KR20220054675A - 혈액용 디바이스 - Google Patents

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KR20220054675A
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diameter
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KR1020227011104A
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토모히로 쿠보
히로아키 야마나카
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티엘 제노믹스 인크.
티엘 제노믹스 인크.
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Abstract

혈액용 디바이스(1)는, 컬럼(50)과 컬럼(50)의 하류에 위치하는 미세 유로(20)를 구비한다. 컬럼(50)은 다공질재를 고정상으로서 구비하고, 미세 유로(20)에 다공질재와 접촉한 혈액이 흐른다. 혈액용 디바이스(1)는 컬럼(50)과 미세 유로(20)가 별체로서 제공되는 것이다. 컬럼(50)은 연결부(55)를 갖고, 미세 유로(20)는 입구(21a)를 가지며, 연결부(55)와 입구(21a)를 연결함으로써 컬럼(50)과 미세 유로(20)를 일체화시키고 나서 혈액(BL)을 컬럼(50)으로부터 통과시킨다.

Description

혈액용 디바이스
본 발명은 혈액용 디바이스, 특히 혈구 분리용 디바이스에 관한 것이다. 또, 이들 디바이스의 사용 방법에 관한 것이다.
특허문헌 1에는, 미세 유로에 의한 혈구의 분급이 기재되어 있다.
국제공개공보 제2018/123220호
혈액을 미세 유로 중에 흘려 보내면 미세 유로 중에서 막힘이 발생하는 경우가 있다. 본 발명은 막힘의 해소에 적합한 디바이스와 그 사용 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
<1> 컬럼과 상기 컬럼의 하류에 위치하는 미세 유로를 구비하는 혈액용 디바이스로서,
상기 컬럼은 다공질재를 고정상으로서 구비하고,
상기 미세 유로에 상기 다공질재와 접촉한 혈액이 흐르는, 혈액용 디바이스.
<2> 상기 다공질재는 입자로 이루어지고,
상기 컬럼은, 상기 다공질재를 수용 가능한 수용부를 더 구비하며, 상기 수용부의 하류의 상기 미세 유로에 가까운 쪽에, 상기 다공질재의 입자를 트랩하는 필터를 더 구비하고,
상기 다공질재의 입자로부터는, 컷오프 직경 이하의 입자경을 갖는 작은 입자가 미리 제거되어 있으며,
상기 필터의 눈크기는 상기 컷오프 직경보다 작은, <1>에 기재된 혈액용 디바이스.
<3> 상기 컷오프 직경은 25~100μm의 범위에 있는, <2>에 기재된 혈액용 디바이스.
<4> 상기 필터가 갖는 그물의 직경은 20~40μm의 범위에 있고, 당해 범위는 컷오프 직경 미만인, <2> 또는 <3> 중 어느 하나에 기재된 혈액용 디바이스.
<5> 상기 입자는 입자경 분포를 가짐과 함께, 그 체적 기준의 누적 분포에 있어서의 중앙 입자경 d50V가 25~280μm이되, 상기 입자경 분포는 컷오프에 의하여 상기 작은 입자를 제거하기 전의 입자경 분포를 나타내는, <2> 내지 <4> 중 어느 하나에 기재된 혈액용 디바이스.
<6> 상기 수용부의 상류의 상기 미세 유로에서 먼 쪽에, 상기 다공질재의 입자를 트랩하는 필터를 더 구비하는, <2> 내지 <5> 중 어느 하나에 기재된 혈액용 디바이스.
<7> 상기 미세 유로에 상기 다공질재와 접촉한 혈액이 흐르면, 상기 미세 유로가 상기 혈액 중의 혈구를 수력학(水力學)적으로 분급하는, <1> 내지 <6> 중 어느 하나에 기재된 혈액용 디바이스.
<8> 상기 미세 유로는, 필러 밀집대(帶)와 상기 필러 밀집대의 하류에 위치하는 수력학적 유로를 구비하는 평면적인 칩으로 만들어져 있고,
상기 컬럼이 상기 평면적인 칩의 표면 또는 이면에 대하여 접속하며,
상기 미세 유로로부터 상기 혈액용 디바이스의 외부에 상기 수력학적으로 분급된 혈구를 방출하는 출구를 더 구비하는, 혈구 분리용의, <7>에 기재된 혈액용 디바이스.
<9> 상기 다공질재는 입자로 이루어지고,
상기 다공질재의 입자는, 다당류, 실리카 또는 수지로 이루어지는 다공질성의 표면을 구비하는, <1> 내지 <8> 중 어느 하나에 기재된 혈액용 디바이스.
<10> 상기 혈액용 디바이스는 상기 컬럼과 상기 미세 유로가 별체로서 제공되는 것이고, 상기 컬럼은 연결부를 가지며, 상기 미세 유로는 입구를 갖고, 상기 연결부와 상기 입구를 연결함으로써 상기 컬럼과 상기 미세 유로를 일체화시키고 나서 혈액을 상기 컬럼으로부터 통과시키는, <1> 내지 <9> 중 어느 하나에 기재된 혈액용 디바이스의 사용 방법.
본 발명에 의하여 미세 유로 중의 막힘의 해소에 적합한 디바이스와 그 사용 방법을 제공하는 것이 가능해진다.
도 1은 혈액 분리용 디바이스의 모식도.
도 2는 컬럼의 정면도.
도 3은 다공질재의 입자의 입자경 분포.
도 4는 혈액 분리용 디바이스의 정면 단면도.
도 5는 도 4의 영역 V로 나타내는 컬럼의 확대 정면 단면도.
도 6은 도 1의 영역 VI으로 나타내는 미세 유로의 관찰상 1(상단) 및 그 스케치(하단).
도 7은 도 1의 영역 VII로 나타내는 미세 유로의 부분 평면도.
도 8은 비교예 1에 관한 미세 유로의 관찰상 2(상단) 및 그 스케치(하단).
도 9는 비교예 2에 관한 미세 유로의 관찰상 3(상단) 및 그 스케치(하단).
도 10은 참고예의 미세 유로의 단면도.
<1. 혈액 분리용 디바이스>
본 발명의 일 양태는, 컬럼과 상기 컬럼의 하류에 위치하는 미세 유로를 구비하는 혈액 분리용 디바이스이다. 혈액에는 세포 및 혈장이 포함된다. 세포에는, 혈구 및 혈액 중을 순환하는 다른 세포가 포함된다. 혈액 중의 세포는 다양한 크기의 세포가 서로 섞여 있다. 각 세포종(細胞種)은 세포의 크기에 관하여 고유의 입자경 분포를 나타낸다. 혈액 분리용 디바이스란, 혈액 중의 세포를 그 크기에 따라 분획하는 분급을 행하기 위한 디바이스이다. 혈액 분리용 디바이스를 이용하여 혈액을 분급함으로써, 특정 세포종이 농축된 세포의 집단을 얻을 수 있다. 분급의 예는 미세 유로 내에서 행하는 수력학적 분급이다.
혈액 분리용 디바이스를 이용한 분급의 대상으로 하는 혈액의 종류 및 농축 가능한 세포종의 예는 이하와 같다.
대상으로 하는 혈액에는 농축해야 할 세포종으로서 혈구가 포함된다. 혈구는 태아 유래 유핵 적혈구일 수 있다. 취득되는 혈액은 태아 유래 유핵 적혈구를 함유한다. 태아 유래 유핵 적혈구는 임신부혈에 포함된다. 진단의 대상자는 태아 및 임신부이다. 컬럼을 이용하여 당해 임신부혈을 전처리한다. 미세 유로를 이용한 분급에 의하여 태아 유래 유핵 적혈구를 농축한다. 농축된 태아 유래 유핵 적혈구로부터 태아에 대한 진단에 유용한 데이터를 취득한다.
대상으로 하는 혈액에는 농축해야 할 세포종으로서, 혈액 중을 순환하는 세포로서 혈구는 아닌 다른 세포가 포함된다. 그것은 순환 종양 세포(CTC)일 수 있다. 취득되는 혈액은 CTC를 함유한다. CTC는 예를 들면 암이 의심되는 피험자, 암 환자 및 암 치료를 이미 받은 피험자의 혈액에 포함될 가능성이 있다. 이 사람들이 진단의 대상자가 된다. 컬럼을 이용하여 당해 혈액을 전처리한다. 미세 유로를 이용한 분급에 의하여 CTC를 농축한다. CTC가 혈액에 포함되어 있는지 아닌지에 관계없이 CTC를 농축하는 데 필요한 공정을 실행한다. 농축된 CTC로부터 암의 진단에 유용한 데이터를 취득한다.
대상으로 하는 혈액에 포함되는 세포로서 농축해야 할 세포종은 골수종 세포일 수 있다. 취득되는 혈액은 골수종 세포를 함유한다. 골수종 세포는 예를 들면 골수종의 치료를 행한 환자로부터 미소 잔존 병변(MRD)으로서 검출될 가능성이 있다. 이 사람들이 진단의 대상자가 된다. 골수종의 일례는 다발성 골수종이다. 이러한 환자로부터 채취한 혈액을 컬럼을 이용하여 전처리한다. 분급에 의하여 골수종 세포를 농축한다. 골수종 세포가 혈액에 포함되어 있는지 아닌지에 관계없이 골수종 세포를 농축하는 데 필요한 공정을 실행한다. 농축된 골수종 세포로부터 MRD에 대한 진단에 유용한 데이터를 취득한다.
이하에 수력학적인 분급을 위한 디바이스의 일례를 나타낸다. 먼저, 도 1의 모식도를 참조하여 혈액 분리용 디바이스(1)의 전체상(全體像)에 대하여 설명한다. 도 1에는 혈액 분리용 디바이스(1)가 나타나 있다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 혈액 분리용 디바이스(1)는 컬럼(50)과 미세 유로(20)를 구비한다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 몇 개의 미세 유로(20)를 겹침으로써, 다층 구조를 갖는 유로 칩(70)으로 해도 된다. 유로 칩(70)은 1층의 미세 유로(20)만을 갖는 칩이어도 된다. 이하, 유로 칩(70)의 최상층의 미세 유로(20)에 대하여 설명한다. 유로 칩(70)의 최상층보다 아래의 층은, 이하에 설명하는 미세 유로(20)와 동일한 미세 유로를 구비하고 있어도 되고, 상이한 미세 유로를 구비하고 있어도 된다. 컬럼(50)과 미세 유로(20)는 별체로서 구성되어도 된다. 컬럼(50)은 미세 유로(20)의 상류 측에 배치된다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 컬럼(50)의 일단과 혈액(BL)을 넣은 시린지(30)가 연결된다. 또, 컬럼(50)의 타단과 미세 유로(20)의 입구(21a)가 연결된다. 컬럼(50)은 적어도 다공질재(51)와 필터(53a, 53b)를 구비한다. 일 양태에 있어서 컬럼(50)은 이것에 충전된 다공질재(51)를 고정상으로 하고, 혈액(BL)을 이동상으로 하여 컬럼 크로마토그래피를 행하기 위한 것이다. 컬럼(50)의 상세는 도 2를 이용하여 후술한다. 혈액(BL)과 다공질재(51)의 다공질성의 표면을 접촉시키고, 혈액(BL) 중의 성분과 반응하여 상호 작용시킨다. 이와 같이 시린지(30)로부터 소정의 유량으로 혈액(BL)을 보내고 컬럼(50)을 통과함으로써 전처리된 혈액(BL)이 미세 유로(20)의 입구(21a)에 들어간다.
미세 유로(20)는 혈구를 비롯한 부유 세포의 분리에 이용한다. 도 1에 나타내는 미세 유로(20)는 마이크로 미터 단위의 유로 구조를 갖는다. 이와 같은 마이크로 유로 구조는 혈액의 분급에 적합한 것이다(특허문헌 1). 혈액의 분급에 이용되는 미세 유로를 갖는 칩을 특히 혈구 분리 칩 또는 유로 칩이라고 부르는 경우가 있다. 혈액(BL)은, 미세 유로(20)에서 분급되어 각 출구(22a~22c)로 도달한다.
도 1에 있어서 미세 유로(20)는 주(主)유로(23)를 갖는다. 주유로(23)의 일방의 단부는 입구(21a)로 되어 있다. 주유로(23)의 다른 일방의 단부는 출구(22c)로 되어 있다. 미세 유로(20)는 부유로(24)를 더 갖는다. 부유로(24)의 단부는 입구(21b)로 되어 있다. 부유로(24)의 단부는 합류부(28)에서 주유로(23)에 접속되어 있다.
도 1에 있어서 주유로(23)는 입구(21a)로부터 출구(22c)를 향하여 순서대로 유로 파트(25a~25d)를 갖는다. 유로 파트(25a~25d)는 입구(21a)부터 출구(22c)까지 하나로 연결되어 있다. 유로 파트(25a)와 유로 파트(25b)의 사이에 합류부(28)가 있다.
도 1에 있어서 미세 유로(20)는 분기 유로(26a 및 26b)를 갖는다. 분기 유로(26a 및 26b)는 모두 주유로(23)로부터 분기하는 유로이다. 상류 측으로부터 순서대로 분기 유로(26a) 및 분기 유로(26b)가 이 순서로 주유로(23)로부터 분기된다. 분기 유로(26a 및 26b)의 일단은 유로 파트(25c)에서 주유로(23)와 접속한다. 유로 파트(25c)에 있어서, 부유로(24)와 대향하는 측에 분기 유로(26a 및 26b)가 배치되어 있다. 분기 유로(26a 및 26b)의 타단에 출구(22a) 및 출구(22b)가 있다.
도 1에 있어서 분기 유로(26a 및 26b)는 모두 주유로(23)로부터 분기되는 세유로(細流路)를 복수 개 갖는다. 각 세유로는 주유로(23)의 상류로부터 하류로의 방향을 따라 나열된다. 각 세유로는 각각 출구(22a 및 22b)에 이른다. 각 세유로는 각각 출구(22a 및 22b)의 앞쪽에서 합류한다. 유로 파트(25c)의 하류에는 유로 파트(25d)가 있다. 유로 파트(25d)는 출구(22c)에 이른다.
시린지(30)로부터는, 소정의 유량으로 혈액(BL)을 컬럼(50)에 보낸다. 컬럼(50)에 보내진 혈액(BL)은 입구(21a)를 경유하여 유로 파트(25a)에 들어간다.
도 1에 있어서 미세 유로(20)는 부유로(24)를 갖는다. 부유로(24)는 시린지(35)와 연결되어 있다. 시린지(35)에는 청징액(CL)이 들어가 있다. 청징액(CL)은 부유 세포를 포함하지 않는 액체이다. 청징액(CL)은 혈구나 그 외의 세포에 손상을 주지 않는 액체이다. 청징액(CL)은 완충액이다. 청징액(CL)은 PBS일 수 있다. 시린지(35) 내에 압력을 가함으로써 청징액(CL)은 입구(21b)로부터 부유로(24)에 들어간다. 청징액(CL)은 부유로(24)를 흐른다. 청징액(CL)은 유로 파트(25b)에 유입된다.
각 출구에는 세포 현탁액의 획분이 배출된다. 출구(22c)에는 획분(F3)이, 출구(22b)에는 획분(F2)이, 출구(22a)에는 획분(F1)이 얻어진다. 획분(F1) 및 획분(F2)에는 유로 파트(25c)에서 분급된 세포가 각각 포함된다. 획분(F3)에는 유로 파트(25c)를 통과한 혈장이 포함된다. 도 1의 영역 VII로 나타내는 유로 파트(25b~25d)를 통과한 부유 세포의 분급 과정의 상세에 대해서는 도 7을 이용하여 후술한다.
<2. 컬럼의 상세>
다음으로, 도 2를 참조하여 컬럼(50)의 상세에 대하여 설명한다. 이후, 도면 중의 X, Y 및 Z의 각 축은 컬럼(50)의 구성 기능을 이해하기 위하여 편의적으로 나타낸 것이다.
도 2에는 정면에서 본 컬럼(50)이 나타나 있다. 컬럼(50)은 컬럼 본체(60)를 구비한다. 컬럼 본체(60)는, 적어도 다공질재(51)와, 다공질재(51)를 수용하는 수용부(52)와, 필터(53a, 53b)를 구비한다. 컬럼(50)은 연결부(54, 55)를 더 구비해도 된다. 연결부(54)는 시린지(30)에 착탈 가능하다. 연결부(55)는 미세 유로(20)의 입구(21a)에 착탈 가능하다. 필터(53a)와 연결부(54)의 사이에 튜브(56)를 구비해도 된다.
이하, 각 구성의 상세에 대하여 설명한다.
<2-1. 다공질재>
다공질재(51)는 표면이 다공질성을 갖는 재료이다. 환언하면, 다공질재(51)의 표면에는 다수의 미세 구멍이 형성되어 있다. 다공질재(51)는 입자여도 된다. 입자는 구상(球狀)이어도 된다. 입자는 비즈여도 된다. 본 명세서에 있어서 비즈란, 각 입자가 구상이 되도록 하는 수법으로 형성된 입자군을 말한다. 또한, 다공질재(51)는 혈액 중에서 가라앉는 것이어도 된다. 다공질재(51)로서 이용되는 입자로부터는, 필요에 따라 작은 입자가 컷오프되어 있는 것이 바람직하다. 컷오프란, 다공질재의 입자로부터 컷오프 직경 이하의 입자경을 갖는 작은 입자를 미리 제거하는 것이다. 구체적으로는, 메시에 의한 체 분급 등으로 행할 수 있다. 다공질재의 컷오프의 상세는, <3.>에서 후술한다.
다공질재(51)가 갖는 다공질성의 표면에 접촉시키는 혈액은, 다른 액체에 의하여 희석되어 있지 않은 전혈(全血)이어도 된다. 전혈이란 혈액이 혈액 성분별로 분리되어 있지 않고, 혈구, 혈장 등의 모든 성분을 포함하고 있는 것을 말한다. 예를 들면 다공질재(51)가 전혈 중에 포함되는 부유 세포의 일부와 상호 작용해도 된다. 상호 작용하는 성분은 그 자체가 미세 유로(20)의 막힘이 되는 것이어도 된다. 상호 작용하는 성분은 미세 유로(20)의 막힘을 간접적으로 촉진하는 것이어도 된다.
다공질재가 혈장 중에 포함되는 성분과 반응해도 된다. 예를 들면 다공질재가 혈장 중에 포함되는 성분과 상호 작용해도 된다.
다공질재는 다공질이 아닌 그 외의 재료와 결합하고 있어도 된다. 예를 들면 다공질이 아닌 입자가 다공질재로 코팅되어 있음으로써 다공질성의 입자로 되어 있어도 된다. 입자의 중심은 다공질성이 아니어도 된다. 입자의 중심은 강자성체여도 된다.
다공질재의 재질은 다당류여도 된다. 다공질재의 미세 구멍은 다당류로 형성된 것이어도 된다. 다당류는 가교되어 있어도 된다. 다당류는 아가로스, 덱스트란 및 알릴덱스트란 중 어느 것이어도 된다. 다당류는 변성되어 있어도 된다. 변성은 DEAE(Diethylethanolamine) 변성이어도 된다. 또, 다공질재의 재질은 실리카 또는 수지여도 된다.
입자상의 다공질재는 겔 여과 크로마토그래피에 이용할 수 있는 것이어도 된다. 결 여과 크로마토그래피란 이동상이 수용액인 사이즈 배제 크로마토그래피이다. 또 이때에 DNA를 분획할 수 있는 것이어도 된다. 다공질재의 DNA에 대한 배제 한계는 45염기쌍 이상인 것이 바람직하다. 다공질재의 DNA에 대한 배제 한계는 165 이상이어도 되고, 이하여도 된다. 다공질재의 DNA에 대한 배제 한계는 1078 이상이어도 되고, 이하여도 된다.
입자상의 다공질재는 단백질을 분획할 수 있는 것이어도 된다. 다공질재의 단백질에 대한 분획 범위의 하한이 1Х104Da 이상인 것이 바람직하다. 다공질재의 단백질에 대한 분획 범위의 상한이 4Х106Da 이상인 것이 바람직하다. 입자상의 다공질재는 적어도 상기 어느 하나를 충족시키는 것이 바람직하다.
<2-2. 수용부>
도 2에 나타내는 바와 같이, 수용부(52)는 다공질재(51)를 수용 가능한 구성이다. 수용부(52)의 형상으로서는, 양단면이 개구된 단면(端面)이고 예를 들면 단면 원통상이나 각통상의 중공상으로 할 수 있다. 예를 들면 수용부(52)의 형상을 원통상으로 한 경우, 수용부(52)가 각부(角部)를 갖지 않음으로써 각부에서의 다공질재(51) 및 흐르는 혈액(BL)의 체류를 억제할 수 있다. 따라서, 수용부(52)의 형상은 원통상으로 하는 것이 특히 바람직하다. 수용부(52)의 형상을 단면 원통상으로 하는 경우, 당해 단면 형상에는 진원, 대략 진원, 타원 모두 포함되는 것으로 한다.
<2-3. 필터>
필터(53a, 53b)는, 다공질재의 입자는 통과할 수 없지만, 미세 유로에서 분급을 행하는 혈액 등의 원하는 액체는 통과할 수 있는 그물 구조를 갖는다. 즉, 필터(53a, 53b)는 다공질재의 입자를 트랩한다. 다공질재의 입자로부터는 컷오프 직경 이하의 입자경을 갖는 작은 입자가 미리 제거되어 있기 때문에, 어떤 일정한 입자경 이하의 작은 입자는 배제되어 있다. 따라서, 필터(53a, 53b)는, 다공질재의 입자의 컷오프 직경, 즉 다공질재의 입자에 포함되는 최소의 입자경보다 작고, 혈구를 비롯한 세포는 통과 가능한 그물 구조를 구비하는 것이 바람직하다. 여기에서, 세포의 크기는, 예를 들면 큰 것으로 12μm 정도이다. 따라서, 예를 들면, 각 그물 구조가 20~40μm의 직경, 특히 바람직하게는 20μm 직경을 갖는 필터를 이용할 수 있다. 즉, 그물 구조의 직경이 맞춰져 있는 것이 바람직하다. 당해 그물 구조를 구비함으로써, 필터(53a, 53b)에 의하여 다공질재의 입자가 컬럼 본체(60)의 외부로 새어 나가는 것을 억제할 수 있다.
여기에서, 본 명세서에 있어서의 「그물 구조」란, 필터(53a, 53b)에 눈이 형성된 것을 의미한다. 그물 구조는, 직선이 종횡으로 교차하도록 배치되어 구성된 것과, 다각형이 반복하여 배치된 것의 양자를 포함한다. 직선이 종횡으로 교차하도록 배치된 것으로서, 예를 들면, 격자상인 것을 포함한다. 그물 구조는, 원형이 반복하여 배치된 것이어도 된다.
필터는, 필터(53b)로서 나타내는 바와 같이, 수용부(52)의 양단 중 적어도 미세 유로(20)의 입구(21a) 쪽에 배치할 수 있다. 즉, 필터(53b)는 컬럼(50) 중의 혈액의 흐름의 하류쪽에 배치할 수 있다. 또, 필터(53a, 53b)는 수용부(52)의 양단에 배치할 수도 있다. 즉, 필터(53a, 53b)는, 컬럼(50) 중의 혈액의 흐름의 상류쪽 및 하류쪽의 양방에 배치할 수 있다. 즉 필터(53a, 53b)는, 수용부(52)의 양단면에 위치하는 개구 단면의 전체면을 완전하게 덮도록 배치할 수 있다. 필터(53a, 53b)의 외경은, 수용부(52)의 개구 단면의 전체면을 완전하게 덮기 위하여 적어도 수용부(52)의 외경 이상의 직경을 갖는 것이 바람직하다. 필터(53a, 53b)를 수용부(52)의 양단면에 배치함으로써, 혈액(BL)은 수용부(52)에 충전된 다공질재(51)에 접촉하면서, 다공질재(51)가 외부로 새어 나오는 것을 억제할 수 있다.
<2-4. 연결부>
연결부(54, 55)는, 컬럼 본체(60)를 컬럼(50)의 상류에 위치하는 시린지 및 하류에 위치하는 미세 유로로 연결하기 위한 부재이다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 연결부(54)는 시린지(30)에 착탈 가능한 구성이다. 연결부(55)는 미세 유로(20)의 입구(21a)에 착탈 가능한 구성이다. 연결부(54, 55)의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 각 구성으로 착탈 용이한 구성으로 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 연결부(54)는, 시린지(30)의 선단의 볼록부의 형상에 끼워지는 오목부를 구비하는 형상으로 할 수 있다.
예를 들면, 연결부(55)는, 미세 유로(20)의 입구(21a)의 오목부에 대응하는 볼록부를 구비하는 형상으로 할 수 있다. 또, 각 볼록부 및 오목부의 표면에 나사형상의 홈을 마련하고, 서로 회전시켜 연결할 수도 있다. 이와 같은 구성으로 함으로써, 컬럼(50)과 미세 유로(20)를 확실하게 연결할 수 있어, 조작성이 향상된다.
연결부(54, 55)의 형상은 예를 들면 한번 시린지(30)나 입구(21a)와 연결을 행하면 분리할 수 없는 구성으로 해도 된다. 분리 불가의 구성으로 한 경우, 보다 확실하게 연결할 수 있고, 각 연결부에 시린지(30)로부터의 압력이 가해진 경우에도, 연결부를 흐르는 혈액이 외부로 새어 나오기 어렵다. 즉, 연결부에 있어서의 수밀성을 향상시킬 수 있다.
<2-5. 튜브>
도 2에 나타내는 바와 같이, 일 양태에서는 필터(53a)와 연결부(54)의 사이에 튜브(56)를 구비한다. 튜브(56)는 가요성을 갖고 있어도 되고, 예를 들면 실리콘 수지 튜브나 폴리 염화비닐의 튜브 등을 이용할 수 있다. 튜브(56)를 구비함으로써, 혈액을 보내는 시린지로부터 컬럼 본체(60)까지의 거리를 확보할 수 있다. 예를 들면 튜브(56) 상에 핀치 밸브를 마련해도 된다. 또, 컬럼(50)을 미세 유로(20) 중에 배치하는 경우는, 필터(53b)와 연결부(55)의 사이에 별도 튜브를 마련해도 된다. 또한, 시린지(30)로부터 컬럼 본체(60)까지의 거리가 짧은 경우, 튜브(56)는 구비하지 않아도 된다. 튜브(56)를 구비하지 않고, <2-4.>에서 설명한 연결부(54)를 구비하는 경우, 예를 들면 필터(53a)에 연결부(54)가 직접 연결된 구성으로 하는 것도 가능하다.
<3. 다공질재의 입자의 컷오프>
다음으로, 도 3을 참조하여 다공질의 입자의 입경 분포에 대하여 설명한 후, 다공질재의 입자의 컷오프에 대하여 보다 상세하게 설명한다. 컷오프란, 다공질재의 입자로부터 작은 입자를 제거하는 것을 의미한다.
도 3에는 다공질의 입자의 입자경 분포가 체적 기준의 누적 분포로 나타나 있다. 다공질재의 입자는 입자경 분포를 갖는다. 다공질재의 중앙 입자경 d50V(Median particle size of the cumulative volume distribution)는 체적 기준의 누적 분포에 있어서의 중앙 입자경이다. 입자가 다당류로 이루어지는 경우, 입자가 완충액 중에서 팽윤한 상태의 입자경을 기준으로 한다. 입자경의 측정예는 레이저 회절·산란법으로 구한 유효 직경이나 쿨터법으로 구한 구(球) 체적 상당 직경이다.
도 3에 있어서, 중앙 입자경 d50V는 500μm 미만인 것이 바람직하다. 중앙 입자경 d50V는 바람직하게는 25~280μm, 보다 바람직하게는 25~165μm, 더 바람직하게는 45~165μm이다. 중앙 입자경 d50V가 이러한 범위에 있음으로써, 다공질재의 표면적을 혈액과의 접촉에 적합하게 할 수 있다.
도 3에 있어서 다공질재의 입자로부터는, 필요에 따라 작은 입자가 컷오프되어 있는 것이 바람직하다. 일 양태에 있어서, 컷오프 직경 CF 이하의 입자경을 갖는 작은 입자가 미리 제거된다. 즉, 컷오프 직경 CF는 다공질재의 입자에 포함되는 최소의 입자경을 의미한다. 컷오프 직경 CF의 범위는 25~100μm이다. 컷오프 직경 CF의 범위는 25~70μm이고, 바람직하게는 40~70μm이다. 작은 입자의 제거는 메시에 의한 체 분급으로 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면 셀 스트레이너를 이용하여 다공질재의 입자의 집단으로부터 작은 입자를 제거해도 된다. 작은 입자가 제거되어 있음으로써, 혈중에 섞인 다공질재 중의 작은 입자에 의한 미세 유로의 막힘을 억제할 수 있다.
미세 유로의 종류에 따라서는 미세 유로에 진입한 다공질재 중의 작은 입자가 쉽게 미세 유로로부터 흘려 나온다. 그와 같은 미세 유로에서는 작은 입자에 의한 막힘을 고려하지 않아도 된다. 그러나 그와 같은 미세 유로에서도 혈중의 어떠한 화학적 성분에 의한 막힘(나중에 설명하는 데브리(debris))은 발생하는 일이 있다. 따라서 그와 같은 미세 유로에 대해서도, 다공질재의 입자를 적용하는 것은 막힘의 억제에 유효하고, 또 다공질재의 입자에 있어서 작은 입자를 컷오프하고 있는지 아닌지에 관계없다.
원래 입자로부터 작은 입자가 제거되면 원래 입자의 입자경 분포가 바뀐다. 즉 컷오프에는 사이즈 선택의 효과가 있다. 사이즈 선택 후는 중앙 입자경도 변화한다. 편의상, 본 명세서에 있어서 중앙 입자경 d50V는, 컷오프에 의하여 원래 입자로부터 작은 입자를 제거하기 전의 입자경 분포에 근거하는 것으로 한다.
이상이 본 발명에 관한 혈액 분리용 디바이스이다.
컬럼과 미세 유로는 별체로 하여 구성되어도 된다. 사용 시에, 컬럼과 미세 유로를 조합하여 하나의 혈구 분리용 디바이스로서 사용할 수 있다. 컬럼과 미세 유로는, 예를 들면 상술한 요철 구조를 구비하는 연결부에 의하여 연결할 수 있다. 또, 예를 들면 요철 구조의 표면에 나사형상의 홈을 구비하는 연결부에 의해서도 연결할 수 있다.
또, 컬럼과 미세 유로는 일체로 하여 구성되어도 된다. 예를 들면 미세 유로의 입구에 연결된 컬럼 구조를 구비하는 구조로 해도 된다. 또, 본 발명에 관한 혈액 분리용 디바이스는, 시린지와 일체형의 카트리지로 해도 된다. 또한 이 카트리지를, 미세 유로를 구동하기 위한 구동 장치에 접속하거나, 또는 구동 장치 내부에 배치하여 이용해도 된다.
이하, 도 4~도 7을 참조하여 혈액 분리용 디바이스를 이용한 혈액의 분급 과정의 상세에 대하여 설명한다.
<4. 혈액의 흐름의 개략>
이하, 도 4를 참조하여 혈액 분리용 디바이스 내부의 혈액의 흐름을 설명한다. 도면에서는, 혈액 분리용 디바이스를 전방에서 단면을 보고 있다. 흰색 화살표는 혈액(BL)의 일련의 흐름을 나타낸다. 본 예의 유로 칩(70)은 미세 유로(20) 및 이것과 동등한 미세 유로로 이루어지는 8층을 갖는다. 유로 칩(70)의 최상층은, 미세 유로(20)의 입구(21a)에 접속하는 입구(71)를 장착한 판상의 시트로 이루어진다. 입구(71)는, 유로 칩(70)의 미세 유로(20)의 입구(21a)와 그 외의 미세 유로의 입구를 합한 입구이다. 유로 칩(70)은 그 최하층에, 미세 유로(20)의 출구(22c)에 접속하는 출구(72)를 구비한다. 출구(72)는, 유로 칩(70)의 미세 유로(20)의 출구(22c)와 그 외의 미세 유로의 출구를 통괄하는 출구이다. 흰색 화살표가 나타내는 바와 같이, 시린지(30)로부터 보내진 혈액(BL)은, 컬럼(50)을 통과한다. 컬럼(50) 내에서의 혈액(BL)의 거동은 도 5를 이용하여 후술한다.
이하, 유로 칩(70) 중, 최상층의 미세 유로(20)에 대하여 설명한다. 다른 층도 미세 유로(20)와 동일한 구성을 구비한다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 컬럼(50)과 입구(71)를 통과한 혈액(BL)은, 입구(21a)로부터 미세 유로(20) 내에 들어간다. 미세 유로(20) 내에 들어간 혈액(BL)은, 적층된 미세 유로(20)의 각층에 형성된 주유로(23)에 들어간다. 유로 파트(25a)는 필터의 역할을 하는 필러 밀집대(11, 13)와, 구획(12, 14)을 구비한다. 도 4에서, 필러 밀집대(11, 13)는 세로선의 해칭으로 나타낸다. 유로 파트(25a)의 상세는 도 6을 이용하여 후술한다. 즉, 미세 유로(20)는, 필러 밀집대(11, 13)와, 당해 필러 밀집대(11, 13)의 하류에 위치하는 수력학적 유로를 구비하는 평면적인 칩으로 만들어져 있다.
도 4에서, 유로 파트(25a)를 통과한 혈액은 계속해서 도 1에 나타낸 유로 파트(25b~25d)를 통과한다. 이로써 미세 유로(20)는 혈액에 포함되는 부유 세포를 분급한다. 유로 칩(70) 중의 하층의 미세 유로도 동일하게 부유 세포를 분급한다. 분급된 부유 세포 중 출구(22c)를 경유한 끝의 출구(72)에는 획분(F3)이 도달한다. 부유 세포를 분급하는 과정의 상세는 도 7을 이용하여 후술한다.
<5. 컬럼과 혈액의 상호 작용>
이하, 도 5를 참조하여, 컬럼과 혈액의 상호 작용을 설명한다. 도 5는 도 4의 영역 V로 나타내는 컬럼(50)의 확대 정면 단면도이다. 도 5에는 컬럼과 혈액의 상호 작용의 모습이 나타나 있다.
도 5에서는 설명을 간단하게 하기 위하여, 미세 유로(20)와 미세 유로의 하층의 유로를 대표하는 미세 유로(80)의 합계 2층만을 나타낸다.
도 5에서는 혈액의 흐름을 검은색 화살표로 나타낸다. 혈액(BL)은 무핵 적혈구(27), 유핵 세포(29a~29c) 및 침전 원인 물질(CC)을 포함한다. 유핵 세포(29a~29c)는 각각 크기가 상이한 세포이다. 침전 원인 물질(CC)은, 미세 유로(20) 및 미세 유로(80)의 막힘(데브리)의 한 요인이라고 추측되는 물질이다.
도 5에 나타내는 바와 같이, 시린지(30)로부터 소정의 유량으로 보내진 혈액(BL)은, 컬럼(50)의 컬럼 본체(60)를 통과한다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 다공질재(51) 중을 침전 원인 물질(CC)이 통과한다. 여기에서 다공질재(51)는, 혈액 중에 포함되는 침전 원인 물질(CC)과 상호 작용함으로써, 이들의 침전성을 큰 폭으로 저하시킨다. 충분한 양의 다공질재(51)를 이용함으로써, 침전 원인 물질(CC)이 미세 유로(20)의 겔상의 데브리를 거의 형성하지 않을 정도까지 그 침전성을 저하시키는 것이 바람직하다. 다공질재(51)가 침전 원인 물질(CC)을 흡착함으로써 미세 유로(20) 및 그 외의 미세 유로의 막힘(데브리)의 발생을 억제해도 된다. 한편, 무핵 적혈구(27) 및 유핵 세포(29a~29c)는 다공질재(51)의 간극을 흘러간다. 따라서 다공질재(51)는 혈구의 흐름을 방해하지 않는다.
<6. 필러 밀집대>
컬럼(50)을 통과한 혈액은 계속해서 주유로(23)가 구비하는 필러 밀집대(11)를 통과한다. 이하, 도 6을 참조하여, 필러 밀집대에 대하여 설명한다.
도 6에는 도 1의 영역 VI으로 나타내는 미세 유로의 관찰상(상단) 및 그 스케치(하단)가 나타나 있다. 도 6을 참조하여 필러 밀집대(11)에 대하여 설명한다. 도 6은 실시예의 관찰상이기도 하다. 실시예에 대해서는 후술한다.
도 6에 나타내는 필러 밀집대(11)는 필터의 역할을 한다. 필러 밀집대(11)는 혈액 중의 불순물, 예를 들면 혈구보다 큰 불용 성분이 필러 밀집대(11)의 하류의 유로 파트에 들어가지 않도록 한다. 또 응집덩어리로 되어 있는 혈구가 있으면, 하나하나의 혈구를 따로 흩어지도록 하는 역할을 한다. 필러 밀집대(11)는 유로 파트(25a) 중의 혈액의 흐름을 횡단하도록 마련되어 있다. 혈액은 도면 중의 상류인 좌측에서 하류인 우측으로 흐른다(흰색 화살표로 나타낸다). 필러 밀집대(11)는 유로 파트(25a)의 상면과 하면을 연결하고 있다. 각 필러의 형상은 혈액의 흐름에 대하여 큰 저항이 되는 형상은 아니다. 즉, 각 필러의 형상은 유체에 대한 저항이 적어지는 형상이 바람직하고, 예를 들면 평면도에서 원형상, 타원상, 유선형을 갖는 물방울형으로 할 수 있다. 도 6에서는 일례로서 물방울형의 필러를 나타냈지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또 필러 밀집대(11)는 혈액의 유속을 현저하게 저하시키는 것은 아니다.
도 6에 있어서 유로 파트(25a)는 구획(12)을 갖는다. 구획(12)은 필러 밀집대(11)의 하류쪽에서 필러 밀집대(11)와 이웃한다. 구획(12)에서는 필러가 성글게 되어 있다. 유로 파트(25a)는 필러 밀집대(13)를 더 구비한다. 필러 밀집대(13)는 필러 밀집대(11)에서 본 하류 방향에서 필러 밀집대(11)의 다음에 위치하는 필러 밀집대이다. 필러 밀집대(13)의 구성은 필러 밀집대(11)와 동등해도 된다.
도 6에 있어서, 구획(12)은 필러 밀집대(11), 필러 밀집대(13) 및 유로 파트(25a)의 측벽 즉 미세 유로의 측벽에 의하여 둘러싸여 있다. 유로 파트(25a)는 구획(14)을 더 갖는다. 구획(14)은 필러 밀집대(13)의 하류쪽에서 필러 밀집대(13)와 이웃한다. 유로 파트(25a)는 구획(14)의 하류에도 필러 밀집대를 더 구비한다. 부호 15, 17은 실시예에서 설명한다.
<7. 미세 유로의 부유 세포 분급 과정>
유로 파트(25a)가 구비하는 필러 밀집대(11)를 통과한 혈액에 포함되는 부유 세포는, 계속해서 유로 파트(25b~25d)에서 분급된다. 이하, 도 7을 참조하여, 미세 유로의 부유 세포 분급 과정에 대하여 설명한다.
도 7에는 평면에서 본 미세 유로(20)가 나타나 있다. 도면은 미세 유로(20)에 의한 부유 세포의 분급 과정을 모식적으로 나타내고 있다. 설명을 간단하게 하기 위하여, 분기 유로(26a)에는 10개의 세유로가, 분기 유로(26b)에는 3개의 세유로가 나타나 있다.
도 7에 나타내는 바와 같이, 유로 파트(25b)의 더 상류인 유로 파트(25a)(도 7에서는 도시생략)로부터 혈액(BL)이 연속적으로 흘러 온다. 혈액(BL)은 세포를 대량으로 포함하고 있다. 혈액(BL)의 흐름에 대하여, 그 측방으로부터 청징액(CL)의 흐름을 연속적으로 접촉시킨다. 이로써 주유로(23)를 흐르는 세포를, 주유로(23)의 측방으로부터 연속적으로 밀어 넣는다. 결과적으로 혈액(BL)의 흐름은 청징액(CL)의 흐름과는 반대 측으로 연속적으로 밀려 들어간다. 유로 파트(25b~25c)에서 분기 유로(26a 및 26b) 쪽으로 연속적으로 부유 세포가 밀림과 함께, 이 분기 유로에 부유 세포가 연속적으로 흘러 든다.
도 7에 나타내는 바와 같이, 분기 유로(26a)에는 무핵 적혈구(27)가 연속적으로 흘러 든다. 유로 파트(25b)에서 혈액(BL) 중의 무핵 적혈구(27)를 수력학적으로 분급한다. 분급은 혈액(BL)의 흐름 중, 청징액(CL)의 흐름과는 접촉하고 있지 않은 측에서 연속적으로 행해진다.
도 7에 나타내는 바와 같이, 분기 유로(26a)는 무핵 적혈구(27)의 제거 유로로서 기능한다. 분기 유로(26a)가 갖는 세유로의 내접 직경은 12~19μm이다. 내접 직경은 13, 14, 15, 16, 17, 및 18μm 중 어느 것이어도 된다.
도 7에 나타내는 바와 같이 분기 유로(26b)에는 유핵 세포(29a~29c)가 연속적으로 흘러 든다. 유로 파트(25b)의 하류의 유로 파트(25c)에서, 혈액(BL) 중의 유핵 세포(29a~29c)를 수력학적으로 분급한다. 분급은 혈액(BL)의 흐름 중, 청징액(CL)의 흐름과는 접촉하고 있지 않은 측에서 연속적으로 행해진다. 특히 분기 유로(26b)로부터 유핵 세포의 세포 현탁액을 연속적으로 얻는다.
도 7에 나타내는 바와 같이 분기 유로(26b)는 유핵 세포(29a~29c)의 회수 유로로서 기능한다. 분기 유로(26b)가 갖는 세유로의 내접 직경은 20~30μm이다. 내접 직경은 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 및 29μm 중 어느 것이어도 된다. 유핵 적혈구를 비롯한 유핵 세포의 직경의 크기는 11~13μm라고 생각된다.
도 7에 나타내는 분기 유로(26a 및 26b)의 각 세유로의 내접 직경은 세유로의 직교 단면에서의 내접원의 직경이다. 세유로의 단면은 사각형이어도 되고 다른 다각형이어도 되며, 원이어도 된다. 다른 분기 유로도 동일하다. 분기 유로(26a 및 26b)에 들어가지 않았던 부유 세포나 혈장은 플로우 스루 FT로서 연속적으로 유로 파트(25d)를 통과한다. 그 후, 도 1의 출구(22c)에 도달한다. 예를 들면 응집된 혈구 등이 플로우 스루 FT에 포함된다.
이상에 의하여, 분기 유로(26a)로부터는 어떤 크기 이상의 부유 세포를 포함하지 않는 유체를 회수할 수 있다. 결과적으로 무핵 적혈구(27)를 여기에서 분급받는다. 또 유핵 세포(29a) 및 그 외의 유핵 세포는 하류에서 분급받는다.
이상이 일 실시형태에 관한 혈액 분리용 디바이스를 이용하여 분급을 행하는 일련의 흐름이다.
<실시예>
본 실시예에서는, 도 6, 도 8 및 도 9를 참조하여, 컬럼에 의한 미세 유로의 막힘 해소 효과를 조사한 실시예 및 비교예와 그 효과를 설명한다.
본 실시예의 일련의 흐름은 다음의 (1)~(5)와 같다.
(1) 다공질의 입자인 비즈에 포함되는 작은 입자의 컷오프를 행한다.
(2) 혈액에 형광 파티클을 스파이크하여 시료혈을 얻는다.
(3) 혈액을 혈액 분리용 디바이스에 흘려 보내 분급한다.
(4) 분급 후, F1~F3 분획을 회수하고, 형광 파티클의 회수율을 평가한다.
(5) 분급 중인 혈구 분리 칩의 막힘율을 평가한다.
상기 (1)~(3)은 실시예에서 행하는 분급의 설명이다. (4)는 분급의 결과 얻어진 데이터의 평가이다. (5)는 분급 중에 얻어진 데이터의 평가이다.
(1-1.) 컷오프
본 실시예에서는 다공질의 입자에 대하여 작은 입자의 컷오프를 행한다. 본 실시예에서는 다공질의 입자로서 비즈인 Sepharose CL-6B를 이용한다. Sepharose는 상표이다. Sepharose CL6B의 겔 매트릭스는 6% 가교 아가로스로 이루어지는 구상체이다. 컷오프 전의 입자경은 45~165μm이다. 1mL의 비즈를 나일론제의 셀 스트레이너(FALCON, 상표)에 넣는다. 교반기로 교반하면서 하룻밤에 걸쳐 비즈에 대한 여과 분리를 행한다. 여과 분리에 들이는 시간은 수 시간부터 24시간이어도 된다. 여과 분리는 증류수 내에서 행한다. 셀 스트레이너의 메시 사이즈는 40μm, 70μm 및 100μm이다. 여과 분리는 각 메시 사이즈의 셀 스트레이너마다 행한다. 여기에서는 70μm 메시의 셀 스트레이너의 사용예에 대하여 상세하게 설명한다. 셀 스트레이너의 메시 사이즈가 컷오프 직경에 대응한다. 컷오프에 의하여 여과 분리된 큰 입자를 컬럼에 수용하여, 전처리에 이용한다. 한편 메시 사이즈가 작을수록 메시 상에 여과 분리되는 입자의 수가 증가한다. 비즈의 세정을 PBS로 2회 행한다.
각 비즈를 비즈와 동일 체적의 청징액으로 현탁한다. 2mL의 청징액에 대하여 비즈의 현탁액 20μL를 첨가하여 이들을 잘 혼합한다. 청징액은 PBS를 베이스로 한 완충액이다. 비즈와 청징액의 혼합액을 추가로 청징액에 첨가한다. 청징액의 일부를 미리 혈구 분리 칩에 흘려 보냄으로써 사전에 혈구 분리 칩의 내부를 완충액에 담근다. 혈구 분리 칩을 담그는 처리는 40분 행한다.
(1-2.) 컷오프 직경의 평가
분급을 마친 혈구 분리 칩을 현미경으로 관찰한다. 100μm의 비즈를 컬럼에 넣어 혈액을 전처리한 경우, 유로 파트(25a)의 내부나 입구(21a)의 근방에서 데브리가 관찰되었다. 유로는 데브리에 의하여 약간 막힘을 일으키고 있었다. 이에 대하여, 컷오프 직경 70μm 및 40μm의 비즈로 전처리한 경우 데브리는 볼 수 없었다. 또 2시간 40분에 걸쳐 시료혈의 분급을 계속했지만 유로의 막힘을 볼 수 없었다. 데브리에 의한 유로의 막힘에 대한 억제 효과를 얻으려면 컷오프 직경을 70μm 이하로 하는 것이 바람직한 것을 알 수 있었다. 컷오프 직경은 60μm여도 되고, 50μm여도 된다.
또한 컷오프 직경 40μm, 70μm 및 100μm의 어느 경우에 있어서도, 시료혈은 전량을 혈구 분리 칩으로 처리할 수 있었다. 데브리에 의하여 혈구 분리 칩이 막혀 분획할 수 없는 시료혈이 남는 일은 없었다. 이하의 시험에서는 컷오프 직경 70μm를 채용한다.
컷오프를 행한 비즈를 컬럼의 수용부에 수용한다. 컬럼에는 예를 들면 컷오프 직경 70μm의 비즈를 50μL 수용한다.
(2) 혈액으로의 형광 파티클의 스파이크
본 실시예에 있어서의 「혈액」이란, 건강한 인간의 성인으로부터 채취한 전혈이다. 혈액을 채취할 때에 이용하는 채혈관에는, 혈액 응고를 억제하는 시트르산 및 EDTA가 포함된다. 지정량의 혈액을 채혈관 내에 채취함으로써, 자동적으로 적절한 분량의 시트르산 및 EDTA가 혈액 중에 첨가된다. 채혈 후 4
Figure pct00001
로 보존되고 있던 3일째의 전혈에 대하여 형광 파티클을 스파이크함으로써 시료혈을 얻는다. 여기에서 스파이크란 세포나 세포를 모방한 것을 미량 더하는 것을 말한다. 「형광 파티클」이란, 임신부혈에 포함되는 미량의 태아 유래 유핵 적혈구를 모방한 구상의 입자이다. 예를 들면 도 5에서는 유핵 세포(29a~29c)에 상당하는 것이다. 얻어진 시료혈에 청징액(PBS를 베이스로 한 완충액)을 더하여 5배로 희석한다. 본 실시예에서는 직경이 상이한 2종류의 형광 파티클을 혈액에 스파이크한다. 구체적으로는 직경 8.42μm와 직경 10μm의 수지제의 형광 파티클을 혈액에 스파이크한다. 직경 8.42μm의 형광 파티클로서, Spherotech사의 FITC Particles (cat#F1CP-80-2)을 이용한다. 10.0μm의 형광 파티클로서, Invitrogen사의 FluoSpheres(상표) polystyrene microspheres, 10μm, blue fluorescent(365/415)를 이용한다. 희석혈 1mL에 대하여, 직경 8.42μm와 직경 10μm의, 직경이 상이한 각 형광 파티클을 각각 60개씩 합계 120개 스파이크한다. 또한, 형광 파티클의 스파이크 후에 전혈의 희석을 행해도 된다. 예를 들면, 전혈 1mL에 대하여, 직경 8.42μm와 직경 10μm의, 직경이 상이한 각 형광 파티클을 각각 300개씩 스파이크하여, 5배로 희석해도 된다.
(3) 혈구 분리 칩에 의한 분급
희석한 시료혈을 컬럼에 통과시킴으로써 전처리를 행하고, 1층의 혈구 분리 칩에 의하여 분급하여, 형광 파티클을 회수한다. 분급의 결과를 도 1 및 도 6을 따라 설명하면 획분(F2)에는 림프구를 포함하는 백혈구가 많이 얻어진다. 획분(F1)에 무핵의 성숙 적혈구가 많이 얻어진다. 또한 혈구 분리 칩에 유입된 세포는 대부분(>99.9%)이 획분(F1)으로 유출된다. F3에는 많은 혈구는 얻어지지 않는다. 형광 파티클은 림프구와 유사하므로 획분(F2)에 포함될 것이 기대된다.
실시예, 비교예 1 및 비교예 2에 있어서 흘려 보내는 시료혈은 상기 (2)에서 설명한 바와 같으며, 동일 조건이다. 시린지로부터 시료혈을 보내는 속도를 20μL/분으로 한다. 시린지로부터 청징액을 보내는 속도를 40μL/분으로 한다. 분급 개시 후 90분, 시료혈을 1.8mL 흘려 보낸 시점에서, F1~F3 분획 형광 파티클로 이루어지는 획분으로부터 형광 파티클을 회수하고, 회수율을 구한다.
실시예와 비교예 1 및 비교예 2에서 상이한 점은, 혈액 분리용 디바이스의 컬럼의 구성이다.
실시예의 컬럼은 CL-6B 비즈 및 필터의 양방을 구비한다. 컬럼에는 컷오프 직경 70μm의 CL-6B 비즈가 50μL 충전되어 있다. 필터의 그물은 격자상이고, 20μm 직경이다.
비교예 1은 컬럼을 구비하지 않는다. 즉, 비교예 1에서는 CL-6B 비즈 및 필터의 양방을 구비하지 않는다. 시료혈은 직접 혈구 분리 칩으로 도입된다.
비교예 2의 컬럼은 CL-6B 비즈가 충전되어 있지 않다. 즉, 비교예 2의 컬럼은 필터만을 구비하고, CL-6B 비즈는 구비하지 않는다. 필터의 그물은 실시예와 동일하게 격자상이고, 20μm 직경이다.
(4) 형광 파티클의 회수율의 평가
형광 파티클의 회수율은, 이하의 식 1을 이용하여 구할 수 있다.
[식 1]
[형광 파티클 회수율(%)]=(일정 시간에 회수된 형광 파티클의 수)/(일정 시간 내에 분획된 혈구에 포함되어 있는 형광 파티클수의 기댓값)*100
「일정 시간에 회수된 형광 파티클의 수」는 실제로 측정함으로써 발견된 형광 파티클의 수이다.
상기 [식 1]의 「일정 시간 내에 분획된 혈구에 포함되어 있는 형광 파티클수의 기댓값」은 이하의 식 2를 이용하여 구할 수 있다.
[식 2]
[일정 시간 내에 분획된 혈구에 포함되어 있는 형광 파티클수의 기댓값(개)]={(일정 시간 내에 분획된 혈구수(cells))/(전혈 1mL당 혈구수(cells/mL))}*(형광 파티클을 5배 희석혈에 더한 시점에서의 전혈 1mL당 형광 파티클의 개수(개/mL))
실시예 및 비교예 1, 2의 형광 파티클의 회수율을 이하의 표 1에 나타낸다.
Figure pct00002
실시예에 대하여, 표 1의 상단에는 컷오프 직경 70μm의 CL-6B 비즈, 시료혈을 90분간 흘려 보낸 경우의 형광 파티클의 회수율이 나타나 있다. F1~F3로 이루어지는 획분으로부터 측정에 의하여 발견된 형광 파티클의 수는, 직경 8.42μm의 형광 파티클이 76개, 직경 10.0μm의 형광 파티클이 85개이다. 획분(F1~F3)으로 이루어지는 획분으로부터 발견된 혈구수는 1.27Х109개이다. 형광 파티클을 더하기 전의 전혈의 1mL당 혈구수는 4.42Х109개이다. 형광 파티클을 5배 희석혈에 더한 시점에서의 전혈 1mL당 형광 파티클의 개수는 직경 8.42μm인 것이 313개, 직경 10μm인 것이 268개이다. 이상의 측정값으로부터 상기 계산식 [식 1] 및 [식 2]를 이용하여 구한 형광 파티클의 회수율은, 직경 8.42μm인 것은 84.5%이고, 직경 10μm인 것은 110.4%였다.
비교예 1에 대하여, 표 1의 중단에는 컷오프 직경 70μm, 시료혈을 90분간 흘려 보낸 경우의 형광 파티클의 회수율이 나타나 있다. F1~F3으로 이루어지는 획분으로부터 측정에 의하여 발견된 형광 파티클의 수는, 직경 8.42μm의 형광 파티클이 114개, 직경 10.0μm의 형광 파티클이 131개이다. 획분(F1~F3)으로 이루어지는 획분으로부터 발견된 혈구수는 1.70Х109개이다. 형광 파티클을 더하기 전의 전혈의 1mL당 혈구수는 4.42Х109개이다. 형광 파티클을 5배 희석혈에 더한 시점에서의 전혈 1mL당 형광 파티클의 개수는 직경 8.42μm인 것이 307개, 직경 10μm인 것이 297개이다. 이상의 측정값으로부터 상기 계산식 [식 1] 및 [식 2]를 이용하여 구한 형광 파티클의 회수율은, 직경 8.42μm인 것은 96.6%이고, 직경 10μm인 것은 114.7%였다.
비교예 2에 대하여, 표 1의 하단에는 컷오프 직경 70μm, 시료혈을 90분간 흘려 보낸 경우의 형광 파티클의 회수율이 나타나 있다. F1~F3으로 이루어지는 획분으로부터 측정에 의하여 발견된 형광 파티클의 수는, 직경 8.42μm인 형광 파티클이 133개, 직경 10.0μm인 형광 파티클이 127개이다. 획분(F1~F3)으로 이루어지는 획분으로부터 발견된 혈구수는 1.71Х109개/mL이다. 형광 파티클을 더하기 전의 전혈의 1mL당 혈구수는 4.42Х109개이다. 형광 파티클을 5배 희석혈에 더한 시점에서의 전혈 1mL당 형광 파티클의 개수는 직경 8.42μm인 것이 313개, 직경 10μm인 것이 289개이다. 이상의 측정값으로부터 상기 계산식 [식 1] 및 [식 2]를 이용하여 구한 형광 파티클의 회수율은, 직경 8.42μm인 것은 109.8%이고, 직경 10μm인 것은 114.3%였다.
컷오프 직경 70μm의 CL-6B 비즈를 이용한 경우, 태아 유래 유핵 적혈구의 대체로서 이용한 형광 파티클의 회수율은 모두 80% 이상인 점에서, 회수율은 충분히 높은 것으로 판단된다.
본 실시예는 태아 유래 유핵 적혈구의 농축의 모델 실험으로서 행해진다. 상기의 결과로부터 컬럼을 이용한 전처리는 태아 유래 유핵 적혈구의 농축에 있어서 유용하다는 것이 나타난다. 구체적으로는 혈구 분리 칩의 막힘을 억제함으로써 장시간의 분급을 행할 수 있는 것이 나타난다. 본 실시예의 혈액 분리용 디바이스를 이용한 방법에 의하여 장시간의 분급을 행함으로써 대량의 시료혈을 처리할 수 있다. 이것은 1회의 처리당 태아 유래 유핵 적혈구의 취득량이 큰 것을 나타낸다.
(5) 혈구 분리 칩의 막힘율의 평가
이하, 혈구 분리 칩의 막힘율의 평가에 대하여, 도 6, 도 8 및 도 9를 참조하여 설명한다.
상기 (4)에서 분급을 마치기 전에, 혈액을 칩에 흘려 보내고 있는 상태에서 도 1의 미세 유로(20)(혈구 분리 칩, 이하 칩)의 화상 데이터를 취득한다. 당해 취득한 화상 데이터에 대하여 화상 해석을 행함으로써 막힘율의 평가를 행한다. 구체적으로는, 도 1의 칩의 주유로(23)(유로 파트(25a))를 평가한다. 본 실시예와, 비교예 1 및 비교예 2에서의 유로 파트(25a)의 평가는, 시료혈을 흘려 보내기 시작하고 나서 30~90분 후에 행한다. 실시예에서는 막힘은 관찰되지 않고, 비교예 1 및 2에서 막힘이 관찰되었다. 이하, 막힘이 발생한 비교예 1을 나타내는 도 8을 참조하여, 구체적인 막힘율의 평가 방법에 대하여 설명한다.
도 8에는 비교예 1에서의 유로 파트(25a)의 관찰상(상단) 및 그 스케치(하단)가 나타나 있다. 도 8은 도 1의 영역 VI으로 나타낸 부분의 확대도이다. 막힘율의 평가는 구획(12)에 대하여 행한다. USB 카메라(호잔 주식회사) 아래에 시료혈을 계속 흘려 보내고 있는 상태의 칩을 배치한다. 칩을 평면에서 보면서 관찰상을 취득한다. 칩을 HOZAN USB cam software로 촬영하여 도 8의 상단에 나타내는 화상 데이터를 얻는다. 화상 데이터는 ImageJ 소프트웨어에 읽어 들여, 동일 소프트웨어상에서 해석한다.
도 8에 있어서 화상 데이터로부터 구획(12)에 상당하는 영역(15)를 잘라낸다. 영역(15) 중의 총픽셀수를 구획(12)의 총면적으로서 취급한다. 영역(15) 중의 데브리부(16)를 육안에 의하여 유동부(17)와 구별한다. 데브리부(16)는 필러 밀집대(11)를 기점으로 축적된 데브리로 점유되어 있다. 「데브리」란, 시료혈에 포함되는 침전 원인 물질(CC)(도 5 참조)로부터 형성된 겔상의 물질이다. 이 데브리가 필러 밀집대(11) 중으로까지 들어가면 필러 밀집대(11)의 막힘의 원인이 된다. 데브리부(16)에 의하여 혈구의 흐름이 밀려난다. 이에 대하여 유동부(17)에서는 혈구가 원활하게 흐르고 있다.
도 8에 있어서 육안에 의하여 데브리부(16)와 유동부(17)의 사이에 선을 긋는다. 영역(15)에서 데브리부(16)를 제외한 부분, 즉 유동부(17)의 픽셀수의 총합을 얻는다. 이것을 유동부(17)의 면적으로서 특정한다. 영역(15)의 총면적으로부터 유동부(17)의 면적을 감산하여, 데브리부(16)의 추정 면적을 얻는다. 이 추정 면적을 데브리 면적으로 한다. 구획(12)의 총면적에서 차지하는 데브리 면적을 백분율로 구한다. 이러한 값을 막힘율로 한다.
도 9에는 비교예 2에 있어서의 유로 파트(25a)의 관찰상(상단) 및 그 스케치(하단)가 나타나 있다. 도 6에는 실시예 1에 있어서의 유로 파트(25a)의 관찰상(상단) 및 그 스케치(하단)가 나타나 있다.
상술한 바와 같이((4) 참조), 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 컬럼의 조건은 이하와 같다.
비교예 1은 컬럼을 구비하지 않는다. 즉, 비교예 1에서는 CL-6B 비즈 및 필터의 양방을 구비하지 않는다. 시료혈은 직접 혈구 분리 칩으로 도입된다.
비교예 2의 컬럼은 CL-6B 비즈가 충전되어 있지 않다. 즉, 비교예 2의 컬럼은 필터만을 구비하고, CL-6B 비즈는 구비하지 않는다. 필터의 그물은 격자상이고, 20μm 직경이다.
실시예의 컬럼은 CL-6B 비즈 및 필터의 양방을 구비한다. 컬럼에는 컷오프 직경 70μm의 CL-6B 비즈가 50μL 충전되어 있다. 필터의 그물은 격자상이고, 20μm 직경이다.
실시예 및 비교예 1, 2의 혈구 분리 칩의 막힘율을 이하의 표 2에 나타낸다. 당해 막힘율은, 시료혈을 90분간 흘려 보낸 시점에서의 막힘율이다.
Figure pct00003
표 2에 나타내는 바와 같이, CL-6B 비즈 및 필터의 양방을 구비하지 않는 비교예 1에서는, 막힘율은 46.6%였다. 또, 필터만을 구비하고, CL-6B 비즈는 구비하지 않는 컬럼을 갖는 비교예 2에서는, 막힘율은 96.5%로 상승하여, 구획(12)의 대부분이 막힘을 일으키고 있었다. 이것은, 필터 단독으로는 막힘을 억제하지 않는 것을 나타내고 있다. 도 8 및 도 9에 나타내는 바와 같이, 각 비교예에서는 필러 밀집대(11)로부터 데브리가 이어져서 막힘을 발생시키고 있는 것으로 추측된다. 한편, 비교예 2에서는 비교예 1에 비하여 막힘율이 상승하고 있다는 점에서, 필터에 의하여 데브리의 원인인 침전 원인 물질이 발생하기 쉬워지는 것으로 생각된다.
이에 대하여, CL-6B 비즈 및 필터의 양방을 구비하는 컬럼을 갖는 실시예에서는 데브리가 관찰되지 않아, 막힘율은 0.0%였다. 이상의 결과로부터, CL-6B 비즈 및 필터를 구비하는 컬럼은 데브리의 발생을 억제할 수 있다. 따라서, 막힘의 해소에 적합한 혈액 분리용 디바이스를 제공하는 것이 가능해진다. 한편, 본 실시예 및 각 비교예에 있어서 사용한 혈액은, 채혈 후 3일 경과한 혈액이다. 그와 같은 혈액이더라도, 소량의 비즈를 이용함으로써 태아 유래 유핵 적혈구 등의 희소 세포를 회수하는 것이 가능해진다.
<참고예>
도 10은, 컬럼을 이용하지 않고 분급을 행하고 있는 모습을 나타내는 참고예이다. 도면은, 미세 유로(20)에 혈액(BL)과 함께 다공질재(51)를 흘려 넣는 모습을 나타내는 부분 정면 단면도이다. 혈액(BL)은 무핵 적혈구(27), 유핵 세포(29a~29c) 및 침전 원인 물질(CC)을 포함한다. 다공질재(51)는 예를 들면 침전 원인 물질(CC)과 상호 작용하여, 미세 유로(20) 중의 막힘 해소 효과를 구비하는 것이다.
도 10에서 미세 유로(80)는 도 5에서 설명한 하층의 미세 유로이다. 미세 유로(80)는 입구(81a)와 주유로(83)를 구비한다. 입구(81a)는 미세 유로(20)의 입구(21a)와 동등하다. 주유로(83)는 미세 유로(20)의 주유로(23)와 동등하다.
도 10에서는 혈액의 흐름을 검은색 화살표로 나타낸다. 혈액(BL)은 미세 유로(20)의 입구(21a)를 경유하여 주유로(23)로 들어간다. 혈액(BL)이 흐르기 시작할 때는, 다공질재(51)가 입구(81a)에 쌓인다. 입구(21a)에는 쌓이지 않는다. 주유로(23)나 주유로(83)에는 다공질재(51)가 진입하지 않는다. 즉, 혈액(BL)이 흐르기 시작할 때에는, 입구(81a)에 충전된 다공질재(51)가 혈액(BL)과 상호 작용한다. 한편, 입구(21a)에서는 다공질재(51)가 충전되어 있지 않기 때문에 다공질재(51)에 의한 막힘 해소 효과를 얻을 수 없을 가능성이 있다. 즉, 혈액(BL)과 함께 흘려 넣는 다공질재(51)의 양이 적은 경우, 유로 칩(70)의 상부에서 다공질재(51)에 의한 미세 유로(20) 중의 막힘 해소 효과에 불균일이 발생할 수 있을 가능성이 있다. 이에 대하여, 컬럼에 CL-6B 비즈 및 필터의 양방을 구비하는 실시예에서는, 혈액(BL)이 주유로(23)에 들어가기 전에 혈액(BL)과 CL-6B 비즈가 반응하기 때문에, 분급되기 전에 침전 원인 물질을 제거할 수 있다. 따라서 특히 비즈의 양이 적은 경우에 본 실시예에 따른 컬럼을 구비하는 혈액 분리용 디바이스는 유리하다.
또한, 본 발명은 상기 실시형태에 한정된 것은 아니고, 취지를 벗어나지 않는 범위에서 적절히 변경하는 것이 가능하다. 예를 들면 혈구 분리용 디바이스는 그 외의 혈액용 디바이스여도 된다. 일례에 있어서, 혈액용 디바이스는 컬럼과, 컬럼의 하류에 위치하는 미세 유로를 구비한다. 컬럼은 다공질재를 고정상으로서 구비한다. 다공질재와 접촉한 혈액이 미세 유로에 흐른다. 일례에 있어서, 혈액용 디바이스는 혈액 분석 디바이스이다. 혈액은 미세 유로 내에서 물리적으로 혹은 화학적으로 분석된다.
이 출원은, 2019년 10월 23일에 출원된 일본 출원 제2019-192420호를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시의 전부를 여기에 원용한다.
1 혈구 분리용 디바이스
11 필러 밀집대
12 구획
13 필러 밀집대
14 구획
15 영역
16 데브리부
17 유동부
20 미세 유로
21a, 21b 입구
22a~22c 출구
23 주유로
25a~25d 유로 파트
26a, 26b 분기 유로
27 무핵 적혈구
28 합류부
29a~29c 유핵 세포
30 시린지
35 시린지
50 컬럼
51 다공질재
52 수용부
53a, 53b 필터
54 연결부
55 연결부
56 튜브
60 컬럼 본체
70 유로 칩
71 입구
72 출구
80 미세 유로
81a 입구
83 주유로
BL 혈액
CC 침전 원인 물질
CF 컷오프 직경
CL 청징액
F1-F3 획분

Claims (10)

  1. 컬럼과 상기 컬럼의 하류에 위치하는 미세 유로를 구비하는 혈액용 디바이스로서,
    상기 컬럼은 다공질재를 고정상으로서 구비하고,
    상기 미세 유로에 상기 다공질재와 접촉한 혈액이 흐르는, 혈액용 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다공질재는 입자로 이루어지고,
    상기 컬럼은, 상기 다공질재를 수용 가능한 수용부를 더 구비하며, 상기 수용부의 하류의 상기 미세 유로에 가까운 쪽에, 상기 다공질재의 입자를 트랩하는 필터를 더 구비하고,
    상기 다공질재의 입자로부터는, 컷오프 직경 이하의 입자경을 갖는 작은 입자가 미리 제거되어 있으며,
    상기 필터의 눈크기는 상기 컷오프 직경보다 작은, 혈액용 디바이스.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 컷오프 직경은 25~100μm의 범위에 있는, 혈액용 디바이스.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 필터가 갖는 그물의 직경은 20~40μm의 범위에 있고, 이 범위는 컷오프 직경 미만인, 혈액용 디바이스.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 입자경 분포를 가짐과 함께, 그 체적 기준의 누적 분포에 있어서의 중앙 입자경 d50V가 25~280μm이되, 상기 입자경 분포는 컷오프에 의하여 상기 작은 입자를 제거하기 전의 입자경 분포를 나타내는, 혈액용 디바이스.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용부의 상류의 상기 미세 유로에서 먼 쪽에, 상기 다공질재의 입자를 트랩하는 필터를 더 구비하는, 혈액용 디바이스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미세 유로에 상기 다공질재와 접촉한 혈액이 흐르면, 상기 미세 유로가 상기 혈액 중의 혈구를 수력학적으로 분급하는, 혈액용 디바이스.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 미세 유로는, 필러 밀집대와 상기 필러 밀집대의 하류에 위치하는 수력학적 유로를 구비하는 평면적인 칩으로 만들어져 있고,
    상기 컬럼이 상기 평면적인 칩의 표면 또는 이면에 대하여 접속하며,
    상기 미세 유로로부터 상기 혈액용 디바이스의 외부에 상기 수력학적으로 분급된 혈구를 방출하는 출구를 더 구비하는, 혈구 분리용의, 혈액용 디바이스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다공질재는 입자로 이루어지고,
    상기 다공질재의 입자는, 다당류, 실리카 또는 수지로 이루어지는 다공질성의 표면을 구비하는, 혈액용 디바이스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 혈액용 디바이스의 사용 방법으로서,
    상기 혈액용 디바이스는 상기 컬럼과 상기 미세 유로가 별체로서 제공되는 것이고, 상기 컬럼은 연결부를 가지며, 상기 미세 유로는 입구를 갖고, 상기 연결부와 상기 입구를 연결함으로써 상기 컬럼과 상기 미세 유로를 일체화시키고 나서 혈액을 상기 컬럼으로부터 통과시키는, 혈액용 디바이스의 사용 방법.
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