CN107075556B - 使用基于磁性和尺寸的分离进行细胞分离的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种方法，其包括使磁珠与流体样品中的细胞群体偶合以形成经磁性标记的细胞、磁性分离所述流体样品中所述经磁性标记的细胞与未经磁性标记的细胞，以及基于所述经磁性标记的目标细胞与未经磁性标记的非目标细胞之间的尺寸差来分离所述经磁性标记的细胞中的目标细胞与非目标细胞。提供微流体装置，其包括穿越磁性隔离区和基于尺寸的隔离区的流体路径。所述磁性隔离区包括磁体，其经定位以分离所述磁性隔离区中经磁性标记的细胞与未经磁性标记的细胞。所述基于尺寸的隔离区包括分离器，其经配置以分离小于阈值尺寸的细胞与大于阈值尺寸的细胞。

Description

使用基于磁性和尺寸的分离进行细胞分离的方法和系统

相关申请案的交叉参考

本申请案要求2014年5月15日提交并且名为“用于包括诊断应用的细胞分离的多参数方法和系统(MULTIPARAMETRIC METHODS AND SYSTEMS FOR CELL SEPARATIONINCLUDING DIAGNOSTIC APPLICATIONS)”的美国临时申请案第61/993,431号的权利，所述申请案以全文引用的方式并入本文中以用于任何目的。

背景技术

从生物流体(如血液、尿液、唾液)分离目标细胞是一项重要的研究领域，其应用于临床诊断和基本研究领域中。对于许多应用，通过向阳性洗脱份(相关细胞)施加与阴性洗脱份(背景细胞)相比不同的力来进行分离。已描述其中使用多种物理性质(包括尺寸、活动性、电荷、电偶极矩、光学质量和磁化率)从这些混合物分离特定细胞或分子的装置。另一种方法是基于特定表面标记物的结合来分离细胞。举例来说，微流体通道的表面已用多种抗原分子图案化；接着细胞群体的子集与表面相互作用并且通过结合表面抗原而被固定。所采用的另一种方法需要选择性地使顺磁材料的珠粒与相关细胞结合，通常经由存在于细胞膜处的表面标记物。接着，通过使经标记的细胞进入具有增加的磁场梯度的区域(通过将磁体置放在细胞悬浮液或微流体通道附近，或通过使用外部磁体以使合并于微观装置中的结构磁化并且增强相邻空间区域中的场梯度)来分离阳性洗脱份。已提供多种大尺度和微观装置，其旨在分离经磁性标记的物质。

发明内容

一种实例方法包括基于流体样品中的抗体结合使珠粒与目标细胞群体偶合，以形成目标细胞-珠粒聚集体，其与流体样品中的非目标细胞群体相比具有更大的尺寸。所述方法还包括基于目标细胞-珠粒聚集体与非目标细胞之间的尺寸差来分离目标细胞-珠粒聚集体与非目标细胞。

另一种实例方法包括使磁珠与流体样品中的细胞群体偶合以形成经磁性标记的细胞，其中某些经磁性标记的细胞是目标细胞并且其它经磁性标记的细胞是非目标细胞。所述方法更包括磁性分离流体样品中经磁性标记的细胞与未经磁性标记的细胞。所述方法还包括基于经磁性标记的目标细胞-珠粒聚集体与经磁性标记的非目标细胞之间的尺寸差来分离经磁性标记的细胞中的目标细胞与非目标细胞。

一种实例微流体装置包括输入端、输出端和在输入端与输出端之间延伸的流体路径。流体路径穿越磁性隔离区和基于尺寸的隔离区。磁性隔离区包括磁体，其经定位以分离磁性隔离区中经磁性标记的细胞与未经磁性标记的细胞。基于尺寸的隔离区位于磁性隔离区的下游并且包括分离器，其经配置以分离小于阈值尺寸的细胞与大于阈值尺寸的细胞。阈值尺寸大于一些经磁性标记的非目标细胞的尺寸，但小于一些经磁性标记的目标细胞的尺寸。在一些实例中，阈值尺寸大于大部分经磁性标记的非目标细胞的尺寸，但小于大部分经磁性标记的目标细胞的尺寸。

提供本概述以帮助理解，并且所属领域的技术人员将理解，公开内容的各种方面和特征中的每一个在一些情况下宜单独使用，或在其它情况下与公开内容的其它方面和特征组合。因此，尽管作为实例呈现公开内容，但应了解，任何实例的个别方面可单独要求或与所述实例或任何其它实例的方面和特征组合。

以引用的方式并入

本说明书中提及的所有公开案和专利申请案以其全文引用的方式并入本文中并且用于任何目的，其引用程度如同每一个别公开案或专利申请案是特定地并且个别地指示为以引用的方式并入一般。

附图说明

可通过参考以下详细描述(其阐述例示性实施例，其中使用方法原理、组合物、装置和设备)和随附图式获得对实例方法、系统和组合物的特征和优点的更好理解，其中：

图1呈现根据本发明的用于从流体样品(如血液样品)分离细胞的实例样品工作流。在一些实例中，在从血液样品分离白细胞血沉棕黄层之后，珠粒与装置中或装置外的相关细胞偶合。可使用分离器(如微流体装置、过滤器衬底或其它装置)基于偶合珠粒和细胞的有效尺寸来进行基于尺寸的分离。可在使用流体冲洗或细胞溶解进行的衬底的细胞内含物回收之后进行所述细胞的分子分布。

图2呈现根据本发明的实例分离原理的示意图。在本实例中，目标细胞可与非目标细胞具有相同尺寸。珠粒可结合于目标细胞以增加目标细胞相对于非目标细胞的表观尺寸(图2A)。非目标细胞可流动通过基于尺寸的分离装置，本文中称为分离器，如过滤器，而可通过分离器捕获目标细胞和与其结合的珠粒，引起目标细胞与非目标细胞分离(图2B)。

图3呈现根据本发明的用于组合磁性分离与珠粒增强型尺寸分离的实例样品工作流。在从血液样品分离白细胞血沉棕黄层之后，大型磁珠与装置中或装置外的相关细胞偶合。基于结合于目标细胞群体的磁珠使用磁力进行第一分离。所得富集群体经历使用分离器(如(但不限于)微流体装置、过滤器衬底或其它装置)进行的基于尺寸的第二分离，产生高纯度水平的目标细胞，如肿瘤细胞。接着可经由分子分布来分析细胞。

图4呈现根据本发明的用于循环肿瘤细胞(CTC)的实例细胞特征和分离的示意性分布，其基于免疫-磁性分离和基于尺寸的分离的组合。在开始时，CTC具有大于白细胞(WBC)的平均尺寸，但仍存在显著重叠，阻止有效的基于尺寸的分离(图4A)。珠粒结合步骤，由此细胞优先结合CTC，引起两个群体之间的尺寸重叠减少，并且能够使用有效的基于尺寸的分离(图4B)。任选地，可通过在基于尺寸的分离之前，使用相同的优先结合于CTC的珠粒以磁免疫方式消耗WBC群体来获得显著更高的纯度。在一些实例中，这产生显著更小的WBC群体，但跨过相同尺寸谱图进入最终的基于尺寸的分离(图4C)。

图5呈现根据本发明的经设计以进行粒子分离的实例微流体装置的示意图。所述装置通常包括两个输入端和两个输出端，以及在输入端与输出端之间延伸的流体路径。所述装置还可以包括两个区域：第一分离区(其可称为磁性细胞隔离区)和第二分离区(其可称为基于尺寸的细胞隔离区)。在第一分离区中，阳性和阴性洗脱份由于例如结合于目标(和一些非目标)细胞的磁珠而磁性分离。在第二分离区中，基于尺寸分离细胞。

图6呈现根据本发明的用于进行基于尺寸的分离的分离工作流的示意图，其包括可拆卸式部分(其形成流体路径(例如微流体通道)的壁的至少一部分)和分离器，如过滤器衬底。在这一垂直截面中，可拆卸式部分安置在磁体与分离腔室之间(图6A)。归因于作用于经标记的细胞的磁力，细胞固定在可拆卸式衬底的底部表面上并且与所述衬底一起从装置移除(图6B)。在分离之后，通过移除衬底回收细胞(图6C)并且例如经由移液置放在过滤器衬底的顶部上(图6D)以用于进一步移除非目标群体。在本实例中，基于尺寸的分离器是过滤器衬底，并且分离是基于尺寸排阻。

图7呈现根据本发明的实例工作流，其用于获得癌症患者血液样品，并且使用免疫磁性和物理性质(例如尺寸)富集循环肿瘤细胞。接着使细胞溶解并且接着从所述样品中提取核酸，接着经由NGS进行处理。可将所得DNA异常信息汇编到说明所述信息的报告中，所述报告用作诊断书或帮助癌症患者的监测和治疗决策。

图8呈现根据本发明的实例工作流，其用于获得癌症患者血液样品，并且使用免疫磁性和物理性质(例如尺寸)富集循环肿瘤细胞。接着使细胞溶解并且经处理以用于RNA提取。经由qPCR、表达阵列、数字PCR和/或RNA测序测定许多不同表达标记物的存在。最终，信息可用于产生患者专用表达谱或评分，用作诊断和/或预后以帮助癌症患者的监测和治疗决策。

图9呈现根据本发明的实例工作流，其用于获得癌症患者血液样品，并且使用免疫磁性和物理性质(例如尺寸)富集循环肿瘤细胞。接着使细胞溶解并且处理以用于RNA提取。使用许多不同的表达标记物，经由qPCR、表达阵列和/或数字PCR测定循环肿瘤细胞的存在。如果测定样品含有CTC(CTC阳性)，那么接着可经由NGS分析样品以进一步表征任何DNA异常。

具体实施方式

本文中所描述的实例包括从液态样品(如液态活检)分离目标细胞(如罕见的循环肿瘤细胞)和使用所述细胞测定患者(如癌症患者)的分子概况的方法。还描述使用基于尺寸的分离与其它方法(具体来说，免疫磁性分离)的组合来分离选择性结合于珠粒的生物材料的实例系统和方法。描述许多可分离目标物质与非目标物质的有利装置设计和方法。一些实例方法使用以下力和细胞特性中的一或多个的组合：珠粒和细胞复合物的尺寸、目标细胞尺寸或目标细胞机械特性、磁力以及所结合的珠粒的尺寸。所述设计适用于标记、分离、计数以及在高纯度和高回收率下的目标细胞从阴性背景的回收，包括足够高以使得能够经由下一代测序来进行有效分析的纯度。实例还可以包括可将由液态活检中的富集肿瘤细胞的分析产生的分子信息用作改良癌症患者的治疗决策的诊断的机制。

本文中所描述的实例涉及经改良的用于从流体样品(如生物流体)分离细胞的系统。一些实施例包括珠粒依赖性基于尺寸的分离，由此细胞的表观尺寸经由珠粒与目标细胞(而非其它非目标(例如背景)细胞)的特异性结合而增加。可通过使第二珠粒类型与第一珠粒类型(其已结合于目标细胞)结合来进一步扩大细胞尺寸。可通过使用模式组合以实现分离生物材料来提高在捕获功效、纯度百分比和回收百分比方面的分离质量。一些实例包括磁性分离与基于尺寸的分离的组合，从而通过存在特异性结合于目标细胞的珠粒来增加表观细胞尺寸。一些实例包括可拆卸式衬底，其可有助于细胞的回收，由此可从装置(如分离腔室)提取细胞。所呈现的实例系统还具有经由分子分析方法(包括qPCR、测序、数字PCR和/或表达谱)来表征细胞的能力。在一些实例中，可通过组合基于尺寸的分离与免疫磁性分离而获得的高细胞纯度使得经由下一代测序(NGS)进行来自液态活检的肿瘤细胞的常规分析成为可能。在一些实例中，所提出的诊断方法还可以用于代替基于组织活检的分子诊断，如其中难以或不可能获得活检的情况，或帮助即将开始新疗程的患者的疗法选择。

先前已呈现许多装置和方法用于从非均质混合物分离细胞或其它相关生物材料。此外，已呈现许多潜在用途，尤其在分析来自癌症患者的罕见的循环肿瘤细胞(CTC)以预测预后和评估癌症患者的治疗功效方面。已设想宏观和微观装置，以及用于实现细胞的阳性洗脱份从更大的群体的分离的许多粒子特性。多种细胞特性已用于分离群体，包括：荧光、结合于衬底的细胞、磁特性、结合于磁珠/磁力的细胞、与声波偶合的惯性特性、细胞的光学和电特性。先前呈现的系统仍可能不满足许多应用，尤其在阳性洗脱份代表极小百分比(<0.1％)的总群体时。先前呈现的参考方法具有许多缺陷，其可通过本文中所描述的实例完全或部分解决。呈现常规系统的缺陷和本文中所描述的系统的优点作为实例并且帮助对本文中所描述的实例的各方面的理解。缺陷和优点的说明并不意图是限制性的，应理解，本文中所描述的每个实例可解决常规系统的所有或甚至任何缺陷，但并且本文中所描述的每个实例都具有所有或甚至任何所描述的优点。注意到常规系统中的缺点如下：

1.低捕获功效。举例来说，许多细胞在沿流动路径进行的转移步骤期间损失，或在下游与样品的阴性洗脱份一起洗脱。一些来自常规系统的实例包括：其中不同的细胞样品部分由于几何形状而经历显著不同的力的宏观系统。微观流系统，其中细胞结合于通道壁，其需要相关细胞与通道壁紧密接触；这一要求引起许多细胞不结合于官能化壁并且在下游与阴性洗脱份一起洗脱。

2.低纯度。对于许多下游分析模式，在具体的下一代测序(NGS)中，重要的是存在阳性洗脱细胞的高度浓缩样品，其未受阴性洗脱细胞污染。优化其中阳性洗脱份占全部样品的极小百分比(如低于1/1000或低于1/10E6个细胞)的样品是极具有挑战性的参数。举例来说，宏观系统无法在分离区中施加恒定的分离力，引起在所分离的样品中包含阴性细胞。一个实例是其中沉积和磁力引起将样品细胞拉拽到容器底部的系统，在这种情况下存在从流动物料流拉出阴性洗脱细胞的非零机率。对于免疫磁性分离，小部分磁珠将非特异性结合于背景细胞(其不是目标群体的一部分)，引起存在显著受污染的洗脱份，尤其当阴性洗脱份群体相对于阳性洗脱份明显更高时。低纯度样品妨碍许多合乎需要的分子分析模式，包括下一代测序。

3.不能回收阳性洗脱份以用于分子分析。举例来说，通过使阳性洗脱份结合于流道壁来分离细胞的系统无法容易地移除所结合的细胞以用于下游分析。如果需要回收细胞，那么需要细胞溶解或苛性洗脱步骤。这降低纯度、降低活的阳性洗脱细胞的可得性、降低所回收的样品中细胞的最终密度并且增加装置操作的复杂度。

4.不能回收活细胞。举例来说，在如分选流式细胞仪的系统中，需要高流动速度，从而剪切力显著影响所分离的细胞的活力。其它系统需要使用固定细胞或溶解缓冲液以洗脱细胞内含物。在两种情况下，所回收的细胞不再是活的，使蛋白质分析变复杂并且排除进行基于mRNA的分析(其需要活细胞)的选择方案，以及消除随后在晶片外培养所分离的细胞的能力。另外，对于某些类别的细胞，如CTC，阳性洗脱细胞是唯一在较短时间量程内分裂的细胞；因此，细胞培养物将天然地产生明显更高纯度的样品并且使蛋白质组发挥作用。

5.用户不能定制捕获方法。来自阳性洗脱细胞的分离和分析的资料可适用于修改或改良捕获准则；因此，对于用户来说，重要的是具有定制用于捕获阳性洗脱细胞的表面标记物(或标记物集合)和捕获方法的其它方面的能力。对于许多先前存在的系统，捕获方法由装置制造商决定(例如捕获到实体衬底上)。此外，对于其中细胞的内源性物理性质决定捕获力的系统(例如基于沉积的捕获、光学捕获、声学聚焦、电泳现象等)，这类力无法由用户调谐以符合所需应用，例如对于基于尺寸的分离(过滤)，细胞尺寸具有天然分布，包括不同细胞亚群之间的重叠。所提出的免疫磁性分离，或免疫磁性分离与其它分离模式的组合通过允许自定义用于基于珠粒的分离的标记物面板来解决这一问题。

6.长运行时间。出于多种原因(细胞存活率、细胞沉降、工作流程考虑因素等)，重要的是在合理的时间段内、优选在1小时内并且更优选在15分钟内完成分离反应。对于许多现有系统，完全分离方案持续显著更长的时间。举例来说，一些所提出的微流体系统迫使全部血液样品(7.5ml)通过小尺寸(<1mm)微尺度通道。因此，处理整个血液样品通常耗费>1小时。本文中所描述的实例可显著缩短所需时间。

7.方法不能自动进行。许多当前正在研发的系统不与标准流体处置设备相容，并且在其它情况下，不具有平行处理多份样品的能力。最后，输送量和样品对样品的污染物是限制分离反应的总输送量的重要问题。本文中所描述的实例提供一种系统，其中流体路径是可完全抛弃式(例如存在极少或不存在样品与样品的交叉污染)，可平行运行多份样品以及使用与现有流体处置设备相容的标准可消耗性型式。举例来说，共用移液步骤的方法始终具有交叉污染的可能。

8.所分离的洗脱份的大流体体积/大稀释度。另一项重要考虑因素是在分离后，阳性样品中每个细胞的流体体积。对于某些分析模式，如经由PCR进行的基因分型，重要的是将细胞分成低流体体积。然而，对于流通分离方法，如FACS(荧光激活细胞分选术)，极难以将相关细胞分离成小于每个细胞数微升的体积。对于大型背景中的低细胞数目，阳性洗脱份的总体积通常在毫升范围内。本文中所描述的实例装置和方法使得能够将细胞分离成数微升(对于所有阳性洗脱细胞)，或下降到0.01微升/孔(对于100个所分离的细胞)。

本文中所描述的实例可通过新颖的装置设计、方法和系统解决以上缺点中的一或多者。

提供实例方法，其可以用于基于珠粒活化尺寸排阻从较大的混合物分离细胞的亚群。一组官能化珠粒与整个群体混合，引起选择性结合于目标群体，提供表达已知表面标记物的所述目标群体。如果需要进一步尺寸扩大，可向混合物中添加结合第一珠粒类型的第二组珠粒，其结合于已装饰目标细胞的珠粒。在珠粒偶合步骤之后，进行使用分离器装置(如(但不限于)过滤器或微流体元件)进行的基于尺寸的分离。在称为珠粒活化尺寸排阻的方法中，基于所结合的珠粒和细胞的组合尺寸保留目标亚群。一种使用这种方法的样品工作流程呈现于图1中，其中示意图呈现于图2中。这一所提出的分离模式的引人注目的应用包括溶解目标细胞群体、提取核酸以及细胞群体的分子分析。一些实例方法的一种特征是对相同细胞群体的基于磁珠亲和力的分离与尺寸分离的组合使用。另一种特征是使用相同磁珠进行二者的磁性分离以及珠粒结合细胞的表达尺寸的选择性增加；接着，这一尺寸增加用于增强基于尺寸的分离。

尤其引人注目的工作流可组合正交分离模式，如磁性分离和基于尺寸的分离。基于结合于目标细胞群体的磁珠使用磁力进行第一分离。所得富集群体经历使用分离器(如微流体装置、过滤器衬底或其它分离机制)进行的第二基于尺寸的分离，产生高纯度肿瘤细胞。接着可经由分子分布来分析细胞(参见例如图3)。

提供实例系统以用于从悬浮液中细胞的较大混合样品分离细胞亚群(例如罕见的细胞群体)，所述系统可包括：官能化珠粒，其结合由目标群体特异性表达的抗原(从而增加表观细胞尺寸)，和基于尺寸的分离装置。所述系统还可以含有：分离腔室、磁场源和官能化磁珠，其结合由目标群体特异性表达的抗原(从而增加表观细胞尺寸)。这类所提出的系统的一般操作模式可包括以下步骤中的一或多个：

1.官能化珠粒选择性结合于表达相关抗原(或相关抗原集合)的细胞的亚群。这一步骤可在晶片上或在晶片外进行，并且应注意最小化珠粒与阴性洗脱细胞的非特异性结合。当珠粒结合于目标细胞时，表观细胞尺寸的分布改变，使得目标细胞形成与背景(非目标)群体相比具有更高的表观尺寸的群体。

2.基于总体表观尺寸分离细胞，所述总体表观尺寸是固有细胞尺寸与结合珠粒尺寸的组合。基于尺寸的分离可使用过滤器薄膜型设置或经设计以基于尺寸来分离细胞的微流体通道进行。实例微流体通道可含有障碍物(参见例如图4和5)，或弯曲/螺旋形状，其使用迪恩流分离(dean flow fractionation)、惯性分离和其它现象以适合的流动速率基于尺寸、密度和变形性来分离粒子。基于尺寸的分离可使用分离器(如过滤器薄膜型设置，或含有可基于尺寸来分离粒子的障碍物的微流体通道)进行(参见例如图4和5)。基于尺寸的分离还可以在不存在结合珠粒的情况下进行，并且仅基于细胞尺寸的实际差异。

3.任选地，可对相同起始细胞群体进行免疫磁性分离。可在基于尺寸的分离之前或之后进行免疫磁性分离。用于尺寸增强的相同珠粒可以用于磁性分离，或可使用不同的磁珠群体(参见例如图4、5、6)。

4.接着使用一或多种分析模式分析所分离的细胞，包括：成像(经由显微镜或其它装置)；测量来自所分离的细胞的荧光信号；FISH；经由PCR、rt-PCR、基于阵列或基于珠粒的测序方案进行基因分析；RNA或DNA分析；表达分析；蛋白质组分析。任选地，在最终分析步骤之前进行其它样品制备步骤，其可包括：移除阴性洗脱细胞、分别进行单一细胞的分隔和分析、细胞溶解和/或在晶片上或在晶片外培养活的经分离的细胞。

5.优选分析方法包括下一代测序(NGS)，通过由使用2种或2种以上正交选择标准(例如尺寸和磁力)产生的较高纯度实现。可通过基于RNA的分析法来扩增NGS工作流，以便测定经分离的样品中是否存在CTC(例如图7、8和9)。

6.由所述细胞的分析产生的资料可以多种方式用于诊断，包括：用于微小残留病或复发的患者监测、基于已知抗性突变或已知敏感突变的治疗选择、针对新引入的药物化合物的伴随诊断、基于与疗法反应相关的表达概况进行的治疗选择。

参考图1-9，提供一种方法，其通常包括使磁珠与流体样品中的细胞群体偶合以形成经磁性标记的细胞，其中某些经磁性标记的细胞是目标细胞并且其它经磁性标记的细胞是非目标细胞。流体样品通常可包括任何流体(例如气体或液体)。实例液体包括生物流体，如(但不限于)血液、尿液、汗水、间质液或由人类或其它动物衍生或获得的其它体液。流体样品可包括与所述生物流体在一起的其它流体或添加剂，如(但不限于)缓冲液流体、粘度调节流体或其它试剂。在一些实例中，生物流体可含有多个细胞，其中一些与所意图的分析有关(例如目标细胞)并且其中一些与所意图的分析无关(例如背景细胞)。目标细胞可包括例如循环肿瘤细胞(CTC)、循环胚胎细胞(CFC)或其它相关细胞。非目标细胞可包括例如白细胞，或流体样品中与进行的技术(例如测序)无关的其它细胞。

在图2A、2B和5B-6D中，目标细胞和非目标细胞通常可具有相同尺寸，或在一些实例中，在其群体中具有明显尺寸重叠。可引入磁珠以用于结合于流体样品中的细胞。通常，可使用任何磁珠，并且可使用多种尺寸的珠粒，包括尺寸是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μm的珠粒。可将磁珠引入流体样品并且使其与样品中的细胞结合。在一些实例中，可使用经官能化或以其它方式经设计以优先结合于目标细胞(例如循环肿瘤细胞)的磁珠。尽管经设计以结合于目标细胞，但一定量的磁珠仍可结合于非目标细胞。在图2A、2B和5B-6D中，目标细胞202、502、602包括连接到其周边的许多磁珠204、504、604，举例来说，三个或三个以上珠粒连接到其周边，而非目标细胞206、506、606通常不包括任何连接到其周边的磁珠。一部分磁珠204、504、604可非特异性结合于非目标细胞206、506、606。因此，在图2A、2B和5B-6D中，一些非目标细胞206、506、606包括一个连接到其边缘的磁珠204、504、604，以表示磁珠与一些非目标细胞的非特异性结合。包括连接到其边缘的磁珠204、504、604的目标细胞202、502、602和非目标细胞206、506、606通常形成可通过磁场操纵的经磁性标记的细胞。不包括连接到其边缘的磁珠204、504、604的非目标细胞206、506、606通常形成未经磁性标记的细胞并且通常不可通过磁场操纵。一些用于粒子从流体的磁性分离的方法、微流体装置和仪器描述于美国专利公开案第2013/0017538A1号中，其以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。

继续参考图1-9，提供一种方法，其通常包括磁性分离流体样品中经磁性标记的细胞与未经磁性标记的细胞。具体地参考图5B和6A，经磁性标记的细胞在流体样品流经微流体装置的流体路径期间固定在微流体装置的内表面上。在图5B和6A中，磁体508、608与微流体装置的流体路径相邻安置并且将经磁性标记的细胞沿流体路径的内表面吸引到磁体。

在一些实施例中，未经磁性标记的细胞不由磁体固定并且流向安置在固定的经磁性标记的细胞下游的分离器510(参见图5A-5C)。在适合的时间段之后，通常具有足以允许未经磁性标记的细胞离开磁性分离区的时间，经磁性标记的细胞从微流体装置的内表面释放，例如通过移除磁体508或磁场，并且经磁性标记的细胞流向分离器510。可将经磁性标记的细胞固定某一时间段，使得未经磁性标记的细胞充分地位于经磁性标记的细胞的下游，以便确保未经磁性标记的细胞在经磁性标记的细胞遇到分离器之前遇到分离器。

继续参考图1-9，提供一种方法，其通常包括基于经磁性标记的目标细胞与经磁性标记的非目标细胞之间的尺寸差来分离经磁性标记的细胞中的目标细胞与非目标细胞。因此，可提供分离器210、510、610。可使用多种分离器中的任一种，包括(但不限于)具有阈值尺寸的开口或孔的衬底，使得大于阈值尺寸的细胞不可通过，而小于阈值尺寸的细胞可通过。其它可分离小于阈值尺寸的细胞与大于阈值尺寸的细胞的分离器包括螺旋形流体通道。分离器210、510、610通常包括孔口212、512、612或其它特征，其经设定大小以允许未经磁性标记的细胞和经磁性标记的非目标细胞通过孔口212、512、612并且继续向下流出分离器210、510、610，以及阻止经磁性标记的目标细胞通过孔口。

因此，实例分离器210、510、610通常在分离器210、510、610的上游侧捕获经磁性标记的目标细胞。为了从分离器210、510、610的上游侧移除经磁性标记的目标细胞，可颠倒通过分离器的流体流量Q的方向以使经磁性标记的目标细胞流向微流体装置的入口，到达其中可从微流体装置移除细胞的位置。可将所捕获的经磁性标记的目标细胞测序，如在本申请案的其它部分中更全面地描述。

参考图6A和6B，在一些实施例中，流体路径包括可拆卸式部分614。如图6A和6B中所示，可拆卸式部分614可覆盖在微流体装置的壁形成的界定流体路径的开口。磁体608可沿可拆卸式部分614的顶部表面安置，以吸引经磁性标记的细胞。如图6A和6B中示意性表示，经磁性标记的细胞可固定在微流体装置的流体路径的可拆卸式部分614的底部表面上。可从微流体装置移除可拆卸式部分614和经固定的细胞(参见图6B)并且安置于流体容器内(参见图6C)。如图6B和6C中表示，一或多个未经磁性标记的细胞可固定在可拆卸式部分614的底部表面上，例如通过在一或多个经磁性标记的细胞与可拆卸式部分614的底部表面之间捕获。由图6C中示意性描绘的流体容器，细胞可置放于分离器610的顶部(参见图6D)。如图6D中表示，在经磁性标记的非目标细胞和未经磁性标记的细胞通过分离器610时，通常在分离器610的顶部表面上捕获经磁性标记的目标细胞。可将所捕获的经磁性标记的目标细胞测序，如在本申请案的其它部分中更全面地描述。

参考图5A-6B，提供实例微流体装置516。装置516通常包括一或多个输入端518、一或多个输出端520以及在一或多个输入端518与一或多个输出端520之间延伸的流体路径522。如图5A中示意性表示，流体路径522通常跨越磁性隔离区524和基于尺寸的隔离区526。参考图5A、5B和6A，磁性隔离区524通常包括经定位以分离磁性隔离区524中经磁性标记的细胞与未经磁性标记的细胞的磁体508。参考图6B，磁性隔离区524可包括微流体装置的可拆卸式壁部分614。参考图5A和5C，基于尺寸的隔离区526可安置在磁性隔离区524的下游。参考图5C，基于尺寸的隔离区526可包括分离器510。分离器510可延伸越过微流体装置516的流体路径522的整个横截面并且可界定多个延伸穿过分离器510的孔口512(参见图5C)。孔口512可平行于流体路径522中的流体流量Q的方向纵向延伸(参见图5C)。

继续参考图5C，分离器510可经配置以分离小于阈值尺寸的细胞与大于阈值尺寸的细胞。阈值尺寸通常大于一些经磁性标记的非目标细胞的尺寸，但小于一些经磁性标记的目标细胞的尺寸。在一些实施例中，阈值尺寸大于大部分经磁性标记的非目标细胞的尺寸，但小于大部分经磁性标记的目标细胞的尺寸。参考图4A-4C，提供实例目标细胞和非目标细胞的相对尺寸的示意图。在图4A-4C中，目标细胞由循环肿瘤细胞(CTC)表示，并且非目标细胞由白细胞(WBC)表示。

图4A通常表示不存在结合于CTC或WBC的磁珠情况下，CTC和WBC的相对尺寸。如图4A所示，CTC的平均尺寸通常大于WBC。然而，存在阻止有效的基于尺寸的分离的实质性尺寸重叠。在图4A中，过滤器捕获的洗脱份由矩形、交叉影线区域表示，其示意性指示分离器中经设定大小以捕获最小量的WBC，从而增加相对于全部捕获的细胞的CTC纯度水准的孔口将捕获小于一半的CTC。图4B通常表示在磁珠与细胞偶合之后，CTC和WBC的相对尺寸。如图4B中示意性表示，珠粒主要连接到CTC，由此增加CTC相对于WBC的表观或有效尺寸。通过使珠粒与CTC结合，减少CTC与WBC之间的尺寸重叠，实现有效的基于尺寸的分离(参见图4B)。如图4B中表示，通过用珠粒增加CTC的有效尺寸，相同阈值尺寸的分离器捕获大部分CTC和仅最小量的WBC。如图4C中示意性表示，可通过进行磁性分离步骤来进一步降低所捕获的细胞中WBC的浓度，例如通过使用相同的结合于CTC的珠粒以增加其有效尺寸、在基于尺寸的分离之前以磁免疫方式消耗WBC群体。这在所捕获的样品中产生更高纯度的CTC，其使得可对所捕获的样品进行测序。在一些实例中，使用与CTC偶合的磁珠进行磁性分离和基于尺寸的分离可使WBC数目减少约10e7到约10e2，并且样品中CTC的数目是约50到约100，引起所捕获的样品中CTC的浓度的显著增加。

实例实施例：

实例1：使用珠粒改良基于尺寸的分离

在本实例中，与单独的基于尺寸的分离相比，使用珠粒辅助的基于尺寸的分离可提供重要改良。我们假设试图分离两个细胞群体(图4)，所述两个细胞群体在一组标记物A(例如EpCAM、EGFR、HER2)的表达以及平均尺寸差方面不同。因为相同群体内的细胞尺寸显著不同，两个洗脱份将具有显著重叠，意味着如果大部分背景群体(B)待移除，那么任何仅选择超过Y0线的细胞的过滤将仅含有小部分目标细胞群体(A)。

向混合群体中添加直径是dY的珠粒将引起珠粒优先结合于表达标记物A的细胞，并且作为目标群体的一部分的细胞的表观尺寸增加(参见图2)。在珠粒结合之后，过滤操作将明显更有效；目标群体中的大部分细胞超过尺寸分离截止值(图4)。

由此获得的细胞(例如通过过滤器保留)可用于许多基于基因DNA、RNA-碱基或基于蛋白质的测试，以便帮助患者治疗决策。

实例2：整合磁性和珠粒增强型尺寸分离的微流体装置

第二实例例示微流体装置中磁性分离与基于尺寸的分离的整合(参见图5)。我们假设试图分离两个细胞群体，所述两个细胞群体在一组标记物A(例如EpCAM、EGFR、HER2)的表达以及平均尺寸差方面不同。因为相同群体内的细胞尺寸显著不同，两个洗脱份将具有显著重叠，意味着任何基于尺寸的分离将含有目标细胞群体(A)的成员以及大量背景群体(B)的成员。类似地，对于单独的基于磁性珠粒的分离，一些非特异性结合将意味着拉出的珠粒将又含有群体(A)以及来自群体(B)的显著背景的富集。向混合群体中添加直径是dY的珠粒将引起珠粒优先结合于表达标记物A的细胞，并且作为目标群体的一部分的细胞的表观尺寸增加(参见图4C)。珠粒-细胞混合和结合可在微流体装置的第一区域内发生。

随后可进行基于尺寸的分离，从而允许群体B中的许多细胞在微流体装置中流动通过(例如步进或柱状或分支/弯曲通道)，同时保留大部分细胞A以及结合的珠粒。分离可经由尺寸排阻(参见图5)或流动驱使的惯性分离或迪恩流分离实现。所结合的珠粒将用语增加细胞A的表观尺寸。接着，可经由逆流或压力增加(其将施加更大的拖曳力和/或增加柔性衬底中捕获结构的尺寸)从基于尺寸的分离结构释放细胞。接着，细胞(仍由磁珠结合)将流动通过靠近磁体的第二分离区，从而向珠粒施加磁力。群体(A)的细胞保留在这一区域中，而允许群体B的细胞(其不具有由于满足基于尺寸的分离要求而结合的珠粒)流动通过。在固定目标细胞(A)并且彻底洗涤其它细胞之后，可通过降低磁场使目标细胞再次流动。或者，可使相关细胞溶解并且在下游收集溶解物。可颠倒以上操作，其中在基于尺寸的分选操作之前进行使用磁场的分离。

由此获得的细胞可以用于许多基于DNA、RNA或蛋白质(或其组合)的测试，以便帮助患者治疗决策。

实例3：使用可拆卸式通道壁部分和过滤器装置增强分离捕获功效、纯度以及细胞回收(参见图6)。

本实例提供实现细胞群体的基于磁珠和基于尺寸的分离的机制的改良。我们再次假设样品呈现目标细胞群体A与背景细胞群体B的混合物。细胞用珠粒预先标记，所述珠粒提供尺寸增强和/或在磁场存在下的磁矩，并且优先结合属于群体A的细胞。本文中，将细胞引入合并有分离腔室的微流体装置中。

将阳性洗脱份固定在分离腔室中的衬底上；因此可仅需要一个出口用于接收阴性细胞洗脱份和洗涤缓冲液。将磁场源置放在分离腔室附近(参见例如图2)，其中腔室可简单地成为微流体通道的一部分。所述分离腔室包括可拆卸式衬底，其形成腔室壁的至少一部分，但可形成分离腔室的多个壁。随着样品流动通过分离腔室，将经磁珠标记的阳性洗脱细胞从流动物料流抽出并且优先固定在分离衬底上。在洗涤步骤之后，衬底从分离腔室解耦合并且与任何结合细胞一起置放于包括过滤器衬底(具有受控尺寸的孔的薄膜)的容器中。接着，样品通过基于尺寸的分离装置，例如过滤器衬底或弯曲流动通道，其选择性分离具有大于设定尺寸截止值的尺寸(如通过固有细胞尺寸和任何结合珠粒尺寸测定)的细胞。可基于细胞-珠粒复合物的尺寸或在不存在珠粒的情况下仅基于细胞尺寸分离细胞。

由此获得的细胞可用于许多基于基因DNA、RNA-碱基或基于蛋白质的测试，以便帮助患者治疗决策。

实例4：将来自循环细胞的遗传异常和表达数据用于癌症治疗决策

在本实例中，使用经分离的罕见的细胞样品以更好地确定患者癌症治疗的过程。可从所得经纯化的细胞样品分离DNA和RNA以确定患者对特定类型的疗法起反应的可能性、由特定疗法类型带来的优势或血流中是否存在肿瘤物质，和/或所述患者的疾病将发展的风险。细胞可经纯化(例如使用本文中所描述的基于尺寸和/或磁性的方法收集)。可分析来自所收集的细胞的DNA和/或RNA以发展或改变疗程。举例来说，可通过下一代测序(NGS)方法分析DNA以确定是否存在体细胞突变或如拷贝数变化或重排等变化。所呈现的使用基于磁性和尺寸的分离的方法可获得更高纯度的循环肿瘤细胞，其是NGS所需的。存在已知体细胞突变可单独或与其它生物标记(如肿瘤活检数据)一起用于测定所引导的疗法的功效。(参见图7和9)。在一个实例中，存在KRAS或BRAF突变可指示对抗EGFR试剂的抗性。下一代测序技术的使用是特定针对所描述的经组合的基于亲和力/尺寸的分离模式，因为需要至少5％肿瘤物质的纯度以有效地测定是否存在基因异常。在另一个实例中，体细胞突变的存在可用作包含在正在进行中的临床试验中的依据。在另一个实例中，体细胞突变的存在可用于规定最初经研发以按路径依赖性方法用于不同来源组织的化合物。与由多参数富集引起的肿瘤和其它罕见的细胞样品的经改良纯度无关，使用低错误测序方法(如单分子条码(在扩增和测序步骤之前用独特的条码标记每个DNA分子)和单细胞测序)观察所得样品作为富集样品的最终读数可能是有利的。

在未检测到体细胞突变的情况下，肿瘤细胞标记物的表达资料可用于测定肿瘤细胞是否从血液样品分离以及最终样品中存在肿瘤衍生；以下基于RNA的标记物中的一或多种可用于这一目的：细胞角蛋白、Ep-CAM、HER2、EGFR、存活素(Survivin)、hTERT、CK-7、TTF-1、TSA-9、Pre-proGRP、HSFIB1、UCHL1、MUC-1。可通过计算‘肿瘤分数’来测定是否存在肿瘤细胞，所述计算包括将一或多种标记物的表达量乘以个别系数并且比较肿瘤分数与预定临界值。举例来说，可根据下式计算肿瘤分数：分数＝(表达基因1)×系数1+(表达基因2)×系数2+……+(表达基因n)×系数n。如果分数大于肿瘤临界值，那么确认存在CTC。(参见例如图9)

实例5：将来自循环细胞的基因表达资料用于癌症治疗决策。

在本实例中，使用许多指定基因(基因图)的mRNA复本的丰度进行治疗决策(参见图8)。举例来说，对于乳癌，可使用以下标记物的组合：CK19、CK20、CK8、SCGB2A2、MUC1、EpCAM、BIRC5、ERBB2、MRP1、2、4、5、7；dCK、ALDH1、MBG1、MAGEA3、hMAM、CCNE2、DKFZp762E1312、EMP2、MAL2、PPIC、SLC6A、B305D-C、B726P、GABA AP、SCGB2、TFF1、TFF3。

对于肺癌，可使用以下标记物的组合：BIRC5、hTERT、TTF-1、FN1、PGP9.5、TSA-9(FAM83A)、Pre-proGRP、hMTH1(NUDT1)、SP-D、ITGA11、COL11A1、LCK、RND3、WNT3a、ERBB3、BAG1、BRCA1、CDC6、CDK2AP1、FUT3、IL11、SH3BGR、EGFR、c-Met、MAGE-A3、CK-19、CK-20、CK-7、EpCAM、CD45。

对于u前列腺癌，可使用以下标记物的组合：CK-19、-20、CK-7、EpCAM、CD45、EGFR、PSMA、PSA、AR、HPN、HK2、PSGR、MGB1、MGB2、AZGP1、KLK2、SRD5A2、FAM13C、FLNC、GSN、TPM2、GSTM2、TPX2。

可通过计算‘肿瘤分数’来测定进程和/或预后的患者风险，所述计算包括将一或多种标记物的表达量乘以个别系数并且比较肿瘤分数与预定临界值。举例来说，可根据下式计算肿瘤分数：分数＝(表达基因1)×系数1+(表达基因2)×系数2+……+(表达基因n)×系数n。接着基于总分来评估风险。

此外，可通过计算‘肿瘤分数’来评估患者从特定全身治疗(例如化学疗法)或局部治疗(例如手术)获得的益处，所述计算包括将一或多种标记物的表达量乘以个别系数并且比较肿瘤分数与预定临界值。举例来说，可根据下式计算肿瘤分数：分数＝(表达基因1)×系数1+(表达基因2)×系数2+……+(表达基因n)×系数n。视结果而定，可向患者指定特定辅助疗法，或可测定局部治疗的时间表。

罕见的细胞表达概况可用作单独测试，或与基于组织的测试结果或其它生物标记(如PSA分数)一起。

以上实例详细说明本发明的一些优选实施例。视应用要求而定，也可以设想以上内容的许多组合或变化。出于说明和描述的目的呈现先前论述并且并不意图将公开内容限于本文中所公开的形式。举例来说，出于简化公开内容的目的，公开内容的多种特征在一或多个方面、实施例或配置中集合在一起。然而，应理解，公开内容的某些方面、实施例或配置的多种特征可在替代性方面、实施例或配置中组合。此外，以下权利要求书以引用的方式并入本具体实施方式中，其中每个权利要求本身作为本发明的一个单独的实施例。

Claims (18)

1.一种方法，其包含：

使磁珠与流体样品中的细胞群体偶合以形成经磁性标记的细胞，其中某些所述经磁性标记的细胞是目标细胞并且其它所述经磁性标记的细胞是非目标细胞；

磁性分离所述流体样品中的所述经磁性标记的细胞与未经磁性标记的细胞；和

基于所述经磁性标记的目标细胞-珠粒聚集体与所述经磁性标记的非目标细胞之间的尺寸差来分离所述经磁性标记的细胞中的所述目标细胞与所述非目标细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其更包含将来自所述经磁性标记的目标细胞的DNA或mRNA测序。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述磁性分离步骤包含在所述流体样品流动通过微流体装置的流体路径期间，将所述经磁性标记的细胞固定在所述微流体装置的内表面上。

4.根据权利要求3所述的方法，其更包含使一部分所述流体样品流动通过安置在所述经固定的经磁性标记的细胞下游的分离器。

5.根据权利要求4所述的方法，其更包含：

从所述微流体装置的所述内表面释放所述经磁性标记的细胞；和

使所述经磁性标记的细胞流向所述分离器。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述分离所述目标细胞与所述非目标细胞步骤包含在所述分离器的上游表面上捕获所述经磁性标记的目标细胞。

7.根据权利要求3到5中任一权利要求所述的方法，其更包含将来自所述经磁性标记的目标细胞的DNA或mRNA测序。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述固定步骤包含在所述微流体装置的流体路径的可拆卸式部分的底部表面上固定所述经磁性标记的细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其更包含∶

从所述微流体装置移除所述可拆卸式部分与所述经固定的经磁性标记的细胞；和

将所述经磁性标记的细胞放在分离器的顶部。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述分离所述目标细胞与所述非目标细胞步骤包含在所述分离器的顶部表面上捕获所述经磁性标记的目标细胞。

11.根据权利要求8到10中任一权利要求所述的方法，其更包含将来自所述经磁性标记的目标细胞的DNA或mRNA测序。

12.根据权利要求1到5和8到10中任一权利要求所述的方法，其中所述流体样品是血液样品，并且更包含在使磁珠与所述细胞群体偶合之前，从所述血液样品分离血沉棕黄层。

13.根据权利要求1到5和8到10中任一权利要求所述的方法，其中所述目标细胞是肿瘤细胞。

14.一种经配置以执行权利要求1所述的方法的微流体装置，其包含：

输入端；

输出端；和

在所述输入端与所述输出端之间延伸的流体路径，所述流体路径穿越磁性隔离区和基于尺寸的隔离区，其中所述磁性隔离区包括磁体，其经安置以分离所述磁性隔离区中的经磁性标记的细胞与未经磁性标记的细胞，并且其中所述基于尺寸的隔离区位于所述磁性隔离区的下游并且包括分离器，所述分离器经配置以分离小于阈值尺寸的细胞与大于阈值尺寸的细胞，其中所述阈值尺寸大于一些经磁性标记的非目标细胞的尺寸，但小于一些经磁性标记的目标细胞的尺寸。

15.根据权利要求14所述的微流体装置，其中所述阈值尺寸大于大部分所述经磁性标记的非目标细胞的尺寸，但小于大部分所述经磁性标记的目标细胞的尺寸。

16.根据权利要求14或15所述的微流体装置，其中所述磁性隔离区包括所述微流体装置的可拆卸式壁部分。

17.根据权利要求14或15所述的微流体装置，其中所述分离器延伸越过所述流体路径的整个横截面。

18.根据权利要求14或15所述的微流体装置，其中所述分离器界定多个平行于所述流体路径中的流体流动方向纵向延伸的孔口。

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