每1mL樣本分為500,000個2nL等分試樣)。於一些態樣中，線共焦偵測方法可偵測來自各細胞之螢光發射。該等虛擬等分試樣可依照標記方案分級。假若被標記，則等分試樣為「陽性」及假若未被標記，則等分試樣為「陰性」。於一些態樣中，陰性等分試樣可做棄置處理(圖4A)。
於一些態樣中，在等分試樣分級之後，自動化反饋機制結構可啟動流動之流體動力切換。該切換可收集並轉移「陽性」等分試樣至微流體晶片之特定區域以進行進一步純化(例如，純化腔室)及分析。於一些態樣中，經分選之等分試樣可傳送至微流體晶片之罕見細胞(例如，循環腫瘤細胞)可捕集及血液細胞可做棄置處理之區域(圖4A)。於一些態樣中，經捕集之細胞可經成像並藉由一或若干種可識別生物標記之標籤(例如，經標記之抗體)標記。
分析物(例如，罕見細胞)之標記及成像可發生於微流體晶片(例如，eDAR設備)上。於一些態樣中，微流體晶片上之兩個埠可置於打開位置以進行灌注標記及洗滌步驟(圖13A)。其餘三個埠可維持封閉。蠕動泵可遞送洗滌緩衝液(例如，Isoton(Beckman Coulter Inc.，加州奇諾市))及標記試劑至微流體晶片。加壓緩衝液來源可使用六向(six-way)閥耦合至泵及微流體晶片。於一些態樣中，閥上之其他三個埠可係封閉以防止洩露及/或污染。
該方法提供單離分析物(例如，罕見細胞)上之標記之染色(圖13B)。可使用抗體(例如，小於或等於10毫微克)及培養步驟(例如，短於或等於30分鐘)來進行該方法。為進行免疫染色及光漂白方法，六向閥可朝向加壓緩衝液打開以穩定地控制流體動力切換。閥可轉向蠕動泵以注入特定量的試劑至微流體晶片中。蠕動泵可用於遞送標記試劑及洗滌緩衝液(圖13)。橫桿指示可封閉對應埠。於一些態樣中，閥可防止氣泡進入微流體晶片系統。
於一些態樣中，該方法可用於進行細胞內標記染色。於該方法中，所捕獲的細胞可經固定並於微流體晶片上在免疫染色之前使用諸如洗滌劑(例如，Triton、surfynol 465表面活性劑等等)之透化劑透化。該方法進一步描述免疫染色個別細胞之多回、經染色之細胞之洗滌、細胞中標記之成像及與個別細胞結合之標記之光漂白。該等步驟可依序地重複多回。
於一些態樣中，可將單離的細胞固定。固定可使用灌注(例如，人工或自動化)或擴散(例如，人工或自動化)方法來進行。於一些態樣中，固定可於微流體晶片上或微流體晶片外在樣本已從微流體晶片移去之後進行。於一些態樣中，可以不固定樣本或單離的顆粒。於此情況中，樣本可包括活顆粒(例如，哺乳動物細胞、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞等等)。樣本可包括會因固定而受損傷之結構。
於一些態樣中，可透化單離的顆粒。透化可利用灌注(例如，人工或自動化)或擴散(例如，人工或自動化)來進行。於一些態樣中，透化可於微流體晶片上或微流體晶片外在樣本已從微流體晶片移去之後進行。於一些態樣中，可以不透化樣本或單離的顆粒。於此情況中，樣本可包括標記(例如，胞外、細胞相關者等等)。樣本可包括會因透化而受損傷之結構。
可光漂白已與標籤接觸之分析物。光漂白之製程可減低自與分析物接觸之標籤發射之訊號。於一些態樣中，可用於光漂白之裝置可包括雷射、發光二極體、電壓性弧燈、白熾燈、螢光燈、紫外線燈或鹵素燈。於一些態樣中，電壓性弧燈可選自(但不限於)以下弧燈、氖燈、氬燈、氙燈、氪燈、鈉等、金屬鹵化物燈、水銀燈或碳燈類型。
於一些態樣中，分析物可與標籤接觸及該標籤可經過化學漂白。於一些態樣中，該標籤可產生偵測器可讀的訊號。例如，該訊號可能係由螢光團發射。於一些態樣中，該訊號可使用包括(但不限於) 氧化劑、鹵離子、還原劑、或任何其他適宜螢光淬滅劑之化學品來化學淬滅或漂白。於一些態樣中，還原劑為二硫蘇糖醇。於其他情況中，可識別諸如抗體之生物標記之標籤可使用適宜之試劑高效地自結合部位化學解離。於一些態樣中，去染色劑可為具有2% SDS、20mM二硫蘇糖醇(DTT)及60mM Tris pH 6.8之Tris緩衝液。
該方法可包括各成像步驟後之光漂白。使用的參數可達成高效且快速通過量之光漂白製程(圖14及表2)。可在將經標記之細胞曝露於光漂白光源之不同功率之後獲得藉由引導至生物標記(例如，抗-EpCAM-PE)之標籤標記之細胞(例如，MCF-7)之光漂白曲線(圖15A)。可使用結合至相同抗體之多種結合物(例如，Alexa 647、Alexa488、FITC、PE)獲得其他曲線(圖15B)。
可重複標記及光漂白之步驟多次以研究生物標記之若干種群組。例如，可將所關注的兩種生物標記與陽性對照標記(例如，細胞核染色)及陰性對照標記(例如，CD45)組合以建立一個群組。可在每回中研究一個群組，接著在免疫染色之第二個循環發生之前進行光漂白。於一些態樣中，順序免疫染色及光漂白之方法可用於測定分析物上不同蛋白質標記之表現。例如，捕集於微流體晶片上之分析物(例如，罕見細胞、癌細胞等等)為EpCAM、細胞角蛋白及Hoescht陽性但為CD45陰性(表2，下方)。
Figure 103123208-A0305-02-0053-4
Figure 103123208-A0305-02-0054-5
於一些態樣中，僅一種引導至生物標記之第一標籤可用於免疫染色之第一回中。於此情況中，該第一標籤可進行光漂白。一種不同的引導至一種不同生物標記之第二標籤可用於免疫染色之下一回中。該不同第二標籤可進行光漂白。
於一些態樣中，僅一種引導至生物標記之第一標籤可用於免疫染色之第一回中。於此情況中，該第一標籤可進行光漂白。引導至一種不同生物標記之相同第二標籤可用於免疫染色之下一回中。該第二相同標籤可進行光漂白。
於一些態樣中，僅一種引導至生物標記之第一標籤可用於免疫染色之第一回中。於此情況中，該第一標籤可進行光漂白。一種不同 的引導至一種不同生物標記之第二標籤可用於免疫染色之下一回中。該第二不同標籤可進行光漂白。
於一些態樣中，僅一種引導至生物標記之第一標籤可用於免疫染色之第一回中。於此情況中，該第一標籤可進行光漂白。一種不同的引導至相同生物標記之第二標籤可用於免疫染色之第二回中。該第二不同標籤可進行光漂白。
於一些態樣中，複數種標籤之包含各者均引導至獨特生物標記之第一組可用於免疫染色之第一回中。於此情況中，該複數種標籤之第一組係進行光漂白。複數種標籤之引導至不同獨特生物標記組之不同第二組可用於免疫染色之下一回中。該第二不同標籤組可進行光漂白。於一些態樣中，用於第一組中之一些標籤亦可用於第二組中。於一些態樣中，藉由第一組中之標籤標靶之一些生物標記亦可藉由第二組中之標籤標靶。於一些態樣中，該第二生物標記組可與該第一生物標記組相同。於一些態樣中，該第二標籤組可與該第一標籤組相同。於一些態樣中，該第二標籤組可包含與該第一標籤組重疊之標籤。於一些態樣中，該第二生物標記組可包含與該第一生物標記組重疊之生物標記。
於另一種情況中，六種(例如，多種)個別細胞(例如，癌細胞)可捕集於微流體晶片上(圖14)。這八種生物標記可包括兩種對照生物標記(例如，一種陽性對照及一種陰性對照)及每一回可觀察到四種生物標記(例如，EpCAM/細胞角蛋白、MUCI/Her2、CD44/CD24及CD166/EGFR)。於一些態樣中，陽性對照生物標記(例如，Hoechst細胞核染色)可不進行光漂白。陰性對照生物標記(例如，CD45)可進行光漂白及就免疫染色之各個循環而言，可包含新標籤。每一回之這四種生物標記可包括兩個對照及兩種其他標記。每一回可包括免疫染色、成像及光漂白(表2)。
線內免疫染色及光漂白系統可配合免疫染色及光漂白之方法來標記及螢光成像分析物(例如，罕見細胞)。該線內系統可在使用多個循環之情況下提高免疫染色及光漂白方法之速度及效率。該系統可包括，以與不同螢光團結合之抗體群組標記罕見細胞(例如，CTC)，接著進行光漂白。於光漂白之後，該等罕見細胞可經抗其他生物標記之不同螢光抗體再標記。
於一些態樣中，使用eDAR微流體晶片設備單離的罕見細胞可使用緩衝液來洗滌。該等緩衝液可為適用於該應用之任何緩衝液。單離的細胞可滯留於微流體晶片上及主要通道、側通道及廢棄物通道可藉由關閉線內閥封閉。
提供使用裝置來偵測由標籤發射之訊號、或由若干種標籤發射之訊號之方法。於一些態樣中，該裝置可為顯微鏡。顯微鏡(例如，共焦、倒立式等等)可配備光源及針對於螢光之偵測器。於其他情況中，該裝置可為熟習此項技藝者已知的可偵測由標籤發射之訊號之若干種裝置中的一者。
於一些態樣中，偵測可結合光漂白發生，在光漂白完成之後，或在光漂白開始之前進行。偵測可用於確定可偵測訊號自標籤發射之終點。於一些態樣中，偵測可結合免疫染色進行。偵測亦可發生在洗滌步驟之後，發生在洗滌步驟之前，發生在洗滌步驟期間或發生於不存在洗滌步驟下。於一些態樣中，偵測亦可發生在透化步驟之後，發生在透化步驟之後，發生在透化步驟期間或發生於不存在透化步驟下。於一些態樣中，偵測亦可發生在固定步驟之後，發生在固定步驟之前，發生在固定步驟期間或發生於不存在固定步驟下。
該方法包括由標籤發射之訊號之成像。用於成像之裝置已於上文進行描述，係包含於PCT W02010/120818中或為熟習此項技藝者已知。例如，可在光漂白步驟之前及之後收集螢光影像。影像可包括 來自所有發射通道之資料。於一些態樣中，發射通道可包括黃光(555至605nm)、藍光(435至485nm)、綠光(510至540nm)及紅光(665至695nm)。於一些態樣中，單離的分析物可使用明視野或Nomarski顯微鏡來成像。
於一些態樣中，可基於多種生物標記之表現來分析影像。藉由eDAR捕獲並與偵測生物標記(例如，Her2及MUC1)之標籤接觸之個別細胞(例如，四種)及陽性對照生物標記(例如，Hoechst)可利用螢光進行成像(圖16)。數位處理器(例如，電腦)及軟體可用於合併多張影像成單一多色影像(圖16D)。
該方法進一步提供分析物(例如，顆粒)之收集。收集的該等顆粒(例如，罕見細胞)可已經經過免疫染色及光漂白。於一些態樣中，捕集的罕見細胞可進行微流體晶片外免疫染色及光漂白之其他回。於一些態樣中，可基於進一步處理而收集該等罕見細胞。收集可能涉及將罕見細胞放置於儲存槽(例如，管、盤、陣列等等)中。罕見細胞可在收集之後進行固定。於一些態樣中，該等罕見細胞可為活細胞並維持於細胞培養基中。
於一些態樣中，提供於本文中之方法可進一步於單離分析物之後與分析方案耦合。可與本文所提供方法耦合之分析法之非限制性實例包括基於核酸之方法，諸如RNA提取(進行或不進行增殖)、cDNA合成(逆轉錄)、基因微陣列、DNA提取、聚合酶鏈式反應(PCR)(單鏈式、巢套式、定量即時、或連接子-銜接物)、或DNA-甲基化分析；細胞計數法，諸如螢光原位雜交(FISH)、雷射捕獲纖維切割、流式細胞儀、螢光活化細胞分選(FACS)、細胞培養、或對照性基因組雜交(CGH)研究；化學分析法，諸如電泳、南方墨點分析或酶聯免疫吸收劑分析法(ELISA)；可測定微型RNA及siRNA含量之分析；可測定DNA/RNA含量之分析；可測定脂質含量之分析；可測定碳水化合物 含量之分析；可測定代謝產物含量之分析；可測定蛋白質含量之分析；及功能性細胞分析(例如，凋亡分析、細胞遷移分析、細胞增生分析、細胞分化分析等等)、及類似。
標籤之類型
免疫染色及光漂白之方法可包括使用標籤(tag)或標籤(label)，以識別位於捕集的分析物(例如，顆粒)上之生物標記。於一些態樣中，標籤可使用本文所述之eDAR設備、或熟習此項技藝者已知的其他經組態以偵測標籤之設備來偵測。於一些態樣中，標籤可使用本文所述設備之組件或使用熟習此項技藝者已知的光漂白裝置來進行光漂白。於一些態樣中，該等標籤可使用會導致對顆粒造成損傷之設備來進行光漂白。於其他情況中，標籤可不進行光漂白。
於一些態樣中，標籤可用作用於免疫染色之標籤。標籤可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學、或其他物理方法來偵測。例如，有用的標籤可不受限制地包括放射性核素、螢光染料(例如，螢光素、異硫氰酸螢光素(FITC)、Oregon GreenTM、玫瑰紅、德克薩斯紅(Texas red)、異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)、Cy3、Cy5等等)、螢光標記(例如，綠色螢光蛋白(GFP)、藻紅素(PE)等等)、藉由腫瘤相關蛋白酶(例如，螢光素酶、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等等)活化之自淬滅螢光化合物、奈米顆粒、生物素、地高辛(digoxigenin)、及類似。於一些態樣中，該等標籤可發射可呈影像中之色彩偵測的光譜。該等色彩可包括紅色、藍色、黃色、綠色、紫色、橙色及類似。
於一些態樣中，該等標籤可經輸注以選擇性地標記或突出單離的細胞。該等試劑之實例包括(不限制地)螢光、免疫螢光、與染料結合的分子(諸如抗體、fab片段、適合體、聚合物、配體、促效劑、拮抗劑、或其組合)磁、電活性、生物活性、或光活性化合物。一個實 例係使用與為上皮癌細胞中細胞骨架之不可或缺組分之細胞角蛋白反應之著色劑。其他染料實例包括與異硫氰酸螢光素(FITC)結合的小鼠抗人上皮抗體(HEA)及與藻紅素(PE)結合的抗-CD45。與染料結合的抗體之其他實例包括(但不限於)泛-細胞角蛋白抗體A45B/B3、AE1/AE3、或CAM5.2(識別細胞角蛋白8(CK8)、細胞角蛋白18(CK18)、或細胞角蛋白19(CK19)及抗：乳癌抗原NY-BR-I者之泛-細胞角蛋白抗體(亦稱為B726P、ANKRD30A、錨蛋白(Ankyrin)重複域30A)；B305D同型A或C(B305D-A或B305D-C；亦稱為抗原B305D)；Hermes抗原(亦稱為抗原CD44、PGP1)；E-鈣黏素(亦稱為桑椹胚黏著蛋白(Uvomorulin)、鈣黏素-1、CDH1)；癌胚抗原(CEA；亦稱為CEACAM5或癌胚抗原相關細胞黏著分子5)；β-人類絨毛膜促性腺激素(β-HCG；亦稱為CGB、慢性促性腺激素、β多肽)；組織蛋白酶-D(亦稱為CTSD)；神經肽Y受體Y3(亦稱為NPY3R；脂多糖相關蛋白質3(LAP3)、融合蛋白質；趨化細胞素(CXC基序、受體4)；CXCR4)；致癌基因ERBB1(亦稱為c-erbB-1、表皮生長因子受體、EGFR)；Her-2 Neu(亦稱為c-erbB-2或ERBB2)；GABA受體A、pi(π)多肽(亦稱為GABARAP、GABA-A受體、pi(π)多肽(GABA A(π)、γ-胺基丁酸類A受體pi(π)子單元)、或GABRP)；ppGalNac-T(6)(亦稱為β-1-4-N-乙醯基-半乳糖胺基-轉移酶6、GaINAc轉移酶6(GaINAcT6)、UDP-N-乙醯基-d-半乳糖胺：多肽N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶6、或GALNT6)；CK7(亦稱為細胞角蛋白7、組織凝集素(Sarcolectin)(SCL)、角蛋白7、或KRT7)；CK8(亦稱為細胞角蛋白8、角蛋白8、或KRT8)；CK18(亦稱為細胞角蛋白18、角蛋白18、或KRT18)；CK19(亦稱為細胞角蛋白19、角蛋白19、或KRT19)；CK20(亦稱為細胞角蛋白20、角蛋白20、或KRT20)；Mage(亦稱為黑素瘤抗原家族A亞型或MAGE-A亞型)；Mage3(亦稱為黑素瘤抗原家族 A 3、或MAGA3)；肝細胞生長因子受體(亦稱為HGFR、第2型乳頭狀腎細胞癌(RCCP2)、原致癌基因met、或MET)；黏蛋白-1(亦稱為MUC1、癌抗原15.3(CA15.3)、癌抗原27.29(CA 27.29)；CD227抗原、上皮蛋白(Episialin)、上皮膜抗原(EMA)、多形性上皮黏蛋白(PEM)、花生反應性尿黏蛋白(PUM)、腫瘤相關糖蛋白12(TAG12))；大囊病液體蛋白(亦稱為GCDFP-15、催乳激素誘導蛋白(PIP))；尿激酶受體(亦稱為uPR、CD87抗原、纖維蛋白溶酶活化因子受體尿激酶型、PLAUR)；PTHrP(甲狀旁腺激素相關蛋白；亦稱為PTHLH)；BS106(亦稱為B511S、小乳腺上皮黏蛋白、或SBEM)；前列腺蛋白類親脂素B(LPB、LPHB；亦稱為抗原BU101、分泌球蛋白家族1-D成員2(SCGB1-D2))；乳腺球蛋白2(MGB2；亦稱為乳腺球蛋白B(MGBB)、淚液球蛋白(Lacryglobin)(LGB)親脂素C(LPC、LPHC)、分泌球蛋白家族2A成員1、或SCGB2A1)；乳腺球蛋白(MGB；亦稱為乳腺球蛋白1(MGB1)、乳腺球蛋白A(MGBA)、分泌球蛋白家族2A成員2、或SCGB2A2)；乳腺絲胺酸蛋白酶抑制劑(Maspin，亦稱為絲胺酸(或半胱胺酸)蛋白酶抑制劑支系B(卵白蛋白)成員5、或SERPINB5)；前列腺上皮特異性Ets轉錄因子(PDEF；亦稱為包含滅菌α基序指向性結構域(Sterile alpha motif pointed domain)之ets轉錄因子、或SPDEF)；腫瘤相關鈣訊號傳導物1(亦稱為結腸直腸癌抗原CO17-1A、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白40kDa(EGP40)、上皮細胞黏著分子(EpCAM)、上皮特異性抗原(ESA)、胃腸道腫瘤相關抗原733-2(GA733-2)、KSI/4抗原、染色體4表面標記1(CM4S1)之膜組分、MK-1抗原、MIC18抗原、TROP-1抗原、或TACSTD1)；端粒酶(Telomerase)逆轉錄酶(亦稱為端粒酶催化子單元、或TERT)；三葉因子(Trefoil Factor)1(亦稱為乳癌雌激素誘導序列(BCEI)、胃腸三葉蛋白、GTF、pS2蛋白、或TFF1)；葉酸鹽；或三葉因子3(亦稱為腸三葉 因子(ITF)、p1.B；或TFF3)、或類似。
標記/生物標記
該方法可提供複數種可藉由位於分析物(例如，捕集之顆粒)上或接近其表示之生物標記。該複數種可藉由本發明偵測之生物標記會進行許多個可於捕集顆粒上進行之免疫染色及光漂白循環。每個免疫染色循環可包括0種標籤、1種標籤、2種標籤、3種標籤、4種標籤、5種標籤、6種標籤、7種標籤、8種標籤、9種標籤或10種標籤。用於每個免疫染色循環之標籤之範圍可包括1至10種標籤(例如，4種)。
於一些態樣中，諸如生物標記之標記之存在係藉由由標籤發射之訊號指示，其中該標籤具有針對於標記之親和力。如本文所用，詞語「具有針對於...之親和力」廣泛地包含標籤針對於標記之直接分子結合親和力、及間接親和力，諸如，標籤及標記經由與一或多種其他結構有關之分子複合物而相互作用之能力。例如，於一些態樣中，該標籤可為具有針對於標記之直接親和力之一級抗體，而於其他態樣中，該標籤可為具有針對於標記之間接親和力之二級抗體。
於一些態樣中，細胞係依照特異性標記或生物標記圖譜來單離，使得給定的細胞係展現獨特及/或可識別標記或生物標記圖譜。於某些態樣中，標記或生物標記圖譜為可用於界定並識別細胞或細胞類型之一或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、或十種或更多種標記或生物標記之特異性組合。於一些態樣中，標記或生物標記圖譜可用於識別細胞作為具有特定性質組之特定細胞群體之一部分。
於一些態樣中，生物標記係細胞外。於其他情況中，生物標記可係細胞內、細胞質、細胞質內、細胞表面、核外、核內、溶酶體、粒線體、內質網及類似。於其他情況中，生物標記可附著至(但非轉 移至)該顆粒。
於一些態樣中，生物標記可為胺基酸、肽、多肽、蛋白質、變性蛋白質。於該等情況中，結構可係天然或變性。
於一些態樣中，生物標記可為核酸、寡聚核酸、核糖核酸、轉移核糖核酸、信使核糖核酸、微型核糖核酸或去氧核糖核酸。於該等情況中，酸可為單股或雙股。
於其他情況中，罕見顆粒可為細胞、蛋白質、蛋白質複合物、核酸、核蛋白複合物、碳水化合物、代謝產物、降解物、及類似。於一些態樣中，罕見顆粒為細胞。於一些態樣中，細胞可為癌細胞、循環腫瘤細胞(CTC)、癌症幹細胞、展現癌細胞表面抗原(例如，選自由CD44、CD2、CD3、CD10、CD14、CD16、CD24、CD31、CD45、CD64、CD140b、或其組合組成之群者)之癌細胞。
於一些態樣中，細胞為胎兒細胞。於一些態樣中，胎兒細胞可在母體體液中。母體體液可包括全血、血液分離物、血清、血漿、汗液、淚液、耳流液、痰、淋巴、骨髓懸浮液、尿液、唾液、精液、陰道流液、糞、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水、母乳、玻璃體液(vitreous humor)、眼房液(aqueous humor)、皮脂、內淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液體、及呼吸道、腸道及泌尿生殖道之分泌物。
於一些態樣中，分析物為並非係連接至其他細胞或胞外基質、或嵌於組織中之離散細胞。
於一些態樣中，癌症幹細胞可藉由灌注可選擇性地與包括(但不限於)CD44、CD2、CD3、CD10、CD14、CD16、CD24、CD31、CD45、CD64、CD140b或CD166之生物標記結合之其他試劑而與尋常癌細胞顯出區別。
例如，標籤可經設計以偵測EGFR及CD166之表現來證實腫瘤細 胞之間質特徵。諸如波形蛋白及鈣黏素之其他相關標記可用於該群組中。
於其他情況中，可使用可指示顆粒活度之生物標記。於該等情況情況中，可使用可指示凋亡、壞死、有絲分裂、有絲分裂階段、減數分裂及類似之生物標記。
於一些態樣中，各組標記可包括作為陽性對照生物標記之核染劑(Hoechst)、作為陰性對照生物標記之與CD45結合的FITC、及兩種與PE或Alexa 647結合的蛋白質生物標記。於一些態樣中，Hoechst染色劑可不進行光漂白。於此情況中，Hoechst為陽性對照。於此情況中，Hoechst可不藉由標準光源來光漂白。於此情況中，UV曝露可用於漂白染色劑。
光漂白
該方法可提供在免疫染色之後進行光漂白。光漂白可關於使用光來消除或減低由分析物標籤之可偵測部分發射之訊號之強度。該標籤可藉由淬滅標籤或標記發射的訊號移除。於一些態樣中，光漂白可發生在一個免疫染色循環之後或發生在連續免疫染色循環之後。
於一些態樣中，可使用LED或氙弧燈作為光源(Sutter instrument，加州諾瓦托市)來進行光漂白。使用氙弧燈，各光漂白步驟可進行1至59秒、1至30分鐘或15分鐘。
於一些態樣中，LED氙弧燈之最大功率可經鎖定達成在1至20mW範圍內或在10mW或在100mW或1W之安全性，取決於光源之功率密度(例如，W/m2)。可考量使用保護方法，諸如穿戴護目鏡或藉由黑盒覆蓋光漂白區域。
於一些態樣中，可漂白螢光團(例如，PE、FITC及Alexa 488)之螢光發射。訊號之漂白(例如，達到小於10%)可發生在短的時間內(例如，發生在短於5min內)。具有較長波長(例如，610至660nm)之雷射 之使用可使得光漂白之持續時間相較彼等具較短波長之者更長(圖17B)。於一些態樣中，於涉及使用在不同波長之多種雷射之情況下，漂白時間可能要多於其中一種雷射之最基本需要時間(例如，15min)才可實現高漂白效率及可接受產生。
例如，利用不同曝露功率之使用經抗-EpCAM-PE標記、並置於2號蓋玻片上之MCF-7細胞之光漂白曲線顯示於圖15A中。不同功率設定(例如，三種)可用於漂白細胞。於一些態樣中，於高功率(例如，高於2mW)下，可縮短曝露時間(例如，短於10min)以達成高(例如，95%)漂白效率。
樣本
在提供於本文中之揭示案中，樣本可包括流體樣本。流體樣本可源自多種來源。於一些態樣中，該等來源可係人類、哺乳動物、動物、微生物、細菌、真菌、酵母、病毒、齲齒動物、昆蟲、兩栖動物及魚類。
提供於本發明中之流體樣本可為可或可不包含所關注罕見顆粒之液體。於一些態樣中，該樣本可為(例如)來自湖、河、海洋、池、溪、泉、沼澤、水庫、或類似之環保流體樣本。又於其他情況中，該樣本可為(例如)來自海水淡化廠、水處理廠、水庫、泉、溪、冰川水流、水塔、或其他的可包含為可飲水源之水源之水樣本。
於一些態樣中，本發明提供分析物，包括為罕見顆粒之分析物。罕見顆粒可為於低含量下存於流體樣本中之細胞或大分子。於某些態樣中，罕見顆粒可為細胞、蛋白質、蛋白複合物、核酸、核蛋白複合物、碳水化合物、代謝產物、降解物、及類似。於某些態樣中，顆粒可被視為係罕見，假若其係以流體中總顆粒群體之小於約10%濃度、或以小於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、或更小濃度之流體中總顆粒群體存於 流體樣本中。又於其他情況中，罕見顆粒可以流體中總顆粒群體之小於約1份/103份、或以流體中總顆粒群體之小於約1份/104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012份、或更小存於流體樣本中。於某些態樣中，顆粒可被視為係罕見，假若其係以小於10%濃度之流體中總顆粒群體、或以小於9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、或更小濃度之流體中總顆粒群體存於流體樣本中。又於其他情況中，該罕見顆粒可以流體中總顆粒群體之小於1份/103份、或以小於1份/104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012份、或更小流體中總顆粒群體存在流體樣本中。
於一些態樣中，流體樣本可包含特定百分比之水及/或其他元素。例如，流體樣本可為除其他物質外包含血漿之血液。一般而言，血漿主要為水分且可包含蛋白質、離子、維他命、酵素、激素、及其他體內化學物質。
於一些態樣中，流體樣本可為體液。體液通常為生物顆粒在液體中之複合物懸浮液。例如，體液可為血液。於一些態樣中，血液可包括血漿及/或細胞(例如，紅血球、白血球、循環罕見細胞)及血小板。於一些態樣中，血液流體體積之55%可為細胞。於一些態樣中，血液樣本可經濃縮使得血液之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%為細胞。於一些態樣中，血液樣本包含已經耗乏一或多種細胞類型之血液。於一些態樣中，血液樣本包含已經富集一或多種細胞類型之血液。於一些態樣中，血液樣本可經稀釋使得血液之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%為細胞。於一些態樣中，血液樣本包含細胞之非均質、均質或接近均質之混合物。
體液可包括(但不限於)全血、血液分離物、血清、血漿、汗液、淚液、耳流液、痰、淋巴、骨髓懸浮液、尿液、唾液、精液、陰道流 液、糞、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水、母乳、玻璃體液、眼房液、皮脂、內淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液體、及呼吸道、腸道及泌尿生殖道之分泌。於一些態樣中，體液可與包含細胞及生物顆粒之混合物之各種器官(例如，肺)接觸。
於一些態樣中，體液可包含罕見顆粒。於一些態樣中，罕見顆粒為罕見細胞。罕見細胞可係有核或無核。罕見細胞包括(但不限於)表現惡性表型之細胞；胎兒細胞(諸如，在母體周邊血液中之胎兒細胞)、腫瘤細胞(諸如，已自腫瘤脫落進入血液或其他體液中之腫瘤細胞)；受病毒感染之細胞，諸如，受HIV感染之細胞、受所關注基因轉染之細胞；及存於遭受自體反應疾病折磨之個體之周邊血液中之T-細胞或B-細胞之異常性亞型。
於一些態樣中，體液可為血液且包含罕見細胞。罕見細胞可為紅血球(erythrocyte)、白血球(white blood cell)、白血球(leukocyte)、淋巴細胞、B細胞、T細胞、肥大細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、樹突細胞、幹細胞、紅血球(erythroid cell)、癌細胞、腫瘤細胞或自任何源自內胚層、中胚層、外胚層之組織或神經脊組織單離得的細胞。罕見細胞可來自一級來源或來自二級來源(例如，細胞株)。
存於特定體液(例如，血液)中之細胞及生物顆粒之類型及量可顯示關於生物體健康狀態之資訊。例如，罹患癌症之個體可在體液中具有癌細胞。來自罹患感染之個體的樣本可包含增加數目的指示感染之免疫細胞(例如，淋巴細胞、嗜中性粒細胞、B細胞、T細胞、樹突細胞等等)或可包含諸如微生物細胞或核酸之致病原物質。來自懷孕婦女之樣本可包含指示胎兒之基因型或染色體核型(karyotype)之胎兒細胞。
一些細胞或生物顆粒可以相較於常量為少量地存於體液中。該 等罕見細胞可包括循環腫瘤細胞、癌症幹細胞等等。因事件(例如，癌症)發生在身體特定區域而導致該等細胞可出現在體液中。該細胞可源自包含體液之器官或接近體液之器官。例如，罕見乳癌細胞可存於位於接近乳腺之處之血液或淋巴液中。於一些態樣中，該細胞係源自更多種遠處器官。例如，源自睾丸腫瘤之細胞可存於自手臂採集的血液樣本中。
分析
本發明進一步提供可進行分析之方法。於一些態樣中，分析可包括用於詢問等分試樣之資源。於等分試樣包含可本質上展現化學發光或生物發光之分析物(例如，罕見顆粒)之其他情況中，設備可不需要用於詢問等分試樣之資源。
於一些態樣中，分級裝置可選自電腦、處理器、控制器、具有積體電路之晶片、電路板、電子元件、軟體、演算法、或其組合。於一些態樣中，處理器可為數位處理器(例如，FGPA、ASIC、或RT)。於一些態樣中，電腦接收來自偵測裝置之訊號且透過演算法來分級等分試樣。該分級裝置可基於分級值(例如，流體樣本中罕見顆粒之存在、不存在、量、同一性、或組成)來引導等分試樣進入適宜之通道中。
於一些態樣中，可分析來自第一偵測器之資訊。可分析來自第一偵測器之資訊及結果證實分析物為陽性。於一些態樣中，可分析來自偵測器之資訊及結構證實分析物為陰性。於一些態樣中，分級裝置將可讀取陽性或陰性分析物之訊號發送至流體動力切換元件(例如，螺線管)以分選分析物。於一些態樣中，陽性分析物可被移至微流體晶片之獨特通道。於一些態樣中，陽性分析物可被移至微流體晶片之獨特腔室。於一些態樣中，陽性分析物可被移至微流體晶片之廢棄物腔室。於一些態樣中，陰性分析物可被移至微流體晶片之獨特通道。 於一些態樣中，陰性分析物可被移至微流體晶片之獨特腔室。於一些態樣中，陰性分析物可被移至微流體晶片之廢棄物腔室。於一些態樣中，陽性分析物係與陰性分析物分開分配。
於一些態樣中，分析可使用藉由第二偵測器轉達的資訊來進行。第二偵測器可用於證實使用第一偵測器所獲得的資訊。於一些態樣中，第二偵測器可位於微流體晶片上。於一些態樣中，第二偵測器可不位於微流體晶片上。於一些態樣中，第二偵測器獲得來自基於藉由第一偵測器所偵測到的訊號來分選之細胞之訊號。於一些態樣中，第二偵測器接收來自分選的細胞之偵測訊號及可將關於該訊號之資訊發送給電腦。該電腦可用於決定是否分選得適宜之細胞。
於一些態樣中，可對在免疫染色方法中獲得的資訊進行分析。免疫染色分析物之方法係在微流體晶片之腔室中進行。於腔室處，偵測器可偵測到來自染色之第一循環之一種或複數種訊號。於一些態樣中，該一或複數種訊號可進行光漂白。該偵測器可監測所發射訊號的持續時間及強度。於一些態樣中，分析物可進行染色之第二循環。該偵測器可偵測藉由於染色之第二循環後之分析物發射之訊號。於一些態樣中，該一或複數種訊號可進行光漂白。該偵測器可監測所發射的訊號之持續時間及強度。於一些態樣中，可重複免疫染色及光漂白之循環複數個循環。電腦可用於(例如)經免疫染色的分析物之一或多種訊號間的比較，其中免疫染色之第一循環係確保已進行的光漂白。
單分析物陣列裝置及方法
本發明提供自液相捕獲單分析物之方法及設備。於一些態樣中，分析物可為顆粒。於其他情況中，分析物可為細胞。分析物可捕集於腔室中。於其他情況中，分析物可捕集於孔中。於其他情況中，分析物可捕集於貼片上。於一些態樣中，腔室或孔可配置成線性形式。於其他情況中，該等腔室或孔可配置成陣列形式。
該裝置可設計成各種形式。例如，可建立二維(2D)裝置。於一些態樣中，2D裝置可具有軸向線性流動(圖17B)。軸向線性流動可係連續流動設計。於一些態樣中，可建立三維(3D)裝置。例如，3D裝置可具有配置成格網之腔室(圖17C)。存在若干種假若需要則可用於2D或3D方法之替代設計。
2D裝置可具有具有多種可能尺寸之通道或腔室。該等尺寸會影響串行流阻捕集設計。具有可能捕集密度及尺寸之裝置之示意圖顯示於圖18中及該裝置之放大區域顯示於插圖中。於一些態樣中，該等可能的尺寸可包括主要通道之寬度、收縮部之寬度、自主要通道收縮部入口至主要通道收縮部出口之長度、跨該收縮部之長度、及主要通道、收縮部、及收縮腔室之高度。
於一些態樣中，串行流阻捕集可與微流體裝置配對使用。該裝置可由樣本可引入的入口(左側)及過量的液相可移去的出口(右側)組成。該裝置之中央可具有高密度之可引入的流阻捕集阱。圖18B顯示圖18C之放大區域。於一些態樣中，流阻捕集阱可構成該裝置之功能性部分。
3D裝置可具有具有多種可能尺寸及形狀之腔室。該等尺寸及形狀會影響平行流阻捕集阱設計。於一些態樣中，3D裝置之腔室可為孔。該裝置可由解決辦法(例如(諸如)珠粒、細胞等等)來捕集單顆粒/細胞及多個孔可配置成平行以形成該裝置。3D裝置上孔之橫截面側視圖繪示可能的形狀改變(圖19)。於一些態樣中，孔設計可包括螺旋形、橢圓形、抛物線形、雙曲線形、多邊形、無限邊形、一千邊形、十邊形、九邊形、10100邊形(googolgon)、一百邊形、七邊形、十一邊形、六邊形、一百萬邊形、一萬邊形、八邊形、五邊形、四邊形、三角形、梯形、圓柱形、超平面、平面、柏拉圖立體(platonic solid)、十二面體、六面體、二十面體、八面體、四面體、環面、二次曲面、 圓形(done)、圓柱體、球體、雙曲面、拋物面、多胞體(polychoron)、正120胞體(hecatonicosachoron)、正600胞體(hexacosichoron)、正16胞體(hexadecachoron)、正24胞體(icositetrachoron)、正5胞體(pentachoron)、超正方體(tesseract)、球椎體、或圓頂形狀。於一些態樣中，孔之尺寸可由h1=孔深度，h2=收縮部深度，r1=孔半徑，及r2=收縮部半徑所界定。
於一些態樣中，該裝置之物理材料可由包括(但不限於)玻璃、聚合物(例如，PDMS、美拉(mylar)、戴瑪斯(Dymax)、聚胺基甲酸酯)之光學透明材料組成。於其他情況中，該裝置之物理材料可藉由多個層組態。於一些態樣中，該多個層可包括上述材料之各種層。
述於本發明中之裝置可使用本文所述方法來組態。例如，圖20為可用於建立一些該等裝置之方法之示意性描繪。於一些態樣中，該方法可包括逐層地組態裝置。就第一層而言，可藉由光阻劑旋塗固體基板(例如，矽晶圓)。經塗佈之基板可放置成硬接觸壓印有UV-透明及不透光區域中所描繪所欲設計的微影蝕刻光罩。可將該光罩及基板曝露於UV-光。UV-光可用於使光阻劑中之光化學物質交聯。所製得裝置之第一層可藉由顯影所得交聯圖形、溶解除去光阻劑之非交聯部分完成。於一些態樣中，第二層可使用模具來建立。該模具可藉由塗佈、曝光、及顯影另一個光阻劑層來製造。於一些態樣中，該模具可用於在可固化(例如，PDMS)或可模壓材料中形成通道、腔室、及孔結構。例如，可將模具置於盤中。於一些態樣中，可將PDMS澆注於模具之上並固化。可從模具放出該PDMS，及入口及出口可進行穿孔。於一些態樣中，圖案化PDMS可經相對平坦玻璃或PDMS片密封以封閉該等通道及腔室或孔。
述於本發明中之裝置可使用本文所述方法來組態。例如，微製造方法可用於製造平行流阻捕集阱(圖21)。該裝置可用除光阻劑(例 如，SU-8)外可包括(但不限於)聚合材料、光阻劑、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚胺基甲酸甲酯(PUMA)等等之材料來製造。於一些態樣中，微製造方法可包括：(1)於矽(Si)晶圓上旋塗犧牲性層，(2)沉積光阻劑(SU-8)於頂部，(3)將光罩與微陣列圖形對準及將該晶圓曝露於UV，(4)處理並移去未交聯的光阻劑，若需要，則旋塗並處理第二個光阻劑層，及最後，(5)自Si晶圓釋離SU-8層繼而自組裝至(僅路徑1)多孔聚碳酸酯過濾器及/或(路徑1-2)具有插入管件用單一出口之PDMS安裝件上。
於一些態樣中，可藉由流體力來捕集單細胞。流體力可將該等細胞固持在一起。於一些態樣中，可藉由與裝置表面上之分子相互作用來增大流體力。於一些態樣中，分子可展現特異性結合(例如，適合體、抗體、一級胺、琥珀醯亞胺酯)或非特異性結合(例如，聚電解質)。於其他情況中，可藉由光學力來增大流體力。光學力可包括(但不限於)吸引力(例如，單光束梯度光學捕集阱、旋渦捕集阱)、排斥力(例如，散射)、界面力(例如，馬南哥尼力(Marangoni force))、靜電力(排斥力、吸引力)或磁力(例如，由外加磁場與固有易磁化內部物質相互作用所施加)。
本發明提供可進行樣本之封存或捕集、處理、及偵測之裝置、方法及系統。於一些態樣中，該等樣本可由捕集(例如，藉由藉由流體流動產生的力、重力、光學力、或分子相互作用或共價鍵結之形成固持在固定位置)於微流體裝置中之分析物組成。
於一些態樣中，分析物係捕集、固定、固持、或以其他方式附著至諸如微流體裝置中之孔或區室的微腔。於其他態樣中，分析物係在微腔中。於一些態樣中，分析物係捕集、固定、固持、或以其他方式附著至諸如微流體裝置中之藉由基板塗佈之貼片的微貼片。於其他態樣中，分析物係透過藉由流體流動產生的力及/或重力捕集、固 定、固持、或以其他方式附著至微腔或微貼片。於一些態樣中，分析物係透過黏著力、分子相互作用及/或共價鍵結捕集、固定、固持、或以其他方式附著至微腔或微貼片。於一些態樣中，分析物係通過不受限制地包括凡得瓦(van der Waals)相互作用、靜電相互作用、疏水性交互作用及/或非特異性吸附之非共價鍵結而捕集、固定、固持、或以其他方式附著至微腔或微貼片。
於一些態樣中，分析物為單細胞。分析物可與標籤接觸。於一些態樣中，標籤可識別分析物上之標靶。該標籤可與該標靶結合。於一些態樣中，該標靶可為分析物之分子組分。於一些態樣中，該分子組分可於分析物之外部。於其他情況中，該分子組分可於分析物之內部。該等標籤可使用多種偵測方法來偵測。
本發明提供一種用於容納或物理捕集單分析物之方法。於一些態樣中，分析物可為細胞。該等細胞可呈液相進行運送，其中液體會沿流動路徑流動且可運送至物理上界定的部位。於一些態樣中，該等細胞可留存在界定的部位。流動力可施加於細胞上以將該細胞捕集在界定的部位。於另一種情況中，該等細胞可依序地被捕集，此乃因流體流動路徑就從入口至出口而言係連續的。又於另一種情況中，多個流體流動路徑及其相稱之多種單細胞可以平行方式捕集或封存。於一些態樣中，以平行方式捕集可係歸因於介於入口及出口之間之細胞可同時地經過的許多流動路徑。
於一種較佳的情況中，該方法可使各分析物(例如，細胞)在流體樣本地沿流體路徑流動並進入腔室。該分析物可進入該腔室且阻塞流體路徑從而停止通過該流體路徑的流動。於此情況中，另一種分析物可不進入該腔室。於該流體樣本中的其餘細胞可進入殘留空腔室直到部分或整個腔室裝納分析物。
於一些態樣中，於本文中揭示串行流阻捕集阱發揮作用以收 集、離散化、及讀取生物衍生之樣本的方法。例如，圖22A顯示樣本可如何串行地填充界定的部位。該製程可在當樣本之關鍵尺寸(直徑)為以下時發生：(1)小於主要通道之高度及寬度，及(2)大於收縮部之高度或寬度。於一些態樣中，流阻差可引導該樣本進入界定的區域，因此會閉塞收縮部繼而可停止流動。隨後的樣本可沿流動路徑流動通過主要通道到達下一個捕集部位直到填充所有捕集阱。例如，圖22B顯示不可混溶液相可如何通過樣本入口引入。該不可混溶液體可串行地離散捕集的樣本。於一些態樣中，該不可混溶液體可不流入樣本區域。缺乏不可混溶液體之流體流動可歸因於閉塞的限制件。於一些態樣中，缺乏流體流動可歸因於因不可混溶相與通道材料之間的不同接觸角而建立的界面障壁及捕集區域之尺寸。於一些態樣中，關於各樣本之時間資訊可實質上地在各位置進行編碼。可偵測到離散化樣本之可變化學性質(圖22C)。
於一些態樣中，於本文中揭示平行流阻捕集阱發揮作用以收集、離散化、及讀取生物衍生之樣本的方法。例如，圖22A與22D顯示樣本可如何填充平行流阻捕集阱。於一些態樣中，樣本顆粒可隨著流動從裝置頂部進入孔中。多種樣本可同時地捕集於平行流阻捕集阱中。於一些態樣中，相較於串行流阻捕集阱使用平行流阻捕集阱之樣本收集之速度可能更為快速。例如，圖22D顯示可如何在捕集孔平面之上方及下方置換不可混溶相。於一些態樣中，在捕集孔平面之上方及下方之不可混溶相可產生離散化樣本。於一些態樣中，關於各樣本之時間資訊可實質上地在各位置中進行編碼。可偵測到離散化樣本之可變化學性質(圖22C)。
於一些態樣中，可自單分析物陣列釋放捕集的分析物並進行分析。例如，圖24繪示基於分析捕集生物分析物之陣列及釋放之可能的順序。於一些態樣中，該順序可包括：(1)應用自管件移動流體流動 通過捕集阱之流動，(2)一旦捕集分析物，立刻停止在局部區域中流動，及，(3)使用緩衝液沖洗過量的流體及顆粒。
於一些態樣中，捕集在單分析物陣列中之分析物可進行進一步分析。於一些態樣中，該單分析物陣列可與順序免疫染色及光漂白之方法併用。
於一些態樣中，該單分析物陣列可與熟習此項技藝者已知之用於核酸之分析的方法併用。於一些態樣中，核酸之分析可包括聚合酶鏈式反應(PCR)。就使用單分析物陣列(圖17)來進行PCR而言，所有腔室可填充流體中之單分析物。可密封(例如，使用油)各腔室及可以平行方式於各單分析物上進行PCR。
裝納於單分析物陣列之個別孔或腔室中之分析物可利用多種技術來偵測。例如，可使用顯微鏡成像在該等孔或腔室中之分析物。於一些態樣中，顯微鏡可包括明視野顯微鏡。於一些態樣中，顯微鏡可包括螢光顯微鏡。於顯微鏡之任何情況中，樣本可置於載台上。於一些態樣中，載台可以人工方式操作。於其他情況中，載台可為可受電腦程式控制之自動化轉譯載台。於顯微鏡之任何情況中，可藉由CCD攝影機獲得影像。
應用
本揭示案提供可用於多種應用中的方法。於一些態樣中，該方法可提供個體與例如生物流體(諸如血液樣本)之流體樣本中罕見顆粒之存在相關聯之病況之診斷或預後。
述於本文中之方法及設備可包括以下步驟：(a)使取自個體之生物流體與標籤在適於轉移標籤至包含該標籤及分析物之複合物中之條件下接觸；(b)偵測生物流體之等分試樣中形成於步驟(a)中之複合物之存在或不存在；(c)基於形成於步驟(a)中之複合物之存在或不存在而為該等分試樣指示一個數值；及(d)基於單離的等分試樣之分析來 提供個體診斷或預後。於一些態樣中，步驟(b)可包括藉由輻射源詢問該等分試樣及偵測由與分析物結合之標籤發射之訊號。
於各種態樣中，提供於流體中識別存於分析物上之複數種標記的方法，其中該方法包括：(a)使用輻射源來偵測來自第一標籤之訊號，其中該第一標籤係附著至與該分析物上之該第一標記結合之第一結構；(b)基於該第一標籤之存在來分配該分析；(c)減低該第一標籤之訊號之強度；(d)使該分析物與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係附著至第二標籤；及(e)偵測該第二標籤。
於一些態樣中，步驟(b)之分配係基於第一標籤及第三標籤之存在。於其他態樣中，步驟(b)之分配係藉由微流體裝置來進行。又於其他態樣中，步驟(b)之分配及步驟(b)或步驟(e)中至少一個步驟之偵測係在相同微流體裝置中進行。
於各種態樣中，提供用於偵測存於分析物上之複數種標記的方法，該方法包括：使分析物與第一標籤接觸，其中該分析物包含第一標記及該第一標籤對該第一標記具有親和力；偵測由該第一標籤發射之第一訊號，其中該第一訊號之存在指示存在該第一標記；基於該第一訊號之存在來進行包含該分析物之流體之分配；減低該第一訊號之強度；使該分析物與第二標籤接觸，其中該分析物包含第二標記及該第二標籤具有針對於該第二標記之親和力；及偵測由該第二標籤發射之第二訊號，其中該第二訊號之存在指示存在該第二標記。
於一些態樣中，該第一標籤之訊號減低超過50%。於某些態樣中，訊號強度之減低係藉由應用輻射於分析物達成。於其他態樣中，白光係用於減低訊號之強度。又於其他態樣中，雷射係用於減低訊號之強度。於其他態樣中，發光二極體係用於減低訊號之強度。於一些態樣中，訊號強度之減低係藉由塗佈化學品至第一標籤達成。於某些態樣中，該化學品為還原劑。於其他態樣中，該還原劑為二硫蘇糖 醇。
於一些態樣中，流體之分配係基於第一訊號及第三訊號之存在。於其他態樣中，第一訊號之偵測、第二訊號之偵測、流體之分配、或其組合係使用微流體裝置來進行。
於一些態樣中，分析物為細胞。於某些態樣中，細胞為癌細胞。於其他態樣中，癌細胞為罕見細胞。於一些態樣中，分析物為循環腫瘤細胞。於某些態樣中，細胞為細菌細胞、免疫細胞、胎兒細胞、指示治療後殘留疾病之細胞、或幹細胞。於其他態樣中，細胞為包含小於1%之流體中細胞總群體的罕見細胞。於某些態樣中，分析物為離散的細胞。
於一些態樣中，流體係選自由以下組成之群：全血、血液分離物液、血清、血漿、汗液、淚液、耳流液、痰、淋巴、骨髓懸浮液、尿液、唾液、精液、陰道流液、糞、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水、母乳、玻璃體液、眼房液、皮脂、內淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液體、及呼吸道、腸道及泌尿生殖道之分泌物。於某些態樣中，流體為全血。於其他態樣中，流體為全血分離物。
於一些態樣中，第一標籤為螢光團。於其他態樣中，第一標籤為抗體。於其他態樣中，第一標籤為由核酸組成之探針。於某些態樣中，該等方法進一步包括使來自第一標籤及第二標籤之訊號成像。於一些態樣中，分析物係存於流體中，及該流體為流體之較大體積之等分試樣。於其他態樣中，同時地在複數種分析物上進行由第一標籤發射之第一訊號之偵測。
於某些態樣中，分配係在半自動化或自動化地進行。於某些態樣中，分配係藉由總體決策等分試樣分級來進行。於一些態樣中，流式細胞儀係用於分析物之分配。
於其他態樣中，該分析物包含複數種標記。於一些態樣中，該 複數種標記中之各者為生物標記。於某些態樣中，該分析物包括表現圖譜，其中該表現圖譜係由該複數種標記界定。
於其他態樣中，該方法進一步包括使分析物與緩衝液接觸。又於其他一些態樣中，緩衝液包含固定劑。於某些態樣中，緩衝液包含透化劑。於其他態樣中，緩衝液為洗滌緩衝液。
於各種態樣中，提供用於自包含第一細胞類型及第二細胞類型之樣本單離細胞的方法，該等方法包括：(a)樣本經一組管件引入至微流體晶片中，其中該微流體晶片包括(i)至少一個與該組管件流體連接之通道；(ii)經組態以偵測該至少一個通道中細胞之訊號之偵測器；及(iii)至少一個與該至少一個通道流體連接之腔室；(b)使該樣本之一部分流動通過該偵測器；(c)使用該偵測器以偵測該樣本之一部分中該第一細胞類型之存在或不存在；(d)假若在該樣本之一部分中偵測到該第一細胞類型，則引導該樣本之等分試樣進入該腔室中，其中該等分試樣包含該第一細胞類型；及(e)重複步驟(b)、(c)、及(d)，藉此單離該腔室中之複數個等分試樣使得該腔室包含該樣本中第一細胞類型總數之80%以上及該樣本中第二細胞類型總數之5%以下。
於各種態樣中，提供用於自樣本單離細胞的方法，該等方法包括：(a)將樣本引入至微流體晶片中，其中該樣本包含第一細胞類型及第二細胞類型，及其中該流體晶片包括：通道；經組態以偵測在該通道中發射的訊號之偵測器；與該通道流體連通之腔室；(b)使該樣本之一部分流動通過該通道，其中該部分包含複數個第一細胞類型、複數個第二細胞類型、或其組合；(c)使用該偵測器來偵測該部分中該第一細胞類型之存在或不存在；(d)假若於該部分中存在該第一細胞類型，則引導該部分進入該腔室中；及(e)重複(b)、(c)、及(d)足夠多次使得該腔室包含存於該樣本中該第一細胞類型總數之80%以上及存於該樣本中該第二細胞類型總數之5%以下。
於一些態樣中，第一細胞類型及第二細胞類型中之至少一者為癌細胞。於某些態樣中，該癌細胞為罕見細胞。於其他態樣中，第一細胞類型及第二細胞類型中之至少一者為循環腫瘤細胞。又於其他態樣中，第一細胞類型及第二細胞類型中之至少一者為細菌細胞、免疫細胞、胎兒細胞、指示治療後殘留疾病之細胞、或幹細胞。於某些態樣中，第一細胞類型及第二細胞類型中之至少一者為包含小於1%之該樣本中之細胞總群體之罕見細胞。
於一些態樣中，該樣本係選自由以下組成之群：全血、血液分離物液、血清、血漿、汗液、淚液、耳流液、痰、淋巴、骨髓懸浮液、尿液、唾液、精液、陰道流液、糞、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水、母乳、玻璃體液、眼房液、皮脂、內淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液體、及呼吸道、腸道及泌尿生殖道之分泌物。於某些態樣中，該樣本為全血。於其他態樣中，該樣本為全血分離物。
於一些態樣中，該腔室係於微流體晶片之外部。於某些液體中，其中之腔室為小瓶、微離心管、或於孔盤中之孔。於其他態樣中，該腔室經管件與通道流體連通。又於其他態樣中，該腔室經毛細管與通道流體連通。
於各種態樣中，提供識別存於分析物上之複數種標記的方法，其中該等方法包括：(a)藉由使分析物於包含複數個微腔或微貼片之基板上流動，來分配複數種分析物，其中該大多數微腔或微貼片可裝納不多於一種分析物及其中該等微腔或微貼片係位於微流體裝置中；(b)於該等微腔或微貼片中，使各分析物與可與第一標記結合之第一結構接觸，其中該第一結構係連接至第一標籤；(c)偵測來自該第一標籤之訊號；(d)減低該第一標籤之該訊號之強度；(e)使該分析物與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係連接至第二標籤； 及(f)偵測該第二標籤。
於一些態樣中，步驟(b)之接觸係藉由使包含第一結構之流體流動通過與微腔或微貼片流體連通之通道來達成。於某些態樣中，遵循步驟(b)之該接觸步驟，該方法進一步包括：使分析物與洗滌緩衝液接觸。
於各種態樣中，提供用於偵測存於分析物上之複數種標記的方法，該等方法包括：藉由使流體於包含微腔或微貼片之基板上流動，在微腔或在微貼片中單離分析物，其中該流體包含該分析物；使該分析物與第一標籤接觸，其中該分析物包含第一標記，及其中該第一標籤對該第一標記具有親和力；偵測由該第一標籤發射之第一訊號，其中該第一訊號之存在指示存在該第一標記；減低該第一訊號之強度；使該分析物與第二標籤接觸，其中該分析物包含第二標記，及其中該第二標籤對第二標記具有親和力；及偵測由第二標籤發射之訊號，其中該第二訊號之存在指示存在該第二標記。
於一些態樣中，該方法係在複數個微腔或微貼片中所單離的複數種分析物上進行。於某些態樣中，該第一標籤之訊號減低超過50%。於其他態樣中，至少一種分析物為細胞。
於一些態樣中，分析物係藉由藉由流體流動產生的力、重力、或黏著力固持在微腔中之固定位置。於某些態樣中，該分析物係透過分子相互作用連接至微腔或微貼片。於其他態樣中，分析物係透過非共價鍵結連接至微腔。又於其他態樣中，該非共價鍵結為凡得瓦相互作用、靜電鍵結、疏水性鍵結或非特異性吸附。
於各種態樣中，提供於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣的方法，其中該等分試樣包含罕見顆粒，該方法包括以下步驟：(a)偵測等分試樣中之罕見顆粒之存在或不存在；(b)基於該罕見顆粒之存在或不存在而為該等分試樣指示一個數值；及(c)依據該指示之數 值，藉由打開電致動閥來引導該等分試樣之流動，其中該電致動閥係位於在微流體晶片之外部之裝置上。於一些態樣中，該微流體晶片包括樣本輸入通道、至少兩個輸出通道、及至少一個定向流動通道，且其中該電致動閥控制該定向流動通道中流體之流動。
疾病之診斷
於一些態樣中，使用本發明方法單離的分析物(例如，細胞)可進一步進行子群體分析(例如，依照基因型或表現型)以開發標靶治療。例如，單離的細胞(例如，腫瘤細胞)可與結合特異性生物標記(例如，藥物標靶)結合之標籤(例如，螢光抗體)培養以確定藥物標靶之存在或表現程度。一旦證實藥物標靶之表現，則可選擇該等藥物用於專門開發靶向特定藥物標靶之表現之治療。於一個實例中，單離的腫瘤細胞可與與Her2受體特異結合之螢光抗體培養以確定乳腫瘤脫落之CTC是否係Her2-陽性。假若該等單離的腫瘤細胞展現高度Her2表現，則可使用赫賽汀(Herceptin)(曲妥珠單抗(trastuzumab))作為該藥物係經設計以靶向並阻斷HER2蛋白過度表現之功能之治療。其他已知的藥物標靶，包括BCR-ABL或PDGFR(由藥物基利克(Gleevec)靶向)、ERBB2(由赫賽汀靶向)、EFGR(由艾瑞莎(Iressa)、得舒緩(Tarceva)靶向)、RAR-α(由ATRA靶向)、雌激素受體(由他莫昔芬(Tamoxifen)靶向)、芳香酶(aromatase)(由來曲唑(Letrazole)靶向)、雄激素受體(由氟他胺(Flutamide)、比卡魯胺(Biclutamide)靶向)、CD20(由利妥昔單抗(Rituximab)靶向)、VEGF-受體(由癌思停(Avastin)靶向)，亦可類似地在開立適宜之化學療法治療之前自單離的腫瘤細胞篩選。
於一些態樣中，分析物可為罕見顆粒(例如，癌細胞或循環腫瘤細胞(CTC))。於其他情況中，罕見顆粒可為寄生性細胞或生物體，例如，梨形鞭毛蟲屬(Giardia)或隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)物種、受瘧原蟲屬(Plasmodium)物種感染之紅血球、受HIV感染之淋巴細胞或 白血球、母體血液中之胎兒細胞、幹細胞、受朊病毒感染之細胞、CD4+ T-細胞、及類似。
於一些態樣中，該方法可包括偵測取自個體之血液樣本中之循環腫瘤細胞。該方法可包括eDAR。於某些態樣中，該個體可為經診斷罹患癌症之患者。於一些態樣中，癌症可為I期、II期、III期、或IV期。於一些態樣中，可在取自過去曾診斷罹患癌症之患者之血液樣本中偵測到循環腫瘤細胞(CTC)。於該等情況中，患者可經過進一步診斷罹患轉移性癌症。
於一些態樣中，該方法可用於診斷過去曾診斷罹患實體腫瘤之個體中轉移性癌症，該方法包括以下步驟：(a)偵測取自個體之血液樣本之等分試樣中之CTC之存在或不存在；(b)基於該CTC之存在或不存在而為該等分試樣指示一個數值；及(c)依據該指示之數值來引導該等分試樣之流動或收集。
於一些態樣中，於血液樣本中不存在CTC可與未罹患轉移性癌症之個體相關聯。於血液樣本中存在至少一種CTC可與罹患轉移性癌症之個體相關聯。於一些態樣中，於血液樣本中存在至少許多種CTC可與罹患轉移性癌症之個體相關聯。該方法可進一步包括(d)假若在血液樣本中未偵測到CTC，則診斷個體為不罹患轉移性癌症或假若在血液樣本中偵測到至少一種CTC，則診斷個體為罹患轉移性癌症之步驟。
本揭示案亦提供一種用於監測經診斷罹患癌症之個體之方法。該方法可包括使用提供於本文中之eDAR方法來偵測取自個體之血液樣本之等分試樣中之CTC之存在或不存在。於一些態樣中，可以規律時間間隔(例如，每年至少一次、每年至少兩次、每年至少3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、或更多次、或每年至少約3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、或更多次)地監測患者 自癌症至轉移性癌症之進展。於一些態樣中，可每月一次、或每月至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、或更多次地監測個體。於一些態樣中，可每月約一次、或每月至少約2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、或更多次地監測個體。於血液樣本中不存在CTC可與不罹患轉移性癌症之個體相關聯。於血液樣本中存在至少一種CTC可與罹患轉移性癌症之個體相關聯。於血液中存在至少許多種CTC可與罹患轉移性癌症之個體相關聯。
於在血液樣本中偵測到CTC之情況中，該方法可進一步包括對一或多個經識別為包含CTC之等分試樣進行進一步分析以識別一或多種CTC細胞之一或多種特徵之步驟。例如，可使包含CTC之等分試樣或等分試樣收集物與一或多種對一或多種癌細胞特異性表面抗原具特異性之偵測試劑接觸。可能分析的癌細胞特異性表面抗原之非限制性實例不受限制地包括BCR-ABL或PDGFR(由藥物基利克靶向)、ERBB2(由赫賽汀靶向)、EFGR(由艾瑞莎、得舒緩靶向)、RAR-α(由ATRA靶向)、雌激素受體(由他莫昔芬靶向)、芳香酶(由來曲唑靶向)、雄激素受體(由氟他胺、比卡魯胺靶向)、CD20(由利妥昔單抗靶向)、VEGF-受體(由癌思停靶向)、及類似。於一些態樣中，可使用述於本文中之順序免疫染色及光漂白方法來分析表面抗原。
提供於本文中之方法及裝置可用於診斷除癌症外之疾病。於一些態樣中，可診斷瘧疾，該方法包括偵測受瘧原蟲屬感染之紅血球。於另一種情況中，提供一種用於診斷HIV感染之方法，該方法包括使用提供於本文中之eDAR方法及/或設備來偵測受HIV病毒感染之淋巴細胞或白血球。又於另一種情況中，提供一種用於診斷與朊病毒相關聯之疾病的方法，該方法包括偵測取自人或其他動物之生物流體中之朊病毒。
於一些態樣中，分析物為罕見細胞及罕見細胞為細菌細胞。於 一些態樣中，細菌細胞存在於全血樣本中。於其他態樣中，該裝置、方法、系統或設備係用於偵測全血中罕見細菌細胞之存在。於一些態樣中，該裝置、方法、系統或設備係用於偵測全血樣本中罕見細菌細胞之存在以提供診斷、預後、或其他的與特徵分析或處理細菌感染或敗血症相關之治療參數。
疾病之預後
本發明提供針對於與流體中分析物之存在相關聯之疾病或病況之預後的方法。於一些態樣中，分析物可為生物顆粒。於一些態樣中，流體可為生物流體。於一些態樣中，該方法包括以下步驟：(a)偵測取自個體之樣本之等分試樣中之分析物之存在或不存在；(b)基於該分析物之存在或不存在而為該等分試樣指示一個數值；(c)依據該指示之數值來引導該等分試樣之流動或收集；及(d)假若在樣本中未偵測到分析物則提供良好預後或假若在樣本中偵測到分析物，則提供不良預後。
於一些態樣中，等分試樣可基於等分試樣中之分析物之量或同一性來賦值。於一些態樣中，可基於樣本中分析物的量獲得良好或不良預後。例如，假若樣本中分析物的量小於預定參考值則可獲得良好預後及假若樣本中分析物的量等於或大於參考值則獲得不良預後。於一些態樣中，預定參考值可與對特定治療產生反應之機率或總存活期或無疾病存活期達一段時間(例如，至少6個月、或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年、20年、或更多年)之機率相關聯。
於一些態樣中，提供於本文中之方法可用於提供任何與罕見顆粒相關聯之疾病之預後。於一些態樣中，提供用於提供瘧疾之預後的方法，該方法可包括利用本文中提供之eDAR方法及/或設備來確定取自個體之血樣中之受瘧原蟲屬感染之紅血球之數目。於一些態樣中， 假若在血液樣本中所偵測到受感染紅血球之總數小於預定參考值則獲得良好預後或假若在樣本中所偵測到受感染紅血球之總數等於或大於參考值則獲得不良預後。於一些態樣中，提供一種用於提供HIV感染之預後的方法，該方法可包括使用本文中提供之eDAR方法及/或設備來確定取自個體之血液樣本中受HIV病毒感染之淋巴細胞或白血球之數目及假若在血液樣本中所偵測到受感染細胞之總數小於預定參考值則獲得良好預後或假若樣本中所偵測到受感染細胞之總數等於或大於參考值則獲得不良預後。於一些態樣中，提供一種用於提供與朊病毒相關聯之疾病之預後的方法，該方法可包括利用本文中提供之eDAR方法及/或設備來確定取自個體之生物流體樣本中朊病毒之數目及假若樣本中所偵測到朊病毒之總數小於預定參考值則獲得良好預後或假若樣本中所偵測到朊病毒之總數等於或大於參考值則獲得不良預後。
於一些態樣中，本發明提供一種用於提供經診斷罹患實體腫瘤之個體預後之方法。於一些態樣中，該方法包括以下步驟：(a)偵測取自個體之血液樣本之等分試樣中之CTC之存在或不存在；(b)基於該CTC之存在或不存在而為該等分試樣指示一個數值；(c)依據該指示之數值來引導該等分試樣之流動或收集；及(d)假若未偵測到CTC則獲得良好預後或假若偵測到CTC則獲得不良預後。
於一些態樣中，提供一種用於提供經診斷罹患轉移性癌症之個體預後的方法。於一些態樣中，該方法包括以下步驟：(a)偵測取自個體之血液樣本之等分試樣中之CTC之存在或不存在；(b)基於該等分試樣中所偵測到CTC之數目而為該等分試樣指示一個數值；(c)依據該指示之數值來引導該等分試樣之流動或收集；及(d)假若血液樣本中所偵測到CTC之總數小於預定參考值則獲得良好預後或假若樣本中所偵測到CTC之總數等於或大於參考值則獲得不良預後。
於一些態樣中，預定參考值可與對特定治療產生反應之機率或 總體存活期或無疾病存活期達一段時間(例如，至少6個月、或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年、20年、或更多年)之機率相關聯。
疾病對治療之反應
本發明提供用於監測疾病之進展或對治療之反應的方法。於一些態樣中，該方法可包括偵測在流體樣本中之分析物。於一些態樣中，該方法包括以下步驟：(a)偵測在第一時間點自個體取得之第一生物樣本之複數個等分試樣中之分析物之存在或不存在；(b)基於罕見顆粒之存在、不存在、量、或同一性來賦值給該等等分試樣；(c)確定衍生自該第一樣本之所有等分試樣之總值；(d)偵測在第二時間點自個體取得之第二生物樣本之複數個等分試樣中之分析物之存在或不存在；(e)基於該分析物之存在、不存在、量、或同一性來賦值給該等等分試樣；(f)確定衍生自該第二樣本之所有等分試樣之總值；及(g)在賦值給該第一樣本之總值與賦值給該第二樣本之總值之間作比對，其中相較於該第一樣本而言賦值給該第二樣本之值之增加與疾病之進展及/或對治療之不良反應相關聯及/或相較於該第一樣本而言賦值給該第二樣本之值之減小與疾病之消退及/或對治療之良好反應相關聯。於一些態樣中，該等等分試樣可進一步依據該指示之數值引導至顆粒通道或腔室(開道)中以達成收集、進一步富集、或進一步分析。
於一些態樣中，可於診斷疾病或開始治療療法之後規律地利用監測疾病進展或對治療反應之方法。例如，可每年至少一次、每年至少兩次、每年至少3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、或更多次、或每年至少約3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、或更多次地自個體採集樣本。於一些態樣中，可每月一次、或每月至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、或更多次 地監測個體。於一些態樣中，可每月約一次、或每月至少約2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、或更多次地監測個體。
於發現疾病之進展或對治療不良反應之一些態樣中，該方法可進一步包括安排治療、延長給藥方案時間、改變治療方案、及類似之步驟。於一些態樣中，與罕見顆粒相關聯之疾病或病況可為癌症、瘧疾、HIV/Aids、與朊病毒相關之疾病、或類似。
範圍可在本文中表示為自「約」一個特定值、及/或至「約」另一個特定值。當表示成該種範圍時，另一個實施例包括自該一個特定值及/或至另一個特定值。類似地，當該等值表示為近似值時，藉由使用前綴「約」，將理解為該特定值形成另一個實施例。另應瞭解各範圍之端點即可與其他端點顯著相關又可與其他端點無關。術語「約」如本文中所用係指在特定連用之上下文中所述數字數值加上或減去15%之範圍。例如，約10將包括自8.5至11.5之範圍。
雖然已於本文中顯示並描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技藝者當明瞭該等實施例僅以實例方式提供。熟習此項技藝者現可在不脫離本發明下進行多種改動、改變、及替代。應理解述於本文中之本發明實施例之各種替代可用於實施本發明。預期附隨申請專利範圍界定本發明之範疇及因此可包括在該等申請專利範圍之範疇中之方法及結構及其等效物。
顯示於本文中之特例係藉由實例方式且僅係基於例示本發明之較佳實施例之論述之目的及係基於提供據認為是本發明之各種實施例之原理及概念性態樣之最為有用且容易明瞭的說明之原因而提出的。關於此方面，尚未嘗試以相較基本上理解本發明所需更為詳細地顯示本發明之結構細節，可實際上呈現結合附圖及/或實例進行說明使得熟習此項技藝者明瞭本發明之若干種形式為何。隨後之定義及說明意欲並意圖控制任何未來結構，除非以下實例中清楚且明確地作出修改 或在該含義之應用獲得任何無含義結構或基本上無含義之情況下。於術語之結構將致使其無含義或基本上無含義之情況中，定義應依照韋氏辭典(Webster's Dictionary)(第3版)或熟習此項技術者已知的辭典(諸如Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(編輯Anthony Smith，牛津大學出版社，牛津市，2004))。
如本文中所用且除非另外指明，否則使用術語「一(a)」及「一種(an)」意指「一種」、「至少一種」或「一或多種」。除非為上下文中所要求，否則用於本文中之單數形式的術語將包括複數種及複數形式的術語將包括單數形式。
除非本文另外清楚地要求，否則在本說明書及申請專利範圍中，詞語「包括(comprise)」、「包括(comprising)」、及類似應被理解為在與排他性或詳述性意義相反之包容性意義；換言之，係在「包括(但不限於)」之意義上。
除非另作指明，否則目前描述的方法及製程可以任何順序進行。例如，描述步驟(a)、(b)、及(c)之方法可先以步驟(a)、接著步驟(b)、及然後步驟(c)地進行。或者，該方法可以諸如(例如)先以步驟(b)接著步驟(c)及然後步驟(a)之不同順序進行。另外，除非另作特別地指出，否則該等步驟可同時或分開地進行。
使用單數或複數數值之詞語亦分別包括複數形式及單數形式的數值。另外，詞語「本文」、「上文」、及「下文」及包含類似意思之詞語在用於本申請案中時將係指作為總體之本申請案而不是指本申請案之任何特定部分。
實例
包含以下實例以進一步描述本發明之一些態樣，而不應用於限制本發明之範疇。
實例1
基於微流體組件之總體決策等分試樣分級以大容量捕集循環腫瘤細胞
本實例描述並證實根據本發明一個態樣之用於單離包括細胞之顆粒之新穎eDAR平台。
確定eDAR平台之特徵及性能之兩種因素為有效且主動分選方案及接續之有效純化(例如，純化腔室)方案。本發明eDAR-平台將這兩種組件最佳化。於一個實例中，eDAR平台可包括由標準微影方法製造之整合過濾區域。微流體晶片可由位於矽母板上之兩個層組成及可藉由一步式重複模製形成聚二甲基矽氧烷(PDMS)來製造。微流體晶片可藉由結合至玻璃基板製成成品。整個系統可包括主動分選方案。微流體晶片及流體動力切換機制結構之分析性能可經最佳化以達成特定回收效率(例如，95%)、特定假陽性率(例如，0)及特定通過量(例如，4.8mL全血/1小時)。
微流體晶片
用於本實例中之微流體晶片具有整合於相同設計中之兩個功能性區域，即eDAR分選區域及基於狹縫結構之過濾單元。在分選單元中之引入血液至分選接面之主要通道具有50μm之高度及150μm之寬度；所有其他4個通道為50μm高及200μm寬。狹縫過濾器為5μm高及5μm寬。所測試的狹縫之最大個數為20,000個。
矽母板係使用兩種光微影製程來製造(圖5、20及21)。使用AutoCAD(Autodesk，加州聖瑞菲爾市)來設計該等特徵，及寫於鉻光罩(TRICR Corporation，加州聖瑞菲爾市)上。選擇正光阻劑微影及深反應性離子蝕刻(DRIE)來形成第一層，微過濾器特徵。使用AZ 1512作為正光阻劑，此可由於華盛頓大學(University of Washington)之Micromanufacturing Facility(MMF)提供。DRIE製程係經最佳化以達到在4.5至5μm範圍內之深度。使用SU-8-3050作為負光阻劑 (MicroChem，馬薩諸塞州牛頓市)來製造eDAR特徵之第二層，及該特徵之高度係控制為50μm。於使用十三氟-1,1,2,2-四氫辛基-1-三氯矽烷(Sigma-Aldrich，密蘇裡州聖路易斯)將該母板矽烷化之後，將未固化PDMS澆注於矽晶圓上並於70℃下烘焙2小時。自該矽母板剝離具有所欲微特徵之PDMS片，且接著使用標準電漿氧化製程與蓋玻片結合。
生物及臨床樣本
三種乳癌細胞株SKBr-3、MCF-7、及MDA-MB-231細胞(美國菌種培養物保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，維吉尼亞州馬納薩斯)係用於特徵分析並最佳化eDAR系統。將SKBr-3細胞培養於麥考伊氏(McCoy's)5中，將MCF-7培養於依格最低必需培養基(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM)中，及將MDA-MB-231培養於杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)(ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯)中。所有細胞培養基亦包含2mM L-麩醯胺酸、10%胎牛血清(FBS)(ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯)、及50μg/mL青黴素/鏈黴素(ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯)。培養係於37℃與5% CO2下在增濕環境中進行。MDA-MB-231-GFP細胞株係由在塔夫斯大學(Tuffs University)的索能斯罕(Gail Sonenshein)教授提供並培養於具有10% FBS及1μg/mL嘌呤黴素之DMEM培養基(Life Technologies，加州卡爾斯巴德)中。取自健康施體之對照血液購自國際血漿實驗室(Plasma International Lab)(華盛頓州埃弗雷特)；抽取的第一管血液作棄置處理以防止來自皮膚細胞之任何可能的污染。基於經過佛瑞德哈金森癌症研究中心的機制結構審查委員會(Fred Hutchinson Cancer Research Center's institutional review board)核准之方案，自罹患轉移性胰腺癌之患者抽取全血樣本。於西雅圖癌症照護聯盟(Seattle Cancer Care Alliance)(SCCA)，使用裝納EDTA作為抗凝 血劑之真空採血管(BD，新澤西州富蘭克林湖)採集患者樣本，儲藏在4℃，及在4小時以內進行分析。
樣本製備及eDAR分析
除非另作指明，否則所有實驗使用Isoton(Beckman Coulter Inc.，加州奇諾市)作為緩衝液。對於典型eDAR實驗而言，於室溫在黑暗中利用與藻紅素(PE)結合的抗-EpCAM(批號515776，Abnova，加州核桃市)標記1mL全血樣本達30分鐘。已將所有標記參數最佳化。將經標記的樣本稀釋為14mL且接著進行離心以移去游離抗體。最終體積係經調整為與初始體積相同。接著使用注射泵將製得的樣本注入至微流體晶片。藉由PCI資料獲取卡片(PCI 6602，National Instruments，德克薩斯州奧斯汀)收集來自與纖維結合的雪崩光電二極體(APD)(Excelitas Technologies，碼薩諸塞州沃爾瑟姆)之跡線。eDAR之分選製程係自動地使用家庭寫入之LabVIEW(National Instruments，德克薩斯州奧斯汀)指令檔及場可程式化閘陣列(FPGA)裝置來控制。藉由購自Lee Company(康涅狄格州威斯布魯克)之螺線管(INKA1226212H)來控制收集分選的等分試樣之流體動力切換。
在將所有陽性等分試樣收集於過濾區域上之後，使用isoton快速地在少於1分鐘內洗滌該過濾區域。假若將任何細胞質標記用於二次標記，則加載4%多聚甲醛(PFA)至過濾區域中以固定細胞。使用Surfynol® 465(Air product，賓夕法尼亞州艾倫鎮)以透化經固定的細胞。抗-EpCAM-PE及抗-細胞角蛋白-APC(批號MAB5131，Abnova，加州核桃市)及抗-CD45-異硫氰酸螢光素(FITC)(批號B116314，BioLegend，加州聖地亞哥)通常係用作用於二次標記之抗體。Hoechst(Life Technologies，加州卡爾斯巴德)亦用作用於驗證經標記的標靶實際上為有核細胞之核染劑。
遵循eDAR之方法，將血液樣本注入至微流體晶片中及分為等分 試樣。接著應用線共焦偵測方案以將該等等分試樣分級為「陽性」或「陰性」，此係藉由標記方案來確定。例如，於許多種應用中，藉由抗-EpCAM-PE標記血液，因此只有具有來自與該抗體結合的顆粒染料之螢光訊號之等分試樣係經分級為陽性事件。應用自動反饋方案以產生血液流動方向之切換，此容許快速地收集陽性等分試樣。由於極低的CTC濃度所致，棄置大於99.999%之等分試樣，此乃因不存在所欲螢光訊號。其等提供陽性螢光訊號之等分試樣轉移至微流體晶片上之另一個區域以進一步純化且接著進行計數。可於捕集孔上進行一連串下游分析，諸如二次免疫染色步驟、較為複雜之染色/漂白製程、或在單分析物層級上之操縱及培養。
再設計之流體動力分選方案。
在過去，eDAR是用機械閥控制主動分選步驟，此相較於諸如電滲流動或溶膠-凝膠轉化之其他所報告切換機制而言係快速(約2毫秒反應時間)且穩健的。雖然可靠，但該機械閥方案之一些設計因素潛在性地約束eDAR之潛在應用。為了在微流體晶片上形成機械閥，需要3個個別結構層──螺線管、其PDMS線、及於150μm PDMS膜上之微通道。此將會使得微流體晶片之製造變得複雜且耗時。另一個缺點係捕獲之血液等分試樣與機械閥之間之直接接觸，此潛在性地會提高損失或損傷CTC之風險。於本實例中，螺線管改為晶片外模式，其通常係封閉，但可於施加5V DC電壓時在2至3毫秒內打開。因為該線內螺線管不是微流體晶片之一部分，故微流體裝置之製造明顯地簡化。可輕易地將螺線管與任何微通道連接以測試流體動力分選方案。八種不同方案係經設計並測試(圖6)以驅動流體切換。因為此類型螺線管之結構及PDMS之彈性性質，故流體性能可變(表1)，且各方案針對最佳性能進行特徵分析。
於特徵化及最佳化之後，選擇用於eDAR之平台之結構及對應之 流體動力分選方案(圖7)。使用注射泵將經標記的血液樣本注入微流體晶片之頂部通道中(圖7a)。兩個緩衝液流動通過的側通道係用於控制主動分選步驟。存在兩個置於右側通道上之埠，及其等均係連接至加壓緩衝液來源。通常封閉的螺線管係連接至接近分選接面之埠以控制流體動力切換。存在兩個於該分選接面之後的通道。位於左側者係用於收集陽性等分試樣且遞送其等至過濾及收集區域以達成進一步純化(例如，純化腔室)；位於右側者為所有陰性等分試樣流動通過的廢棄物收集通道。
在該等等分試樣係經分級為「陰性」(圖7b)之情況下，無電壓施加在螺線管上，因此其係封閉。最初的壓降係經設定在1號及3號緩衝液來源之間，因此血液僅可流入收集廢棄物之通道中，該廢棄物亦以明視野影像顯示於圖7b中。在經第一偵測窗偵測到陽性事件之情況下，立即對該螺線管施加5V DC電壓以自2號緩衝液儲存槽打開該緩衝液。此減低右側緩衝液通道之流阻且在此處獲得較高流速。血液流動係自右側推送至左側以收集陽性等分試樣(圖7c)。在收集該等分試樣且藉由第二偵測窗獲得證實之後，關閉螺線管以將該血液流動切換回至廢棄物收集通道(圖7d)。每次切換及切換回間所需的時間經測定為2至3毫秒(圖8)。該製程即使在超過105個測試的開-關循環之後亦穩定到足以用於eDAR。線內螺線管係置於緩衝液線上，因此血液不會與該螺線管接觸，此消除血液凝固及交叉污染之可能性。除此之外，於該方案中，於eDAR製程期間，CTC收集通道中有緩衝液恆速流動。此提高接續之純化(例如，純化腔室)步驟之效率及防止形成細胞聚集物。
於本實例之一些態樣中，陽性等分試樣可收集至過濾區域上及使用Isoton以在少於1分鐘內洗滌該過濾區域。細胞質標記可用於二次標記及可包括負載4%多聚甲醛於過濾區域中以固定細胞。Surfynol® 465(Air product，賓夕法尼亞州艾倫鎮)可用於透化經固定的細胞。抗-EpCAM-PE及抗-細胞角蛋白-APC(Abnova，加州核桃市)及抗-CD45-異硫氰酸螢光素(FITC)(BioLegend，加州聖地亞哥)可用於二級標記。Hoechst(Life Technologies，加州卡爾斯巴德)可用作用於驗證有核細胞之核染劑。
純化(例如，純化腔室)機制結構之設計
本實例之又一態樣可包括新穎的可由PDMS製成及可不需要其他層之基於晶片上過濾之微狹縫結構之方案(圖10a)。圖10a顯示該等微狹縫之一個實例之基礎結構，其用於捕獲CTC而不會滯留任何紅血球(RBC)。狹縫之尺寸係經最佳化為5μm高及5μm寬(圖10b)，以避免任何小CTC之損失。許多WBC並非是使用較用於大多數基於過濾之CTC方法中之過濾器小的該尺寸過濾器來捕獲。因為微過濾器係由PDMS製成且與蓋玻片結合，故相較於不完全透明且可產生散射及像差之聚碳酸酯過濾器明顯地改良成像品質(圖10c及10d)。除此之外，因為細胞僅可沿著狹縫陣列被捕集，故可輕易地引用及追蹤該等細胞；於諸多其他方法中，細胞係隨機地分佈在表面上。此種沿著該等狹縫之捕集使得成像程序更為快速及計數之結果更為準確。該等狹縫亦可更為快速且更為有效地於經捕集之CTC上進行二次標記。圖10e顯示兩種經抗-EpCAM-PE標記之癌細胞捕集於微狹縫上。細胞係經固定，透化，及使用抗-細胞角蛋白-Alexa488、抗-Her2-Alexa647及Hoechst標記。螢光影像清楚地顯示這兩種細胞上該等標記之表現，及明視野影像亦可證實其圖譜。兩種細胞亦可經抗-CD45-Alexa700標記作為陰性對照標記，及來自顏色通道之訊號並不對應於該標籤。
eDAR之特徵化及分析性能
即時監測主動分選步驟之效率。圖9顯示來自胰腺癌患者樣本之小部分APD資料。「決策APD跡線」係來自分級等分試樣及控制分選 之第一偵測窗。在978及1298毫秒時之兩個峰值表示兩種經啟動等分試樣分選之抗-EpCAM-PE標記之CTC。「證實APD跡線」之兩個峰值顯示兩種癌細胞流動通過位於收集通道上之第二偵測窗，證實這兩種陽性等分試樣實際上分選。值得指出的是，第二偵測器之背景改變(圖9a)亦證實僅藉由eDAR收集血液之一小部分，造成CTC之高富集率(就典型臨床樣本而言，高達一百萬倍)。
因為經標記之CTC必須自第一偵測窗流至第二偵測窗，故可觀測到決策APD峰值及其證實訊號之間之時間差。該時間差係經定義為分選的CTC之通行時間，該通行時間可改變，此乃因CTC可具有歸因於微通道中層流形式所致之不同線性流速。圖9b顯示於40及80μL/min流速下之通行時間之分佈直方圖。一般而言，較高的血液體積流速導致經分選之CTC之縮短的通行時間(圖9c)。當流速為90μL/min時，平均通行時間縮短至4毫秒，極其地接近分選方案之切換時間(2至3毫秒)，此意指該平均通行時間為設計eDAR之該特定實施例之通過量極限值。於其他實施例中，本發明eDAR設計會導致少於2毫秒之通行時間。
假若經分選之CTC之通行時間短於流體動力切換時間，則細胞可能尚未可靠地分選於該平台上。分選效率因此定義為收集的事件數相對啟動分選之事件總數。圖9d顯示於30至100μL/min流速下之分選效率值。當流速為30μL/min時，分選效率接近100%，此乃因於該流速下之平均越過時間為約10毫秒(圖9c)。該通行時間長到足以實現主動分選步驟以收集CTC。分選效率於80μL/min之流速下減低至90%，且接著在流速為90μL/min時降低至49%。圖9d亦顯示eDAR於不同流速下之回收效率，此藉由相較於分選效率類似的趨勢。然而，回收效率係經定義為於微流體晶片上使用多色螢光成像進行計數之外加入的細胞數相對回收的細胞數。該性能係許多因素之組合，包括抗體-標記 效率、線性-共焦偵測效率及分選效率。此點解釋於相同流速下回收及分選效率間的差異。結果，就此eDAR之目前產生而言，通過量之上限為80μL/min(對於1mL血液，12.5分鐘)與88%回收率。雖然就全血之分析而言該通過量較大多數CTC技術高，但該通過量可藉由設計較寬的血液輸入通道或將第一偵測光束向上移得更遠些來進一步改善。
外加3個至975個MCF-7細胞至1mL健康血液中以分析於50μL/min流速下之回收效率。為確保下端細胞數之準確度，在濃度低於100個細胞/mL時利用毛細管計數方法以精確地外加培養細胞。平均回收率為95%，其中R2值為0.998(圖9e)，此略高於第一代eDAR(93%)。因為CTC之濃度通常極低，故計數結果會受到泊松分佈(Poisson distribution)影響。於此情況中，以可接受之通過量及回收率分析較大體積之全血樣本之能力極為重要。外加相同數目之MCF-7細胞至1、5及10mL健康血液中，且接著於50μL/min之流速下分析這三種樣本。其回收率沒有顯著改變(圖9f)，此顯示該方法可以高效率及通過量地操作大量全血。
雖然EpCAM可在大多數CTC研究中用於篩選腫瘤細胞，但越來越多的研究已報告具有低EpCAM表現之CTC具有較多間質特徵且更具侵犯性。最新的eDAR平台足夠地自由以利用任何標記方案來使用除EpCAM外之生物標記篩選會捕獲腫瘤細胞之罕見細胞。三種方案係經設計以篩選不同的培養乳癌細胞株(圖9g)。EpCAM係用於篩選MCF-7細胞，Her-2係用於篩選SKBr-3細胞，及EGFR係用於篩選MDA-MB-231細胞。所有這三種方案以高於88%之回收率地單離及捕集標靶細胞。eDAR之另一種獨特且重要的特徵在於與標記所在的位置無關。例如，在諸如表面捕獲方法或免疫磁性方法之其他技術中，僅可捕獲位於細胞表面上之抗原。本發明方法可篩選具有諸如GFP之 細胞內標記之細胞(圖9d)。外加至人全血中之MDA-MB-231-GFP細胞之回收率為91%(圖9g)。由於動物模型中廣泛地使用螢光蛋白以研究轉移之進展及機轉，故eDAR為無需任何免疫染色步驟篩選該等模型中之CTC之理想工具。
取自罹患胰腺癌之患者之樣本之高通過量分析
使用取自15位健康施體之血液樣本以評估該方法之假陽性率；於其中均未發現CTC。自罹患胰腺癌之患者採集26種血液樣本。使用第一代eDAR來分析其中的十六種及使用最新的eDAR平台來分析其他10種樣本。圖25顯示三個資料組之分佈：藉由本發明方法分析對照樣本，藉由第一代eDAR分析胰腺癌樣本，及藉由本發明方法分析胰腺癌樣本。該等臨床樣本之原始資料示於表3(下方)中。
Figure 103123208-A0305-02-0096-6
Figure 103123208-A0305-02-0097-8
利用該方法，在範圍自2至872個細胞/mL之樣本之80%(10種樣本中有8種)中偵測到CTC。亦在患者血液樣本中觀測到以往研究所報告的CTC叢。有趣地指出實驗中觀測到的該等叢中許多具有低EpCAM表現。圖26顯示具有高細胞角蛋白表現但低EpCAM表現之CTC之叢。
實例2
藉由順序免疫染色及光漂白成像所捕獲之罕見細胞中之多種生物標記
於本實例中，揭示一種用於順序免疫染色及光漂白製程之較佳方案。於一個較佳的實例中，線內染色及洗滌系統係與eDAR耦合以使死體積最小化；減少所使用抗體的量；避免氣泡之引入；及使該製程自動化。
本實例描述一種進行捕集之CTC上之蛋白質標記之表現分析之最佳化、簡單且半自動化方法。線內免疫染色及光漂白系統可容許於所選CTC上之標記及螢光成像。該方法可包括藉由與不同螢光團結合的抗體群組標記CTC接著光漂白及藉由抗另一個生物標記群組之不同螢光抗體再標記。可重複該製程多次以研究若干個蛋白質生物標記群組。於一種例示性情況中，兩種所述蛋白質標記可與陽性對照標記(例如，核染劑)及陰性對照標記(例如，CD45)組合以建立一個群組。可在每回中研究一個群組，接著在第二回之前光漂白(例如，四回免疫染色及光漂白)以查看所關注蛋白質標記之表現。
微流體組成及線共焦光學器件
使用先前已述的方法來製造聚二甲基矽氧烷(PDMS)微流體晶片。簡言之，使用AutoCAD(AutoDesk，加州聖瑞菲爾市)來設計特徵，且接著藉由細線成像(Fineline Imaging)(Colorado Springs,CO)寫於透明木板上。使用SU-8-3050(Micro-Chem Corp.，馬薩諸塞州牛頓市)作為負光阻劑於矽晶圓上製造微特徵；特徵高度係控制為50μm。一旦顯影該等特徵，將未固化PDMS澆注至矽母板上，於75℃下培養2小時，剝離且接著利用電漿氧化法結合至蓋玻片。
線共焦偵測方案係使用兩種雷射源488及633nm，使用一系列二向色鏡、圓柱形透鏡及光束分離器，以形成兩個偵測窗。同時具有兩種重疊的雷射光束之第一偵測窗係用於偵測經標記的CTC之螢光訊號，且接著自動化地控制分選。第二偵測窗係用於證實經分選的等分試樣並監測分選效率。
生物材料及eDAR製程
除非另作指明，否則使用Isoton(Beckman Coulter Inc.，加州奇諾市)作為用於所有實驗之緩衝液。乳癌細胞株MCF-7、SKBr-3及MDA-MB-231(美國菌種培養物保存中心(ATCC)，維吉尼亞州馬納薩斯)係用於特徵分析該系統。在供應商推薦的條件下進行細胞培養，及每週收穫一次。將MCF-7培養於依格最低必需培養基(EMEM)中；將SKBr-3細胞培養於麥考伊氏5中；及將MDA-MB-231培養於杜貝卡氏改良依格培養基(DMEM)(ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯)中。所有培養基亦包含2mM L-麩醯胺酸、10%胎牛血清(FBS)(ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯)、及50μg/mL青黴素/鏈黴素。自健康施體抽取的人全血係購自國際血漿實驗室(華盛頓州埃弗雷特)及一經獲得立刻儲存在4℃。抽取每20mL分在四個塗佈EDTA作為抗凝血劑之5mL真空採血管中。每次抽取的第一個管做棄置處理以避免來自皮膚細胞之可能的污染。
於14,000rpm下使抗體離心5分鐘以在任何標記程序之前移除可能的聚集物。在黑暗中利用與藻紅素(PE)(Abnova，台灣台北市)結合的抗-上皮細胞黏著分子(EpCAM)標記各血液樣本及在室溫下培養30min。經標記的血液樣本經洗滌並離心(2,300rpm，10min)以移除游離抗體。立即使用注射泵將該等樣本注入微流體晶片中。典型地，對於eDAR之操作，流速設為50μL/min，然而，根據以往的最佳化方法，其可為更高。藉由PCI資料獲取卡片(PCI 6602，National Instruments，德克薩斯州奧斯汀)收集APD訊號跡線及藉由內部開發的MATLAB(MathWorks，馬薩諸塞州納提克)指令檔進行分析。家庭建立之電子盒係經程式化以基於基於偵測到的APD訊號來提供自動反饋控制，及對連接至微流體晶片之螺線管施加電壓(S-10-38-H-40，磁性感測器系統，加州凡奈斯)。先前已描述關於eDAR之更多細節。
順序免疫染色及光漂白製程
於洗滌藉由eDAR單離的細胞之後，藉由關閉線內閥封閉主要、側及廢棄物通道。藉由蠕動泵(Fisher Scientific，賓夕法尼亞州匹茲堡)於15μL/min流速下將細胞固定緩衝液(BioLegend，加州聖地亞哥)之400μL等分試樣引入微流體晶片中。於相同流速下利用緩衝液洗滌5分鐘之後，藉由使250μL 2.5% surfynol 465表面活性劑(Air Products and Chemicals Inc，賓夕法尼亞州艾倫鎮)流動通過將該等細胞透化處理15min。於該步驟之後，進行四回細胞免疫染色及光漂白。對於每回染色而言，製造220μL之具有與四種不同螢光染料結合的四種生物標記之染色溶液。關於用於每回中之抗體及核染劑之詳細內容概述於表2中。於移除聚集物之離心步驟(14,000rpm，5min)之後，收集200μL上清液作為染色緩衝液。於20μL/min流速下將該上清液注入至微流體晶片中。在當抗體溶液填充整個過濾區域時，停止該流動。在黑暗中進行培養20分鐘以確保所有捕集的細胞有效地接觸抗體。於該步驟之後，將該等細胞洗滌10分鐘以移除任何游離的抗體及使螢光背景最小化。光漂白係使用氙弧燈作為光源(Sutter instrument，加州諾瓦托)來進行。每漂白步驟耗時15min。20X物鏡係用於落射螢光成像及光漂白。在光漂白步驟之前及之後自4個不同發射通道收集螢光成像：黃色(針對PE而言，555至605nm)、藍色(針對Hoechst而言，435至485nm)、綠色(針對FITC或Alexa 488而言，510至540nm)及紅色(針對Alexa 647或APC而言，665至695nm)。
關於光漂白製程之安全性考量
為確保操作光漂白測試時之安全性，將最高功率鎖定為10mW。在樣本曝露於光源之情況下應考慮某些保護方法，諸如穿戴護目鏡或以黑色盒覆蓋光漂白區域。
藉由eDAR單離的CTC
利用與螢光團結合的抗體預標記全血樣本且接著引入至微流體 晶片。於許多應用中，EpCAM係用作用於陽性篩選之生物標記。然而，該方法可能在使用不同或更為複雜的篩選邏輯方面具有自由度。
於eDAR中，首先藉由雷射偵測光束、體積流速、及分選速度之組合來界定虛擬等分試樣。基於該等因素，經標記的血液樣本實質上分為500,000個等分試樣(每1mL分成每個等分試樣2nL)。線共焦偵測方法係偵測具有單分析物敏感性之螢光發射。結果，該等虛擬等分試樣係基於一級標記方案分級為「陽性」或「陰性」。歸因於極低的CTC濃度所致，大於99.999%之該等等分試樣做棄置處理(圖10A)，此會導致大於1百萬倍的富集率。
基於等分試樣分級之結果，應用自動反饋機制結構以啟動血液流動之流體動力切換使得可收集「陽性」等分試樣並將其轉移至用於進一步純化(例如，純化腔室)及分析之區域。兩個設計元件控制該流體動力切換──螺線管及兩個側緩衝液線之間之壓降。螺線管係呈封閉位置置於左側CTC收集通道中(圖4A)，因此「陰性」等分試樣僅流入右側廢棄物通道。在兩個緩衝液流動的側通道之間亦存在壓降，此會在螺線管打開時將血液流動自廢棄物通道切換至收集側。該簡單方案快速到足以在2至3毫秒收集具有最少量血液細胞之CTC。第二線共焦偵測窗亦置於該收集側以即時監測流體動力切換之效率。圖4B顯示自肺癌患者採集的樣本之資料之一小部分。於該圖中，綠色訊號顯示來自控制等分試樣分選之第一偵測區域之APD跡線；紅色訊號為來自證實等分試樣實際上經分選之第二偵測區域之APD計數。
該等經分選的等分試樣轉移至可捕集CTC及大多數血液細胞棄置處理之區域(圖4A)。雖然有許多種可能的方法可進一步地純化捕獲之細胞，但將小件的聚碳酸酯過濾器(5×5μm孔徑)併入至微流體晶片中。捕集的細胞經成像及進一步藉由微流體晶片上之多種生物標記標記以確定其同一性。例如，圖26a及圖26b顯示捕集於微流體晶片上之 癌細胞，該癌細胞係抗EpCAM、細胞角蛋白、及核染劑陽性然抗CD45陰性。亦可藉由提供形態資訊之明視野顯微鏡觀察到該細胞。
順序免疫染色及光漂白
開發線內染色及洗滌系統及與eDAR耦合以使死體積最小化；減少所使用抗體的量；避免氣泡之引入；及使該製程自動化。如圖13A中所顯示，微流體晶片上之兩個埠保持打開以進行灌注標記及洗滌步驟而所有其他三個埠完全封閉。蠕動泵遞送洗滌緩衝液及標記試劑至微流體晶片及經六向閥與加壓緩衝液來源耦合。該閥上之其他三個埠完全地阻斷以防止任何可能的洩露或污染。當在操作eDAR實驗時，將六向閥轉至加壓緩衝液側以提供流體動力切換之穩定控制。將六向閥轉至蠕動泵側以將準確量的試劑注入至微流體晶片而不引入任何氣泡。使用該方案，在少於5min內將數毫微克之抗體引入至捕集的細胞；典型培養步驟耗時少於20分鐘(圖13B)。
假若需要進行細胞內標記測試，則在測試之前於微流體晶片上將捕獲的細胞固定並進行透化。接著，連續地進行多回染色、洗滌、成像及漂白實驗。於每回中，監測到四種螢光顏色，即，黃色(PE)、紅色(Alexa 647或APC)、綠色(FITC)、及藍色(核染劑)。
就本研究之該部分而言，基於四回順序免疫染色及光漂白製程來設計針對於捕集之CTC上蛋白質標記之表現之分析。使用落射螢光顯微鏡來監測每回中通過四個個別通道的四種不同標記。各組標記具有作為陽性對照標記之核染劑(Hoechst)、作為陰性對照標記之與FITC結合的CD45、及兩種與PE或Alexa 647結合的蛋白質標記。將該系統設計成不漂白Hoechst染色劑，基於兩個原因：染色劑係用為陽性對照標記，及其將需要UV曝露以漂白染色劑，此會導致顯著細胞損傷。CD45廣泛地於許多種類型之白血球(WBC)上表現，此被視為最大程度地干擾CTC之分離。因此，其等通常係用為陰性對照標記。
可於CTC上測試許多種蛋白質標記，但作為概念之證據，篩選八種抗原及將其分為四組(表2)。第一組具有EpCAM及細胞角蛋白，其為識別CTC之最廣泛使用的標記。在藉由eDAR捕獲CTC之後立刻應用免疫染色測試組以進一步證實及計數具有上皮生物標記之CTC。表2顯示在微流體晶片上捕集有六種腫瘤細胞，其相對Hoechst染色劑陽性但相對CD45陰性。其中兩種具有高EpCAM及細胞角蛋白表現，此意指該等細胞具有上皮特徵。
第二組係經設計以研究對於臨床及生物研究具重要性之其他上皮標記。選擇Her2及MUC1作為該組之兩種蛋白質標記，此乃因這兩種生物標記在癌症病理及藥物抗性中扮演重要角色。其等亦為抗腫瘤藥物及免疫治療之有潛力標靶。圖14中之第二回標記顯示捕集於微流體晶片上之細胞部分具有MUC1表現，但所有其等在其Her2表現中實際上低。
已顯示癌幹細胞在腫瘤進展中扮演重要角色及已在CTC群體中觀測到。第三組標記具有兩種癌幹細胞抗原，即CD44及CD24。其等經廣泛研究作為用於乳癌及亦可能用於其他類型癌症之幹細胞標記。表2中之資料顯示4種細胞具有高CD44+/CD24-表現，及其他兩種為CD44-/CD24+。諸如CD133及CD105之其他幹細胞標記亦可基於原發性癌症之類型而被用於該組中。
表2中之最後一組標記係經設計以查看EGFR及CD166之表現以證實腫瘤細胞之間質特徵。已證明EGFR與EMT製程相關聯，及CD166係用於界定骨髓中之間質幹細胞。其他相關標記諸如波形蛋白及鈣黏素亦可用於該組中。
光漂白之特徵化
有兩種可決定光漂白步驟之效率的關鍵因素──曝露功率及時間，其經特徵化及最佳化以提高效率及通過量同時確保細胞不會因電 位加熱而受到損傷。首先研究於不同曝露功率下之光漂白曲線(圖15A)。利用抗-EpCAM-PE標記MCF-7細胞，及置於2號蓋玻片上。利用三種不同功率設定來漂白經標記的單細胞。漂白曲線顯示曝露時間可控制在10分鐘以內，在曝露功率高於2mW之情況下達成大於95%漂白效率。
基於此點，四種螢光團PE、FITC、Alexa 488及Alexa 647之任何漂白曲線可直接應用於該方案中。圖15B顯示PE、FITC及Alexa 488之螢光發射可經漂白以在少於5min內達成小於10%；Alexa 647之光漂白時間較長，部分係因為光源在610至660nm(紅光激發)之間之功率低於在黃光及綠光激發範圍內之功率。因此，漂白時間設為15分鐘以獲得以可接受通過量之高漂白效率。此可藉由提高光源之功率來改善，然而，此可能會潛在性地提高加熱及細胞損傷之風險。
實例3
順序免疫染色及成像之單分析物捕集
本實例描述與順序免疫染色及成像方法結合之單分析物捕集設備。
相關尺寸涉及有效串行流阻捕集阱設計、及具有任何捕集密度及尺寸之裝置之示意圖(圖17)，其中顯示放大區域之插圖描繪於圖18中。於圖18A中之示意圖顯示裝置之相對尺寸，諸如，主要通道之寬度、收縮部之寬度、自主要通道收縮部入口至主要通道收縮部出口之長度、跨收縮部之長度、及主要通道、收縮部、及收縮部腔室之高度。圖18C顯示使用串行流阻捕集阱之例示性微流體裝置設計。該設計包括引入樣本的入口(左側)及移去過量液相的出口(右側)。裝置設計之中央繪示所併入之高密度流阻捕集阱。圖18B顯示圖18C之放大區域且顯示構成裝置之功能性部件之流阻捕集阱。
圖19描繪平行流阻捕集阱。圖19之上圖繪示裝置中孔之三維橫 截面側視圖，顯示孔及收縮部之形狀變化。孔設計可呈諸如圓柱形、錐形、正方形、六邊形、圓頂形狀等等之形狀之不同或類似組合。孔之尺寸可由h1=孔深度、h2=收縮部深度、r1=孔半徑、及r2=收縮部半徑界定。根據該態樣，該裝置可自溶液捕集單顆粒/細胞(諸如珠粒、細胞等等)。多個孔可成平行配置以形成該裝置。
圖20為用於建立一些本發明所述裝置之程序之示意性描繪。於該製程中，固體基板(例如，矽晶圓)係經光阻劑旋塗。將經塗佈之基板放置成硬接觸壓印描繪於UV-透明及不透光區域中之所欲設計之微影光罩。將該光罩及基板曝露於UV-光，此可引發光阻劑中之光化學交聯反應。所製得裝置之第一層係藉由顯影所得交聯圖案，溶解除去光阻劑之非交聯部分來獲得。該製法之第二層係繼續地藉由塗佈、曝露、及顯影第二層光阻劑來進行。結果為用於在可固化材料(例如，PDMS)或可模壓材料中形成通道、腔室、及孔結構之模具。例如，將該模具置於盤中。接著，將PDMS澆注於該模具之上並固化。然後，使PDMS自該模具脫模(剝離)，及於此時間點，穿孔獲得入口及出口(未繪示)。最後，圖案化PDMS係相對平坦玻璃或PDMS片密封以封閉該等通道及腔室/孔。
圖21顯示用於製造平行流阻捕集阱之微製造方法之一個實例。該裝置係以除上述光阻劑(例如，SU-8)外之材料來製造。可用的材料可包括(但不限於)聚合材料、光阻劑、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚胺基甲酸甲酯(PUMA)等等。(1)可於矽(Si)晶圓上旋塗犧牲層。(2)光阻劑(SU-8)可沉積於頂部。(3)對準具有微陣列圖案之光罩，及將該晶圓曝露於UV。(4)未交聯的光阻劑係經處理並移除，從而在矽晶圓上留下所欲圖案。於一個態樣中使用2-層設計。於此情況中，旋塗第二光阻劑層並進行處理。(5)使SU-8層自該Si晶圓脫模及係經組裝至(僅路徑1)多孔聚碳酸酯過濾器及/或(路徑1- 2)具有插入管件用之單一出口之PDMS安裝件上。
圖22繪示串行流阻捕集阱及平行流阻捕集阱發揮作用以收集、離散、及讀取生物衍生樣本之一組步驟。部分A顯示樣本可如何串行地填充界定的位置。該製程發生在樣本之關鍵尺寸(直徑)小於主要通道之高度及寬度、及大於收縮部之高度或寬度之情況下。流阻之間之差異致使樣本進入界定的區域，因此該收縮部閉塞及流動停止。隨後的樣本沿著流動路徑流動通過主要通道到達下一個捕集位置直到填滿所有捕集阱。部分B顯示不可混溶液相可如何通過樣本入口引入，且串行地離散化所捕集的樣本。該不可混溶液體將不流入樣本區域，此乃因歸因於閉塞的限制件、及因不可混溶相與通道材料之間的不同接觸角而建立的界面障壁及捕集區域之尺寸所致之流體流動之缺乏。部分C證實如何偵測離散化樣本之可變化學性質。由於串行填充性質的結果，關於各樣本之時間資訊亦實質上係在各位置中進行物理編碼。部分D繪示樣本填充平行流阻捕集阱之第一步驟。樣本顆粒自裝置頂部流動進入界定的捕集孔。歸因於設計之平行性質所致，可同時地捕集多個樣本以達成相較本文提出的某些其他捕集方案更快速的樣本收集。部分E顯示如何在捕集孔平面上方及下方置換不可混溶相，藉此產生離散化樣本。部分F呈現如何同時地偵測具可變化學性質之樣本。
圖23顯示基於明視野顯微鏡及螢光顯微鏡之微孔及側腔室陣列之偵測及讀取方案。將樣本置於由電腦程式控制的自動化轉譯載台。藉由高速CCD攝影機獲得影像。
圖24繪示基於分析及釋放而捕集生物顆粒/細胞陣列之順序。(1)自管件施加流動以利於流體流動通過捕集阱。流體中之獨立式顆粒/細胞遵循該流動模式進入開孔中。(2)一旦捕集，於該局部區域中之流動停止。(3)使用溶液以沖洗除去過量的流體及顆粒/細胞。該裝置 容許在該顆粒/細胞上進行隨後的分析，諸如，重複的螢光成像、漂白、及分析循環。於完成分析後，(4)逆轉管件中的流動以釋放顆粒。
實例4
雙重捕獲eDAR
本實例描述根據本發明之一個態樣之eDAR之「雙重捕獲」變型。雙重捕獲eDAR可同時地在相同微流體裝置上自相同入血液樣本分離CTC之兩種不同子群體。這兩種子群體可分開地分別以高回收率及高純度地捕集於微流體晶片上之兩個不同區域上。
圖11顯示微流體裝置之一般結構。利用與不同螢光標籤結合的兩種抗體類型預標記血液樣本。例如，利用上皮標記(諸如，與PE結合的抗-EpCAM)、及間質標記(諸如，與另一種相較於PE具有不同發射波長之螢光團諸如FITC結合的抗-EGFR或抗-波形蛋白)標記血液樣本。將經標記的血樣注入至微流體晶片中，可使用在黃色通道中具有峰值之線共焦方案來偵測具有EpCAM表現之CTC，且接著啟動主動分選事件以將該等分試樣收集至收集通道#1中。類似地，假若等分試樣經分級為相對間質標記陽性，則其會分選至收集通道#2。這兩個子群組則分開地捕集並富集於微流體晶片上。在用於第二代eDAR中之微狹縫之相同設計上建立過濾區域。
可如下概述流體切換方案。在等分試樣經分級為相對所應用的任何標記為陰性之情況下，則圖11中之兩個螺線管封閉。假若於兩個側通道上之壓力達成平衡，則血液會流至用於收集廢棄物之底部中央通道。在等分試樣係經分級為僅相對上皮標記為陽性之情況下，螺線管#2立即打開，因此將血液流動推送至左側收集通道(圖12B)。於收集等分試樣之後，再次封閉螺線管#2，因此將血液流動切換回至中央。在等分試樣係經分級為僅相對上皮標記為陽性之情況下，螺線管 #1立即打開，因此將血液流動推送至右側(圖12C)。eDAR分選事件之兩種類型之反應時間分別為約2至3毫秒。
圖11顯示「雙重捕獲」eDAR之一般結構。經標記的血液係引入至頂部主要通道中。緩衝液流入兩個側通道中，以使用兩個螺線管來控制血液流動之流體動力切換。CTC之兩個子群體係經分離並且捕集於相同微流體晶片上之兩個不同過濾區域上。
圖12描繪血液流動之三種狀態之明視野影像。A)血液流動進入廢棄物收集通道中，此乃因等分試樣經分級為相對任何一種標記為陰性。B)血液經切換至收集通道#1，及CTC之第一子群體轉移至其中。C)血液經切換至收集通道#2，及CTC之第二子群體轉移至其中。
其他態樣
本文中描述用於分析顆粒，特別是流體樣本之等分試樣中之顆粒的方法及設備，其中該等顆粒為分析物及該等分析物為細胞，該等方法及設備之目的在於(1)於流體中識別存於分析物上之複數種標記，特定言之藉由使用針對於分析物上至少每一種標記之標籤及在消除由各種標籤發射之訊號之前偵測由各種標籤發射之訊號及重複偵測及減弱訊號之製程來識別，(2)自包含細胞之第一及第二亞型之混合物之樣本單離細胞，特定言之藉由引入樣本至包含至少一個與該組管件及與至少一個腔室流體連接之通道之微流體晶片來單離，(3)自流體樣本分配表現特異性生物標記圖譜之細胞，特定言之使用包括一組連接至具有至少一個通道之微流體晶片之管件之設備來分配，(4)識別存於分析物上之複數種標記，特定言之藉由使用包含複數個微腔或微貼片之基板以裝納不多於一種分析物於各微腔或微貼片來分配複數種分析物來識別，(5)偵測流體樣本中之顆粒，特定言之使用具有至少一個樣本輸入通道、至少一個定向流動通道、及至少兩個輸出通道之微流體晶片、及位於不為微流體之一部分之裝置上之電致動閥來偵 測，(6)於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣，特定言之藉由基於罕見顆粒之存在或不存在來賦值給等分試樣及依據該指示之數值，藉由打開位於在微流體晶片之外部之裝置上之電致動閥來引導該等分試樣之流動來單離；及(7)使用具有至少兩個輸出通道之裝置偵測流體樣本中之罕見顆粒，特定言之藉由使這兩個輸出通道中至少一者與微孔陣列流體連接，及使用該裝置以分選該一或多種罕見顆粒來偵測。
於一些態樣中，本揭示案提供於流體中識別存於分析物上複數種標記的方法，其中該方法包括：(a)使用輻射源偵測來自第一標籤之訊號，其中該第一訊號係附著至與分析物上之第一標記結合之第一結構；(b)基於該第一標籤之存在來分配該分析物；減低該第一標籤之訊號之強度；(c)使該分析物與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係附著至第二標籤；及(d)偵測該第二標籤。於該等態樣之一些實施例中，該第一標籤之訊號減低超過50%。於一些態樣中，步驟(a)之分配係基於第一標籤及第三標籤之存在。於一些態樣中，步驟(a)之分配係利用微流體裝置來進行。於一些態樣中，步驟(a)之分配及步驟(b)之偵測發生在相同微流體裝置中。於一些態樣中，該分析物為細胞。於一些態樣中，該細胞為癌細胞。於一些態樣中，該癌細胞為罕見細胞。於一些態樣中，該分析物為循環腫瘤細胞。於一些態樣中，該細胞為免疫細胞、胎兒細胞、指示治療後殘留疾病之細胞、或幹細胞。於一些態樣中，該流體係選自由以下組成之群：全血、血液分離物、血清、血漿、汗液、淚液、耳流液、痰、淋巴、骨髓懸浮液、尿液、唾液、精液、陰道流液、糞、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水、母乳、玻璃體液、眼房液、皮脂、內淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液體、及呼吸道、腸道及泌尿生殖道之分泌物。於一些態樣中，該流體為全血。於一些態樣中，該 流體為全血分離物。於一些態樣中，該第一標籤為抗體。於一些態樣中，該第一標籤為螢光團。於一些態樣中，該第一標籤為由核酸組成之探針。於一些態樣中，步驟(c)中之訊號之減弱係藉由對該分析物施用輻射達成。於一些態樣中，該輻射為白光。於一些態樣中，步驟(c)中之訊號之減弱係藉由塗佈化學品至該第一標籤達成。於一些態樣中，該化學品為還原劑。於一些態樣中，該還原劑為二硫蘇糖醇。於一些態樣中，該輻射係使用雷射來施加。於一些態樣中，該輻射係使用發光二極體(LED)來施加。
於一些態樣中，該方法可進一步包括成像來自第一標籤及第二標籤之訊號。於一些態樣中，該分析物係存於流體中，及該流體為較大體積之流體之等分試樣。於一些態樣中，分配係半自動或自動地進行。於一些態樣中，分配係藉由總體決策等分試樣分級來進行。於一些態樣中，各標記為生物標記。於一些態樣中，該複數種生物標記之特徵係表現圖譜。
於一些態樣中，該方法進一步包括使分析物與緩衝液接觸。於一些態樣中，該緩衝液包含固定劑。於一些態樣中，該緩衝液包含透化劑。於一些態樣中，該緩衝液為洗滌緩衝液。於一些態樣中，並不使用流式細胞儀來分配分析物。於一些態樣中，在進行步驟a中之偵測時，該分析物並非是與組織中其他細胞連接之細胞。
本文中描述用於自細胞樣本單離細胞之方法及組合物，於一些態樣中，自可包含第一細胞亞型及第二細胞亞型之細胞樣本單離細胞之方法可進一步包括：(a)經一組管件將樣本引入至微流體晶片中，其中該微流體晶片包括：(i)至少一個與該組管件流體連接之通道；(ii)經組態以偵測該至少一個通道中細胞之訊號之偵測器；及(iii)至少一個與該至少一個通道流體連接之腔室；(b)該細胞樣本之一部分流經該偵測器；(c)使用該偵測器以偵測該細胞樣本中之一部分中該第 一細胞亞型之存在或不存在；(d)假若於該細胞樣本之該部分中偵測到該第一細胞亞型，則引導該細胞樣本之等分試樣至該腔室中，其中該等分試樣包含該第一細胞亞型；及，(e)重複步驟(b)至(d)，藉此單離該腔室中之多種等分試樣，使得該腔室包含該樣本中第一細胞亞型總數之80%以上及該樣本中第二細胞亞型總數之5%以下。
於一些態樣中，本文中提供自衍生自流體之樣本分配表現特異性生物標記圖譜之細胞之設備，其中：該設備包括一組連接至具有至少一個通道及腔室之微流體晶片之管件；及該設備可單離該腔室中之細胞，其中於單離後，該腔室包含該表現特異性生物標記圖譜之樣本中細胞總群體之80%以上，及其中於單離後，該腔室包含表現不同生物標記圖譜之樣本中細胞總群體之5%以下。於一些態樣中，表現特異性生物標記圖譜之細胞之單離過程少於20分鐘內。於一些態樣中，該特異性生物標記圖譜係存於流體樣本中小於5%之細胞。於一些態樣中，該流體為血液。於一些態樣中，該流體為全血分離物。於一些態樣中，該流體為全血之有核細胞部分。
於一些態樣中，本文中提供用於識別存於分析物上之複數種標記的方法，其中該方法包括：(a)藉由使分析物流動於包含複數個微腔或微貼片之基板之上來分配複數種分析物，其中大多數微腔或微貼片可裝納不多於一種分析物及其中該等微腔或微貼片係位於微流體裝置中；(b)在該等微腔或微貼片中，使各分析物與可與第一標記結合之第一結構接觸，其中該第一結構係連接至第一標籤；(c)偵測來自該第一標籤之訊號；減低該第一標籤之訊號之強度；(d)使該分析物與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係連接至第二標籤；及(e)偵測該第二標籤。於一些態樣中，該第一標籤之訊號減低超過50%。於一些態樣中，步驟b之接觸係藉由使包含該第一結構之流體流動通過與該等微腔或微貼片流體連通之通道來實現。於一些態 樣中，於步驟(b)之接觸步驟之後，該方法進一步包括：使該分析物與洗滌緩衝液接觸。於一些態樣中，該等分析物為細胞。於一些態樣中，該等分析物係藉由由流體流動產生的力、重力、或黏著力固持在微腔中之固定位置。於一些態樣中，各分析物係藉由分子相互作用連接至微腔或微貼片。於一些態樣中，各分析物係藉由非共價鍵結連接至微腔。於一些態樣中，該非共價鍵結為凡得瓦相互作用、靜電鍵結、疏水性鍵結或非特異性吸附。
於一些態樣中，本文中提供用於偵測流體樣本中之顆粒之裝置，該裝置包括：包括至少一個樣本輸入通道、至少一個定向流動通道、及至少兩個輸出通道之微流體晶片，其中該至少一個定向流動通道係與該樣本輸入通道交叉；位於不為該微流體晶片之一部分之裝置上之電致動閥，其中該電致動閥係藉由控制與至少一個定向流動通道或該至少兩個輸出通道中之至少一者交叉之輸入通道來控制流體之流動；至少一個可偵測該流體樣本之等分試樣中之一或多種分析物之偵測器；及可基於該等分試樣中分析物之存在、不存在、同一性、組成、或量而為該等分試樣指示一個數值之數位處理器，其中該數位處理器係與該偵測器及該電致動閥連通。於一些態樣中，該電致動閥為螺線管閥。於一些態樣中，該電致動閥控制液體在至少一個定向流動通道中之流動。於一些態樣中，該電致動閥通常係封閉及其中該電致動閥在接收到來自電腦之訊號之後打開。於一些態樣中，該電致動閥通常係打開及其中該電致動閥在接收到來自電腦之訊號之後封閉。於一些態樣中，該至少一個定向流動通道包括至少兩個埠及其中該電致動閥係藉由這兩個埠中之一個埠來控制流體之流動。於一些態樣中，該裝置包括第二偵測器。於一些態樣中，該等輸出通道中之至少一者係流體連接至過濾器。於一些態樣中，該電致動閥直接控制液體在至少一個定向流動通道中之流動。於一些態樣中，該電致動閥直接控制 通道中之液體饋送至至少一個定向流動通道中之流動。於一些態樣中，該電致動閥直接控制液體在僅一個定向流動通道中之流動。於一些態樣中，該電致動閥直接控制液體在該至少兩個輸出通道中一者中之流動。於一些態樣中，該電致動閥直接控制通道中之液體饋送至該至少兩個輸出通道中一者中之流動。於一些態樣中，該至少一個定向流動通道係與該至少兩個輸出通道在一或多個接合處交叉。於一些態樣中，該裝置包括偵測器。於一些態樣中，該裝置包括證實性雷射。於一些態樣中，該偵測器係位於至少一個非輸出通道之通道上。於一些態樣中，該證實性雷射係位於至少一個非輸入通道之通道上。於一些態樣中，該電致動閥為壓電閥。
於一些態樣中，本文中提供於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣的方法，其中該等分試樣包含罕見顆粒，該方法包括以下步驟：偵測等分試樣中之罕見顆粒之存在或不存在；基於該罕見顆粒之存在或不存在而為該等分試樣指示一個數值；及依據該指示之數值，藉由打開電致動閥來引導該等分試樣之流動，其中該電致動閥係位於在微流體晶片之外部之裝置上。於一些態樣中，該微流體晶片包括樣本輸入通道、至少兩個輸出通道、及至少一個定向流動通道，及其中該電致動閥控制流體於該定向流動通道中之流動。
於一些態樣中，本文中提供用於偵測流體樣本中之罕見顆粒之裝置，該裝置包括：至少第一樣本輸入通道；至少兩個輸出通道，其中該兩個輸出通道中至少一者係與微孔陣列流體連接；至少一個可偵測流體樣本之等分試樣中之一或多種罕見顆粒之偵測器；及藉由引導包含該一或多種罕見顆粒之等分試樣流動通過第一輸出通道來分選該一或多種罕見顆粒之機制結構。於一些態樣中，假若該等分試樣不包含罕見顆粒，該機制結構引導該等等分試樣流動進入第二輸出通道中。於一些態樣中，該孔陣列配置在該第一樣本輸入通道及該至少兩 個輸出通道之間。於一些態樣中，該孔陣列係在與該第一樣本輸入通道及該等輸出通道相同的平面中。於一些態樣中，該孔陣列之組態使得該等罕見顆粒不可通過該等孔但至少一種其他顆粒可通過該等孔。於一些態樣中，該孔陣列包括多於1000個孔。於一些態樣中，該用於分選罕見顆粒之機制結構包括電極、磁性元件、聲學元件、或電致動閥。於一些態樣中，該偵測器係選自由以下組成之群：攝影機、電子倍增器、電荷耦合裝置(CCD)影像感測器、光電倍增管(PMT)、雪崩光電二極體(APD)、單光子雪崩二極體(SPAD)、矽光電倍增器(SiPM)、及互補金屬氧化物半導體(CMOS)影像感測器。
於各種態樣中，提供於流體中識別存於分析物上複數種標記的方法，其中該等方法包括：(a)使用輻射源來偵測來自第一標籤之訊號，其中該第一標籤係附著至與該分析物上該第一標記結合之第一結構；(b)基於該第一標籤之存在來分配該分析物；(c)減低該第一標籤之訊號之強度；(d)使該分析物與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係附著至第二標籤；及(e)偵測該第二標籤。
於一些態樣中，該第一標籤之訊號減低超過50%。於其他態樣中，步驟(a)之分配係基於第一標籤及第三標籤之存在。於其他態樣中，步驟(a)之分配係藉由微流體裝置來進行。又於其他態樣中，步驟(a)之分配及步驟(b)之偵測係在相同微流體裝置中發生。於一些態樣中，該分析物為細胞。於其他態樣中，該細胞為癌細胞。於其他態樣中，該癌細胞為罕見細胞。又於其他態樣中，該分析物為循環腫瘤細胞。於一些態樣中，該細胞為免疫細胞、胎兒細胞、指示治療後殘留疾病之細胞、或幹細胞。於其他態樣中，該流體係選自由以下組成之群：全血、血液分離物、血清、血漿、汗液、淚液、耳流液、痰、淋巴、骨髓懸浮液、尿液、唾液、精液、陰道流液、糞、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水、母乳、玻璃體液、眼房液、皮脂、內 淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液體、及呼吸道、腸道及泌尿生殖道之分泌物。於一些態樣中，該流體為全血。於其他態樣中，該流體為全血分離物。又於其他態樣中，該第一標籤為抗體。於一些態樣中，該第一標籤為螢光團。於一些態樣中，該第一態樣為由核酸組合之探針。於其他態樣中，步驟(c)中之訊號之減弱係藉由對分析物施用輻射來達成。於其他態樣中，該輻射為白光。又於其他態樣中，步驟(c)中之訊號之減弱係藉由塗佈化學品至第一標籤來達成。於一些態樣中，該化學品為還原劑。於其他態樣中，該還原劑為二硫蘇糖醇。於一些態樣中，該輻射係使用雷射來施加。於其他態樣中，該輻射係使用發光二極體(LED)來施加。於其他態樣中，該方法進一步包括成像來自第一標籤及第二標籤之訊號。又於其他態樣中，該分析物係存於流體中，及該流體為較大體積之流體之等分試樣。於一些態樣中，該分配係半自動或自動地進行。於其他態樣中，該分配係藉由總體決策等分試樣分級來進行。於一些態樣中，各標記為生物標記。於其他態樣中，該複數種生物標記之特徵係表現圖譜。又於其他態樣中，該方法進一步包括使該分析物與緩衝液接觸。於一些態樣中，該緩衝液包含固定劑。於其他態樣中，該緩衝液包含透化劑。於其他態樣中，該緩衝液為洗滌緩衝液。又於其他態樣中，並不使用流式細胞儀來分配該分析物。於一些態樣中，在進行步驟a之偵測時，該分析物並非係連接至組織中之其他細胞之細胞。
於各種態樣中，提供自包含第一細胞亞型及第二細胞亞型之細胞樣本單離細胞之方法，該方法包括：(a)經由一組管件將樣本引入微流體晶片中，其中該微流體晶片包括(i)至少一個流體連接至該組管件之通道；(ii)經組態以偵測該至少一個通道中之細胞之訊號之偵測器；及(iii)至少一個流體連接至該至少一個通道之腔室；(b)使該細胞樣本之一部分流動通過該偵測器；(c)使用該偵測器以偵測該細胞樣 本之一部分中該第一細胞亞型之存在或不存在；(d)假若在該細胞樣本之一部分中偵測到該第一細胞亞型，則引導該細胞樣本之等分試樣進入該腔室中，其中該等分試樣包括該第一細胞亞型；及(e)重複步驟(b)、(c)、及(d)，藉此單離該腔室中之多個等分試樣使得該腔室包含該樣本中第一細胞亞型總數之80%以上及之該樣本中第二細胞亞型總數之5%以下。
於各種態樣中，提供自衍生自流體之樣本來分配表現特異性生物標記圖譜之細胞之設備，其中：(a)該設備包括一組連接至具有至少一個通道及腔室之微流體晶片之管件；及(b)該設備可單離該腔室中之細胞，其中於單離後，該腔室包含表現特異性生物標記圖譜之樣本中細胞總群體之80%以上，及其中於單離後，該腔室包含表現不同生物標記圖譜之樣本中細胞總群體之5%以下。於一些態樣中，表現特異性生物標記圖譜之細胞之單離過程少於20分鐘內。於其他態樣中，該特異性生物標記圖譜係存於流體樣本中之小於5%細胞上。於其他態樣中，該流體為血液。又於其他態樣中，該流體為全血分離物。於一些態樣中，該流體為全血之有核細胞部分。
於各種態樣中，提供用於識別存於分析物上之複數種標記的方法，其中該等方法包括：(a)藉由使分析物流動於包含複數個微腔或微貼片之基板之上來分配複數種分析物，其中大多數微腔或微貼片可裝納不多於一種分析物及其中該等微腔或微貼片係位於微流體裝置中；(b)在該等微腔或微貼片中，使各分析物與可與第一標記結合之第一結構接觸，其中該第一結構係連接至第一標籤；(c)偵測來自該第一標籤之訊號；(d)減低該第一標籤之訊號之強度；(e)使該分析物與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係連接至第二標籤；及(f)偵測該第二標籤。
於一些態樣中，第一標籤之訊號減低超過50%。於其他態樣中， 步驟b之接觸係藉由使包含第一結構之流體流動通過與微腔或微貼片流體連通之通道來實現。於其他態樣中，於步驟(b)之接觸步驟之後，該方法進一步包括：使該分析物與洗滌緩衝液接觸。又於其他態樣中，該等分析物為細胞。於一些態樣中，該等分析物係藉由由流體流動產生的力、重力、或黏著力固持在微腔中之固定位置。於其他態樣中，各分析物係藉由分子相互作用連接至微腔或微貼片。於其他態樣中，各分析物係藉由非共價鍵結連接至微腔。又於其他態樣中，該非共價鍵結為凡得瓦相互作用、靜電鍵結、疏水性鍵結或非特異性吸附。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之顆粒之裝置，該等裝置包括(a)包括至少一個樣本輸入通道、至少一個定向流動通道、及至少兩個輸出通道之微流體晶片，其中該至少一個定向流動通道係與該樣本輸入通道交叉；(b)位於不為微流體晶片之一部分之裝置上之電致動閥，其中該電致動閥係藉由控制與至少一個定向流動通道或該至少兩個輸出通道中至少一者交叉之輸入通道來控制液體之流動；(c)至少一個可偵測流體樣本之等分試樣中之一或多種分析物之偵測器；及(d)可基於該等分試樣中該等分析物之存在、不存在、同一性、組成、或量而為該等分試樣指示一個數值之數位處理器，其中該數位處理器係與該偵測器及該電致動閥連通。於一些態樣中，該電致動閥為螺線管閥。於其他態樣中，該電致動閥控制液體在至少一個定向流動通道中之流動。
於其他態樣中，該電致動閥通常係封閉及其中該電致動閥在接收到來自電腦之訊號之後打開。又於其他態樣中，該電致動閥通常係打開及其中該電致動閥在接收到來自電腦之訊號之後封閉。於一些態樣中，該至少一個定向流動通道包括至少兩個埠及其中該電致動閥係藉由這兩個埠中之一者來控制流體之流動。於其他態樣中，該裝置包 括第二偵測器。於其他態樣中，該等輸出通道中之至少一者係流體連接至過濾器。
於各種態樣中，提供於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣的方法，其中該等分試樣包含罕見顆粒，該等方法包括以下步驟：(a)偵測等分試樣中之罕見顆粒之存在或不存在；(b)基於該罕見顆粒之存在或不存在而為該等分試樣指示一個數值；及(c)依據該指示之數值，藉由打開電致動閥來引導該等分試樣之流動，其中該電致動閥係位於在微流體晶片之外部之裝置上。
於一些態樣中，該微流體晶片包括樣本輸入通道、至少兩個輸出通道、及至少一個定向流動通道，及其中該電致動閥控制液體在該定向流動通道中之流動。
於各種態樣中，提供用於偵測流體樣本中之罕見顆粒之裝置，該裝置包括：(a)至少第一樣本輸入通道；(b)至少兩個輸出通道，其中該兩個輸出通道中之至少一者係與微孔陣列流體連接；(c)至少一個可偵測流體樣本之等分試樣中之一或多種罕見顆粒之偵測器；及(d)藉由引導包含該一或多種罕見顆粒之等分試樣流動通過第一輸出通道來分選該一或多種罕見顆粒之機制結構。
於一些態樣中，該機制結構係引導該等等分試樣流動進入第二輸出通道，假若該等分試樣不包含罕見顆粒。於一些態樣中，該孔陣列配置在該第一樣本輸入通道及該至少兩個輸出通道之間。於一些態樣中，該孔陣列係在與該第一樣本輸入通道及該等輸出通道相同的平面中。於一些態樣中，該孔陣列經組態使得該等罕見顆粒不可通過該等孔但至少一種其他顆粒可通過該等孔。於一些態樣中，該孔陣列包括多於1000個孔。於一些態樣中，該用於分選罕見顆粒之機制結構包括電極、磁性元件、聲學元件、或電致動元件。於一些態樣中，該偵測器係選自由以下組成之群：攝影機、電子倍增器、電荷耦合裝置 (CCD)影像感測器、光電倍增管(PMT)、雪崩光電二極體(APD)、單光子雪崩二極體(SPAD)、矽光電倍增器(SiPM)、及互補金屬氧化物半導體(CMOS)影像感測器。於一些態樣中，該電致動閥直接控制液體在至少一個定向流動通道中之流動。於一些態樣中，該電致動閥直接控制通道中之液體饋送至至少一個定向流動通道中之流動。於一些態樣中，該電致動閥直接控制液體在僅一個定向流動通道中之流動。於一些態樣中，該電致動閥直接控制液體在該至少兩個輸出通道中一者中流動。於一些態樣中，該電致動閥直接控制通道中之液體饋送至該至少兩個輸出通道中一者中之流動。於一些態樣中，該至少一個定向流動通道係與該至少兩個輸出通道在一或多個接合處交叉。於一些態樣中，該裝置包括偵測器。於一些態樣中，該裝置包括證實性雷射。於一些態樣中，該偵測器係位於至少一個非輸出通道之通道上。於一些態樣中，該證實性雷射係位於至少一個非輸入通道之通道上。於一些態樣中，該電致動閥為壓電閥。
100:引入分析物至微流體裝置
110:視情況-進行eDAR
115:引導分析物至預備腔室
120:標記預備腔室中之分析物
125:輻射預備腔室中之分析物
130:偵測預備腔室中之分析物
135:減弱預備腔室中分析物上之標籤之訊號
140:視情況-重複複數個循環
150:分析來自標籤之訊號
155:偵測方案
160:載台
165:電腦及軟體
170:電荷耦合裝置(CCD)
175:輻射
180:光
190:雷射

Claims (17)

  1. 一種用於偵測流體樣本中之顆粒之裝置，該裝置包括：一微流體晶片，其包括一輸入通道、一第一輸出通道、一第二輸出通道、及一定向流動通道；一閥，其中該閥可與該微流體晶片分離，且其中：該閥調節第一流體在該定向流動通道中之流動；及該定向流動通道中該第一流體之流動引導第二流體自該輸入通道流至該第一輸出通道、該第二輸出通道、或其組合；一偵測器，經組態可以偵測由該輸入通道中該第二流體之一部分發射之訊號；及一處理器，經組態可以：使該顆粒與第一標籤接觸，其中該顆粒包含第一標記，且該第一標籤對該第一標記具有親和力；使用偵測器偵測該部分中該顆粒之存在或不存在，其中偵測該部分中該顆粒之存在或不存在包含使用輻射源來偵測由該第一標籤發射之第一訊號，其中該第一訊號指出該第一標記之存在；根據該第一訊號為該部分指示一個數值；及操作該閥以依據該指示之數值來引導該部分之流動；減低該第一訊號之強度；使該顆粒與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係附著至第二標籤；及使用偵測器偵測該第二標籤。
  2. 如請求項1之裝置，其中該顆粒為罕見細胞。
  3. 如請求項1之裝置，其中該部分為等分試樣，且其中該等分試樣包含隨機地分佈於三維空間之複數顆粒。
  4. 如請求項1之裝置，其進一步包含與該第一輸出通道流體連通之一過濾器。
  5. 如請求項1之裝置，其進一步包括一組管件，其中該微流體晶片包含至少一個與該組管件流體連接之通道。
  6. 如請求項1至5中任一項之裝置，其進一步包含至少一個與該第一輸出通道流體連通之腔室。
  7. 如請求項6之裝置，其中該腔室係經由管件與該第一輸出通道流體連通。
  8. 如請求項4之裝置，其中該過濾器經配置使得罕見細胞不能通過該過濾器。
  9. 如請求項6之裝置，其中該腔室為小瓶、微量離心管、或孔盤中之孔。
  10. 如請求項1至5中任一項之裝置，其進一步包含一輻射源，經配置減低自該顆粒發射之訊號。
  11. 如請求項3之裝置，其中該閥依據為該等分試樣指示之數值將該等分試樣之流動引導至該第一輸出通道或該第二輸出通道。
  12. 一種於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣的方法，其中該等分試樣包含在隨機地分佈於三維空間之複數顆粒中的顆粒，該方法包括以下步驟：使該顆粒與第一標籤接觸，其中該顆粒包含第一標記，且該第一標籤對該第一標記具有親和力；偵測該等分試樣中該顆粒之存在或不存在；其中偵測該等分試樣中該顆粒之存在或不存在包含使用輻射源來偵測由該第一 標籤發射之第一訊號，其中該第一訊號指出該第一標記之存在；基於該顆粒之存在或不存在而為該等分試樣指示一個數值；依據該指示之數值，藉由打開電致動閥來引導該等分試樣之流動，其中該電致動閥係位於在微流體晶片之外部之裝置上；減低該第一訊號之強度；使該顆粒與結合第二標記之第二結構接觸，其中該第二結構係附著至第二標籤；及偵測該第二標籤。
  13. 如請求項12之方法，其進一步包括：a.引入該樣本至該微流體晶片中，其中該樣本包含第一細胞類型及第二細胞類型，且其中該微流體晶片進一步包括輸入通道、第一輸出通道以及與該第一輸出通道流體連通之腔室；b.使該樣本之一部分流動通過該輸入通道，其中該部分包含複數個第一細胞類型、複數個第二細胞類型、或其組合；c.使用偵測器偵測該部分中該第一細胞類型之存在或不存在；d.假若該第一細胞類型存於該部分中，則將該部分引導至該腔室中；及e.重複(b)、(c)、及(d)足夠多次使得該腔室包含存於該樣本中該第一細胞類型總數之80%以上及存於該樣本中該第二細胞類型總數之5%以下。
  14. 如請求項12或13之方法，其中該微流體晶片包括樣本輸入通道、至少兩個輸出通道、及至少一個定向流動通道，且其中該電致動閥控制該定向流動通道中流體之流動。
  15. 如請求項14之方法，其進一步包含使用與該至少兩個輸出通道 流體之至少一者連通之過濾器捕集該顆粒。
  16. 如請求項15之方法，其中該過濾器包括孔陣列。
  17. 如請求項15之方法，其中該顆粒為罕見細胞，且其中該過濾器經組態使得該罕見細胞不能通過該過濾器。
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