DE102009037331A1 - Verfahren zur Separierung von Partikeln und/oder Zellen mit 2 und mehr Oberflächenspezifitäten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein einfaches Verfahren zur schonenden Separierung von Zellen und/oder Partikeln aus Flüssigkeiten, vorzugsweise Blut. Dazu werden bekannte Schritte von magnetischen Trennverfahren kombiniert mit dem Vefahren einer Fängerpartikel-Siebabtrennung.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Separierung von Partikeln und/oder Zellen mit 2 und mehr Oberflächenspezifitäten. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Pharmazie.
• Beschreibung
• Identifizieren und Separieren von Partikeln, insbesondere somatischer Zellen und Krankheitserreger aus komplexen Flüssigkeiten wie Blut ist ein notwendiger Verfahrensschritt für die Erforschung, Diagnostik und Behandlung von Krankheiten. Für die Separierung von Partikeln mit unterschiedlicher spezifischer Dichte (z. B. Leukozyten und Erythrozyten) haben sich Zentrifugationsverfahren oder Filter bewährt. Mit den Fortschritten in der Erforschung von Patho- und Immunogenese von Krankheiten besteht ein wachsendes Bedürfnis zur Identifizierung uns Separierung von Zellen gleicher spezifischen Dichte aber unterschiedlicher Funktion. Die unterschiedliche Funktion von Lymphozyten z. B. werden durch die Expression von typischen Strukturen auf der äußeren Zellmembran begleitet (so. z. B. die so genannten Cluster of Differentiation – CDs). Gegen diese Strukturen können Antikörper generiert werden, die das entscheidende Werkzeug für die mehr spezifischen Separationsverfahren sind. Fluoreszenz aktivierte Separationsverfahren und magnetische Trennverfahren haben sich seit Jahrzehnten für diese Aufgabe bewährt, neuerdings wird durch die Firma Pluriselect (Deutschland) auch ein Fängerpartikel gestütztes Sieb-Separationsverfahren angeboten.
• Diese Verfahren erlauben es auf einfache Weise, Zellen aus komplexen Flüssigkeiten zu isolieren, die sich in einem Merkmal auf der Membran von anderen unterscheiden. Zellen mit unterschiedlicher Funktion tragen häufig ein gleiches Merkmal (A) auf der Oberfläche neben weiteren, innerhalb der Zellpopulation anders verteilten Merkmalen (B, C, ...), charakteristisch für anderer Funktionen. Die Isolierung von Zellen, die nur eine gewünschte Kombination von A, B oder C aufweisen, ist nach wie vor eine große Herausforderung in der biologischen Forschung. Gegenwärtig kann nur mittels Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) nach Mehrfachmarkierungen diese Aufgabe gelöst werden. FACS ist zweifelsfrei der Goldstandard für die Separation von Zellen, aber mit hohem apparativen und personellen Aufwand verbunden. Weitere Nachteile dieser Technik liegen in dem hohen Stress für die isolierten Zellen, dem komplizierten sterilen Arbeiten und auch der Sortierung einer größeren Anzahl vitaler von Zellen sind methodische Grenzen gesetzt.
• Der Erfindung löst diese Aufgabenstellung durch eine neuartige Kombination von magnetischen und durch Fängerpartikel gestützten Trennverfahren. Sie wird gemäß den Ansprüchen 1–9 realisiert.
• Beschreibung der Erfindung:
• Es sollen beispielhaft Zellen mit den Merkmalen A, B und C aus Blut isoliert werden. Aus dieser Anzahl von Oberflächenmerkmalen ergeben sich 7 unterschiedliche Kombinationen (A, B, C, AB, AC, ABC, BC).
• Die Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung spezifischer Antikörper gegen A, B und C. In diesem Beispiel werden die Antikörper gegen A an Partikel mit einem Durchmesser von 40 μm gekoppelt, Antikörper gegen B an Partikel mit einem Durchmesser von 20 μm und Antikörper gegen C an magnetisierbare Partikel < 10 μm.
• Verfahrensschritt 1:
• Die Blutprobe wird jetzt mit den Detektionssystemen A und C für 10 Minuten vorinkubiert. Danach wird Detektionssystem B zugegeben und für weitere 10 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Probe durch eine Siebkaskade mit 2 Sieben der Maschengrösse 40 μm und 20 μm filtriert und ausreichend gespült.
  Das Sieb 40 μm hält zurück: A, AB, AC, ABC
  Das Sieb 20 μm hält zurück: B und BC
  Im Durchlauf: C
• Verfahrensschritt 2:
• Alle 3 Proben werden einem magnetischen Trennverfahren unterworfen
  Die 40 μm-Fraktion wird aufgeteilt in: A, AB und AC, ABC
  Die 20 μm-Fraktion wird separiert in die homogene Fraktionen B und BC
  Aus dem Durchlauf wird separiert die homogene Fraktion C
• Verfahrensschritt 3:
• Die Fraktionen A, AB sowie AC, ABC werden mittels bekannten Methoden vom Fängerpartikel A abgelöst. Eine Ko-Inkubation mit B ist angezeigt. Danach werden die Proben über ein 20 μm Sieb getrennt.
  Auf dem Sieb werden zurückgehalten: AB und ABC
  Im Durchlauf befinden sich A und AC
• Verfahrensschritt 4:
• Beide Fraktionen werden einem magnetischen Trennverfahren unterzogen, das zur Separation der homogenen Fraktionen AC und ABC, sowie A und AB führt.
• Das Verfahren kann mit großen Zellzahlen, geringem Aufwand in kurzer Zeit und stressarm für die Zellen durchgeführt werden. Ein Fachmann kann weite Kombinationen durch die geeignete Zusammenstellung von magnetischen und Größe-definierten Fängerpartikel entwickeln.

Claims (9)

1. Verfahren zur Separierung von Partikeln oder Zellen mit 2 oder mehr Oberflächenspezifitäten bestehend aus einer Kombination von Partikel-gestützter und magnetische Separation.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetisierbaren Fängerpartikel kleiner sind als die nichtmagnetisierbaren Fängerpartikel.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Partikel oder Zellen enthaltende Gemisch nacheinander oder gleichzeitig mit Fängerpartikeln für die Oberflächenspezifität A, mit Fängerpartikeln für die Oberflächenspezifität B und ggf. mit Fängerpartikeln für die Oberflächenspezifität C und ggf. weiteren Spezifitäten inkubiert wird, wobei die Fängerpartikel unterschiedliche Größe aufweisen bzw. magnetisierbar sind, nachfolgend durch Siebmembranen getrennt oder einem magnetischen Trennverfahren unterworfen und anschließend gegebenenfalls weiterbehandelt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nicht magnetisierbaren Fängerpartikel durch Siebmembranen erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung mehrerer nichtmagnetisierbarer Fängerpartikel durch Siebe/Membranen mit der dafür notwendigen Maschenweite/Porengröße erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nicht magnetisierbaren Fängerpartikel durch Magnetfeldeinwirkung erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Nukleinsäuren, Peptide oder Proteine, vorzugsweise Antikörper, als Fängerspezifitäten eingesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung der fixierten Partikel/Zellen mit an sich bekannten Verfahren erfolgt.
9. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8 für die Separierung von Partikeln und/oder Zellen aus komplexen Flüssigkeiten, vorzugsweise Blut, für Forschungszwecke und zur Diagnostik und Therapie von Krankheiten.