CN114901392A - 使用离心力从全血中直接和可扩展地分离循环胞外囊泡 - Google Patents

使用离心力从全血中直接和可扩展地分离循环胞外囊泡 Download PDF

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Abstract

本文的分离外泌体的方法包括提供具有螺旋形通道的微流体装置，该螺旋形通道与两个入口端口和至少两个出口端口流体连通。两个入口端口中的一个靠近螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近其外壁。该出口端口中的至少一个与用于储存分离的外泌体的容器流体连通。将血液样本和鞘液引入靠近外壁和内壁的入口端口以在螺旋形通道中形成稀释的样本，并驱动通过以在容器中回收外泌体。与第一出口端口流体连通的螺旋形通道包括第一出口通道，该第一出口通道将该螺旋形通道连接到该第一出口端口，并且比分别将该螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。

Description

使用离心力从全血中直接和可扩展地分离循环胞外囊泡
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月21日提交的新加坡专利申请第10201909776U号的优先权，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及从血液中分离外泌体的方法。本公开还涉及可操作以执行该方法的微流体装置以及基于该微流体装置和方法鉴定糖尿病(diabetes mellitus)的方法。
背景技术
胞外囊泡(EV)，包括外泌体(～50至200nm)和微泡(～100nm至1μm)，由细胞在生理或病理诱因下产生，并作为细胞间通讯的媒介。虽然血液中的循环EV是癌症和多尿病(diabetes)的有希望的诊断生物标志物，但血源性外泌体的分离涉及费力的超速离心或具有高蛋白质污染的商业沉淀试剂盒。
细胞成分高(约50％v/v)的血液的复杂性以及EV和血小板之间尺寸范围相似(～2至3μm)对EV的分离提出了巨大的技术挑战。EV分离的当前标准可能涉及多步差速和超速离心(通常～1,000×g，持续10分钟以去除细胞成分；～2,000×g，持续20分钟以获得无血小板血浆；～20,000×g，持续60分钟沉淀微泡；～175,000×g，持续70分钟以沉淀外泌体)。这样的标准可能通常用于纯化EV，但该过程很费力，并且EV的收率和纯度可能高度依赖于用户操作和采血方法。
在一个示例中，基于免疫磁珠的外泌体捕获似乎更有效，但可能取决于结合靶标而导致分析有偏差。
基于过滤和/或沉淀的商业产品也可用于从血清中分离EV。然而，尽管它们对用户友好，但纯度低于传统/标准方法，并且在洗脱后往往存在丧失EV功能性的风险。
已经开发了其他几种外泌体分离和检测微流体平台，其中最常见的是在微通道表面或微珠上使用成熟的外泌体表面标志物(CD81或CD63)进行亲和捕获。这些技术在血浆或血清样本中得到了证明，这些样本需要额外的样本处理(离心)步骤来使血细胞耗竭。这些装置的通量和流速往往较低(～4至20μL min-1)，因为它们需要促进外泌体在通道内结合或与捕获珠混合。这恰好限制了直接全血处理，因为大的红细胞会产生背景干扰，该背景干扰显著阻碍EV与抗体功能化表面的结合。
另一种策略是经由基于尺寸的排阻来通过膜错流过滤或通过使用硅纳米线的微孔纤毛微柱分离外泌体。这些无标记方法在捕捉EV时往往是非选择性的，从而导致更高的收率和无偏差的分析。通量可以通过更大的过滤占用空间(filtration footprint)轻松扩大，但装置操作在很大程度上受到堵塞问题和EV回收率低的限制。
在另一个示例中，开发了用于亚微米二元颗粒分选的被称为“高分辨率迪恩流分级(High-resolution Dean Flow Fractionation，HiDFF)”的微流体技术。HiDFF利用颗粒跨通道的非平衡差速迪恩迁移来实现小的微米颗粒和纳米颗粒(～50nm至1μm)的基于尺寸的连续分离。这提供了在高通量(～70至100μL min-1)下以高分离分辨率对小颗粒进行分级，并且可以在芯片外连续收集纯化的颗粒以用于下游分析。然而，这种技术可能是特定的，并且不能充分提供外泌体分离所需的分辨率。
因此，需要提供一种解决上述一个或多个限制的解决方案。该解决方案至少应提供分离EV(例如外泌体)的方法和/或具有低于300nm分离分辨率的多路EV分级工具。该解决方案还应提供从全血中直接分离循环外泌体的能力。
发明内容
在第一方面，提供了从血液中分离外泌体的方法，该方法包括：
提供具有螺旋形通道的微流体装置，该螺旋形通道与(i)两个入口端口和(ii)至少两个出口端口流体连通，其中，该两个入口端口中的一个靠近该螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近该螺旋形通道的外壁，其中，该出口端口中的至少一个与被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通；
将血液样本引入靠近该外壁的入口端口，并将鞘液引入靠近该内壁的入口端口，以在该螺旋形通道中形成稀释的样本；
驱动稀释后的样本通过该螺旋形通道；和
将外泌体回收于该容器中，
其中，该至少两个出口端口包括第一出口端口，该第一出口端口与该被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通，
其中，与该第一出口端口流体连通的该螺旋形通道包括第一出口通道，该第一出口通道将该螺旋形通道连接到该第一出口端口，并且比分别将该螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。
在另一方面，提供了可操作以从血液中分离外泌体的微流体装置，该微流体装置包括：
螺旋形通道，其与(i)两个入口端口和(ii)至少两个出口端口流体连通，其中，该两个入口端口中的一个靠近该螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近该螺旋形通道的外壁；和
与该出口端口中的至少一个流体连通的容器，其中，该容器被配置为储存分离的外泌体，
其中，该至少两个出口端口包括第一出口端口，该第一出口端口与该被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通，
其中，与该第一出口端口流体连通的该螺旋形通道包括第一出口通道，该第一出口通道将该螺旋形通道连接到该第一出口端口，并且比分别将该螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。
在另一个方面，提供了鉴定糖尿病的方法，该方法包括：
提供血液样本并将该血液样本引入上述方面的各个实施例中描述的微流体装置；
操作该微流体装置；和
根据上述第一方面的各个实施例中描述的方法分离外泌体以鉴定糖尿病。
附图说明
附图不一定按比例绘制，而是通常重点调放在说明本公开的原理上。在以下描述中，参考以下附图描述了本公开的各个实施例，其中：
图1A涉及描绘本公开的两入口、四出口螺旋微通道的设计的装置示意图。
图1B示出循环EV与全血的分离。在图1B中，在迪恩涡流的影响下，小颗粒(EVs和血小板ap/h<0.07)横向向内壁迁移。在内壁附近，颗粒的最内层瞬态位置由取决于尺寸的壁诱导惯性升力(FWL)确定，可用于以优越的分辨率进行小颗粒分离。
图2A显示了50nm珠子的荧光图像和CFD预测的出口区域处的流线，其中在出口1中具有0×阻力通道长度。ANSYS FLUENT用于模拟样本入口的流线。
图2B显示了50nm珠子的荧光图像和CFD预测的出口区域处的流线，其中在出口1中具有2.5×阻力通道长度。ANSYS FLUENT用于模拟样本入口的流线。
图2C显示了出口区域处的流线横截面图，其中在出口1中具有0×阻力通道长度。ANSYS FLUENT用于模拟样本入口的流线。
图2D显示了出口区域处的流线横截面图，其中在出口1中具有2.5×阻力通道长度。ANSYS FLUENT用于模拟样本入口的流线。
图3A显示了50nm、1μm、2μm和3μm珠子分离到不同出口的平均荧光复合图像。
图3B显示了每个出口中珠子分离效率的流式细胞术分析。O1、O2、O3、O4表示四个出口。
图3C显示了每个出口中珠子分离效率的扫描电子显微镜(SEM)图像分析。O1、O2、O3、O4表示四个出口。比例尺表示1μm。
图4A显示了RBC和血小板分离到出口3和4的高速堆叠图像。插图(中间图像中显示的框和最右图像中的框的放大图)以40倍放大率描绘了血小板。除血浆(0.3μL)外，所有样本均等量上样(15μL)。
图4B显示了纳米颗粒追踪分析(NTA)，分析了来自超速离心(UC)、HiDFF出口1(O1)和出口2(O2)的EV的尺寸。除血浆(0.3μL)外，所有样本均等量上样(15μL)。
图4C显示了来自超速离心(UC)、HiDFF出口1(O1)和出口2(O2)的EV的收率比较。除血浆(0.3μL)外，所有样本均等量上样(15μL)。
图4D显示了血浆、HiDFF出口和超速离心样本(微泡(MV)和外泌体)中外泌体标记CD9、膜联蛋白和组蛋白的表达的蛋白质印迹检测。除血浆(0.3μL)外，所有样本均等量上样(15μL)。
图5显示了报道的HiDFF装置设计从两出口到本申请四出口的改进，其中具有增加的2.5×阻力通道长度，并显示了它们各自的出口1洗脱液的NTA尺寸分析结果。
图6A显示了4个出口中总RNA的核苷酸(nt)和荧光强度(FU)的尺寸分布图。尺寸标记(内标)表明RNA为25nt。RNA表示核糖核酸。
图6B显示了来自超速离心、HiDFF出口1和出口2的外泌体RNA的叠加图，比较了RNA浓度。
图7A示出了本公开的堆叠装置(两层和三层)以实现更高的通量。
图7B显示了两层装置的顶层(左)和底层(右)中的2×血液分离高速图像。插图显示荧光50nm珠子类似地分离进入出口1。
图7C描绘了来自单层装置(左图)和两层装置(右图)的出口1的NTA结果，显示了相似的EV尺寸截止。
图7D显示了在三层装置中1μm珠子分选的荧光成像，示出了相似的流动谱，其中大部分从出口2排出。
图8A将第一代四出口HiDFF装置与本申请第二代两出口ExoDFF装置和本公开的四螺旋高通量ExoDFF(ExoDFFHT)装置进行比较。缩写“Gen”和“ExoDFF”分别表示术语“代”和“外泌体迪恩流分级(Exosomes Dean Flow Fractionation)”。第2代ExoDFF和ExoDFFHT具有较长的第一出口通道，如本文各个实施例中所述。
图8B描绘了荧光合成图像，该荧光合成图像显示第二代ExoDFF装置的出口1(O1)和出口2(O2)中50nm(最左的荧光合成图像-绿色)、500nm(中央荧光合成图像-黄色)、1μm(最右的荧光合成图像-红色)荧光珠子的分离。比例尺表示200μm。图8B还显示了在最佳流动条件(雷诺数为42)下沿装置通道宽度的荧光珠子的平均强度线扫描。
图9A显示了填充有红色染料以用于可视化的四螺旋ExoDFFHT装置的照片。对第1代(4出口)HiDFF、第2代(2出口)ExoDFF和第2代ExoDFFHT装置的出口1(O1)中200nm分离效率的量化表明两种不同流速下的分离效率相似。
图9B显示了ExoDFFHT出口区域的高速图像，表明血细胞的流动谱相似并且它们被移入较大的外壁废物出口(O2)。
图10A展示了来自所有4个ExoDFFHT螺旋和UC分离的小EV的颗粒浓度的NTA分析。除血浆(0.5μL)外，所有样本均等体积上样(15μL)。
图10B演示了与UC相比，来自第一代HiDFF、第二代ExoDFF和ExoDFFHT装置的EV分离效率更高。除血浆(0.5μL)外，所有样本均等体积上样(15μL)。
图10C显示了外泌体标志物TSG101、筏蛋白-1和CD9以及血浆的白蛋白和apoA-1的蛋白质印迹检测。除血浆(0.5μL)外，所有样本均等体积上样(15μL)。
图11A显示宽度为300μm的两入口、两出口半环ExoDFF装置的俯视图和横截面视图的示意图。
图11B显示了将PBS中的50nm(绿色)、500nm(黄色)、1μm(红色)珠子以不同流速分离到O1和O2的荧光合成图像(样本与缓冲剂的比例为1:10)。
图11C显示了将与1×稀释全血(含PBS)混合的50nm(绿色)、500nm(黄色)、1μm(红色)珠子以不同流速分离到O1和O2的荧光合成图像(样本与缓冲剂的比例为1:10)。
图11D演示了两种不同流速下入口1×稀释血样、O1和O2洗脱液的颗粒浓度和尺寸的NTA。
图12A显示宽度为500μm的两入口、两出口半环ExoDFF装置的的俯视图和横截面视图的示意图。
图12B显示了将PBS中的50nm(绿色)、500nm(黄色)、1μm(红色)珠子以不同流速分离到O1和O2的荧光合成图像(样本与缓冲剂的比例为1:20)。
图13A显示了示出RBC和血小板分离到作为废物出口的ExoDFF出口3(O3)和出口4(出口)的高速图像。插图(蓝框-中央图像和放大的最右图像)描绘了40倍放大倍率下的血小板流动位置。
图13B显示了使用NTA对ExoDFF O1和UC外泌体(UC exo)以及ExoDFF O2和UC MV制作的颗粒浓度和尺寸分布图。
图13C显示了分离后ExoDFF的不同出口处的EV浓度(n＝3)。
图13D比较了ExoDFF和UC(n＝3)之间的EV分离效率。
图13E描绘了UC exo和ExoDFF O1(n＝7)之间的EV收率比较(倍数变化)。**P<0.01，未配对Mann-Whitney检验。
图13F显示了外泌体标志物TSG101、筏蛋白和CD9以及血浆的apoA-1的蛋白质印迹检测。除血浆(0.5μL)外，所有样本均等体积上样(15μL)。
图13G是从ExoDFF O1分离的具有杯形形态的EV的透射电子显微镜(TEM)图像。比例尺表示100nm。
图13H是来自ExoDFFO1、O2和UC Exo的EV的MicroRNA定量。该图显示了总RNA核苷酸(nt)和荧光强度(FU)的尺寸分布。尺寸标记(内标)表明RNA为25nt。
图14A是使用ExoDFF从健康(n＝7)和T2DM对象(n＝5)分离的每mL全血(WB)的EV收率的比较。在所有情况下，该结果还与UC的结果进行了比较，数据使用平均值±s.e.m.呈现。*P<0.05和**P<0.01。
图14B显示了EV收率与HbA1c(％)的相关性。
图15显示了基于本方法开发的并结合本微流体装置的原型。该原型对于外泌体采样是非侵入性的，并且允许随着时间的推移收集多个样本并连续监测疾病进展和对治疗的反应。原型可以是自动化的，因为它在整个分离过程中规避/最大限度地减少了人为干预，从而也减少了人为错误。此外，由于本装置提供的稳定操作参数，结果可在多次运行中重现。该原型可以是低成本的，因为它可以基于连续流基础进行操作，这与涉及多个过程的方法相比减少了在途时间，从而降低了操作成本和整体分离时间。该原型是可靠的，因为它可以在不涉及抗体标记或损害采样目标的情况下分离外泌体。相反地，涉及标记的方法往往成本高、耗时且容易产生偏差。
图16比较了本方法和微流体装置(参见图像的中央和最右列)，与其中出口通道到所有出口端口的长度相同的方法和微流体装置相比，本方法和微流体装置包括一个将螺旋形通道连接到第一出口端口的更长的出口通道。最右图像表示的方法和微流体装置提供了最理想的外泌体分离结果。
具体实施方式
以下详细描述参考了附图，这些附图通过说明的方式显示了可以实施本公开的具体细节和实施例。
在实施例的上下文中描述的特征可以相应地适用于其他实施例中相同或相似的特征。在实施例的上下文中描述的特征可以相应地适用于其他实施例，即使这些特征在这些其他实施例中没有明确描述。此外，针对在实施例的上下文中的特征描述的添加和/或组合和/或替代可以相应地适用于其他实施例中的相同或相似特征。
本公开介绍了直接从全血中快速且连续地分离胞外囊泡(例如外泌体)的策略，该策略促进和改善了离心诱导的迪恩迁移在例如螺旋微流体装置中的影响。该策略允许可扩展的、基于单步尺寸的外泌体纯化，无需超速离心或额外的标记或处理步骤。
该策略包括提供改进的分离或分级分辨率以分离样本中的胞外囊泡(例如外泌体)的方法和装置。样本可以是血液样本。本方法和微流体装置提供了优于现有方法的几个优点，即它是无标记的，能够以高通量直接处理全血，并且可以以微米级和纳米级的特征工作而不会堵塞。本文中的术语“分离”和“分级”可以互换使用。
下文描述本方法和微流体装置的各个实施例的细节，以及与各个实施例相关的优点。各个实施例和优点也通过本文下文进一步提供的示例来演示。
在本公开中，提供了一种从血液中分离外泌体的方法。该方法包括提供具有螺旋形通道的微流体装置，该螺旋形通道与(i)两个入口端口和(ii)至少两个出口端口流体连通，其中，该两个入口端口中的一个靠近该螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近该螺旋形通道的外壁。出口端口中的至少一个可以与被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通。
本方法可包括将血液样本引入靠近该外壁的入口端口，并将鞘液引入靠近该内壁的入口端口，以在该螺旋形通道中形成稀释的样本。可以借助注射器、通过将装置浸入样本中或通过其他方式引入血液样本和鞘液。
两个入口端口中的一个靠近螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近螺旋形通道的外壁，这促进并改善弯曲通道(即螺旋形通道)中惯性聚焦分离的影响。弯曲通道中的这种惯性聚焦分离在本文中可以称为“迪恩流分离”。换句话说，所描述的两个入口端口的布置有助于在螺旋形通道中建立流动条件，使得作用在外泌体上的力有利地使样本中的外泌体完全分离。
此外，由于两个入口端口中的一个靠近螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近螺旋形通道的外壁，以本文描述的方式引入血液样品和鞘液也有助于外泌体受到迪恩流的显著影响，使得外泌体在排出螺旋形通道之前被引导至螺旋形通道的内壁。换言之，当外泌体在螺旋形通道中流动时，外泌体经受向心力，该向心力驱动外泌体朝向作为螺旋形通道曲率“中心”的点。按照这种流动形态，可以容易地理解，螺旋形通道的内壁是靠近“中心”的壁，螺旋形通道的外壁是远离“中心”的壁。本文中的术语“靠近”在其含义内包括“...附近”、“在...处”或“在...近处”。
本文中的术语“鞘液”是指多种流体，包括水性或非水性流体和/或可包含额外材料组分(例如可溶性化学组分或至少部分不溶性组分的悬浮液或乳液)的流体。作为非限制性示例，鞘液可以是与血细胞相容的缓冲剂，例如磷酸盐缓冲盐水(缩写为PBS)。本文中的术语“缓冲剂”是指控制它们溶解或分散的环境的pH值的任何化合物或化合物的组合。关于pH值，缓冲剂会减弱添加到缓冲溶液中的酸或碱的影响。缓冲剂通常可以根据它们的溶解度分为两类。可以单独或组合使用两类缓冲剂。“水溶性缓冲剂”在水中的溶解度通常为100ml中至少1gm、75ml中至少1gm、或30ml中至少1gm等。水溶性缓冲剂的实例包括但不限于PBS、葡甲胺、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钾、酒石酸钠、乙酸钠、甘油磷酸钙、氨丁三醇、氧化镁或前述物质的任意组合。“水不溶性缓冲剂”在水中的溶解度通常在1,000ml中小于1gm，在5,000ml中小于1gm，或在10,000ml中小于1gm等。水不溶性缓冲剂的实例包括但不限于氢氧化镁、氢氧化铝、二羟基铝碳酸钠、碳酸钙、磷酸铝、碳酸铝、二羟基氨基乙酸铝、氧化镁、三硅酸镁、碳酸镁以及前述物质的组合。缓冲剂也可以补充有支持剂，如盐类、去污剂、BSA(牛血清白蛋白)等。
本方法可包括驱动稀释后的样本通过螺旋形通道和将外泌体回收在该容器中，其中，至少两个出口端口包括第一出口端口，该第一出口端口与被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通，稀释的样本可以由毛细吸力驱动。或者，稀释后的样本可以由任何泵通过电力或通过用于驱动样本通过入口、螺旋形通道和离开出口的其他方式驱动。
在本方法中，与第一出口端口流体连通的螺旋形通道包括第一出口通道，该第一出口通道将该螺旋形通道连接到该第一出口端口，并且比分别将该螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。本文中的“出口通道”是指将螺旋形通道连接到出口端口的通道。例如，第一出口通道是将螺旋形通道连接到排出外泌体的第一出口端口的通道。第一出口通道在本文中如此命名，因为它是连接到第一出口端口并且与第一出口端口流体连通的通道。因此，第二/第三/第四出口通道是指分别连接到第二/第三/第四出口端口并且与第二/第三/第四出口端口流体连通的相应通道。仅通过非限制性示例的方式以蛇形通道的形式演示了第一出口通道(参见本文的示例部分，也参见例如图16)。可以使用其他使第一出口通道比其他出口通道更长的设计。第一出口通道可以成形为蛇形通道，以提供更长的流路供外泌体排出。有利地，更长的第一出口通道提供了更大的流体阻力，这种更大的流体阻力为在第一出口中完全分离的外泌体提供了更好的分离分辨率。这是由于输出到第一出口通道的较小流量有利地特异性洗脱外泌体，其中外泌体定位在内壁处和/或靠近内壁，同时防止任何较大的颗粒通过第一出口通道和第一出口端口排出。在各个实施例中，由于第一出口通道可以是唯一的长度比其他出口通道长的通道，因此第一出口通道可具体称为“第一连接通道”，其中该表述中的术语“第一”表示螺旋形通道与第一出口端口的连接。
在各个实施例中，第一出口通道可以具有0.5cm至1.5cm、1cm至1.5cm等的长度。这可以提供收集整个体积输出的一小部分(例如～0.5％至4％)以及收集从内壁区域排出的流体的优势。
进一步有利地，本方法避免了对离心步骤(即使用离心机)的需求。换句话说，该方法不包括离心步骤。
在各个实施例中，引入血液样本和鞘液可以包括以与引入血液样本的流速相比更高的流速引入鞘液。例如，引入血液样本和鞘液可以包括：将血液样本引入靠近外壁的入口端口，并且将鞘液引入靠近内壁的入口端口，流速比为1:5至1:50、1:10至1:50、1:20至1:50、1:30至1:50、1:40至1:50等。这些流速比有助于最初将血液样本限制在通道外壁上，以便具有受控且更紧密的迪恩诱导性的外泌体向内壁的横向迁移，从而实现有效的外泌体分离。
在各个实施例中，螺旋形通道可以定义为具有150μm至500μm、200μm至500μm、250μm至500μm、300μm至500μm、350μm至500μm、400μm至500μm、450μm至500μm等的宽度。这些通道宽度维度适用于处理高细胞浓度样本(例如全血)，且通道堵塞问题最小。
在各个实施例中，螺旋形通道可以定义为具有30μm至100μm、40μm至100μm、50μm至100μm、60μm至100μm、70μm至100μm、80μm至100μm、90μm至100μm等的高度。这些通道高度维度有助于防止较大的细胞(～5um至20um)靠近外泌体所迁移到的或外泌体所在的内壁流动。
在各个实施例中，螺旋形通道可以定义为具有3cm至10cm、4cm至10cm、5cm至10cm、6cm至10cm、7cm至10cm、8cm至10cm、9cm至10cm等的长度等。这些通道长度维度使得在螺旋形通道中形成足够稳定以诱导外泌体迁移到螺旋形通道内壁的次级迪恩涡流。
在各个实施例中，螺旋形通道可以定义为具有3比7、4比7、5比7、6比7等的宽高比。这些纵横比有助于防止较大的细胞(例如～5um至20um)靠近外泌体所迁移到的或外泌体所在的内壁流动。
在各个实施例中，螺旋形通道可以定义为具有0.3cm至1cm、0.4cm至1cm、0.5cm至1cm、0.6cm至1cm、0.7cm至1cm、0.8cm至1cm、0.9cm至1cm等的曲率半径。这些曲率半径使得在螺旋形通道中形成次级迪安涡流。螺旋形通道的曲率半径是从螺旋形通道的横截面中心到“向心”中心所测得的距离，使得所测量的半径与在螺旋形通道中流动的流体的运动正交。换言之，向心中心是路径曲率中心的固定点。
由于一个或多个维度在微米级范围内，螺旋形通道在本文中可称为“螺旋形微通道”。螺旋形通道可具有上述尺寸和/或比例中的一个或多个。在某些实施例中，螺旋形通道可以是半螺旋形通道。这意味着螺旋形通道是形成半圆形的通道(参见例如图11A和/或12A)。这种半螺旋形通道在本文中可互换地称为“半环”。半螺旋形通道可具有5mm到25mm、10mm到25mm、15mm到25mm、20mm到25mm、5mm到10mm、5mm到15mm、5mm至20mm、10mm至20mm、10mm至15mm、15mm至20mm等的长度。有利地，半螺旋形通道增加流体通过螺旋形通道的流速。
在各个实施例中，两个入口端口可以以螺旋形通道围绕入口端口水平螺旋的方式布置，并且至少两个出口端口可以远离螺旋形通道布置(参见例如图1A、图8A)。在某些实施例中，两个入口端口可以远离螺旋形通道布置，并且至少两个出口端口可以以螺旋形通道围绕至少两个出口端口水平螺旋的方式布置(参见例如图8A)。
在各个实施例中，驱动稀释后的样本可以包括驱动稀释后的样本在螺旋形通道中流动，以具有20至100、30至100、40至100、50至100、60至100、70至100、80至100、90至100等的雷诺数，和/或2至10、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10、9至10等的迪恩数。如本文所用，雷诺数是指ρυL/μ，其中p代表液体的密度，υ代表液体的速度，L代表流动通道的特征长度，μ代表液体的粘度。如本文所用，迪恩数是指雷诺数(基于通过直径为D的通道的轴流υ)与曲率比平方根的乘积，即Re√[D/(2Rc)]，其中Rc是通道路径的曲率半径。
在某些实施例中，至少两个出口端口可以包括四个出口端口。出口端口的数量可能取决于要从样本中分离的除外泌体以外的成分。
在各个实施例中，螺旋形通道可以逐渐扩大或分叉至500μm至3000μm的宽度。换言之，连接到一个或多个出口端口的螺旋形通道的端部可以分叉到连接它们各自的出口端口的出口通道。在某些实施例中，第一出口端口和/或第一出口通道可具有20μm至100μm的宽度，并且其他出口端口和/或其他出口通道则具有加起来高达500μm至3000μm的宽度。作为一个示例，螺旋形通道可以逐渐扩大或分叉至1000μm的宽度，其中第一出口端口和/或第一出口通道的宽度可以是50μm，第二出口端口和/或第二出口通道的宽度可以是50μm，第三出口端口和/或第三出口通道的宽度可以是50μm，第四出口端口和/或第四出口通道的宽度可以是第四出口可以是800μm。
在各个实施例中，第一出口端口可具有20μm至100μm、30μm至100μm、40μm至100μm、50μm至100μm、60μm至100μm、70μm至100μm、80μm至100μm、90μm至100μm等的宽度。这样的宽度有助于基于尺寸分离外泌体，增加分离的外泌体的收率。
本公开还提供了一种可操作以从血液中分离外泌体的微流体装置。在用于第一方面的方法的各个实施例中描述的实施例和优点可以类似地适用于本文随后描述的本微流体装置，反之亦然。由于上文已经描述了各个实施例和优点并且在本文中演示了示例，因此为了简洁起见，不应重复叙述。
微流体装置包括：螺旋形通道，其与(i)两个入口端口和(ii)至少两个出口端口流体连通，其中，该两个入口端口中的一个靠近该螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近该螺旋形通道的外壁；和与该出口端口中的至少一个流体连通的容器，其中，该容器被配置为储存分离的外泌体。
在各个实施例中，至少两个出口端口包括第一出口端口，该第一出口端口与该被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通，其中，与该第一出口端口流体连通的该螺旋形通道包括第一出口通道，该第一出口通道将该螺旋形通道连接到该第一出口端口，并且比分别将该螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。
在各个实施例中，第一出口通道可以具有0.5cm至1.5cm的长度。第一出口通道的其他长度已经在上文与第一方面的方法有关的实施例中进行了描述。
在各个实施例中，靠近螺旋形通道的内壁的入口端口是可操作的从而以比靠近螺旋形通道的外壁的入口端口更高的流速引入鞘液。
在各个实施例中，靠近螺旋形通道的出口壁的入口端口和靠近螺旋形通道的内壁的入口端口是可操作的从而以1:5至1:50的流速比引入血液样本和鞘液。其他流速比已经在上文与第一方面的方法有关的实施例中进行了描述。
螺旋形通道可定义为具有150μm至500μm的宽度、30μm至100μm的高度、3cm至10cm的长度、3至7的宽高比，和/或0.3cm到1cm的曲率半径。其他维度和比例已经在上文与第一方面的方法有关的实施例中进行了描述。
螺旋形通道可以是半螺旋形通道。半螺旋形通道可以具有如第一方面的方法的各个实施例中描述的长度。
在各个实施例中，两个入口端口可以以螺旋形通道围绕入口端口水平螺旋的方式布置，并且至少两个出口端口可以远离螺旋形通道布置。在某些实施例中，两个入口端口可以远离螺旋形通道布置，并且至少两个出口端口可以以螺旋形通道围绕至少两个出口端口水平螺旋的方式布置。
至少两个出口端口可以包括四个出口端口。
螺旋形通道可以逐渐扩大或分叉至500μm至3000μm的宽度。
第一出口端口可以具有20μm至100μm的宽度。
本微流体装置可以用于离体和/或体外识别多尿病，例如糖尿病。如上所述以及在本文的示例部分中，可以从对象抽取样本，例如血液样本。然后，无需对象在场，例如，可以将血液样本注入本微流体装置中。
本公开还提供了一种识别多尿病例如糖尿病的方法，该方法可以包括：提供血液样本并将该血液样本引入根据上述各个实施例描述的微流体装置中，操作该微流体装置，和根据第一方面的各个实施例中描述的方法分离外泌体以鉴定糖尿病。
针对第一方面的本方法和针对微流体装置描述的实施例和优点可以类似地适用于本文描述的识别糖尿病的本方法，反之亦然。由于上文已经描述了各个实施例和优点并且在本文中演示了示例，因此为了简洁起见，不应重复叙述。本方法和微流体装置用于鉴定2型糖尿病的演示/应用在下文示例部分中进行了描述。
“基本上”一词不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，本公开的定义中可以省略“基本上”一词。
在各个实施例的上下文中，关于特征或元素使用的冠词“一”、“一个”和“该”包括对一个或多个特征或元素的引用。
在各个实施例的上下文中，标点符号“～”、术语“约”或“大约”应用于数值时包含准确值和合理差异。
如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
除非另有说明，否则术语“包括”和“包含”及其语法变体旨在表示“开放性”或“包含性”的措辞，使得它们包括所列举的元素但也允许包含额外的未列举的元素。
示例
本公开涉及可操作以从血液中分离胞外囊泡、特别是或具体是外泌体的方法和微流体装置。
本方法和微流体装置可能涉及，例如使用两入口和至少两出口(例如四出口)系统螺旋微通道，所述两入口和至少两出口(例如四出口)系统螺旋微通道可以演示将EV(外泌体(～50至200nm)和微泡(～100nm至1μm)、血小板(～2μm)和血细胞(>8μm)基于尺寸多路分离到不同出口。本方法和微流体装置提供了无标记、低成本的EV纯化方法，该方法具有理想的高通量(～20μL未稀释全血(WB)/分钟)、可通过装置堆叠进行扩展、以及与超速离心相比提供更高的外泌体收率。WB表示全血。螺旋形通道由于其微米级的维度而在本文中被称为“螺旋形微通道”。本文中的术语“螺旋”和“螺旋形”可互换使用来描述通道的结构。
本方法和微流体装置涉及螺旋形或曲线通道，怀疑含有外泌体的样本可以在该通道中流动。螺旋形或曲线通道可至少具有第一端和第二端，其中螺旋形通道可具有靠近第一端(即，位于第一端处或第一端附近)的至少两个入口端口和靠近第二端的至少两个出口端口，其中至少两个出口端口包含第一出口端口(O1)，该第一出口端口(O1)可以与提供更大的流体阻力的额外通道长度流体连通，从而为外泌体分离提供低于300nm的分离分辨率。如上所述，该额外通道长度在本文中可称为“第一连接通道”或“第一出口通道”。
在某些实施例中，连接到第一出口端口(O1)的额外通道长度可以是例如0.5cm至1.5cm。连接到第一出口端口(O1)的额外通道长度可以是例如0.5cm至1.5cm，并且具有例如1uL/min至15uL/min的流速。第一出口端口(O1)靠近或位于内壁区域。换言之，将第一出口端口定位为接收在螺旋形微通道的内壁区域附近流动的外泌体。出口端口(O1)将收集总体积输出的一部分(～0.5至4％)。
在各个实施例中，微流体装置可具有多于一个流动通道以允许多路进行。
有利地，本微流体装置允许低于300nm的分离分辨率。有利地，所提出的微流体装置能够从全血中完全分离外泌体。
本方法和微流体装置在本文中可称为“HiDFF”技术和/或“ExoDFF”技术。本方法和微流体装置通过非限制性示例进一步详细描述，如下文所述。
示例1：本方法和微流体装置设计
使用标准软光刻技术在聚二甲基硅氧烷(PDMS)中制造两入口、四出口螺旋微器件(300μm(w)×50μm(h))，该两入口、四出口螺旋微器件的半径为0.5cm至0.6cm，总长度约为6.5cm(图1A)。样本(50μm宽)和鞘(250μm宽)入口分别固定在通道的外壁和内壁。在出口分叉处，通道逐渐扩展为具有优化的非均匀流体阻力的四出口系统，以促进基于细微尺寸差异的EV分离。最靠近通道内壁的出口设计为用于收集外泌体(出口1)和较大的微泡(出口2)，而较大的血小板和血细胞被收集在靠近通道外壁的出口(分别为出口3和4)。
在装置操作期间，稀释的WB(1:1)通过外入口灌注，而鞘缓冲剂(1×磷酸盐缓冲盐水(PBS))通过内入口以更高的流速(1:10)灌注以将样本流限制在外壁附近。当较小的血液成分(血小板和EV，粒径(ap)/水力直径(Dh)<0.07)穿过通道时，它们会受到横向阻力(FD)并由于迪恩涡流的影响而向内壁迁移(图1B)。在内壁附近，由于取决于尺寸的壁诱导惯性升力(FWL)，它们占据差速最内瞬态(非平衡)位置，以高分辨率尺寸分级进入出口1至3。受到显著斯托克阻力(Stoke’s drag)的较大血细胞保持更靠近外壁并通过出口4排出(参见图1B中的右图)。
示例2：装置操作
使用ANSYS FLUENT进行计算流体动力学(CFD)建模以研究出口设计。外泌体由于其微小尺寸(<200nm)而被认为表现得像流体颗粒，并且从样本入口开始并贯穿整个通道来追踪它们的流线。首先通过改变出口1的通道长度(表示为0×和2.5×阻力)来研究出口1的通道阻力。然后在出口1的不同通道长度之间比较实验获得的50nm荧光珠子的流动轨迹和使用CFD预测的流线轮廓(图2A和2B)。由于2.5×阻力设计中通道长度越长，水力阻力越高，进入出口1的流量减少了约2.11倍，这使得能够收集最靠近内壁的流体流线子集(表示为橙色线，即朝向图2B中右下图像顶部的流线)。尽管2.5×阻力设计中4个出口的流线分布稍大。可以通过实验看出，50nm珠子带(模拟外泌体)被有效地收集到出口1。这一点被CFD流线谱的横截面图(图2C和2D)进一步证实，这表明在2.5×阻力设计中靠近出口1的流线更加集中。相反，流体流线在0×阻力设计中占据更宽的位置，因为大多数流线进入出口1和2，导致进入出口2的外泌体大量损失。
示例3：本装置的结果和讨论
为了表征本装置并研究流速条件，使用定义尺寸(例如50nm、1μm、2μm、3μm)的聚苯乙烯荧光微珠(ap/h<0.07)来使流线位置可视化，并展示出成功的多路珠子分离(图3A)。还通过流式细胞术和扫描电子显微镜(图3B和3C)对珠子分离效率进行量化，以确认基于尺寸的珠子分级进入不同的出口。
作为全血处理的概念验证，全血用PBS以1:1的比例稀释并灌注到HiDFF装置中。高速成像清楚地表明，分别通过出口3和4有效去除了血小板(～2至3μm)和较大的血细胞(～5至15μm)(图4A)。然后使用纳米颗粒追踪分析(NTA)对HiDFF分选的EV(出口1、2)进行表征。HiDFF出口1(O1)显示EV回收率略低于出口2(O2)，但具有更均匀的外泌体群(单个主峰在约80nm处)，并用于进一步的外泌体分析(图4B和4C)。有趣的是，与由相同起始血量进行超速离心相比，HiDFF O1的EV收率提高了约50％，并且蛋白质印迹(外泌体标志物(CD9)、微泡/凋亡小体标志物(膜联蛋白和组蛋白))也证实了外泌体富集在HiDFF O1(图4D)。与报道的HiDFF设计(即具有2个出口但没有阻力通道的第一代装置)相比，当前四出口HiDFF设计针对出口1产生了显著更小和更均匀的尺寸范围(图5)，这展示了出口1中额外的2.5×阻力通道长度对于小颗粒分离的重要性。此外，Bioanalyzer分析表明HiDFF O1中的microRNA比超速离心增加，这有利于下游RNA分析(图6A)。RNA表示核糖核酸。为了进一步增加处理通量，将本公开的相同HiDFF装置(2至3层)堆叠，以便以相似的EV分离性能实现约40μL至60μL未稀释的WB/min的处理时间(图7A)。
示例4：本装置的参数
下文列出了可用于本装置的某些参数的非限制性示例。这些参数用于在结构上描述本装置，而不旨在将设备限制为这些参数。
入口构造：
样本入口设置在螺旋通道的外侧。
鞘入口设置在螺旋通道的内侧。
样本与鞘的流速比可以是1:5至1:50。
通道构造：
通道长度：3cm至10cm
通道宽度：150μm至500μm
通道高度：30μm至100μm
通道纵横比(宽/高)：3至7
曲率半径：0.3cm至1cm
可操作雷诺数范围：20至100
可操作迪恩数范围：2至10
样本可以沿着顶部和底部通道壁从外壁向内壁区域迁移。
出口构造：
外泌体出口可以在螺旋通道的内壁。
出口设计可以有超过1个出口，最多10个出口。
外泌体出口可以收集总体积输出的一部分(～0.5％至4％)。
外泌体出口宽度可以为20μm至100μm。
实施例5A：使用本装置从全血中直接分离循环纳米级外泌体和微泡以实现2型糖尿病中的快速血管风险分析
胞外囊泡(EV)是健康和疾病中细胞内通讯的介质。尽管对液体活检中基于EV的生物标志物非常感兴趣，但由于难以以高收率和可重复性从全血中分离EV，因此临床实用性仍然有限。惯性微流体广泛用于细胞分离(直径～10至20μm)，但由于颗粒平衡聚焦(particle equilibrium focusing)的惯性力可忽略不计，因此对于较小的纳米颗粒(<1μm)仍然具有挑战性。本装置是一种独特的微流体分离技术，该技术用于使用基于惯性的方法从全血中直接分离循环EV。这种无标记方法能够基于螺旋微通道中的差速壁诱导升力从全血中同时对纳米级EV(外泌体，直径50nm至200nm)和中等大小EV(微泡(MV)，直径100nm至1μm)进行分级。除了实现EV收率的三倍增加和细胞成分的完全耗竭外，由于剪切诱导的血小板裂解最小，与超速离心(UC)相比，温和的分选方法还导致血小板来源的MV显著(十倍)减少。在对健康(n＝9)和2型糖尿病(T2DM)(n＝12)对象进行的初步临床研究中，使用本方法在T2DM患者中检测到更高的EV水平(P<0.05)，并且通过对分选的EV进行免疫表型分析，确定了“高风险”T2DM对象亚组，其血小板(CD41a+)或白细胞来源(CD45+)MV量异常高(～10至50倍)。体外内皮细胞试验进一步显示，与健康和T2DMEV相比，“高风险”T2DM EV诱导显著更高的血管炎症(ICAM-1表达)(P<0.05)，因此反映了促炎表型。总体而言，此处呈现的方法是一种可扩展且通用的EV研究工具，可减少体力劳动、成本和处理时间。这促进使用液体活检进一步开发基于EV的诊断，并且组合EV免疫和功能表型策略可用于T2DM的快速血管风险分层。
示例5B：高通量ExoDFF(ExoDFFHT)
本方法和微流体装置是通用于迎合本文所公开的多路策略的另一个示例，其中出口和入口的位置被切换以创建另一个第二代HiDFF(以下称为第二代ExoDFF)，使得每个子单元螺旋的入口可以在不修改出口设计的情况下而被轻松连接，其中缩写“ExoDFF”表示外泌体迪恩流分级。换言之，对于当前ExoDFF装置，入口定位在远离螺旋通道的位置，并且出口以通道围绕出口盘旋的方式定位(例如围绕出口——参见图8A的中央和最右图像)。同时，具有HiDFF构造的本微流体装置为，其中入口端口以螺旋形通道围绕入口端口水平螺旋的方式布置，至少两个出口端口远离螺旋形通道布置。当前HiDFF和ExoDFF装置都有较长的第一出口通道。
作为概念验证，螺旋通道的4个子单元被设计和制造成高通量ExoDFF(ExoDFFHT)(图8A)。第二代ExoDFF中的出口从4个减少到2个(图8A中的左图)，ExoDFFHT中的出口从16个减少到8个(图8A中的右图)。使用50nm、500nm和1μm珠子优化了第二代ExoDFF中O1的通道长度(图8B)。与第一代四出口HiDFF相比，类似的取决于尺寸的珠子分离是通过大多数50nm珠子和少数500nm珠子在最佳流速下(雷诺数为42)洗脱到O1中实现的而不会污染1μm珠子。
使用200nm珠子进一步量化了当前ExoDFFHT的分离性能。纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果表明，第二代ExoDFF和ExoDFFHT在每个螺旋处的最高分离效率为20:400μL/min(图9A)。在每个螺旋处的样本到鞘流速为20:400(和40:400)μL/min时，与第一代HiDFF的29％(和18％)相比，第二代ExoDFF和ExoDFFHT的分离效率略有下降，分别为25.2％(和16.1％)和27.8％(和14.8％)。对于全血处理，每个ExoDFFHT子单元出口区域的高速图像也显示较大的血细胞排列在外壁旁边并洗脱到较大的废物出口中(图9B)。
接下来使用NTA和蛋白质印迹比较由第一代HiDFF、ExoDFFHT和超速离心(UC)收集的血源性EV。NTA显示ExoDFFHT和UC小EV表现出200nm以下相似的粒度分布，对应于小EV(图10A)。观察到第一代HiDFF(40:400μL/min)、第二代ExoDFF(20:400μL/min)和ExoDFFHT(20:400μL/min)的分离效率约为14％，而UC约为4％，这表明使用各种ExoDFF装置的效率较高，约为3倍(图10B)。与UC相比，蛋白质印迹结果还显示，两种ExoDFF装置中外泌体标志物如筏蛋白-1、TSG101和CD9的表达更高。与UC相比，血浆白蛋白和脂蛋白(apoA-I)没有被完全去除，并且在两种ExoDFF装置中观察到白蛋白表达略高(图10C)。总之，ExoDFFHT在多路第一代HiDFF(每分钟处理40μL全血)后，通量提高2倍。通过ExoDFFHT出口长度可以实现更高的通量。
示例5C：采用“半环”设计的高通量ExoDFF(ExoDFFHT)
如上所述，本方法和微流体装置是通用的。在本公开的用于高通量样本处理的另一种策略中，ExoDFF螺旋长度缩短了4至5倍以形成“半环”通道设计(即半螺旋通道)。这个想法是增加流速以实现相似的EV分选性能。这使用珠子(50nm、500nm、1um)在300μm宽度(与ExoDFF相同)(图11A至11C)和500μm通道宽度(图12A和12B)的2个半环设计中进行了证明。数据表明流速可以增加～4至5倍，这是有利的，因为在较短的通道长度中压降较低。这也可以应用于本HiDFF装置。
示例5D：当前四出口装置的临床验证(2型糖尿病)
演示了使用四出口HiDFF从全血中分离循环胞外囊泡(EV)(为了简单起见，下文中该芯片也可称为ExoDFF，并意味着当前HiDFF和ExoDFF构造均可针对该示例可操作)，其中，当前四出口HiDFF装置具有较长的第一出口通道，并且入口端口以螺旋形通道围绕入口端口螺旋的方式布置，出口端口远离螺旋形通道布置。稀释的全血(1:1PBS)和鞘液以优化的流速(Re～40、40μLmin-1(样本)和400μLmin-1(鞘))灌注到ExoDFF装置中。Re表示雷诺数。如高速图像所示，较大的血细胞(～6μm至15μm)在出口之前保持靠近通道外壁，并通过O4被有效地去除(图13A)。较小的血小板(～2μm至3μm)进一步向内壁迁移，并被分选到O3和O4。由于使用显微镜成像看不到EV，因此收集了来自O1和O2的洗脱液以使用NTA对尺寸分布和颗粒收率进行下游表征。还将结果与作为金标准技术且应用最为广泛的多步超速离心(UC)进行了比较。ExoDFF O1和UC外泌体(UC exo)均表现出相似的EV尺寸分布，主峰在～150nm(图13B)，而ExoDFF O2和UC MV具有更宽的EV尺寸分布(～100nm至800nm)。EV浓度在ExoDFF O1中最高(图13C)，这意味着EV分离效率约为15(±3.8)％，与UC相比为其约3倍(～4.8(±4.2)％)(图13D)。这导致ExoDFF O1的EV收率比UC exo显著提高(P<0.05)(图13E)，并清楚地表明ExoDFF以单步方式分离EV的重要性和独特能力，这与UC截然不同(更容易出现EV损失)。为了进一步鉴定来自ExoDFF O1/O2和UC样本的外泌体，使用蛋白质印迹法表征了外泌体蛋白标志物TSG101、筏蛋白和CD9。与NTA结果一致，与具有相同样本体积的UC exo相比，在ExoDFF O1、O2中检测到强信号，这定性地表明在ExoDFF处理后EV浓度更高(图13F)。在ExoDFF和UC样本中都微弱地检测到指示脂蛋白污染的ApoA-I标志物。还对来自ExoDFF O1的EV进行了透射电子显微镜分析(TEM)，显示了约60nm至120nm的外泌体的独特杯形形态(图13G)。最后，从ExoDFF O1/O2和UC Exo中分离出总RNA含量，并使用Bioanalyzer RNAPico测定检查RNA尺寸分布和收率。来自ExoDFF O1、O2和UC exo的RNA显示主峰低于200nt的短RNA谱，这代表外泌体来源的microRNA23(图13H)。ExoDFF O1的RNA收率最高，这表明外泌体浓度高，并且通过NTA和蛋白质印迹结果得到印证。总之，这些结果清楚地表明，ExoDFF是可以直接处理全血的高效EV分离装置，并且在EV收率、处理时间和易用性(单个步骤)方面优于UC。作为临床测试的概念验证，分别从健康(n＝9)和T2DM(n＝12)对象的ExoDFF Exo和MV中分离出纳米级EV和中等大小EV。还与UC Exo和UC MV进行了比较。尽管无论采用何种分离方法，EV都具有相似的尺寸分布，但在ExoDFF Exo(P<0.05)和ExoDFF MV(P<0.05)中，T2DM患者的EV计数(每单位体积全血)高于健康对象(图14A)。UC Exo和UC MV均未显示两组间EV计数的任何显著差异。请注意，ExoDFF Exo和MV的EV收率分别高于UC Exo和UC MV，这表明ExoDFF在这种情况下是更有效的EV分离工具。由于T2DM中慢性高血糖和低度炎症诱导的功能失调的内皮细胞或血细胞导致血液中的EV脱落，因此试图确定EV计数是否与作为疾病严重程度的衡量标准的血糖水平相关。显然，较高的血红蛋白A1c(HbA1c)水平(血糖指标)对应于ExoDFF MV中T2DM患者较高的EV计数(图14B)，这说明来自ExoDFF MV的EV可能提供疾病特异性的EV特征或表型。
示例6：商业和潜在应用
本文开发了一种低成本且无标记的微流体策略以用于从全血中直接和可扩展地分离循环外泌体。本方法和微流体装置使用简单，需要最少的用户操作，并且可以很容易地转化到临床环境，以加速外泌体生物学研究和即时(point-of-care)外泌体诊断工具的开发。
开发单个步骤、高通量且无标记的外泌体分选方法在从基因组学和蛋白质组学研究到大规模外泌体生物制造和即时临床诊断方面具有巨大的商业利益。借助本技术，它可以推进基于“样本入答案出(sample-in-answer-out)”液体活检的测试系统(图15)的开发以用于快速EV定量和表型分析，并且允许早期疾病检测。对于外泌体工程应用，目前开发的连续流EV纯化方案比标准超速离心法具有显著优势，因为它成本低、用户操作最少、可扩展性以及在封闭回路(无菌环境)中生产GMP或临床级EV以用于治疗应用的潜力。
本技术的优点包括被动分离原理、用户友好(仅需要注射泵)和低成本操作(无需标记或处理)。值得注意的是，该微型装置还是便携的，可轻松集成到其他平台以用于下游检测或分析。
尽管已经参照特定的实施例具体示出和描述了本公开，但是本领域技术人员应该理解，在不背离所附权利要求所定义的本公开的精神和范围的情况下，可以对其中的形式和细节进行各种改变。因此，本公开的范围由所附权利要求指示，并且因此旨在包含在权利要求的等同含义和范围内的所有变化。

Claims (23)

1.一种从血液中分离外泌体的方法，所述方法包括：
提供包括螺旋形通道的微流体装置，所述螺旋形通道与(i)两个入口端口和(ii)至少两个出口端口流体连通，其中，所述两个入口端口中的一个靠近所述螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近所述螺旋形通道的外壁，其中，所述出口端口中的至少一个与被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通；
将血液样本引入靠近所述外壁的入口端口，并将鞘液引入靠近所述内壁的入口端口，以在所述螺旋形通道中形成稀释的样本；
驱动稀释后的样本通过所述螺旋形通道；和
将所述外泌体回收于所述容器中，
其中，所述至少两个出口端口包括第一出口端口，所述第一出口端口与被配置为储存分离的外泌体的所述容器流体连通，
其中，与所述第一出口端口流体连通的所述螺旋形通道包括第一出口通道，所述第一出口通道将所述螺旋形通道连接到所述第一出口端口，并且比分别将所述螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法不包括离心步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，引入所述血液样本和所述鞘液包括以与引入所述血液样本的流速相比更高的流速引入所述鞘液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，引入所述血液样本和所述鞘液包括：将所述血液样本引入靠近所述外壁的入口端口，并且将所述鞘液引入靠近所述内壁的入口端口，流速比为1:5至1:50。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，螺旋形通道定义为具有：
150μm至500μm的宽度；
30μm至100μm的高度；
3cm至10cm的长度；
3比7的宽高比；或
0.3cm至1cm的曲率半径。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述螺旋形通道为半螺旋形通道，其中，所述半螺旋形通道具有5mm至25mm的长度。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中：
所述两个入口端口以所述螺旋形通道围绕所述入口端口水平螺旋的方式布置，并且所述至少两个出口端口远离所述螺旋形通道布置；或
所述两个入口端口远离所述螺旋形通道布置，并且所述至少两个出口端口以所述螺旋形通道围绕所述至少两个出口端口水平螺旋的方式布置。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，驱动所述稀释后的样本包括驱动所述稀释后的样本在所述螺旋形通道中流动以具有
20至100的雷诺数；和
2至10的迪恩数。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述第一出口通道具有0.5cm至1.5cm的长度。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述至少两个出口端口包括四个出口端口。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述螺旋形通道逐渐扩大至500μm至3000μm的宽度。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述第一出口端口具有20μm至100μm的宽度。
13.一种可操作以从血液中分离外泌体的微流体装置，所述微流体装置包括：
螺旋形通道，其与(i)两个入口端口和(ii)至少两个出口端口流体连通，其中，所述两个入口端口中的一个靠近所述螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近所述螺旋形通道的外壁；和
与所述出口端口中的至少一个流体连通的容器，其中，所述容器被配置为储存分离的外泌体，
其中，所述至少两个出口端口包括第一出口端口，所述第一出口端口与被配置为储存分离的外泌体的所述容器流体连通，
其中，与所述第一出口端口流体连通的所述螺旋形通道包括第一出口通道，所述第一出口通道将所述螺旋形通道连接到所述第一出口端口，并且比分别将所述螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。
14.根据权利要求13所述的微流体装置，其中，靠近所述螺旋形通道的内壁的入口端口是可操作的从而以比靠近所述螺旋形通道的外壁的入口端口更高的流速引入所述鞘液。
15.根据权利要求13或14所述的微流体装置，其中，靠近所述螺旋形通道的出口壁的入口端口和靠近所述螺旋形通道的内壁的入口端口是可操作的从而以1:5至1:50的流速比引入所述血液样本和所述鞘液。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的微流体装置，其中，螺旋形通道定义为具有：
150μm至500μm的宽度；
30μm至100μm的高度；
3cm至10cm的长度；
3比7的宽高比；或
0.3cm至1cm的曲率半径。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的微流体装置，其中，所述螺旋形通道为半螺旋形通道，其中，所述半螺旋形通道具有5mm至25mm的长度。
18.根据权利要求13至16中任一项所述的微流体装置，其中：
所述两个入口端口以所述螺旋形通道围绕所述入口端口水平螺旋的方式布置，并且所述至少两个出口端口远离所述螺旋形通道布置；或
所述两个入口端口远离所述螺旋形通道布置，并且所述至少两个出口端口以所述螺旋形通道围绕所述至少两个出口端口水平螺旋的方式布置。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一出口通道具有0.5cm至1.5cm的长度。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的微流体装置，其中，所述至少两个出口端口包括四个出口端口。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的微流体装置，其中，所述螺旋形通道逐渐扩大至500μm至3000μm的宽度。
22.根据权利要求13至21中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一出口端口具有20μm至100μm的宽度。
23.一种鉴定糖尿病的方法，所述方法包括：
提供血液样本并将所述血液样本引入权利要求13至22中任一项所述的微流体装置；
操作所述微流体装置；和
根据权利要求1至12中任一项所述的方法分离外泌体以鉴定糖尿病。
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