WO2018011397A1 - Verfahren, nanopartikel und kit zum nachweis von zielstrukturen - Google Patents

Verfahren, nanopartikel und kit zum nachweis von zielstrukturen Download PDF

Info

Publication number
WO2018011397A1
WO2018011397A1 PCT/EP2017/067845 EP2017067845W WO2018011397A1 WO 2018011397 A1 WO2018011397 A1 WO 2018011397A1 EP 2017067845 W EP2017067845 W EP 2017067845W WO 2018011397 A1 WO2018011397 A1 WO 2018011397A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nanoparticles
target structures
specific
filter
nucleic acid
Prior art date
Application number
PCT/EP2017/067845
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas BRETTSCHNEIDER
Jochen Hoffmann
Anne BUCHKREMER
Original Assignee
Robert Bosch Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch Gmbh filed Critical Robert Bosch Gmbh
Publication of WO2018011397A1 publication Critical patent/WO2018011397A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4724—Lectins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of
  • Target structures in particular of specific nucleic acid sequences and / or specific peptides or proteins and / or specific cells or cell types, as well as nanoparticles which can be used in this method, a kit for the detection of target structures and a use of this kit for the detection of target structures.
  • Analyzes of nucleic acids and in particular the detection of certain DNA sequences are performed for a variety of purposes. Especially medical-diagnostic applications play an important role here.
  • minute amounts of BCR-ABL1 gene translocation provide information on chronic myeloid leukemia (CML) in the area of minimal residual disease. Mutations in the
  • Chromosome sets 21, 18 and 13 indicate trisomies that can be examined in the field of prenatal diagnosis. Smallest amounts of a specific virus RNA, z. B. Ebola virus, can provide early information about an infection. Detection of certain nucleic acid sequences is often performed via an enzymatic amplification reaction (Polymerase Chain Reaction - PCR), which does not always allow a clear detection.
  • Polymerase Chain Reaction - PCR Polymerase Chain Reaction - PCR
  • Quantum dots which can be evaluated by a fluorometric measurement. But also this method is relative costly and time-consuming and does not always lead to satisfactory
  • the present invention provides a method for the detection of target structures, in particular of specific nucleic acid sequences and / or specific peptides or proteins and / or specific cells or cell types, which is inexpensive and easy to carry out and can be performed quickly without much equipment. It is therefore suitable for many applications, for example in medical diagnostics.
  • the key point of the method according to the invention is that nanoparticles are used which are used with at least one immobilized specific capture molecule which can interact with the target structure. These nanoparticles are brought into contact with the target structures in a reaction mixture under conditions that allow binding of the target structures to the nanoparticles (conjugation step). Subsequently, the reaction mixture is under
  • Clustering is based, at least in part, on nonspecific intramolecular and / or intermolecular interactions.
  • the target structures with the nanoparticles bound to them, so to speak, become larger units.
  • these formed clusters are separated from the remaining nanoparticles, which have no bound target structures, so that the separated clusters can be evaluated. This evaluation can be carried out optically, for example, in a particularly simple manner,
  • the microscopic evaluation can be carried out, for example, by means of light or dark field microscopy or fluorescence microscopy, wherein the clusters formed are immediately visible and provide information about the presence of the target structures in the original sample. Furthermore, for example, a spectrometric evaluation is possible.
  • the buffer and / or temperature conditions can be adjusted accordingly, wherein for the clustering generally lower temperatures than in the binding of the target structures to the nanoparticles are suitable.
  • Nucleic acid sequences as target structures may be used as conditions which allow binding of the target structures to the nanoparticles, for example hybridization conditions known per se with appropriate buffer and
  • Temperature e.g., 5x SSC, 0.1% SDS and 50% formamide, temperature 42 ° C.
  • the same buffer and lowering the temperature to, for example, 10-20 ° C can be used.
  • the concrete structure of these conditions must be adapted to the respective application.
  • the separation of the clusters formed by a size exclusion can be carried out, for this purpose, a size exclusion filtration with a filter having a pore size in the
  • Size range of the nanoparticles can be carried out
  • the filter for example as microfiltration.
  • the filter is chosen so that the formed clusters are retained and the nanoparticles, which have no bound target structures, pass through the filter.
  • Commercially available filters can in principle be used for this purpose.
  • Size exclusion separation can also be performed by other methods, such as size exclusion chromatography or
  • the capture molecules are chosen so that they specifically bind to the target structures. This bond can be based on different principles.
  • this interaction may be based on hybridization, in which case the target structures are nucleic acid sequences and the
  • Catcher molecules are also nucleic acid molecules. Binding via hybridization relies on more or less complementary DNA or RNA single strands attaching to each other. If a nucleic acid molecule is used as catcher molecule, in particular DNA or PNA molecules are suitable for this purpose owing to their particular stability in comparison with RNA molecules. Molecules that are generally more difficult to handle. However, it may also be, for example, protein-protein or peptide-protein or peptide-peptide interactions, for example, when a peptide aptamer is used as a capture molecule, the specific interactions with the target structure, in particular a peptide or protein or certain
  • a capture molecule for example, a nucleic acid aptamer can be used, which is also characterized by specific interactions with specific target structures. Another possibility is antibody-antigen interactions that can be used for the inventive approach.
  • catcher molecules are called nucleic acid molecules or as
  • Nucleic acid aptamers preferably sequences of about 5 to about 2000
  • Nucleotides in particular used with about 10 to about 100 nucleotides, wherein the respective sequence is selected in adaptation to the target structure to be detected.
  • anti-EpCAM antibodies can be used, for example, for detection of circulating tumor cells as antibodies.
  • FcMBL antibodies are suitable in which the mannose-binding lectin (MBL) is coupled to an Fc domain of an antibody.
  • At least two different capture molecules are immobilized on the nanoparticles. This can be used in the sense of multiplexing in one
  • the nanoparticles are further functionalized with reducing groups, in particular with aldehyde groups.
  • reducing groups in particular with aldehyde groups.
  • the respective reagent can be added before and / or after the separation of the clusters formed.
  • the detectability of the clusters formed can be simplified.
  • the silver nitrate present in this reagent is reduced to elemental silver and precipitates locally (Silberspielgelprobe).
  • a filter can be used for the separation of the clusters formed, which is also coated with at least one specific capture molecule that can interact with the target structure, wherein the capture molecules are preferably immobilized substantially over the entire surface of the filter.
  • the sample with the target structures to be detected is subjected to binding conditions
  • Catcher molecules is significantly larger than the maximum expected absolute number of target structures in the sample.
  • the nanoparticles are then added, which attach specifically to the target structures bound to the filter, in which case clustering occurs. In this case, the addition and binding of the nanoparticles in the
  • Variant has the particular advantage that, by counting the clusters formed on the filter, the absolute amount of the target structures can be counted to a certain extent and thus determined quantitatively.
  • portions of the filter are coated with different specific capture molecules.
  • Embodiment allows the simultaneous analysis of different target structures.
  • the method according to the invention is an easy-to-implement method for the specific detection of specific target structures. No elaborate apparatuses are required for this, since the method according to the invention provides, in particular, for mechanical separation of the clusters formed, for example by microfiltration customary in the laboratory.
  • the binding is beyond the selection of the respective capture molecules
  • Cluster is about the size of the nanoparticles and the type and number of nanoparticles
  • Catcher molecules adjustable. As a result, cluster sizes of about 200 nm or larger can be achieved, for example. This allows a simple optical detection with a normal light microscope or, for example, a CCD camera with suitable optics. Due to these low demands on one
  • Processing unit for example, a realization in the form of a hand-held apparatus possible.
  • the approach according to the invention also allows a quantitative evaluation in the manner described. Compared to conventional detection methods such as quantitative PCR, the inventive method also has the advantage that for a Quantification of target structures no reference reactions performed
  • the invention further comprises nanoparticles which are provided for the detection of target structures, in particular of specific nucleic acid sequences and / or specific peptides or proteins and / or specific cells or cell types.
  • At least one specific capture molecule, which can interact with the target structure, is immobilized on the nanoparticles.
  • the capture molecule may in particular be a nucleic acid molecule, in particular a DNA molecule or a PNA molecule, and / or an aptamer and / or an antibody.
  • the nucleic acid molecule or the aptamer can be, for example, 5-2000 nucleotides, especially 10-100
  • the antibody may be, for example, an anti-EpCAM antibody or an antibody coupled with FcMBL.
  • FcMBL an antibody coupled with FcMBL.
  • Nanoparticles immobilized at least two different capture molecules are provided, which can be used for the method according to the invention.
  • the nanoparticles can additionally be functionalized with reducing groups, in particular with aldehyde groups.
  • the reaction batch can be admixed with a reagent for detecting the reducing groups, preferably with Tollens reagent, wherein preferably the reagent is added before and / or after the separation of the clusters formed.
  • the invention comprises a kit for the detection of certain
  • This kit comprises nanoparticles as described above and / or a filter having a pore size in the size range of the nanoparticles.
  • the kit only contains the nanoparticles and if appropriate, comprising suitable buffers and similar reagents and that the user uses a commercial filter having a corresponding pore size.
  • the kit preferably also contains this special filter or possibly only the special filter in addition to the nanoparticles.
  • the invention encompasses the use of such a kit for the detection of specific target structures. Depending on the target structure to be detected, the components of the kit are equipped with specific capture molecules.
  • the kit it is also possible for the kit to be composed in the manner of a construction kit which permits or requires the user to immobilize the specific catcher molecules which may be present in a selection in the kit or are provided by the user.
  • Figure 1 is a schematic representation of a nanoparticle with it
  • Nanoparticles according to the invention and various
  • Figure 3 is a schematic representation of the separation of the clusters formed according to the method of the invention.
  • Fig. 1 shows schematically the basic structure of a
  • Nanoparticle according to the invention 10 which comprises a nanoparticle structure 11, on the surface of a plurality of capture molecules 12 is immobilized.
  • the catcher molecules 12 may be, for example, certain DNA molecules which, with regard to interaction with the
  • capture molecules 12 are antibodies or aptamers.
  • Nanoparticle structure 11 can be carried out by methods known per se, such as. As a controlled polymerization, reduction of metal salts or seed-mediated Groi / i / i? S methods. In addition to spherical shapes, for example, rod-shaped nanoparticles or other are possible.
  • Nanoparticle structure 11 may have a magnetic core
  • the nanoparticle 10 has a particularly good biocompatibility and also provides a very suitable surface layer for the
  • FIG. 2 A-C shows the principle of cluster formation from the nanoparticles according to the invention with target structures bound thereto in an aqueous phase according to the method according to the invention.
  • Fig. 2A shows the principle of cluster formation from the nanoparticles according to the invention with target structures bound thereto in an aqueous phase according to the method according to the invention.
  • Suitable catcher molecules for the nanoparticles 10 according to the invention can be, for example, aptamers or antibodies, for example antibiotics.
  • EpCAM suitable for certain cancer cells
  • FcM BL universal binder, which in particular binds fungi, toxins and bacteria
  • FIG. 2B illustrates the method according to the invention with regard to nucleic acids 220, in particular DNA or RNA, as target structures.
  • the nanoparticles 10 may optionally be functionalized with different capture sequences. If the target structures 220 are present in the sample, it comes first to an interaction and a connection of the
  • Nanoparticles 10 to the nucleic acids 220 ( Figure 2B - left). It is particularly advantageous during the conjugation step in which the
  • Nanoparticles 10 and the nucleic acids 220 interact,
  • nucleic acids 220 are optimally accessible to the DNA capture molecules (unbelted), for example by increasing the temperature to between 40 to 70 ° C, for example.
  • known hybridization conditions can be set, e.g. 5x SSC, 0.1% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • crosslinking takes place under appropriate incubation conditions (eg lowering the temperature to 10-20 ° C., same buffer conditions)
  • Clustering 20 or to a Verknäulen (Fig. 2B - right).
  • the clusters 20 can be separated from the unbound nanoparticles 10 and detected.
  • Figure 2C illustrates the method of the invention for the detection of peptides or proteins 230 as target structures. Suitable capture molecules for this purpose may be, for example, antibodies or aptamers. If the desired peptides or proteins 230 are present in the sample, there is an interaction with the specific nanoparticles 10 and an intramolecular incorporation of the nanoparticles 10 within the peptide or protein structures 230 in the form of larger units 20 (FIG. 2C-right). , Intermolecular bonding and thus enhanced cross-linking or clustering 20 is also possible. Subsequent microfiltration allows the formed clusters of unbound nanoparticles 10 to be separated and detected.
  • Fig. 3 illustrates the step of filtration to separate the formed clusters 20. After the conjugation reaction in which the nanoparticles 10 are attached to the
  • Target structures 210, 220 or 230 bind, incubation conditions for the formation of clusters 20 are set.
  • This suspension is replaced by a suitable filter 30 out (Fig. 3 - left).
  • the filter 30 may be off
  • the filter 30 has a pore size adapted to the target structures or clusters 20 so that the filter retains the clusters 20 (FIG. 3 - right) and allows the unbonded nanoparticles 10 to pass unhindered.
  • the retained clusters 20 can then be detected and evaluated on the filter, for example with a suitable optical system, for example a microscope.
  • the binding reaction conjugation step
  • the nanoparticles with attached target structures are separated from nanoparticles without bound target structures, for example by means of a filtration.
  • the nanoparticles for example, a species of a
  • Carry catcher molecule may be particularly advantageous if, for example, in the case of certain DNA sequences as target structures, two or more specific capture molecules are immobilized on the nanoparticles, which at different points of the DNA target sequence binding of the
  • Nanoparticles cause, whereby a Verknäulen and thus a clustering is supported. This clustering may be due to an increased number of different capture molecules and the number of these different capture molecules
  • FIG. 4A illustrates the embodiment of the method according to the invention, in which the nanoparticles 10 are additionally functionalized with reducing groups, for example aldehyde groups.
  • a Detecting reagent for reducing groups eg Tollens reagent
  • the detectability and evaluation of the method according to the invention is further improved.
  • the formed clusters 20 are added with the reagent, deposition of a silver layer 40 and within the clusters 20 occurs. This stabilizes the formed clusters 20 and increases the yield and speed in the filtration step via the filter 30 and improves detectability
  • 4B illustrates a further embodiment of the method according to the invention, in which additional catcher molecules 402 are immobilized on the filter 30.
  • the filter 30 is thus in a sense additionally coated with the catcher molecules 402.
  • a first reaction step of the method according to the invention in this case the sample or the solution with the target structures 420 to be detected, for example specific DNA sequences, under appropriate reaction conditions
  • Partial regions of the filter 30 are immobilized, so that different specific target structures, for example, different DNA target sequences, can be analyzed quantitatively in parallel.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Bei einem Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen (210) werden Nanopartikel (10) mit wenigstens einem immobilisierten spezifischen Fängermolekül, das mit der jeweiligen Zielstruktur wechselwirken kann, verwendet. Die Nanopartikel (10) werden mit den Zielstrukturen (210) in einem Reaktionsansatz unter Bedingungen, die eine Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel erlauben, in Kontakt gebracht. Der Reaktionsansatz wird unter Bedingungen, die eine Clusterbildung der Nanopartikel mit den daran gebundenen Zielstrukturen untereinander erlauben, inkubiert. Die gebildeten Cluster (20) werden von den Nanopartikeln (10), die keine gebundenen Zielstrukturen aufweisen, abgetrennt, sodass die abgetrennten Cluster (20) ausgewertet werden können.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren, Nanopartikel und Kit zum Nachweis von Zielstrukturen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von
Zielstrukturen, insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen, sowie Nanopartikel, die in diesem Verfahren einsetzbar sind, einen Kit zum Nachweis von Zielstrukturen sowie eine Verwendung dieses Kits zum Nachweis von Zielstrukturen.
Stand der Technik
Analysen von Nukleinsäuren und insbesondere der Nachweis bestimmter DNA- Sequenzen werden für eine Vielzahl von Zwecken durchgeführt. Hierbei spielen vor allem medizinisch-diagnostische Anwendungen eine große Rolle.
Beispielsweise geben kleinste Mengen einer BCR-ABLl-Gentranslokation Auskunft über eine chronische myeloische Leukämie (CML) im Bereich der Minimal Residual Disease (minimale Resterkrankung). Mutationen im
Chromosomensatz 21, 18 und 13 deuten auf Trisomien hin, die im Bereich einer pränatalen Diagnostik untersucht werden können. Kleinste Mengen einer bestimmten Virus-RNA, z. B. Ebolavirus, können frühzeitig Aufschluss über eine Infektion liefern. Ein Nachweis bestimmter Nukleinsäuresequenzen wird oftmals über eine enzymatische Amplifikationsreaktion (Polymerase Chain Reaction - PCR) durchgeführt, die aber nicht immer einen eindeutigen Nachweis ermöglicht.
Zudem ist hierfür ein hoher apparativer, zeitlicher und personeller Aufwand erforderlich. Bei einem anderen Ansatz werden einzelne Moleküle mit gelabelten Hybridisierungssonden markiert. Als Markierung können beispielsweise
Quantum-Dots (QDs) eingesetzt werden, die über eine fluorometrische Messung ausgewertet werden können. Aber auch diese Methode ist verhältnismäßig kostenintensiv und aufwändig und führt nicht immer zu befriedigenden
Ergebnissen.
Offenbarung der Erfindung Vorteile der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen, insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen, bereit, das kostengünstig und einfach in der Durchführung ist und ohne großen apparativen Aufwand schnell durchgeführt werden kann. Es eignet sich daher für viele Anwendungen, beispielsweise in der medizinischen Diagnostik. Kernpunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass Nanopartikel eingesetzt werden, die mit wenigstens einem immobilisierten spezifischen Fängermolekül, das mit der Zielstruktur wechselwirken kann, verwendet werden. Diese Nanopartikel werden mit den Zielstrukturen in einem Reaktionsansatz unter Bedingungen, die eine Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel erlauben, in Kontakt gebracht (Konjugationsschritt). Anschließend wird der Reaktionsansatz unter
Bedingungen, die eine Clusterbildung der Nanopartikel mit den daran
gebundenen Zielstrukturen untereinander erlauben, inkubiert. Diese
Clusterbildung basiert zumindest zum Teil auf unspezifischen intra- und/oder intermolekularen Wechselwirkungen. Die Zielstrukturen mit den damit gebundenen Nanopartikeln verknäulen sich gewissermaßen zu größeren Einheiten. Im folgenden Schritt werden diese gebildeten Cluster von den übrigen Nanopartikeln, die keine gebundenen Zielstrukturen aufweisen, abgetrennt, sodass die abgetrennten Cluster ausgewertet werden können. Diese Auswertung kann beispielsweise in besonders einfacher Weise optisch erfolgen,
beispielsweise mikroskopisch oder mit optischen Sensoren. Die mikroskopische Auswertung kann beispielsweise mittels Hell- oder Dunkelfeldmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie erfolgen, wobei unmittelbar die gebildeten Cluster sichtbar sind und Aufschluss über das Vorhandensein der Zielstrukturen in der Ausgangsprobe geben. Weiterhin ist beispielsweise auch eine spektrometrische Auswertung möglich. Zur Einstellung von Bedingungen, die eine Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel bzw. eine Clusterbildung erlauben, können insbesondere die Pufferund/oder Temperaturbedingungen entsprechend eingestellt werden, wobei für die Clusterbildung im Allgemeinen niedrigere Temperaturen als bei der Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel geeignet sind. Im Fall von
Nukleinsäuresequenzen als Zielstrukturen können als Bedingungen, die eine Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel erlauben, beispielsweise an sich bekannte Hybridisierungsbedingungen mit entsprechendem Puffer und
Temperatur (z.B. 5x SSC, 0,1 % SDS und 50 % Formamid, Temperatur 42 °C) eingestellt werden. Als Bedingungen für die Clusterbildung in diesem Beispiel kann der gleiche Puffer und eine Absenkung der Temperatur auf beispielsweise 10 - 20 °C eingesetzt werden. Die konkrete Ausgestaltung dieser Bedingungen ist auf den jeweiligen Anwendungsfall abzustimmen.
In besonders bevorzugter und einfacher Weise kann die Abtrennung der gebildeten Cluster durch einen Größenausschluss erfolgen, wobei hierfür eine Größenausschlussfiltration mit einem Filter, der eine Porengröße im
Größenbereich der Nanopartikel aufweist, durchgeführt werden kann,
beispielsweise als Mikrofiltration. Der Filter wird hierbei so gewählt, dass die gebildeten Cluster zurückgehalten werden und die Nanopartikel, die keine gebundenen Zielstrukturen aufweisen, den Filter passieren. Hierfür können im Prinzip handelsübliche Filter eingesetzt werden. Eine
Größenausschlussabtrennung kann auch mit anderen Methoden durchgeführt werden, beispielsweise durch Größenausschlusschromatographie oder
Ähnliches.
Die Fängermoleküle sind so gewählt, dass sie spezifisch an die Zielstrukturen binden. Diese Bindung kann auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen.
Beispielsweise kann diese Wechselwirkung auf einer Hybridisierung beruhen, wobei in diesem Fall die Zielstrukturen Nukleinsäuresequenzen und die
Fängermoleküle ebenfalls Nukleinsäuremoleküle sind. Die Bindung über die Hybridisierung beruht darauf, dass mehr oder weniger komplementäre DNA- oder RNA-Einzelstränge sich aneinander anlagern. Wenn als Fängermolekül ein Nukleinsäuremolekül eingesetzt wird, eignen sich hierfür insbesondere DNA- oder PNA-Moleküle aufgrund ihrer besonderen Stabilität im Vergleich mit RNA- Molekülen, die in der Handhabung im Allgemeinen schwieriger sind. Es kann sich aber beispielsweise auch um Protein-Protein- oder Peptid-Protein- oder Peptid- Peptid-Wechselwirkungen handeln, beispielsweise, wenn ein Peptid-Aptamer als Fängermolekül eingesetzt wird, das spezifische Wechselwirkungen mit der Zielstruktur, insbesondere einem Peptid oder Protein oder bestimmten
Oberflächenproteinen von bestimmten Zellen oder Zelltypen, eingeht. Als Fängermolekül kann beispielsweise auch ein Nukleinsäure-Aptamer eingesetzt werden, das sich ebenfalls durch spezifische Wechselwirkungen mit bestimmten Zielstrukturen auszeichnet. Eine weitere Möglichkeit sind Antikörper-Antigen- Wechselwirkungen, die für den erfindungsgemäßen Ansatz genutzt werden können.
Bei den Fängermolekülen werden als Nukleinsäuremoleküle oder als
Nukleinsäure-Aptamere vorzugsweise Sequenzen mit ca. 5 bis ca. 2000
Nukleotiden, insbesondere mit ca. 10 bis ca. 100 Nukleotiden eingesetzt, wobei die jeweilige Sequenz in Anpassung an die nachzuweisende Zielstruktur ausgewählt wird. Wenn für den erfindungsgemäßen Ansatz Antikörper als Fängermoleküle verwendet werden, kann beispielsweise für einen Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen als Antikörper Anti-EpCAM-Antikörper eingesetzt werden. Für andere Anwendungen bzw. Nachweise eignen sich beispielsweise FcMBL-Antikörper, bei denen das Mannose-bindende Lektin (MBL) an eine Fc- Domäne eines Antikörpers gekoppelt ist. Prinzipiell ist durch Auswahl geeigneter Fängermoleküle das erfindungsgemäße Verfahren an eine sehr große
Bandbreite von Zielstrukturen, die mit diesem Verfahren nachweisbar sind, anpassbar.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind an den Nanopartikeln wenigstens zwei verschiedene Fängermoleküle immobilisiert. Hiermit können im Sinne eines Multiplexing in einem
Reaktionsansatz gegebenenfalls verschiedene Zielstrukturen parallel getestet werden.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens bzw. der Nanopartikel sind die Nanopartikel weiterhin mit reduzierenden Gruppen, insbesondere mit Aldehyd-Gruppen funktional isiert. Hierbei wird der Reaktionsansatz mit Tollens-Reagenz oder einem anderen Reagenz, das für den Nachweis von reduzierenden Gruppen geeignet ist, versetzt. Das jeweilige Reagenz kann vor und/oder nach der Abtrennung der gebildeten Cluster zugegeben werden. Durch die Verwendung derartiger Reagenzien kann die Nachweisbarkeit der gebildeten Cluster vereinfacht werden. Beim Einsatz des Tollens-Reagenz wird das in diesem Reagenz vorhandene Silbernitrat zu elementarem Silber reduziert und scheidet sich lokal ab (Silberspielgelprobe). Durch das damit verbundene Aufwachsen einer Silberschicht auf den gebildeten Clustern können diese mechanisch stabilisiert werden und der Differenzdruck bei einer Filtration erhöht werden, wodurch das Risiko eines Auflösens des Clusters verringert wird. Dies kann sowohl die maximale Geschwindigkeit des
Filtrationsschrittes (Zentrifugation) als auch die Ausbeute erhöhen. Wenn das Tollens-Reagenz beispielsweise nach der Filtration zugefügt wird, werden die abgetrennten Cluster beschichtet und vergrößert, wodurch beispielsweise eine optische Detektion der Cluster vereinfacht wird.
Weiterhin kann für die Abtrennung der gebildeten Cluster ein Filter eingesetzt, der ebenfalls mit wenigstens einem spezifischen Fängermolekül, das mit der Zielstruktur wechselwirken kann, beschichtet ist, wobei die Fängermoleküle vorzugsweise im Wesentlichen ganzflächig auf dem Filter immobilisiert sind. In dieser Ausführungsform wird in einem ersten Reaktionsschritt die Probe mit den nachzuweisenden Zielstrukturen unter Bindungsbedingungen
(Konjugationsschritt) mit dem beschichteten Filter in Kontakt gebracht. Hierbei binden die Zielstrukturen statistisch verteilt (Poisson-Verteilung) an die
Fängermoleküle, wobei zweckmäßigerweise die absolute Anzahl der
Fängermoleküle deutlich größer als die maximal zu erwartende absolute Anzahl der Zielstrukturen in der Probe ist. In einem zweiten Reaktionsschritt werden dann die Nanopartikel zugegeben, die sich spezifisch an die auf dem Filter gebundenen Zielstrukturen anlagern, wobei es hierbei zu der Clusterbildung kommt. In diesem Fall dienen die Zugabe und die Anbindung der Nanopartikel im
Wesentlichen dem Sichtbarmachen der Zielsequenzen. Ungebundene oder überschüssige Nanopartikel werden vor der Detektion weggespült. Diese
Variante hat den besonderen Vorteil, dass über ein Auszählen der auf dem Filter gebildeten Cluster die absolute Menge der Zielstrukturen gewissermaßen ausgezählt und damit quantitativ bestimmt werden kann. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung dieses Aspektes des
erfindungsgemäßen Verfahrens sind Teilbereiche des Filters mit jeweils unterschiedlichen spezifischen Fängermolekülen beschichtet. Diese
Ausführungsform erlaubt die gleichzeitige Analyse verschiedener Zielstrukturen.
Es können beispielsweise auf einem Filter in vier Quadranten jeweils
unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sein, um damit in der eben beschriebenen Weise vier verschiedene Zielstrukturen binden zu können. Die Probe mit den potentiell vorhandenen Zielstrukturen wird dann also zunächst mit dem Filter in Kontakt gebracht. Anschließend werden die Nanopartikel zugesetzt, um die an dem Filter angebundenen Zielstrukturen über eine entsprechende Clusterbildung in der oben beschriebenen Weise sichtbar zu machen. Bei dieser Variante ist es also möglich, unterschiedliche einzelne Zielstrukturen,
beispielsweise unterschiedliche DNA-Zielsequenzen, quantitativ nachzuweisen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine einfach zu realisierende Methode für die spezifische Detektion bestimmter Zielstrukturen. Es sind keine aufwendigen Apparate hierfür erforderlich, da das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere eine mechanische Abtrennung der gebildeten Cluster, beispielsweise durch eine laborübliche Mikrofiltration, vorsieht. Bei der Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel über die spezifischen Fängermoleküle (Konjugationsschritt) ist die Bindung über die Auswahl des jeweiligen
Fängermoleküls, beispielsweise eine bestimmte DNA-Sequenz, und über die Oberflächenbelegung bzw. die Immobilisierung von weiteren spezifischen Fängermolekülen auf dem Filter steuerbar. Die Größe der zu erwartenden
Cluster ist über die Größe der Nanopartikel und die Art und Anzahl der
Fängermoleküle einstellbar. Dadurch lassen sich beispielsweise Clustergrößen von etwa 200 nm oder größer erzielen. Dies erlaubt eine einfache optische Detektion mit einem normalen Lichtmikroskop oder beispielsweise einer CCD- Kamera mit geeigneter Optik. Durch diese geringen Anforderungen an eine
Prozessiereinheit ist beispielsweise auch eine Realisierung in Form eines handgeführten Apparates möglich. Der erfindungsgemäße Ansatz erlaubt auch eine quantitative Auswertung in der beschriebenen Weise. Gegenüber herkömmlichen Nachweisverfahren wie beispielsweise einer quantitativen PCR hat das erfindungsgemäße Verfahren auch den Vorteil, dass für eine Quantifizierung von Zielstrukturen keine Referenzreaktionen durchgeführt
werden müssen, was die Komplexität und den Platzbedarf einer entsprechenden Vorrichtung reduziert. Zusätzlich lassen sich über ein einfaches Multiplexing beispielsweise verschiedene Nukleinsäuresequenzen in einem Ansatz
nachweisen, indem ein Filter eingesetzt wird, der mit verschiedenen
Fängermolekülen beschichtet ist.
Die Erfindung umfasst weiterhin Nanopartikel, die zum Nachweis von Zielstrukturen, insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen, vorgesehen sind. An den Nanopartikeln ist jeweils wenigstens ein spezifisches Fängermolekül, das mit der Zielstruktur wechselwirken kann, immobilisiert. Das Fängermolekül kann insbesondere ein Nukleinsäure-Molekül, insbesondere ein DNA-Molekül oder ein PNA-Molekül, und/oder ein Aptamer und/oder ein Antikörper sein. Das Nukleinsäure-Molekül oder das Aptamer kann beispielsweise 5 - 2000 Nukleotide, insbesondere 10 - 100
Nukleotide, umfassen. Der Antikörper kann beispielsweise ein Anti-EpCAM-Antikörper oder ein mit FcMBL gekoppelter Antikörper sein. Vorzugsweise sind an den
Nanopartikeln wenigstens zwei verschiedene Fängermoleküle immobilisiert. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Nanopartikel sind wenigstens zwei unterschiedliche Nanopartikel mit jeweils verschiedenen immobilisierten spezifischen Fängermolekülen vorgesehen, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können. Darüberhinaus können die Nanopartikel zusätzlich mit reduzierenden Gruppen, insbesondere mit Aldehyd-Gruppen, funktionalisiert sein. Bei der Durchführung des Nachweisverfahrens mit diesen Nanopartikeln kann der Reaktionsansatz mit einem Reagenz zum Nachweis der reduzierenden Gruppen, vorzugsweise mit Tollens- Reagenz, versetzt werden, wobei vorzugsweise das Reagenz vor und/oder nach der Abtrennung der gebildeten Cluster zugegeben wird. Bezüglich weiterer Merkmale dieser Nanopartikel und dem damit durchführbaren Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Weiterhin umfasst die Erfindung einen Kit zum Nachweis von bestimmten
Zielstrukturen. Dieser Kit umfasst Nanopartikel gemäß der obigen Beschreibung und/oder einen Filter, der eine Porengröße im Größenbereich der Nanopartikel aufweist. Es ist beispielsweise möglich, dass das Kit nur die Nanopartikel und gegebenenfalls entsprechend geeignete Puffer und ähnliche Reagenzien umfasst und dass von dem Anwender ein handelsüblicher Filter eingesetzt wird, der eine entsprechende Porengröße aufweist. Insbesondere in den Fällen, in denen ein Filter mit immobilisierten Fängermolekülen, wie oben beschrieben, verwendet wird, enthält der Kit neben den Nanopartikeln vorzugsweise auch diesen speziellen Filter oder gegebenenfalls nur den speziellen Filter. Schließlich umfasst die Erfindung die Verwendung eines solchen Kits zum Nachweis von bestimmten Zielstrukturen. Je nach der nachzuweisenden Zielstruktur sind die Komponenten des Kits mit spezifischen Fängermolekülen ausgestattet. Weiterhin ist es auch möglich, dass der Kit nach Art eines Baukastens zusammengesetzt ist, der eine Immobilisierung der spezifischen Fängermolekülen, die gegebenenfalls in einer Auswahl im Kit vorhanden sind oder vom Anwender bereitgestellt werden, durch den Anwender erlaubt bzw. erfordert.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der
nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in
Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Figuren zeigt
Figur 1 schematische Darstellung eines Nanopartikels mit daran
immobilisierten spezifischen Fängermolekülen;
Figur 2A-C schematische Darstellung der Interaktion zwischen
erfindungsgemäßen Nanopartikeln und verschiedenen
Zielstrukturen;
Figur 3 schematische Darstellung der Abtrennung der gebildeten Cluster gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren;
Figur 4A-B schematische Darstellung von bevorzugten Ausführungsformen
des Verfahrens (Fig. 4A - Nanopartikel, die mit reduzierenden
Gruppen funktionalisiert sind; Fig. 4B - Filter mit immobilisierten
Fängermolekülen).
Beschreibung von Ausführungsbeisp Fig. 1 zeigt in schematischer Weise den prinzipiellen Aufbau eines
erfindungsgemäßen Nanopartikels 10, der eine Nanopartikelstruktur 11 umfasst, auf deren Oberfläche eine Mehrzahl von Fängermolekülen 12 immobilisiert ist. Bei den Fängermolekülen 12 kann es sich beispielsweise um bestimmte DNA- Moleküle handeln, die im Hinblick auf eine Wechselwirkung mit den
nachzuweisenden Zielstrukturen ausgewählt sind. Andere Möglichkeiten für Fängermoleküle 12 sind Antikörper oder Aptamere. Die Herstellung der
Nanopartikelstruktur 11 kann mit an sich bekannten Verfahren erfolgen, wie z. B. einer kontrollierten Polymerisation, Reduktion von Metallsalzen oder Seed- mediated Groi/i/i ?s-Methoden. Neben sphärischen Formen sind beispielsweise auch stäbchenförmige Nanopartikel oder Anderes möglich. Die
Nanopartikelstruktur 11 kann einen magnetischen Kern aufweisen,
beispielsweise aus Fe304, und mit einer Goldhülle überzogen sein. In dieser Ausgestaltung hat der Nanopartikel 10 eine besonders gute Bioverträglichkeit und stellt darüber hinaus eine sehr geeignete Oberflächenschicht für die
Anbindung von beispielsweise Thiol-modifizierten Nukleinsäuren oder
Proteinmolekülen dar.
Fig. 2 A-C zeigt das Prinzip der Clusterbildung aus den erfindungsgemäßen Nanopartikeln mit daran gebundenen Zielstrukturen in einer wässrigen Phase gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Hierbei sind in der Fig. 2A
bestimmte Zellen oder Zelltypen 210, beispielsweise Bakterien, Pilze oder humane Zellen, beispielsweise Krebszellen, dargestellt. Als hierfür geeignete Fängermoleküle an den erfindungsgemäßen Nanopartikeln 10 können beispielsweise Aptamere oder Antikörper eingesetzt werden, beispielsweise Anti-
EpCAM (geeignet für bestimmte Krebszellen) oder FcM BL (universeller Binder, der insbesondere Pilze, Toxine und Bakterien bindet). Wenn die in der zu untersuchenden Probe nachzuweisenden Zielstrukturen vorhanden sind, kommt es zu einer Wechselwirkung mit den Nanopartikeln in einem ersten
Konjugationsschritt und nachfolgend zu einer Quervernetzung der Zellen
(Clusterbildung) über die daran gebundenen Nanopartikel 10 (Fig. 2A - rechts). Diese gebildeten Cluster 20 können anschließend beispielsweise über eine Mikrofiltration von den überschüssigen bzw. nicht in Wechselwirkung getretenen Nanopartikeln 10 abgetrennt und nachgewiesen werden. Fig. 2B illustriert das erfindungsgemäße Verfahren in Hinblick auf Nukleinsäuren 220, insbesondere DNA oder RNA, als Zielstrukturen. Durch spezifische Fängermoleküle auf den Nanopartikeln 10, die beispielsweise auf der Basis einer Hybridisierung mit den Nukleinsäuren 220 wechselwirken (komplementäre Fängersequenzen) kommt es zu einer Bindung der Nanopartikel 10 an die Nukleinsäuren 220. Dabei können die Nanopartikel 10 gegebenenfalls mit verschiedenen Fängersequenzen funktionalisiert sein. Sofern die Zielstrukturen 220 in der Probe vorhanden sind, kommt es zunächst zu einer Wechselwirkung und einer Anbindung der
Nanopartikel 10 an die Nukleinsäuren 220 (Fig. 2B - links). Dabei ist es besonders vorteilhaft, während des Konjugationsschrittes, bei dem die
Nanopartikel 10 und die Nukleinsäuren 220 in Wechselwirkung treten,
Bedingungen zu schaffen, unter welchen die Nukleinsäuren 220 optimal für die DNA-Fängermoleküle zugänglich sind (unverknäult), beispielsweise durch eine Erhöhung der Temperatur auf beispielsweise zwischen 40 bis 70 °C. Hierfür können an sich bekannte Hybridisierungsbedingungen eingestellt werden, z.B. 5x SSC, 0,1 % SDS, 50 % Formamid, 42 °C. Im folgenden Schritt kommt es unter entsprechenden Inkubationsbedingungen (z. B. Erniedrigung der Temperatur auf 10 - 20 °C, gleiche Pufferbedingungen) zu einer Quervernetzung und
Clusterbildung 20 bzw. zu einem Verknäulen (Fig. 2B - rechts). Beispielsweise mittels einer anschließenden Mikrofiltration können die Cluster 20 von den ungebundenen Nanopartikeln 10 abgetrennt und nachgewiesen werden. Fig. 2C illustriert das erfindungsgemäße Verfahren für den Nachweis von Peptiden oder Proteinen 230 als Zielstrukturen. Geeignete Fängermoleküle hierfür können beispielsweise Antikörper oder Aptamere sein. Sofern die gesuchten Peptide oder Proteine 230 in Probe vorhanden sind, kommt es zu einer Wechselwirkung mit den spezifischen Nanopartikeln 10 und zu einer intramolekularen Einlagerung der Nanopartikel 10 innerhalb der Peptid- oder Proteinstrukturen 230 in Form von größeren Einheiten 20 (Fig. 2C - rechts). Eine intermolekulare Bindung und damit eine verstärkte Querverbindung oder Clusterbildung 20 ist ebenso möglich. Durch eine anschließende Mikrofiltration können die gebildeten Cluster von ungebundenen Nanopartikeln 10 abgetrennt und nachgewiesen werden.
Fig. 3 illustriert den Schritt einer Filtration zur Abtrennung der gebildeten Cluster 20. Nach der Konjugationsreaktion, bei der die Nanopartikel 10 an die
Zielstrukturen 210, 220 oder 230 binden, werden Inkubationsbedingungen für die Bildung von Clustern 20 eingestellt. Diese Suspension wird durch einen geeigneten Filter 30 geführt (Fig. 3 - links). Der Filter 30 kann aus
unterschiedlichen Materialien, wie beispielsweise Polymeren, Metallen oder Halbleitermaterialien gefertigt sein. Wichtig ist, dass der Filter 30 eine den Zielstrukturen bzw. den Clustern 20 angepasste Porengröße aufweist, sodass der Filter die Cluster 20 zurückhält (Fig. 3 - rechts) und die ungebundenen Nanopartikel 10 ungehindert passieren lässt. Auf dem Filter können dann die zurückgehaltenen Cluster 20 beispielsweise mit einem geeigneten optischen System, beispielsweise einem Mikroskop, erfasst und ausgewertet werden.
Wenn ausschließlich auf den Nanopartikeln Fängermoleküle immobilisiert sind, also keine Fängermoleküle auf einer Filteroberfläche, findet die Bindungsreaktion (Konjugationsschritt) zwischen den Nanopartikeln und den Zielstrukturen ausschließlich in der Lösung statt. Anschließend werden Nanopartikel mit daran gebundenen Zielstrukturen von Nanopartikeln ohne gebundene Zielstrukturen separiert, beispielsweise mittels einer Filtration. Für diese Durchführung des Verfahrens können die Nanopartikel beispielsweise eine Spezies eines
Fängermoleküls tragen. Es kann jedoch besonders vorteilhaft sein, wenn beispielsweise im Fall von bestimmten DNA-Sequenzen als Zielstrukturen zwei oder mehr spezifische Fängermoleküle an den Nanopartikeln immobilisiert sind, die an verschiedenen Stellen der DNA-Zielsequenz eine Bindung der
Nanopartikel bewirken, wodurch ein Verknäulen und damit eine Clusterbildung unterstützt wird. Diese Clusterbildung kann durch eine erhöhte Anzahl von verschiedenen Fängermolekülen und über die Anzahl dieser jeweiligen
Sequenzen auf den Nanopartikeln weiter verstärkt und gesteuert werden. Diese verschiedenen Fängermoleküle können jeweils auf einem Nanopartikel bzw. einer Spezies von Nanopartikeln immobilisiert sein. Es ist auch möglich, verschiedene Spezies von Nanopartikeln einzusetzen, die jeweils
unterschiedliche Fängermoleküle tragen und die dann in einem Ansatz miteinander kombiniert werden können. Mit diesen Ansätzen kann die Bindung bzw. die Konjugation mit den Zielstrukturen verstärkt werden, indem
verschiedene Unterstrukturen der jeweiligen Zielstrukturen adressiert werden.
Fig. 4A illustriert die Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Nanopartikel 10 zusätzlich mit reduzierenden Gruppen, beispielsweise Aldehyd-Gruppen, funktionalisiert sind. Durch Behandlung mit einem Nachweisreagenz für reduzierende Gruppen (z.B. Tollens- Reagenz) wird die Detektierbarkeit und Auswertung des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter verbessert. Wenn die gebildeten Cluster 20 mit dem Reagenz versetzt werden, kommt es zu einer Abscheidung einer Silberschicht 40 auf und innerhalb der Cluster 20. Dies stabilisiert die gebildeten Cluster 20 und erhöht die Ausbeute und die Geschwindigkeit bei dem Filtrationsschritt über den Filter 30 und verbessert die Nachweisbarkeit. Fig. 4B illustriert eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem zusätzliche Fängermoleküle 402 auf dem Filter 30 immobilisiert sind. Der Filter 30 ist also gewissermaßen mit den Fängermolekülen 402 zusätzlich beschichtet. In einem ersten Reaktionsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird hierbei die Probe oder die Lösung mit den nachzuweisenden Zielstrukturen 420, beispielsweise bestimmten DNA- Sequenzen, unter entsprechenden Reaktionsbedingungen
(Hybridisierungsbedingungen) mit dem beschichteten Filter 30 in Kontakt gebracht, sodass die Zielstrukturen 420 spezifisch an den Filter binden (Fig. 4B - links). Durch Zugabe der Nanopartikel 20, die ebenfalls an die bereits am Filter 30 angebundenen Zielstrukturen 420 binden, kommt es zur Clusterbildung 20 auf dem Filter 30 (Fig. 4B - rechts). Diese Ausgestaltung des Verfahrens kann mit besonderem Vorteil für eine Quantifizierung der Zielstrukturen genutzt werden. Diese Ausführungsform des Verfahrens kann dahingehend erweitert werden, dass verschiedene Fängermoleküle auf den Nanopartikeln 10 und auf
Teilbereichen des Filters 30 immobilisiert werden, sodass unterschiedliche bestimmte Zielstrukturen, beispielsweise verschiedene DNA-Zielsequenzen, parallel quantitativ analysiert werden können.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen (210; 220; 230; 420), insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen (220; 420) und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen (230) und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen (210), dadurch gekennzeichnet, dass
- Nanopartikel (10) mit wenigstens einem immobilisierten spezifischen
Fängermolekül (12), das mit der Zielstruktur (210; 220; 230; 420)
wechselwirken kann, bereitgestellt werden;
- die Nanopartikel (10) mit den Zielstrukturen (210; 220; 230;420) in einem Reaktionsansatz unter Bedingungen, die eine Bindung der Zielstrukturen an die Nanopartikel erlauben, in Kontakt gebracht werden;
- der Reaktionsansatz unter Bedingungen, die eine Clusterbildung der
Nanopartikel (10) mit daran gebundenen Zielstrukturen (210; 220; 230; 420) untereinander erlauben, inkubiert wird,
- die gebildeten Cluster (20) von den Nanopartikeln (10), die keine gebundenen Zielstrukturen aufweisen, abgetrennt werden, und
- die abgetrennten Cluster (20) ausgewertet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung optisch und/oder mikroskopisch und/oder fluoreszenzmikroskopisch und/oder spektrometrisch und/oder mit optischen Sensoren erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung durch Größenausschluss erfolgt, insbesondere durch
Größenausschlussfiltration mit einem Filter (30), der eine Porengröße im
Größenbereich der Nanopartikel (10) aufweist und die gebildeten Cluster (20) zurückhält.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fängermolekül (12) ein Nukleinsäure-Molekül, insbesondere ein DNA- Molekül oder ein PNA-Molekül, und/oder ein Aptamer und/oder ein Antikörper ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäure- Molekül oder das Aptamer 5 - 2000 Nukleotide, insbesondere 10 - 100
Nukleotide, umfasst.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein Anti-EpCAM-Antikörper oder ein mit FcMBL gekoppelter Antikörper ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an den Nanopartikeln (10) wenigstens zwei verschiedene Fängermoleküle (12) immobilisiert sind.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens zwei unterschiedliche Nanopartikel (10) mit jeweils
verschiedenen immobilisierten spezifischen Fängermolekülen (12) eingesetzt werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel (10) weiterhin mit reduzierenden Gruppen, insbesondere mit Aldehyd-Gruppen, funktionalisiert sind und wobei der Reaktionsansatz mit einem Reagenz zum Nachweis von reduzierenden Gruppen, vorzugsweise mit Tollens-Reagenz, versetzt wird, wobei vorzugsweise das Reagenz vor und/oder nach der Abtrennung der gebildeten Cluster (20) zugegeben wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Abtrennung ein Filter (30) eingesetzt wird, wobei der Filter mit wenigstens einem spezifischen Fängermolekül (402), das mit der Zielstruktur (420) wechselwirken kann, beschichtet ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, insbesondere für einen quantitativen Nachweis der Zielstrukturen (420), dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Inkontaktbringen der Zielstrukturen mit den Nanopartikeln (10) die Zielstrukturen (420) mit dem Filter (30) in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Teilbereiche des Filters (30) mit jeweils unterschiedlichen spezifischen
Fängermolekülen (402) beschichtet sind.
Nanopartikel (10) zum Nachweis von Zielstrukturen (210; 220; 230; 420), insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen (220; 420) und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen (230) und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen (210), dadurch gekennzeichnet, dass an den Nanopartikeln (10) wenigstens ein spezifisches Fängermolekül (12) immobilisiert ist, das mit der Zielstruktur wechselwirken kann, wobei vorzugsweise die Nanopartikel (10) wenigstens ein Merkmal gemäß einem der Ansprüche 4 bis 9 aufweisen.
Kit zum Nachweis von Zielstrukturen (210; 220; 230; 420), insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen (220; 420) und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen (230) und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen (210), umfassend Nanopartikel (10) gemäß Anspruch 13 und/oder einen Filter (30), der eine Porengröße im Größenbereich der Nanopartikel aufweist, wobei vorzugsweise der Filter (30) wenigstens eine Merkmal gemäß Anspruch 10 oder Anspruch 12 aufweist.
Verwendung eines Kits gemäß Anspruch 14 zum Nachweis von Zielstrukturen (210; 220; 230; 420), insbesondere von bestimmten Nukleinsäuresequenzen (220; 420) und/oder bestimmten Peptiden oder Proteinen (230) und/oder bestimmten Zellen oder Zelltypen (210).
PCT/EP2017/067845 2016-07-14 2017-07-14 Verfahren, nanopartikel und kit zum nachweis von zielstrukturen WO2018011397A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102016212834.5 2016-07-14
DE102016212834.5A DE102016212834A1 (de) 2016-07-14 2016-07-14 Verfahren, Nanopartikel und Kit zum Nachweis von Zielstrukturen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018011397A1 true WO2018011397A1 (de) 2018-01-18

Family

ID=59337688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2017/067845 WO2018011397A1 (de) 2016-07-14 2017-07-14 Verfahren, nanopartikel und kit zum nachweis von zielstrukturen

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102016212834A1 (de)
WO (1) WO2018011397A1 (de)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020172953A1 (en) * 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020172953A1 (en) * 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOPEZ ARIELLE ET AL: "SERS immunoassay based on the capture and concentration of antigen-assembled gold nanoparticles", TALANTA, vol. 146, 4 September 2015 (2015-09-04), pages 388 - 393, XP029349531, ISSN: 0039-9140, DOI: 10.1016/J.TALANTA.2015.08.065 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102016212834A1 (de) 2018-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1100873B1 (de) Krebszellen aus zellhaltigen körperflüssigkeiten, deren isolierung, verwendung sowie diese enthaltende mittel
DE102007021387A1 (de) Detektionsvorrichtung zur Detektion von biologischen Mikropartikeln wie Bakterien, Viren, Sporen, Pollen oder biologische Toxine, sowie Detektionsverfahren
EP1971863A1 (de) Verwendung von polymeren zur erhöhung der signalintensität bei der durchführung von nachweisreaktionen
WO2018011397A1 (de) Verfahren, nanopartikel und kit zum nachweis von zielstrukturen
EP3064944B1 (de) Überschichtung zur partikelabtrennung
DE102011109063B3 (de) Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen
EP1880017B1 (de) Verfahren zur herstellung von liganden, liganden und test-kit
DE102006014000B4 (de) Verfahren zur Charakterisierung einer Mischprobe
DE102004043870B4 (de) Verfahren zur Erweiterung des dynamischen Erfassungsbereich bei Mikroarrays
DE102012210598A1 (de) Verfahren und Anordnung zur Detektion von Zellen in einer Zellsuspension
DE60304262T2 (de) Verfahren zum Kalkulieren von Assoziations- und Dissoziationskonstanten mit einem Polymerchip zum Auffinden von ionischen Polymeren
EP1922545A1 (de) Funktioneller in vitro immunassay
DE102005029811A1 (de) Oligonukleotidanordnungen, Verfahren zu deren Einsatz und deren Verwendung
EP3931359A1 (de) Verfahren zum zählen von zelltypen oder zellmarkern in einer probe, insbesondere in einer blutprobe
EP3111220B1 (de) Verfahren für die molekulardiagnostik zum anreichern einer nukleinsäure aus einer biologischen probe
DE102004023439B4 (de) Nachweis von RNA über Micro-Arrays
DE10150959A1 (de) Verfahren zur quantitativen Bestimmung viraler Partikel mit cholesterinhaltiger Hülle
DE102020215567A1 (de) Rückhaltevorrichtung und Verfahren zur Separierung von Zellen
DE102014200446B3 (de) Verfahren zur Dekonvolution Nukleinsäure enthaltender Substanzgemische
DE10316689A1 (de) Dreidimensionaler Chip
DE102020209412A1 (de) Mittel und Verfahren zur An- oder Abreicherung und zum Nachweis von Coronaviren
DE102018132210A1 (de) Verfahren und Kit zur Detektion von T-Zellen
WO2007000399A1 (de) Trägermaterial, verfahren zu seiner herstellung und verwendung
WO2008080531A2 (de) Verfahren, vorrichtung und kit zur untersuchung einer flüssigkeitsprobe
DE102017128627A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Untersuchung einer Zellsuspension

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17739581

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17739581

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1