TW201927353A - 用於血液樣本之細胞分離的微流體裝置及方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示大致上有關一種用於血液樣本之細胞分離的微流體裝置及方法。該微流體裝置包含一組用於接收該血液樣本之入口；一組流體連接至該入口之出口，其包含一第一廢物出口、一輸出樣本出口及一第二廢物出口；及一組流體連接該入口至該出口之微流體通道。該組微流體通道包含用於接收從該入口過來之血液樣本之一螺旋微流體通道；及流體連接至該螺旋微流體通道之一弧形微流體通道。該螺旋微流體通道分別從該螺旋微流體通道之內側及外側分岐成該弧形微流體通道及第一廢物出口。該弧形微流體通道分別從該弧形微流體通道之內側及外側分岐成該輸出樣本出口及第二廢物出口。該輸出樣本出口配置成用於收集相對於該血液樣本實質上耗減紅血球的輸出樣本。

Description

用於血液樣本之細胞分離的微流體裝置及方法
發明領域
本揭示大致上有關一種用於血液樣本之細胞分離的微流體裝置及方法。更具體地，本揭示描述用於該血液樣本之細胞分離的微流體裝置之各實施例，以及使用該微流體裝置進行該血液樣本之細胞分離的方法。
發明背景
血液樣本之分析已證實可用於不同的應用，諸如研究紅血球(RBC)之變形性，及從血液中分離/單離細胞，如血小板、血漿及白血球以及如循環腫瘤細胞(CTC)及胎兒細胞之稀有細胞。母血中之胎兒細胞的分析對產前診斷非常重要。
目前產前診斷之方法需要以如絨毛膜取樣(CVS)及羊膜穿刺/羊水檢測(AFT)之侵入性程序獲得胎兒細胞，其對胎兒及母體均帶來相關的風險。侵入性程序侷限於評估可能具有胎兒染色體或基因異常/病症風險較高的病人。侵入性程序不適合用於一般孕婦族群的常規篩選。
已花了很多努力於開發可替代此等標準侵入性產前診斷方法之非侵入性產前診斷(NIPD)。目前的一個替代方法是以血漿游離循環胎兒DNA (cell-free circulating fetal DNA)之分析為基礎的非侵入性產前基因檢測(NIPT)。NIPT不是一種診斷測試，而是其評估結果為一個篩選值，其估算胎兒染色體或基因異常/病症之風險。被評估具有較高風險之病人，必須通常標準的侵入性方法如CVS或AC驗證，以便確定是否有任何胎兒基因缺失的存在。
另一標準侵入性方法之替代方法是從母血中單離出完整胎兒細胞，然後使用單離胎兒細胞直接進行胎兒染色體或DNA的分析，此對母體及胎兒二者而言風險最小[Bianchi, D. W., et al.,Prenatal Diagnosis 2002, 22 (7), 609-615]。然而，胎兒細胞很稀少，1毫升母血之50億個紅血球中，有約1至10個胎兒紅血球母細胞。因此在使用習知樣本製備方法單離胎兒細胞方面，有技術上的困難[van Wijk, I. J., et al.,American Journal of Obstetrics and Gynecology 2001, 184 (5), 991-997；Vona, G., et al.,The American Journal of Pathology 2002, 160 (1), 51-58]。
因為胎兒細胞以及其它如循環腫瘤細胞與幹細胞之細胞在血液中極少，因此在分析之前通常需通過細胞富集或細胞分離過程來單離其等。用於從母血中分離/單離胎兒細胞之已知的樣本製備方法包括梯度離心、免疫磁微球、膜過濾、螢光流式細胞分選法(FACS)及磁珠標記細胞分選法(MACS)。梯度離心(根據細胞密度)及膜過濾(根據細胞大小)能夠除去背景中的紅血球，但容易發生胎兒細胞流失。此二種方法在製程中亦會富集白血球(WBC)，使得下游的胎兒紅血球母細胞之分離及分析變得複雜。FACS及MACS需要使用專一性陽性抗體來結合標的細胞，然而尚未有已知的表面抗原確定只在胎兒細胞上表達，導致富集產率及純度不佳。此外，此等習知方法是勞力密集、耗時的，且可能無法達到高富集/純化的胎兒細胞，因為此等方法高度仰賴處理母血之技術人員的技術與經驗。
近年來，微流體由於其尺度小、樣本及試劑量少及裝置成本低之先天的優點，已成為能夠進行細胞分離[Bhagat, A. A. S., et al.,Med Biol Eng Comput 2010, 48 (10), 999-1014]及定點照護分析[Yager, P., et al., Nature 2006, 442 (7101), 412-418]之技術。
已經開發出幾種基於尺寸單離胎兒細胞之微流體技術。例如，已開發出一種根據“決定性側向位移”之理論，從母血中單離出胎兒紅血球母細胞之微流體策略[Huang, R., et al.,Prenatal Diagnosis 2008, 28 (10), 892-899]。簡言之，將全血樣本注射進入微流體裝置/晶片之微柱陣列中，使較大的有核細胞(白血球及紅血球母細胞)連續地偏離較小的紅血球。之後從晶片中洗出有核細胞，進一步基于順磁特性單離紅血球母細胞。此系統可在2至6個小時內處理大約5至20毫升之血液，且其成功地在58個母血樣本中單離出紅血球母細胞(大約37.44個細胞/毫升)。然而，微柱陣列中之阻塞問題會影響細胞分離的性能。
另一微柱微流體裝置/晶片係開發用於根據細胞尺寸及變形性，從母血中物理性捕捉有核細胞[Mohamed, H., et al.,Journal of Chromatography A 2007, 1162 (2), 187-192]。通過使用尺寸範圍從2.5至15µm之柱間隔，使用2.5µm間隔通道捕捉鵝紅血球。鵝紅血球用作為胎兒細胞的模型，因為其等具有相似的尺寸。然而，通量很低(大約350µl/小時)，不適合用於處理臨床相關的血液樣本量(每個血液樣本大約10至20ml)。再者，取得被捕獲在該裝置中之細胞以供下游分析有一定複雜度。
其它使用微流體之細胞分離方法包括使用具有1µm間隔尺寸之氣動微流體裝置[T. Kumo, et al.,In Concentration and extraction chip of fetal nucleated red blood cell (nRBC) by microgap with diaphragm for fetal DNA diagnosis from maternal blood, 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, Groningen, The Netherlands, Groningen, The Netherlands, 2010; pp 1583-1585]；連續掃流過濾[Lee, D., et al.,Journal of Chromatography A 2010, 1217 (11), 1862-1866]；介電泳[Guolin, X., et al.,Journal of Physics: Conference Series 2006, 34 (1), 1106]及整合免疫磁性分離之仿生血漿撇取[Kersaudy-Kerhoas, M., et al.,Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition 2014, 99 (Suppl 1), A2-A2]。然而，缺少使用母血樣本之實驗，且需要更多的驗證來評估此等方法用於臨床檢測之效率。此文獻報導一種使用羥基磷灰石/幾丁聚醣奈米粒子和免疫劑抗CD147來純化胎兒細胞之基于親合力的微流體單離方法[He, Z., et al.,Journal of Materials Chemistry B 2017, 5 (2), 226-235]。此生物晶片已經過使用臍帶血及母血樣本之驗證，包括針對單離有核細胞進行胎兒染色體疾病(三染色體13及21)之螢光原位雜交(FISH)分析。
美國專利公開案2013-0130226 A1揭示一種具有螺旋微流體通道之微流體裝置，其基於患病細胞之尺寸及迪恩(Dean)流動力學，從全血樣本中分離出細胞[Di Carlo, D., et al.,P Natl Acad Sci USA 2007, 104 (48), 18892-18897]。此微流體裝置是用於從全血中分離出諸如循環腫瘤細胞[Hou, H. W., et al.,Sci Rep-Uk 2013, 3]、白血球[Wu, L. D., et al.,Anal Chem 2012, 84 (21), 9324-9331]及微生物[Hou, H. W., et al.,Lab on a chip 2015, 15 (10), 2297-2307]，供用於定點照護之分析及檢測。然而，雖然此微流體裝置在利用輸入的血液樣本流過微流體裝置耗減紅血球，而從血液中分離及富集標的細胞方面有幾分效果，然而仍有殘餘量的紅血球殘餘在輸出血液樣本中。根據一些實驗數據，輸出血液樣本可含約1%至5%之殘餘紅血球，而此紅血球污染可能會影響其後續的分析。
因此，為了克服及減少至少一個前述之問題和/或缺點，有需要提供一種可用於血液樣本之細胞分離且至少存在優於先前技術之改善和/或優點之微流體裝置及方法。
發明概要
根據本揭示之第一態樣，有一種用於血液樣本之細胞分離的微流體裝置。該微流體裝置包含一組用於接收該血液樣本之入口；一組流體連接至該入口之出口，其包含一第一廢物出口、一輸出樣本出口及一第二廢物出口；及一組流體連接該入口至該出口之微流體通道。該組微流體通道包含用於接收從該入口過來之血液樣本之一螺旋微流體通道；及流體連接至該螺旋微流體通道之一弧形微流體通道。該螺旋微流體通道分別從該螺旋微流體通道之內側及外側分岐成該弧形微流體通道及第一廢物出口。該弧形微流體通道分別從該弧形微流體通道之內側及外側分岐成該輸出樣本出口及第二廢物出口。該輸出樣本出口配置成用於收集相對於該血液樣本實質上耗減紅血球的輸出樣本。
根據本揭示之第二態樣，有一種使用本揭示之第一態樣的微流體裝置進行血液樣本之細胞分離的方法。該方法包含：將該血液樣本引入該組入口；使該血液樣本從該組入口通到該螺旋微流體通道；使從該螺旋微流體通道過來之血液樣本分岐成通到該弧形微流體通道之一中間樣本及通到該第一廢物出口之廢物；使從該弧形微流體通道過來之該中間樣本分岐成通到該輸出樣本出口之一輸出樣本及通到該第二廢物出口之廢物；及收集從該輸出樣本出口過來之該輸出樣本，其中該輸出樣本相對於該血液樣本實質上耗減了紅血球。
本揭示之優點為血液樣本分岐二次而改善了耗減紅血球之功效。因此輸出樣本相對於血液樣本實質上耗減了紅血球，如耗減至少99.5%。大量耗減輸出樣本中之紅血球，能有效地分離及單離有核細胞與紅血球，從而實質上富集輸出樣本中之有核細胞，以便隨後進行其改進的分析及測試。
該微流體裝置及方法因此可用於血液樣本之細胞分離。特別是，該微流體裝置及方法可藉由先使該血液樣本通過該螺旋微流體通道，再通過該弧形微流體通道，而分離及單離該血液樣本中之有核細胞與紅血球(見如圖1)。該螺旋微流體通道進行該血液樣本之第一次分岐，而該弧形微流體通道進行該血液樣本之第二次分岐。更具體地，該血液樣本被分岐成一中間樣本及廢物，之後該中間樣本被分岐成一輸出樣本及廢物。
因此在本文中揭示了根據本揭示之用於血液樣本之細胞分離的微流體裝置及方法。從下文中對本發明實施例(僅非限制性舉例)以及所附的圖式的詳細描述，本揭示之各種特徵、態樣及優點將變得顯而易見。
較佳實施例之詳細說明
在本揭示中，於特定圖式或參考到該圖式之相應的說明內文中，一指定元件之說明或一特定元件符號之考慮與使用，可涵蓋在另一圖式或相關說明內容中被認定為相同、相等或類似的元件或元件符號。在圖式或相關內文中“/”之使用，除非另有指示，否則應理解為“和/或”之意思。根據已知的數學定義，本文中所使用之術語“組”，相應於或定義為在數學上展現至少一個基數之非空有限元素組織(如，在本文中所定義之組，可對應於單元、單態或單一元件組或多元件組)。本文中有關特定數值或數值範圍的敘述，應理解為包括或為近似數值或數值範圍之敘述。
為了簡潔和清楚起見，本揭示之實施例的描述是針對根據附圖的微流體裝置和用於血液樣品之細胞分離的方法。雖然將結合本文提供的實施例來描述本揭示的各態樣，但是應該理解，其本意不在將本揭示限制於這些實施例。相反的，本揭示旨在涵蓋本文所述的實施例的替代，修改和等同物，其等包括在由所附申請專利範圍界定的本揭示範疇內。此外，在以下詳細說明中，闡述具體細節以便提供對本揭示的透徹理解。然而，本領域普通技術人員，即技術人員，將認識到，可以在沒有具體細節和/或在由特定實施例態樣組合產生的多種細節之情況下實踐本揭示。在許多情況下，沒有詳細描述已知的系統、方法、製程和組件，以免不必要地模糊本揭示的實施例態樣。
微流體裝置
本揭示之代表性或例示性實施例描述參照圖1之用於血液樣本之細胞分離的微流體通道100。該血液樣本含有紅血球(RBC)及一或多種其它類型之有核細胞(其為分離標的)之集合或混合物。特別是，使用微流體裝置100來分離及單離血液樣本中之某些有核細胞與紅血球。該有核細胞可為要從全血或其分離部分中分離及單離之白血球(WBC)，或要從母血或其分離部分中分離及單離之胎兒有核細胞。應可理解，本文中所使用之紅血球包括無核之成熟紅血球及未成熟紅血球(或網狀紅血球)。本文中所使用之術語“全血”意指沒有移除諸如紅血球、白血球、血漿或血小板之組份的人血。每1毫升全血中大約有50億個紅血球。本文中所使用之術語“母血”意指來自懷孕女性之全血。雖然本發明之裝置非常適合用於從全血樣本中分離或富集特定細胞，但應理解該裝置亦可用在部分分離的血液，只要裝載在該裝置上的樣本中具有感興趣的細胞。
微流體裝置100包含一組用於接收血液樣本之入口及一組流體連接至該組入口之出口。在許多如圖1所示之實施例中，該組入口包含一內入口102及一外入口104。內入口102及外入口104中之一個配置成用於接收該血液樣本，而另一個配置成用於接收鞘液。在某些其它實施例中，該組入口可由單一入口構成，用於接收該血液樣本或血液樣本與鞘液之混合物。在某些其它實施例中，該組入口可包含三個或多個用於接收該血液樣本及任擇地該鞘液之入口。
微流體裝置100進一步包含一組流體連接至該組入口之出口。該組出口包含一第一廢物出口106、一輸出樣本出口108及一第二廢物出口110。在許多如圖1所示之實施例中，第一廢物出口106、輸出樣本出口108及第二廢物出口110是流體連接至內入口102及外入口104。
微流體裝置100進一步包含一組流體連接入口102至出口104之微流體通道，具體地為微流體曲線通道。該微流體通道於本文之各種情況下稱作微通道。在許多如圖1所示之實施例中，該組微流體通道包含用於接收從該入口過來之血液樣本之一螺旋微流體通道112，及流體連接至螺旋微流體通道112之一弧形流體通道114。螺旋微流體通道112及弧形流體通道114各具有容許流體沿著曲線路徑或輪廓於其中流通之橫截面。據此，該血液樣本能夠從該入口通過螺旋微流體通道112及弧形流體通道114通到或流至該出口。
本文中所使用之二或多個微流體元件通過於其等之間形成一流體連接，而流體連接，如此一流體能夠連續地通過或流過該微流體元件且穿過該流體連接。在此使用之“微流體元件”定義為用於微流體之組件、結構或部件。
參照圖2A，該組入口被配置成，如通過灌注來接收或引入血液樣本。在許多實施例中，該組入口包含配置成彼此相鄰之一內入口102及一外入口104。內入口102定位在朝向螺旋微流體通道112之內側或壁，使得流體可從內入口102沿著螺旋微流體通道112之內側通過。該內側意指螺旋微流體通道112之徑向向內或凸側或壁。外入口104定位在朝向螺旋微流體通道112之外側或壁，使得流體可從外入口104沿著螺旋微流體通道112之外側通過。該外側意指螺旋微流體通道112之徑向向外或凹側或壁。內入口102及外入口104中之一個配置成用於接收或引入血液樣本，另一個配置成用於接收或引入鞘液。該鞘液可為補充0.5%BSA (牛血清蛋白)之1xPBS (磷酸鹽緩衝食鹽水)。選擇性地，該鞘液流可為適合紅血球之研究的培養基，諸如林格溶液RPMI、DMEM等等。
參照圖2B，螺旋微流體通道112配置成透過一第一分岐結點116將該血液樣本排至弧形微流體通道114及第一廢物出口106。具體地，該血液樣本從螺旋微流體通道112排至第一分岐結點116，通過分岐成為通到/流至弧形微流體通道114之一中間樣本以及通到/流至第一廢物出口106之廢物。如圖2B所示，弧形微流體通道114定位成朝向螺旋微流體通道112之內側或壁(徑向向內或凸側)，而第一廢物出口106定位成朝向螺旋微流體通道112之外側或壁(徑向向外或凹側)。在一些實施例中，於第一分岐結點116處，弧形微流體通道114及第一廢物出口106配置成具有範圍從30至150度(或更佳地從60至120度)之角距。在如圖2B所示之實施例中，該角距為約90度。螺旋微流體通道112因此從螺旋微流體通道112之內側及外側分別分岐成弧形微流體通道114及第一廢物出口106。
參照圖2C，弧形微流體通道114配置成透過一第二分岐結點118將該中間樣本排至輸出樣本出口108及第二廢物出口110。具體地，該中間樣本從弧形微流體通道114排至第二分岐結點118，通過分岐成為通到/流至輸出樣本出口108之一輸出樣本以及通到/流至第二廢物出口110之廢物。如圖2C所示，輸出樣本出口108及第二廢物出口110之位置彼此相鄰。具體地，輸出樣本出口108定位成朝向弧形微流體通道114之內側或壁(徑向向內或凸側)，而第二廢物出口110定位成朝向弧形微流體通道114之外側或壁(徑向向外或凹側)。在一些實施例中，於第二分岐結點118處，輸出樣本出口108及第二廢物出口110配置成具有範圍從30至150度(或更佳地從60至120度)之角距。在如圖2C所示之一實施例中，該角距為約90度。弧形微流體通道114因此從弧形微流體通道114之內側及外側分別分岐成輸出樣本出口108及第二廢物出口110。
第一廢物出口106包含一第一廢物通道120及從其引出之一第一廢物收集器122 (O1)，用於收集從該血液樣本分岐出之廢物。輸出樣本出口108包含一輸出樣本通道124及從其引出之一輸出樣本收集器126 (O2)，用於收集從該中間樣本分岐出之輸出樣本。第二廢物出口110包含一第二廢物通道128及從其引出之一第二廢物收集器130 (O3)，用於收集從該中間樣本分岐出之廢物。
在許多實施例中，第一廢物通道120比輸出樣本通道124及第二廢物通道128之每一個長。多餘的長度使得廢物從第一廢物出口106花更多的時間沿著第一廢物通道120流動。在第一廢物通道120中額外的停留時間能使廢物慢下來，如此其等可被適當地收集在第一廢物收集器122 (O1)中。相反的，輸出樣本通道124及第二廢物通道128中之流量低於第一廢物通道120。需要較少的停留時間，因此其等之長度較短。此外，在較低的流量下，該輸出樣本及廢物可分別被適當地收集在輸出樣本收集器(O2)及第二廢物收集器130 (O3)中。
在一實施例中，第一廢物通道120具有正弦曲線形狀或輪廓，而輸出樣本通道124及第二廢物通道128各為直線形。正弦曲線形的第一廢物通道120提供降低流量所需之多餘的長度。此外，正弦曲線形狀使得第一廢物通道120能被定位在微流體裝置100之較小的區域內，更有效地利用微流體裝置100中有限的空間。應能理解，第一廢物通道120可呈其它形狀或輪廓，以提供多餘的長度，同時有效地利用微流體裝置100中有限的空間。例如，第一廢物通道120可為曲折的、交替的、蜿蜒、蛇形或螺旋形輪廓。
方法
本發明之各實施例描述一種使用微流體裝置100進行血液樣本之細胞分離的方法200。參照圖3，方法200大致包含下列步驟：
a. 步驟202，將該血液樣本引入該入口組；
b. 步驟204，使該血液樣本從該組入口通到螺旋微流體通道112；
c. 步驟206，使從螺旋微流體通道112過來之該血液樣本分岐成通到弧形微流體通道114之一中間樣本及通到第一廢物出口106之廢物；
d. 步驟208，使從弧形微流體通道114過來之該中間樣本分岐成通到輸出樣本出口108之一輸出樣本及通到第二廢物出口110之廢物；及
e. 步驟210，收集從該輸出樣本出口過來之該輸出樣本，其中該輸出樣本相對於該血液樣本實質上耗減了紅血球。
微流體裝置100及方法200因此可用於血液樣本之細胞分離。特別是，可使用微流體裝置100及方法200，使血液樣本通過微流體裝置100之螺旋微流體通道112及弧形微流體通道114，分離及單離血液樣本中之紅血球與有核細胞。螺旋微流體通道112在第一分岐結點116處進行第一次分岐，而弧形微流體通道114在第二分岐結點118處進行第二次分岐。更具體地，螺旋微流體通道112將血液樣本分岐成一中間樣本及廢物，而弧形微流體通道114將該中間樣本分岐成一輸出樣本及廢物。該輸出樣本相對於該血液樣本實質上耗減了紅血球。在一些實施例中，該輸出樣本相對於該血液樣本耗減至少99.5%的紅血球。該輸出樣本中紅血球之實質上耗減，有效地分離及單離有核細胞(如白血球或胎兒有核細胞)與紅血球，從而實質上富集有核細胞於該輸出樣本中，用於改善其後續的分析及測試，諸如下游的基因分析/測試。
微流體裝置之尺寸特性
螺旋微流體通道112及弧形微流體通道114各具有一長度及一截面寬度與一截面高度之一橫截面，其界定出能夠分離血液樣本中之有核細胞及紅血球之長寬比。在此使用之長寬比是該微通道橫截面高度除以該微通道橫截面寬度之比。該長寬比提供適當的微通道橫截面，使得有核細胞能夠沿著該微通道橫截面之一部分流動，而剩餘的紅血球沿著該微通道橫截面之不同的部分流動。適當的長寬比使得有核細胞根據血液樣本中有核細胞與剩餘紅血球之結構差異，而沿著該微通道橫截面之不同部分流動。此結構特徵之一些例子包括，但不限於，細胞尺寸、剛性、變形性及黏附性(如，細胞黏附性)。
在許多實施例中，螺旋微流體通道112從該組入口到第一分岐結點116形成螺旋或螺旋樣形狀/輪廓。應可理解，該螺旋可定向成順時針或反時針形式。弧形微流體通道114具有曲線輪廓從第一分岐結點116延伸至第二分岐結點118。在一些實施例中，該曲線輪廓形成一圓弧，其被定義為曲線之一部位/部分或圓形圓周之一部位/部分。在如圖2C所示之其它實施例中，該曲線輪廓形成一圓弧部份114a及在圓弧部份114a前面之一直線部分114b。應可進一步理解到，該圓弧之方向取決於螺旋之方向，如此該中間樣本能夠從螺旋微流體通道112流至弧形微流體通道114並沿著其內側流動。
在如圖1中所示之一些實施例中，螺旋微流體通道112形成具有二個繞著其中心且具有曲率半徑為約0.9cm之完整環之螺旋。螺旋微流體通道112可具有約10cm之長度。螺旋微流體通道112之橫截面可具有約500μm之寬度及範圍從85至115μm之高度，產生介於4與6之間之長寬比。在一些實施例中，該橫截面高度為約95μm。
在如圖2C中所示之一些實施例中，弧形微流體通道114具有一圓弧部分114a及一直線部分114b。圓弧部分114a呈繞著其中心之半環形式，具有範圍從0.1至0.9cm (或更佳地從0.3至0.7cm)之曲率半徑。圓弧部份114a對向至少180度之中心角。直線部分114b有助於圓弧部分114a在微流體裝置100上之定位，使得具有足夠的空間形成圓弧部分114a。弧形微流體通道114之橫截面可具有約150μm之寬度及範圍從85至100μm之高度。在一實施例中，弧形微流體通道114具有約0.5cm之曲率半徑、約180度之中心角及約95μm之橫截面高度。圓弧部分114a之圓弧長度因此為約1.57cm。此外，直線部分114b具有約0.4cm之長度，產生總長度約2cm之弧形微流體通道114。
因為血液樣本流過弧形微流體通道114之流量小於流過螺旋微流體通道112之流量，所以弧形微流體通道114之長度比螺旋微流體通道112短。然而，從螺旋微流體通道112至弧形微流體通道114之流量的減少，可能導致流速的降低。在許多實施例中，弧形微流體通道114具有橫截面寬度(如，150μm)小於螺旋微流體通道112之橫截面寬度(如，500μm)。更具體地，計算橫截面寬度，使能夠以實質上恆定的流速流過螺旋微流體通道112及弧形微流體114。據此，可將螺旋微流體通道112及弧形微流體通道114中之流速維持在或接近一恆定值，而不需使用另一裝置，如流體泵，來促進弧形微流體通道114中之流速。
應可理解，在具有實質上恆定的流速下，沿著螺旋微流體通道112及弧形微流體通道114之流動雷諾數Re 是實質上恆定的。雷諾數Re 是一個會影響血液樣本之細胞分離的無因次參數，如下所述。
在一實施例中，第一廢物出口106具有約95μm之相同的橫截面高度及約350μm之橫截面寬度。此外，輸出樣本出口108及第二廢物出口110各具有約95μm之相同的橫截面高度及約75μm之橫截面寬度。
應可理解，微流體裝置100之各尺寸，可依照微流體裝置100將如何用於血液樣本之細胞分離做修改，如依照分離標的有核細胞之類型。
在許多實施例中，如熟悉此技藝之人士容易理解的，微流體裝置100是使用圖案化SU-8矽晶圓及標準軟微影技術，於聚二甲基矽氧烷(PDMS)材料中製得。可用於製造微流體裝置100之其它材料包括，但不限於，玻璃、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚(甲基丙烯酸甲酯) (PMMA)及環烯烴共聚物(COC)。
微流體裝置之流體特性
本文所使用之微通道是微流體曲線通道，諸如螺旋微流體通道112、弧形微流體通道114。當液體流經微通道，特別是具有螺旋形或輪廓如螺旋微流體通道112時，帕穗層流(Poiseuille flow)會受到離心力。離心力會干擾層流之拋物線流速剖面，且最大流速的位置會從微通道之橫截面中心朝微通道之外側移動，使得在最大流速位置及外側之間產生一個急劇的速度梯度。急劇的速度梯度會增加流體壓力，靠近外側的局部流體速度不足以平衡此壓差。此不平衡稱作迪恩(Dean)不穩定性，在微通道之上及下半部中引起二個反旋轉迪恩渦流形式之流體迴流[Dean, W. R.,Philos Mag 1928, 5 (30), 673-695]。為了平衡壓差，各迪恩渦流在微通道之橫截面中心與外側之間循環。迪恩渦流或二次流由無因次參數定義，稱作迪恩數De ，表示由於微通道中二次流引起之迪恩力。
迪恩數De 可由迪恩數方程式得到：

其中Re 是流體雷諾數，R 是微通道之曲率半徑，及Dh 是微通道水力直徑。在一些研究中，Dh 是微通道之最小維度，其通常是微通道的橫截面高度。
在微通道中流動之流體粒子，如血液樣本中之細胞，由於挾帶該流體粒子之橫向迪恩渦流或二次流之存在，而受到沿著迪恩渦流之流動方向的迪恩拖曳力。因此，當流體沿著微通道流動時，流體粒子在微通道之內與外側之間重複地移動。流體粒子在微通道中流動時之橫向遷移速度取決於迪恩數De 。流體粒子橫過的橫向距離，可根據“迪恩周期”定義。例如，一開始位在微通道內側附近之流體粒子遷移至下游微通道之外側，被視為完成半個迪恩周期。假如流體粒子回到微通道進一步下游的內側附近之起始位置，則其完成一個迪恩周期。因此，視微通道之長度而定，流體粒子可經歷一或多個迪恩周期或一部分的迪恩周期。
除了迪恩拖曳力之外，流體粒子亦會受到慣性升力，其可為剪力引起的(因拋物線流體速度剖面)和/或壁引起的(由於流體與微通道之側或壁之間的相互作用)。在微通道中流動之流體粒子會受到慣性升力及迪恩拖曳力之組合。較大的流體粒子受到慣性升力之影響較顯著，而較小的流體粒子受到迪恩拖曳力的影響較顯著。因為慣性升力與迪恩拖曳力之比率會隨不同粒徑而改變，因此流體粒子會根據其等之尺寸而在沿著微通道橫截面的不同位置處平衡。特別是，對於較小的流體粒子，在迪恩拖曳力的影響比慣性升力顯著之情況下，較小的流體粒子開始沿著迪恩渦流遷移，然後在較靠近微通道之外側平衡。對於較大的流體粒子，較大粒子受到慣性升力比迪恩拖曳力明顯，妨礙其等橫向遷移，導致其等在較靠近微通道的內側平衡。此導致形成二個不同的流，其等之後被收集到二個分開的出口。
研究指出，在沿著微通道橫截面之不同位置集中及平衡的流體粒子方面，粒徑大小ap與最小微通道維度Dh 之比值應為至少0.07 [Bhagat, A. A. S., et al.,Physics of Fluids 2008, 20, 101702]。較大的流體粒子產生大於0.07之比值，以致較大流體粒子受到非常大的慣性升力而產生粒子平衡。該比值亦可稱作慣性升力比，敘述如下：

在許多參照圖2A之實施例中，於方法200中，將血液樣本及鞘液灌注至微流體裝置100中。可使用已知的裝置如針筒和/或流體泵將該血液樣本及鞘液引入/灌注至入口。特別是，可將該血液樣本及鞘液以1000至2000μl/min之總流量分別引入外入口104及內入口102。在一些實施例中，該鞘液之流量為該血液樣本之流量的10倍。例如，可以範圍從100至200μl/min之流量將該血液樣本引入外入口104，而以範圍從900至1800μl/min之流量將該鞘液引入內入口102中。在一些實施例中，該血液樣本之流量是160μl/min，而該鞘液之流量為1600μl/min。該鞘液係引入用於擠壓在外入口104處之血液樣本，並使該血液樣本流侷限在螺旋微流體通道112之外側附近。
在灌注於微流體裝置100之前，可先稀釋血液樣本。例如，可將血液樣本稀釋成含有大約1千萬個紅血球/毫升，其中紅血球懸浮在1xPBS及0.5%BSA中。選擇性地，可在灌注至微流體裝置100期間，藉由與鞘液混合在一起稀釋血液樣本。
在另一實施例中，將血液樣本引入內入口102中，而將鞘液引入外入口104中。因此該鞘液擠壓在內入口102處之血液樣本，並使該血液樣本流侷限在螺旋微流體通道112之內側附近。藉由將該血液樣本侷限在螺旋微流體通道112之任一側附近，該血液樣本中之細胞可從大致上相同的位置橫向遷移。
參照圖2A及圖4A，當血液樣本流經螺旋微流體通道112時，較小的紅血球因迪恩渦流而受到迪恩拖曳力FD ，且當血液樣本沿著螺旋微流體通道112往下游流動時，朝螺旋微流體通道112之外側橫向回流。在一實施例中，將血液樣本引入內入口102中。血液樣本中之細胞從內側朝外側橫向回流，完成奇數個半迪恩周期。在另一實施例中，將血液樣本引入外入口104中。該血液樣本中之細胞從外側朝向內側橫向回流，然後再次回到外側，完成整數個迪恩周期。
較小的紅血球沿著螺旋微流體通道112之外側通至第一廢物出口106且收集成廢物。較大的有核細胞受到較強的慣性升力FL 且在靠近螺旋微流體通道112之內側平衡，然後通至弧形微流體通道114。據此，螺旋微流體通道112進行血液樣本之第一次分岐。具體地，血液樣本在第一分岐結點116處分岐成流至弧形微流體通道114之中間樣本(含較大的有核細胞)及流至第一廢物出口106之廢物(含較小的紅血球)。
參照圖2B及圖4B，當該中間樣本流經弧形微流體通道114時，有一些殘餘的紅血球留在該中間樣本中。該殘餘的紅血球因為較強的迪恩拖曳力FD 進一步在遠離內側而靠近外側處平衡，且沿著弧形微流體通道114之外側通至第二廢物出口110並收集成廢物。較大的有核細胞受到較強的慣性升力FL 且在靠近弧形微流體通道114之內側平衡，及通至輸出樣本出口108並收集成輸出樣本。據此，弧形微流體通道114完成該血液樣本之第二次分岐。具體地，該中間樣本在第二分岐結點118處分岐成流至輸出樣本出口108之輸出樣本(含較大的有核細胞)及流至第二廢物出口110之廢物(含殘餘紅血球)。
如上所述，慣性升力FL 及迪恩拖曳力FD 隨著不同的粒徑而變化。特別是，FL 及FD 二種力隨粒徑非線性縮放，且FL 及FD 之疊合決定在微通道橫截面內之平衡位置。因此，通過根據標的有核細胞之粒徑計算微通道尺寸及流速，可評估該標的有核細胞受到的FL 及FD 。該標的有核細胞會根據FL 及FD 之疊合而在沿著微通道橫截面之不同位置處平衡，從而幫助該標的有核細胞之分離及單離。
微通道高度變量
在許多實施例中，螺旋微流體通道112及弧形微流體通道114之橫截面具有範圍從85至115μm之微通道高度。在一實施例中，該微通道高度為95μm。如上文所述，粒子平衡取決於與上文之慣性升力比相關之粒徑及最短的微通道尺寸(微通道高度)。在微通道高度為95μm下，較大的有核細胞如大約10至12μm之白血球及紅血球母細胞，在微通道之內側附近平衡。大小約6至8μm之較小的紅血球在微通道之外側附近平衡。
進行螺旋微流體通道112之不同微通道高度之實驗，以表徵第一次分岐產生之紅血球耗減結果。特別地，測試三種微通道高度–約85至90μm、約95至100μm及約110至115μm。將血液樣本以160μl/min之流量灌注至微流體裝置100中，以表徵沿著螺旋微流體通道112之紅血球的流量。
在第一分岐結點116處之高速成像顯示，在160μl/min之流量下，紅血球隨著微通道高度之增加而傾向於進一步遠離螺旋微流體通道112之內側平衡。參照圖5A中之複合高速照片影像，在85至90μm之微通道高度下，有大量的紅血球進入弧形微流體通道114中，指出紅血球上存在慣性升力。在95至100μm及110至115μm之較高的微通道下，有較少量的紅血球進入弧形微流體通道114中，因為紅血球在朝螺旋微流體通道112之外側方向上受到更明顯的迪恩拖曳力。據此，至少95μm之微通道高度，對有效及大量將紅血球耗減進入第一廢物出口106是較佳的。
圖5B描述在第一分岐結點116處，於160μl/min流量下橫跨螺旋微流體通道112之橫截面寬度之紅血球平衡位置的強度線掃描圖表。原點定義為螺旋微流體通道112之內側，而陰影區域對應於進入弧形微流體通道114之分岐。可看到，大量的耗減了紅血球且進入弧形微流體通道114之紅血球的量最小，從而實質上富集血液樣本中之有核細胞。
樣本血比容變量
因為血液樣本中之細胞間的相互作用會影響紅血球的平衡及影響紅血球耗減的效率，所以改變血液樣本中之紅血球濃度，確定最適合在160μl/min流量下用於螺旋微流體通道112之樣本血比容。特別測試四種樣本血比容–每毫升血液樣本中具約5百萬、1千萬、5千萬及1億個紅血球。
參照圖6A，其顯示在第一分岐結點116處拍攝之複合高速照片影像，在160μl/min流量下，紅血球聚集帶隨著樣本血比容的增加而傾向於螺旋微流體通道112之橫向變寬。此導致在第一分岐結點116處之第一次分岐後，大量的紅血球進入弧形微流體通道114。
圖6B顯示在第一分岐結點116處，於160μl/min流量下橫跨螺旋微流體通道112之橫截面寬度之紅血球平衡位置的強度線掃描圖表。原點定義為螺旋微流體通道112之內側，而陰影區域對應於進入弧形微流體通道114之分岐。根據該強度線掃描圖表，最佳樣本血比容為約1千萬個紅血球/毫升血液樣本。在此紅血球濃度下，有最少的紅血球污染進入弧形微流體通道114，供用於在第二分岐結點118處之第二次分岐。
同樣地根據樣本血比容變量，在160μl/min相同流量下，評估該第一次分岐及第二次分岐後各紅血球耗減的效力。特別是，測試四種樣本血比容–約5百萬個、1千萬個、5千萬個及1億個紅血球/毫升血液樣本。在第二分岐結點118處進行高速照片影像，產生圖7A中所示之複合高速照片影像。
為量化RBC之耗減，收集及分析第一廢物收集器122 (O1)及第二廢物收集器130 (O3)中之廢物，以及輸出樣本收集器126 (O2)中之輸出樣本。參照圖7B，在每毫升5百萬至1千萬個紅血球之低樣本血比容下，在第一分岐結點116處之第一次分岐後有大量的紅血球耗減，耗減範圍從99.5%至99.8%，成為進入第一廢物收集器122 (O1)之廢物。
在每毫升5千萬至1億個紅血球之較高的樣本血比容下，於第一次分岐後之紅血球耗減範圍從95.3%至98.1%。此可由上文提及的紅血球帶變寬預期到。因為較小的紅血球朝弧形微流體通道114之外側遷移，所以在該第一次分岐後進入弧形微流體通道114之殘餘紅血球進一步耗減25.4%至25.9%之範圍。較小的紅血球之後在第二分岐結點118處之第二次分岐後分岐成進入第二廢物收集器130 (O3)之廢物。
因此，除了在第一分岐結點116處之第一次分岐外，該血液樣本在第二分岐結點118的第二次分岐，總體改善紅血球的耗減。相對於起始血液樣本，從輸出樣本收集器126 (O2)收集到之輸出樣本含有非常少的紅血球，顯示出微流體裝置100能有效的耗減紅血球。
流量變量
在許多實施例中，血液樣本是以範圍從100至180μl/min之流量引入內入口102或外入口104中。相應的鞘流之流量範圍從1000至1800μl/min。在一實施例中，樣本流量是160μl/min，而鞘流之流量為1600μl/min。
測試不同的樣本流量，以表徵在第一分岐結點116處之第一次分岐後的紅血球之耗減。特別是，測試四種樣本流量–約100μl/min、約130μl/min、約140μl/min及約160μl/min。對應的鞘流之流量據此設定在1000至1600μl/min之範圍內。
參照圖8A中之複合高速照片影像，在第一分岐結點116處之高速照片圖像顯示，在100μl/min之樣本流量下，紅血球帶靠近螺旋微流體通道112之內側。當樣本流量增加時，紅血球橫向遷移且紅血球帶朝螺旋微流體通道112之外側變寬。此是因為對於較小的紅血球，在較高的樣本流量下迪恩拖曳力FD 變得更明顯 。即，較小的紅血球具有較低的慣性升力比及可忽略的慣性升力FL 。
圖8B描述在第一分岐結點116處之紅血球平衡位置之強度線掃描圖表。原點定義為螺旋微流體通道112之內側，而陰影區域對應於進入弧形微流體通道114之分岐。可看到，由於FD 比FL 明顯，特別是在較高流量之下，所以有更大量的紅血球耗減成為進入第一廢物收集器122 (O1)之廢物，及進入弧形微流體通道114之紅血球的量最少，從而實質上富集在血液樣本中之有核細胞。
微珠模擬
在一些實施例中，將聚苯乙烯微珠132混合進入流體樣本，模擬全血中之有核細胞。微珠132可具有約10μm之大小，用以代表諸如白血球及紅血球母細胞之有核細胞，其等具有約10至12μm之大小。微珠132可為諸如經螢光異硫氰酸鹽(FITC)綴合的螢光，用以更清楚地照亮其等通過第一及第二分岐之流動。圖9A是描述在第一分岐結點116處微珠132之流動的螢光照片影像，而圖9B是描述在第二分岐結點118處微珠132之流動的螢光照片影像。
將含微珠132之流體混合物以160μl/min之流量灌注到微流體裝置100中。如圖9A所示，觀察到微珠132在螺旋微流體通道112之內側附近平衡成一緻密帶，且在第一分岐結點116處分岐進入弧形微流體通道114。該平衡是因為在微珠132上之慣性升力FL 比迪恩拖曳力FD 明顯。如圖9B所示，在第二分岐結點118處，觀察到微珠132仍然在弧形微流體通道114之內側附近平衡，且通過輸出樣本出口108排出並收集在輸出樣本收集器126 (O2)中。
圖9C顯示在弧形微流體通道114之開始及結束處之微珠132的螢光強度線掃描圖。原點定義為弧形微流體通道114之內側。可看到，當微珠132沿著弧形微流體通道114往下游流動時，微珠132之分佈朝弧形微流體通道114之內側移動。此顯示微珠132受到足夠的慣性升力FL 供其等朝弧形微流體通道114之內側橫向遷移，在第二分岐結點118進行第二次分岐。
微通道半徑變量
如上所述，微珠132因迪恩渦流而受到迪恩拖曳力FD 。該迪恩渦流由以上迪恩數方程式所述之迪恩數De 定義。在許多實施例中，螺旋微流體通道112之迪恩數De 範圍從5至10。在一實施例中，螺旋微流體通道112之迪恩數De 為約6.8。
在許多實施例中，弧形微流體通道114具有範圍從0.1至0.9cm (或更佳地從0.3至0.7cm)之曲率半徑。測試弧形微流體通道114之不同的曲率半徑，以表徵慣性升力FL 在微珠132上產生之平衡作用。特別是，測試三種曲率半徑–0.3cm、0.5cm及0.7cm。三種曲率半徑分別對應於約9.0、7.0及5.9之迪恩數De 。將該微珠流體混合物以不同流量灌注到微流體裝置100中–140μl/min、150μl/min及160μl/min。各曲率半徑對應於各流量，產生9種組合。圖10顯示各個組合之螢光照片影像，各螢光照片影像顯示在第二分岐結點118處微珠132之流動。
與之前觀察的相似，所有的組合之微珠132一開始在螺旋微流體通道112之內側附近平衡成一緻密帶，然後在第一分岐結點116處分岐進入弧形微流體通道114。因此，微珠132進入弧形微流體通道114，更靠近其內側。
在0.3cm之曲率半徑下，微珠132因De 最高而受到最明顯的FD ，導致微珠132從弧形微流體通道114內側快速的朝外側橫向遷移。特別是，在150及160μl/min之較高流量下，微珠132不符期望地分岐進入第二廢物出口110 (其通常是用於收集廢物)而不是輸出樣本出口108。
在0.7cm之曲率半徑下，微珠132因為De 最低而受到最不明顯的FD ，導致微珠132從弧形微流體通道114之內側慢慢的或可忽略地朝外側橫向遷移。然而，因為弧形微流體通道114在0.7cm曲率半徑下之長度為在約0.3cm曲徑半徑下的2.3倍，所以微珠132需要更多的時間流過弧形微流體通道114。在弧形微流體通道114中之此額外的停留時間容許微珠132朝外側橫向遷移，導致其等最後不符期望地分岐至第二廢物出口110。因此，0.3cm及0.7cm之曲率半徑對於細胞分離不是最適合的，因為無法成功地從起始流體混合物中分離及單離出微珠132。
相對於其它曲率半徑，在0.5cm曲率半徑下，弧形微流體通道114之FD 、De 及長度是中等的。微珠132仍在弧形微流體通道114之內側平衡，且不管流量如何，之後如所期望的在第二分岐結點118處分岐進入輸出樣本出口108。在0.5cm曲率半徑及160μl/min流量下觀察到最適合細胞分離之條件，因為成功地從起始灌注的混合物中分離及單離出微粒132。
方法應用–白血球
白血球(WBCs或leukocytes)與紅血球不同，因為其等具有核。有核白血球約12至15μm大，而紅血球較小，約6至8μm大。在一些實施例中，方法200用於富集從含全血之血液樣本中單離的白血球。具體地，使用微流體裝置100進行方法200，從全血中分離及單離出白血球。
將每毫升含約1千萬個紅血球之稀釋全血樣本，以各種流量(140、150及160μl/min)灌注到微流體裝置100中。參照圖11A中之複合高速照片影像，在第一分岐結點116處之高速照片影像顯示，大部分的紅血球分岐成進入第一廢物出口106之廢物，流向第一廢物收集器122 (O1)。較大的白血球在螺旋微流體通道112之內側附近平衡，然後分岐進入弧形微流體通道114。
參照圖11B中之複合高速照片影像，在第二分岐結點118處之高速照片影像顯示，白血球仍平衡在弧形微流體通道114之內側附近，且分岐成進入輸出樣本出口108之輸出樣本並收集在輸出樣本收集器126 (O2)中。此與在微球模擬中之觀察相似。可能存在從第一分岐結點116過來之流體中之殘餘的紅血球，在第二分岐結點118處分岐成進入第二廢物出口110之廢物，流向第二廢物收集器130 (O3)。
圖11C顯示在弧形微流體通道114之開始與結束處之白血球的明視野強度線掃描圖表。原點定義為弧形微流體通道114之內側。與在微珠模擬中之觀察相似，當白血球沿著弧形微流體通道114往下游流動時，白血球之分佈朝弧形微流體通道114之內側移動。
圖11D顯示針對各種類型的白血球，具體地嗜中性球(CD66b+)、單核球(CD14+)及淋巴球(CD3+CD19+)，在各種流量下進行的流式細胞測量分析(如，螢光活化細胞分選(FACS))。流式細胞測量分析指出，在輸出樣本中收集到大量所有類型的白血球。雖然流式細胞測量分析亦指出有一些白血球不符期望地被排至第一廢物收集器122 (O1)及第二廢物收集器130 (O3)中，但大部分的白血球成功地從起始血液樣本中分離及單離出來。
方法應用–胎兒有核紅血球
在母血中，或更具體地在母體內循環之周邊血中，有許多類型的胎兒有核細胞於其中循環。胎兒有核細胞之類型包括滋養細胞、紅血球母細胞、造血先驅細胞及淋巴細胞。紅血球母細胞是有核紅血球，非常適合用於非侵入式產前診斷(NIPD)，因為其等在母血中之生命周期短、與白血球之形態不同及可在懷孕早期檢測到。紅血球母細胞約10至18μm大，各含有由高度可變形膜包圍之大小約4至6μm的核。可依據CD71 (運鐵蛋白受體)、血型糖蛋白A (GPA)及CD36 (血小板活化素)表面標記富集紅血球母細胞[Bianchi, D. W., et al.,Prenatal Diagnosis 1993, 13 (4), 293-300]。然而，其等非常稀少，因為每毫升母血中僅有1至10個左右的紅血球母細胞[Takabayashi, H., et al.,Prenatal Diagnosis 1995, 15 (1), 74-77]。紅血球母細胞富集群可含高達50%母體來源的，而不是胎兒來源的[Troeger, C., et al.,Prenatal Diagnosis 1999, 19 (6), 521-526]。
在一些實施例中，方法200係用於富集從包含母血之血液樣本中單離的胎兒有核細胞。具體地，使用微流體裝置100進行方法200，從CD45+耗減的全血中分離及單離胎兒有核紅血球母細胞或有核紅血球(fnRBCs)。預先用羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)染料標記來自臍帶血樣本之富集的胎兒有核紅血球，然而將其加入CD45+耗減的全血中(稀釋至含約1千萬個紅血球/毫升)以產生用於微流體裝置100之血液樣本。將該血液樣本以各種流量(140、150、160及170μl/min)灌注於微流體裝置100中供用於使用方法200之微流體處理。之後從輸出樣本收集器126 (O2)收集輸出樣本。
進行流式細胞測量分析(如，FACS)，根據表面標記識別輸出樣本中之各種細胞類型。具體地，細胞類型包括依據CD71+ /GPA+ /CD45- /Hoechst+ 識別之胎兒有核紅血球、依據CD71- /GPA+ /CD45- /Hoechst- 識別之成熟紅血球及依據CD71+ /GPA+ /CD45- /Hoechst- 識別之未成熟紅血球(網狀紅血球)。
圖12顯示針對各種細胞類型，在各種流量下進行的流式細胞測量分析。流式細胞測量分析指出各種細胞類型在各種流量下之分離及單離效率。根據流式細胞測量分析，觀察到在140及150μl/min之較低流量下，在輸出樣本中回收80%至85%的胎兒有核紅血球。然而，有大量的成熟紅血球及網狀紅血球(0.5%至7%)污染，其不利於後續的分析。在160μl/min之流量下，雖然污染量較低(0.1%至0.9%)，但回收的胎兒有核紅血球之數量亦減少至60%。在170μl/min之流量下，胎兒有核紅血球回收量進一步減少至約50%，污染量(0.1%至0.3%)的改善可忽略。
該流式細胞測量分析因此顯示出，在最適當流量160μl/min下，輸出樣本中回收的胎兒有核紅血球之數量，及成熟紅血球與網狀紅血球之污染量達到適當的平衡。
方法應用–假定的胎兒紅血球母細胞
在一些實施例中，使用微流體裝置100進行方法200，從母血中分離及單離假定的胎兒紅血球母細胞(pfEBs)。首先獲得母體周邊血液，然後於磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)中以1：1之比率稀釋，接著在1800rpm下進行密度梯度離心15分鐘。收集在介面處之血液棕黃層(buffy coat)，且於PBS中清洗兩次。用抗CD45磁珠耗減白血球。將CD45- 細胞重新懸浮於PBS中(約1千萬個細胞/毫升)，產生用於微流體裝置100之血液樣本。將該血液樣本灌注於微流體裝置100中，供用於使用200之微流體處理。之後從輸出樣本收集器126 (O2)及第二廢物收集器130 (O3)中收集輸出樣本及廢物。
在輸出樣本收集器126 (O2)中收集到之細胞的平均數為約94,000個，指出紅血球之耗減效率極高且大量–耗減約99.8%的紅血球。此耗減效率與用於單離胎兒有核紅血球的相似。參照圖13，針對輸出樣本(來自輸出樣本收集器126 (O2))及廢物(來自第二廢物收集器130 (O3))進行流式細胞測量分析(如，FACS)，以識別各種細胞類型，即假定的胎兒紅血球母細胞、殘餘白血球、網狀紅血球以及成熟紅血球。
根據如圖13 (A及B)所示之流式細胞測量分析，觀察到在輸出樣本收集器126 (O2)中之假定的胎兒紅血球母細胞及殘餘白血球的數量，顯著地大於在第二廢物收集器130 (O3)中之數量。此外，如圖13 (C及D)所示，有大量移除的污染細胞(成熟紅血球和網狀紅血球)成為進入第二廢物收集器130 (O3)中之廢物。此結果突顯出微流體裝置100用於從母血分離、單離及富集稀有循環假定的胎兒紅血球母細胞之效率，具有最小的細胞損失及污染。
其它應用
如以上各實施例所述，微流體裝置100使用二種微通道–螺旋微流體通道112及弧形微流體通道114–以連續的方式配置，供用於進行全血樣本之依序的第一次及分岐。通過兩次根據慣性升力及迪恩拖曳力之組合之分岐，從血液樣本中依據尺寸大小分離出有核細胞。此細胞分離、單離或分揀技術或迪恩流分級(DFF)可在通過最少的手作處理血液樣本之情況下被動達成。迪恩流分級是根據迪恩渦流及慣性升力與迪恩拖曳力之組成所產生之流體粒子橫向遷移之原理。當慣性升力與迪恩拖曳力二者隨著粒徑非線性放大時，該橫向迪恩拖曳力提供卓越的分離分辨率[Kuntaegowdanahalli, S. S., et al.,Lab on a chip 2009, 9 (20), 2973-2980; Bhagat, A. A. S., et al., Lab on a chip 2008, 8 (11), 1906-1914]，且其等之疊加決定在微通道橫截面內之平衡位置。
使用微流體裝置100及方法200進行血液樣本之有核細胞的細胞分離。例如，可從全血中分離出白血球供後續的免疫研究，或可從母血中分離出胎兒有核細胞供後續的非侵入性產前診斷。在微流體裝置100之連續的配置中具有第一分岐結點116及第二分岐結點118，有利於以高通量或在160μl/min流量下大量地移除(如至少99.5%)較小的紅血球成為廢物。紅血球之大量的耗減有效地分離或單離有核細胞與紅血球，從而實質上富集有核細胞於輸出樣本中，供用於改善其後續的分析及測試。
微流體裝置100之紅血球耗減效率可通過上文所述之方法200的各種應用得到驗證。例如，一應用成功地達到從白血球耗減的母血樣本中單離出稀少假定的胎兒紅血球母細胞。因此，微流體裝置100能有效的分離循環胎兒有核細胞與母系紅血球，供產前診斷。在第一次及第二次分岐後及在高通量或160μl/min流量下，高度富集了胎兒有核細胞(紅血球母細胞)且大量的耗減了紅血球(如，至少99.5%)。胎兒有核細胞之大量富集可省卻紅血球水解之需求，水解可能會損害和/或改變胎兒有核細胞之形態。
在高流量下快速從母血中分離出稀少的紅血球母細胞對非侵入性產前診斷很重要。胎兒來源之紅血球母細胞含有非常有價值的胎兒基因組資訊，其可用於診斷胎兒非整倍體和/或單基因突變。此外，單離胎兒有核細胞之可能性，使得建立幾乎全部的懷孕女性族群可以獲得/可取得常規臨床產前測試成為可能。
此外，富集的胎兒紅血球有核細胞可能會有其它可能的下游及商業應用。例如，富集胎兒有核紅血球供後續使用DEPArrayTM 之單細胞單離，其是一種使用介電泳精準地單離單一細胞之基於半導體的系統。簡言之，中性粒子(如，細胞)可被困在穩定的懸浮中，這使得系統能夠進行基於螢光的分析，以區分目標細胞(胎兒細胞，如胎兒有核紅血球)和成千上萬的污染細胞(母體細胞，如母體紅血球)。然後選擇標的細胞並自動回收單個細胞，用於下游遺傳分析，避免可能損害遺傳分析的污染母體細胞的可能性。
本揭示之各實施例描述一種微流體裝置100，其具有一螺旋微流體通道112，用於在第一分岐結點 116處進行第次一分岐；以及一弧形微流體通道112，用於在第二分岐結點118處進行第二次分岐。應可理解，可存在額外的微流體通道組，如微流體曲線通道，用以在額外的分岐結點進行額外的分岐。
在前述詳細的說明中，係參照所提供之圖式來說明本揭示中有關用於血液樣本之細胞分離的微流體裝置及方法之實施例。本文對各種實施例的描述本意不在宣稱或僅限於本揭示的特定或特定陳述，而只是用於說明本揭示之非限制性例子。本揭示有助於解決至少一個所提到的問題及與先前技術相關的議題。雖然在本文中僅揭示本揭示之一些實施例，但對熟悉此技藝人士而言，基於本揭示顯而易見的是，可在不逸離本揭示之範疇之情況下，對該揭示的實施例做各種改變和/或修飾。因此，本揭示之範疇以及下列申請專利範圍之範疇不限於本文所述之實施例。
100‧‧‧微流體裝置
102‧‧‧內入口
104‧‧‧外入口
106‧‧‧第一廢物出口
108‧‧‧輸出樣本出口
110‧‧‧第二廢物出口
112‧‧‧螺旋微流體通道
114‧‧‧弧形微流體通道、弧形流體通道
114a‧‧‧圓弧部份
114b‧‧‧直線部分
116‧‧‧第一分岐結點
118‧‧‧第二分岐結點
120‧‧‧第一廢物通道
122、O1‧‧‧第一廢物收集器
124‧‧‧輸出樣本通道
126、O2‧‧‧輸出樣本收集器
128‧‧‧第二廢物通道
130、O3‧‧‧第二廢物收集器
200‧‧‧方法
202、204、206、208、210‧‧‧步驟
FD‧‧‧迪恩拖曳力
FL‧‧‧慣性升力
132‧‧‧微珠
圖1是根據本揭示之各實施例，用於血液樣本之細胞分離的微流體裝置之圖解。
圖2A至圖2C是根據本揭示之各實施例之微流體裝置的入口、螺旋微流體通道及弧形微流體通道之圖解。
圖3是根據本揭示之各實施例，用於血液樣本之細胞分離的方法之流程圖。
圖4A及圖4B是根據本揭示之各實施例之微流體通道的橫截面視圖解，其顯示迪恩(Dean)渦流及較大的有核細胞與較小的紅血球之細胞分離。
圖5A及圖5B是根據本揭示之各實施例中，與螺旋微流體通道之微通道高度變化相關的圖解。
圖6A及圖6B是根據本揭示之各實施例中，與螺旋微流體通道中血液樣本血比容變化相關的圖解。
圖7A及圖7B是根據本揭示之各實施例中，與弧形微流體通道中血液樣本血比容變化相關的圖解。
圖8A及圖8B是根據本揭示之各實施例中，與螺旋微流體通道中流量變化相關的圖解。
圖9A至圖9C是根據本揭示之各實施例，使用微流體裝置之微珠模擬的圖解。
圖10是根據本揭示之各實施例中，與弧形微流體通道之曲率變化相關的圖解。
圖11A至11D是根據本揭示之各實施例，使用微流體裝置從全血中分離出白血球之應用的圖解。
圖12是根據本揭示之各實施例，使用微流體裝置從母血中分離出胎兒有核紅血球之應用的圖解。
圖13是根據本揭示之各實施例，使用微流體裝置從母血中分離出假定的胎兒紅血球母細胞之應用的圖解。

Claims (18)

  1. 一種用於血液樣本之細胞分離的微流體裝置，該微流體裝置包含： 一組用於接收該血液樣本之入口； 一組流體連接至該入口之出口，其包含一第一廢物出口、一輸出樣本出口及一第二廢物出口；及 一組流體連接該入口至該出口之微流體通道，其包含 一螺旋微流體通道，其用於接收從該入口過來之血液樣本；及 一弧形微流體通道，其包含流體連接至該螺旋微流體通道之一唯一入口， 其中該螺旋微流體通道分別從該螺旋微流體通道之內側及外側分岐成該弧形微流體通道之該唯一入口及該第一廢物出口； 其中該弧形微流體通道分別從該弧形微流體通道之內側及外側分岐成該輸出樣本出口及第二廢物出口； 其中該輸出樣本出口配置成用於收集相對於該血液樣本實質上耗減紅血球的輸出樣本；及 其中該弧形微流體通道具有一橫截面寬度小於該螺旋微流體通道之橫截面寬度。
  2. 如請求項1之微流體裝置，其中該弧形微流體通道具有一圓弧部分，其形成繞著其中心之一部分環。
  3. 如請求項2之方法，其中該螺旋微流體通道及該弧形微流體通道之橫截面寬度使得通過其等之流量實質上恆定。
  4. 如請求項2或3之微流體裝置，其中該螺旋微流體通道及該弧形微流體通道之橫截面寬度分別為約500μm及150μm。
  5. 如請求項1至4中任一項之微流體裝置，其中該弧形微流體通道具有約0.5cm之半徑。
  6. 如請求項1至5中任一項之微流體裝置，其中該弧形微流體通道具有至少180度之圓心角。
  7. 如請求項1至6中任一項之微流體裝置，其中該螺旋微流體通道具有約0.9cm之半徑。
  8. 如請求項1至7中任一項之微流體裝置，其中各微流體通道具有約95μm之橫截面高度。
  9. 如請求項1至8中任一項之微流體裝置，其中該組入口包含一內入口及一外入口，一個用於接收該血液樣本，另一個用於接收一鞘液。
  10. 如請求項1至9中任一項之微流體裝置，其中該第一廢物出口包含一正弦曲線出口通道。
  11. 一種使用如請求項1至10中任一項之微流體裝置進行血液樣本之細胞分離的方法，該方法包含： 將該血液樣本引入該組入口中； 使該血液樣本從該組入口通到該螺旋微流體通道； 使從該螺旋微流體通道過來之血液樣本分岐成通到該弧形微流體通道之該唯一入口之一中間樣本及通到該第一廢物出口之廢物； 使從該弧形微流體通道過來之該中間樣本分岐成通到該輸出樣本出口之一輸出樣本及通到該第二廢物出口之廢物；及 收集從該輸出樣本出口過來之該輸出樣本， 其中該輸出樣本相對於該血液樣本為實質上耗減紅血球的。
  12. 如請求項11之方法，其中該組入口包含一內入口及一外入口，及其中將該血液樣本引入該內入口及該外入口之一者中。
  13. 如請求項12之方法，其進一步包含於該內入口及外入口之另一者中引入一鞘液。
  14. 如請求項13之方法，其中該血液樣本及該鞘液以1000至2000μl/min之總流量引入。
  15. 如請求項13或14之方法，其中該鞘液以約1600μl/min之流量引入。
  16. 如請求項11至15中任一項之方法，其中該血液樣本以約160μl/min之流量引入。
  17. 如請求項11至16中任一項之方法，其中該方法用於富集從包含母血之血液樣本中單離的胎兒有核細胞。
  18. 如請求項11至16中任一項之方法，其中該方法用於富集從包含全血之血液樣本中單離的白血球。
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