DE102020215567A1 - Rückhaltevorrichtung und Verfahren zur Separierung von Zellen - Google Patents

Rückhaltevorrichtung und Verfahren zur Separierung von Zellen Download PDF

Info

Publication number
DE102020215567A1
DE102020215567A1 DE102020215567.4A DE102020215567A DE102020215567A1 DE 102020215567 A1 DE102020215567 A1 DE 102020215567A1 DE 102020215567 A DE102020215567 A DE 102020215567A DE 102020215567 A1 DE102020215567 A1 DE 102020215567A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cells
retaining element
detected
cell suspension
retained
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE102020215567.4A
Other languages
English (en)
Inventor
Astrid Roth
Hannah Bott
Jochen Hoffmann
Tanja Maucher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Priority to DE102020215567.4A priority Critical patent/DE102020215567A1/de
Priority to PCT/EP2021/079852 priority patent/WO2022122246A1/de
Publication of DE102020215567A1 publication Critical patent/DE102020215567A1/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means, e.g. by light scattering, diffraction, holography or imaging
    • G01N15/0227—Investigating particle size or size distribution by optical means, e.g. by light scattering, diffraction, holography or imaging using imaging, e.g. a projected image of suspension; using holography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
    • G01N15/0606—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support
    • G01N15/0618—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support of the filter type
    • G01N15/0625—Optical scan of the deposits
    • G01N15/1433—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1484—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers microstructural devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0654—Lenses; Optical fibres
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N2015/0294—Particle shape
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1486—Counting the particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1493—Particle size
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1497—Particle shape

Abstract

Es wird eine Rückhaltevorrichtung (4) zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen Zellen beschrieben, umfassend zumindest eine Zuführeinheit (1) und ein Rückhalteelement (2), insbesondere einen Mikrofilter und/oder ein Mikrosieb mit Poren, wobei die Rückhaltevorrichtung (4) desweiteren eine optische Detektionseinheit (5) zur optischen Detektion in Echtzeit von durch das Rückhalteelement (2) rückgehaltenen Zellen und/oder von Zellen, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement (2) verzögert ist, umfasst.

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Rückhaltevorrichtung und ein Verfahren zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen Zellen sowie auf eine die Rückhaltevorrichtung umfassende Kartusche nach dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche.
  • Stand der Technik
  • Die WO 2012/159820 A1 beschreibt einen automatisierten Nachweis zirkulierender Tumorzellen aus Körperflüssigkeiten, welche mittels einer porösen Membran zurückzuhalten werden. Anschließend wird eine Prozessflüssigkeit auf die Membran aufgebracht, welche die nachzuweisenden Zellen markiert, sodass sie nach dem Filtrieren und Färben optisch untersucht werden können.
  • Die WO 00/06702 A1 beschreibt ein Verfahren und ein Set zur Isolierung von Krebszellen aus einer Körperflüssigkeit mittels eines Siebs oder Membranfilters. Die Flüssigkeit wird durch das Sieb geführt, das die Krebszellen aufgrund ihrer Größe zurückhält. Die isolierten Zellen können dann im Anschluss an die Filtrierung untersucht werden.
  • Die DD 222 827 A5 beschreibt die Selektierung spezifischer biologischer Zellen. Hierfür wird ein Filter mit einer Vielzahl an Aussparungen verwendet, wobei die Aussparungen den Filter von der Oberseite bis zur Bodenseite durchdringen und eine vorgegebene Form und Dimension aufweisen. Beispielsweise nimmt der Durchmesser von der Oberseite zur Unterseite stetig ab sodass die Aussparungen konisch verlaufen und die spezifischen Zellen in den Aussparungen gehalten werden und so zum einen nach ihrer Größe selektiert und zum anderen separiert sind. Anschließend können die in dem Filter zurückgebliebenen Zellen mittels eines optischen Systems analysiert werden.
  • In der DE 10 2011 076 238 A1 wird ein Stützkörper für eine poröse Filtermembran beschrieben. Mittels der Filtermembran wird eine flüssige Probe filtriert und dabei insbesondere zirkulierende Tumorzellen zurückgehalten. Der transparente Stützkörper ist in einem Träger ausgebildet, der im Wesentlichen einem Objektträger für ein Mikroskop entspricht. Die Filtermembran liegt auf dem transparenten Stützkörper auf und ist mit diesem verbunden. Dabei kann das Filtrat durch Löcher oder Poren im Stützkörper ablaufen. Anschließend werden die zirkulierenden Tumorzellen lichtmikroskopisch oder fluoreszenzmikroskopisch analysiert.
  • Die Separierung und Identifizierung verschiedener Zellen aus geeigneten Flüssigkeiten, ist ein wichtiger Schritt für die Erforschung, Diagnose und Behandlung von Krankheiten. Nach der Isolation der spezifischen Zellen, können klinisch relevante Merkmale und Informationen aus den Zellen gewonnen werden.
    Zirkulierende Tumorzellen (engl. Circulating Tumor Cells, CTCs) beispielsweise haben sich in den vergangenen Jahren als vielversprechende und klinisch relevante Biomarker zur Diagnose von bösartigen Tumoren etabliert. Deren möglichst frühzeitige Detektion in geeigneten Flüssigkeiten wie Blut oder Lymphflüssigkeit, auch Flüssigbiopsie (engl. Liquid Biopsy) genannt, ist einer der Forschungsschwerpunkte der modernen Onkologie. So erlaubt zum Beispiel eine zeitlich aufgelöste Quantifizierung von CTCs eines Krebspatienten, dessen Krankheitsverlauf präzise und in Echtzeit zu verfolgen und an die individuelle Krankheitssituation angepasste Therapieentscheidungen treffen zu können. Hierfür ist es von großer Wichtigkeit, möglichst viele der nachzuweisenden Zellen detektieren zu können.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß werden eine Rückhaltevorrichtung und ein Verfahren zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen Zellen, sowie eine die Rückhaltevorrichtung enthaltende Kartusche mit den kennzeichnenden Merkmalen der unabhängigen Ansprüche bereitgestellt.
  • Dies beruht insbesondere darauf, dass die Rückhaltevorrichtung zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen Zellen eine Zuführeinheit und ein Rückhalteelement umfasst, insbesondere einen Mikrofilter und/oder ein Mikrosieb mit Poren, sowie eine optische Detektionseinheit zur optischen Detektion in Echtzeit von durch das Rückhalteelement rückgehaltenen Zellen und/oder von Zellen, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement verzögert ist.
  • Die Rückhalterate von zu separierenden Zellen aus einer Zellsuspension wird von Parametern wie der Porengröße und Porenform des Rückhalteelements, der Porosität, Steifigkeit und Dicke des Rückhalteelements, sowie dem Volumenstrom und Filtrationsdruck, sowie etwaigen Druckdifferenzen dem das Rückhalteelement und die Zellsuspension ausgesetzt sind, dem Zelldurchmesser der zu separierenden Zellen, sowie Oberflächenwechselwirkungen zwischen den Zellen der Zellsuspension und dem Rückhalteelement beeinflusst.
  • Für Zellen in einem gewissen Größenbereich ist der Durchtritt durch ein Rückhalteelement ein zeitabhängiger Prozess, da neben den genannten Parametern, welche ebenfalls die Durchtrittsdauer beeinflussen, hinzukommt, dass kleinere und deformierbare Zellen die Poren des Rückhalteelements deutlich schneller passieren als größere und steifere Zellen. So können beispielsweise Zellen in einem gewissen Größenbereich, welche zunächst durch das Rückhalteelement zurückgehalten werden, dieses nach einer gewissen Zeit, beispielweise aufgrund ihrer Deformierbarkeit, passieren.
  • Mit dem Begriff deformierbar ist gemeint, dass die Zelle elastisch ist und sich zu einem gewissen Grad verformen kann. Für diese Eigenschaft wird in der vorliegenden Beschreibung der Erfindung auch der Begriff Deformation verwendet.
  • Bei konventionellen Filtrationsansätzen, wird die Anzahl der vom Rückhalteelement zurückgehaltenen Zellen erst im Anschluss an den Filtrationsvorgang bestimmt. Nicht erfasst werden hierbei Zellen, welche vom Rückhalteelement zunächst zurückgehalten werden, dieses aber nach kurzer Zeit, beispielsweise durch Zelldeformationen, doch passieren. Vorteilhaft bei der erfindungsgemäßen Rückhaltevorrichtung ist, dass die zu detektieren Zellen in Echtzeit während des Rückhaltevorgangs detektiert werden, und somit auch Zellen erfasst werden, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement verzögert ist. Auf diese Weise kann eine größere Anzahl an zu detektieren Zellen erfasst werden, was zu einem präziseren Ergebnis führt.
  • Um die Rückhalterate der zu detektierenden Zellen, also der Zielzellen, bestimmen zu können, ist es bei herkömmlichen Rückhalteverfahren notwendig, entweder eine Ermittlung der Ausgangskonzentration der zu detektierenden Zellen in der Zellsuspension oder eine Bestimmung der Anzahl der zu detektierenden Zellen, welche vom Rückhalteelement nicht zurückgehalten wurden aus dem Filtrat zu ermitteln. Hierzu sind weitere mikrofluidische und optische Vorrichtungen und Verfahrensschritte notwendig. Vorteilhaft bei der erfindungsgemäßen Rückhaltevorrichtung ist, dass beispielsweise die Anzahl der zu detektierenden Zellen in Echtzeit während des Rückhaltevorgangs quantitativ erfasst wird. Bei der Detektion in Echtzeit wird also direkt die Ausgangskonzentration der Zielzellen mit vernachlässigbar geringen Verlusten bestimmt. Es sind keine weiteren optischen Vorrichtungen oder Verfahrensschritte notwendig um die Rückhalterate bestimmen zu können, wodurch Zeit, Arbeitsgeräte und Arbeitsschritte eingespart werden.
  • Zudem ist es vorteilhaft, wenn die Rückhaltevorrichtung eine Zuführeinheit mit zwei oder mehreren Zuführkanälen aufweist. Beim Durchströmen des Rückhalteelements mit der Zellsuspension wird so eine homogene Verteilung der Zellsuspension auf dem Rückhalteelement erzielt, sodass sich die rückgehaltenen Zellen nicht auf einem Teil der Fläche des Rückhalteelement konzentrieren, sondern über die Fläche des Rückhalteelement verteilt sind. Dadurch wird die Druckdifferenz vor und nach dem Rückhalteelement möglichst klein gehalten, sodass viele zu detektierende Zellen möglichst lange auf dem Rückhalteelement zurückgehalten werden. Dies verbessert die optische Detektion der zu detektierenden Zellen in Echtzeit während das Rückhalteelement von der Zellsuspension durchströmt wird.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform verbinden sich die zwei oder mehrere Zuführkanäle der Zuführeinheit über dem Rückhalteelement zu einem großen Zuführkanal.
  • Weitere vorteilhafte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
  • So ist es von Vorteil, wenn das Rückhalteelement zumindest teilweise aus einem optisch transparenten Material gefertigt ist, insbesondere aus einem Polycarbonat und/oder einem Cycloolefin-Copolymer (COC) und/oder aus einem Glas.
    Vorteilhaft bei der Verwendung eines Polycarbonats ist, dass dieses eine hohe Schlagfestigkeit sowie ein geringes Gewicht aufweist.
    Vorteilhaft bei der Verwendung eines Glases ist, dass dieses weitgehend kratzfest und somit sehr langlebig ist.
    Vorteilhaft bei der Verwendung eines COCs ist, dass es kostengünstig produziert werden kann, bruchresistent ist und eine geringe Dichte sowie ein geringes Gewicht aufweist.
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weisen die Poren des Rückhalteelements einen Durchmesser von 3 µm - 20 µm, bevorzugt von 4 µm - 8 µm, auf.
    Derartige Porendurchmesser sind beispielsweise bei einer Separierung von CTCs aus einer Zellsuspension vorteilhaft. Die meisten CTCs weisen einen etwas größeren Durchmesser auf und sind weniger deformierbar als beispielsweise Leukozyten, sodass die CTCs selektiv am Durchtritt durch das Rückhalteelement gehindert werden.
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist das Rückhalteelement eine einer Zellsuspension aussetzbare Fläche von 1 mm2 - 500 mm2, bevorzugt von 3 mm2 - 100 mm2, auf. Vorteilhaft hierbei ist, dass sich die Zellen eines Probenvolumens einer Zellsuspension von beispielsweise 20 - 300 µl bei einer derartigen Fläche statistisch auf dem Rückhalteelement so verteilen, dass der Abstand der Zellen voneinander eine gute optische Detektion erlaubt.
  • Desweiteren ist es von Vorteil, wenn das Rückhalteelement eine Dicke von 0,9 µm - 20 µm, bevorzugt von 1 µm - 12 µm aufweist.
  • Der Vorteil einer derartigen Dicke ist, dass deformierbare Zellen lange genug brauchen, beispielsweise eine oder mehrere Minuten, um durch das Rückhalteelement hindurchtreten zu können. Durch den verzögerten Durchtritt der Zellen durch das Rückhaltelement wird sichergestellt, dass die Zellen optisch erfasst werden.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen, insbesondere lebenden, Zellen mittels einer erfindungsgemäßen Rückhaltevorrichtung mit nachfolgenden Schritten:
    1. b) Zuführen der Zellsuspension zu der Vorrichtung mit Rückhalteelement
    2. c) Optische Detektion der durch das Rückhalteelement rückgehaltenen Zellen und/oder der Zellen, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement verzögert ist, wobei die Detektion in Echtzeit während des Durchströmens der Zellsuspension durch das Rückhalteelement erfolgt.
  • Die sich daraus ergebenden Vorteile sind bereits vorstehend zu der erfindungsgemäßen Rückhaltevorrichtung beschrieben. Zudem ist es vorteilhaft, dass die Viabilität der zu detektierenden Zellen nicht beeinträchtigt wird, sodass die Zellen zum einen bei der Detektion ihre typischen Verhaltensweisen und phänotypischen Merkmale aufweisen und zum anderen im Anschluss an die Detektion weitere Analysen mit den Zellen durchgeführt werden können.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens geht Schritt b) ein zusätzlicher Schritt a) voran:
    • a) Markierung der zu detektierenden Zellen in der Zellsuspension, wobei insbesondere die Viabilität der zu detektierenden Zellen erhalten bleibt.
  • In Schritt c) erfolgt dann die optische Detektion der durch das Rückhalteelement rückgehaltenen, markierten Zellen und/oder der markierten Zellen, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement verzögert ist, wobei die Detektion in Echtzeit während des Durchströmens der Zellsuspension durch das Rückhalteelement erfolgt.
  • In herkömmlichen Verfahren findet oft zunächst eine Filtration statt, gefolgt von Färbeschritten, beispielsweise auf dem Rückhalteelement selbst, und einer anschließenden Detektion der zu detektierenden Zellen. Vor der Färbung beispielsweise auf dem Rückhalteelement werden die zu detektierenden Zellen hier oftmals mit einer Fixierlösung, wie zum Beispiel Formaldehyd, behandelt, die es ermöglicht, Strukturen im Inneren der Zellen anzufärben. Hierdurch werden die Zellen jedoch inaktiviert und konserviert.
  • Vorteilhaft bei der dieser Erfindung zugrundeliegenden Färbestrategie mit einer dem Separationsvorgang vorausgehenden Markierung ist, dass die zu detektierenden Zellen bereits detektiert werden können während sie das Rückhalteelement durchströmen.
    Zudem ist keine Fixierung der Zellen beispielsweise auf dem Rückhalteelement notwendig, sodass die Viabilität der markierten, zu detektierenden Zellen erhalten bleibt. Auf diese Weise können bei deren Detektion in Echtzeit typische Verhaltensweisen und phänotypischen Merkmale der markierten, zu detektierenden Zellen beobachtet und erfasst werden. Zudem können nach der Detektion weitere Analysen mit den lebenden Zellen durchgeführt werden oder sich beispielsweise molekulardiagnostische Analysen anschließen. Hierzu werden die rückgehaltenen Zellen beispielsweise mit einem Gesamtzell-Lysepuffer lysiert, beispielsweise in ein externes Probengefäß überführt und die Desoxyribonukleinsäuren (deoxyribonucleic acid, DNA) und Ribonukleinsäuren (ribonucleic acid, RNA) der Zellen extrahiert. Auch mit den Zellen, welche das Rückhalteelement passieren, die also im Filtrat vorhanden sind, können weiterführende Analysen durchgeführt werden.
  • Hierbei ist es von Vorteil, wenn die Markierung der zu detektierenden Zellen durch Anfärben mit Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) und/oder mit Propidiumiodid (PI) und/oder durch Markieren von Oberflächenantigenen, insbesondere durch fluoreszierende Antikörper und/oder mittels einer Desoxyribonukleinsäure-bindenden Markierung erfolgt.
  • CFSE ist ein fluoreszierender Farbstoff zu Zellfärbung, welcher zellpermeabel ist und über seine Succinimidylgruppe kovalent an bestimmte intrazelluläre Moleküle koppelt.
  • Vorteilhaft hierbei ist, dass CFSE nur in lebenden Zellen enzymatisch zum fluoreszierenden Farbstoff umgewandelt wird, sodass nur lebende zu detektierende Zellen ermittelt werden. Zudem vorteilhaft ist, dass die zu detektierenden Zellen für die Färbung nicht fixiert werden müssen.
    Desweiteren kann eine Markierung der Zellen mit PI erfolgen, welches ein Fluoreszenzfarbstoff ist, der spezifisch in Nukleinsäuren interkaliert. Da PI nur die perforierte Zellmembran von toten Zellen durchdringen kann, nicht jedoch die intakte Zellmembran von lebenden Zellen, können auf diese Weise tote zu detektierende Zellen detektiert werden. Eine kombinierte Färbung mit CFSE und PI erlaubt eine kombinierte optische Unterscheidung zwischen lebenden und toten zu detektierenden Zellen. Dies ist beispielsweise dann von großer Wichtigkeit, wenn es um die Erforschung, Diagnose oder Behandlung von Krankheiten geht. Bei Krebspatienten beispielsweise geht nur von lebenden Tumorzellen ein Metastasierungsrisiko aus. Somit ist hier die Lebendzellzahl entscheidend.
    Weiterhin vorteilhaft ist, dass auch für eine Markierung mit PI keine Fixierung der zu detektierenden Zellen notwendig ist.
  • Desweiteren können verschiedene Oberflächenantigene der zu detektierenden Zellen detektiert werden.
    Antigene sind meistens Proteine, können aber auch Kohlenhydrate, Lipide oder andere Stoffe sein, an die sich beispielsweise spezifische Antikörper binden können. Beispiele solcher Antigene sind das epitheliale Zelladhäsionsmolekül (engl. epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) und Cytokeratine. EpCAM ist ein auf verschiedenen Epithelzellen vorkommendes Oberflächenprotein und Zelladhäsionsmolekül, welches beispielsweise für Zell-Zell-Kontakte zuständig ist. EpCAM gilt beispielsweise als einer der typischen Marker für CTCs.
    Cytokeratine sind Proteine, die im Zellinneren von Zellen epithelialen Ursprungs vorkommen. Verschiedene Epithelzellen exprimieren unterschiedliche Cytokeratine auf ihrer Zelloberfläche. Cytokeratine sind typische Marker in der diagnostischen Pathologie,
    insbesondere für die Erkennung von Tumoren. Verschiedene Tumore können beispielsweise anhand des gleichen Musters an Cytokeratinen von anderen Tumoren unterschieden werden. Bestimmte Cytokeratine sind somit beispielsweise Marker für CTCs.
  • Allophycocyanin (APC) ist ein bei der Fotosynthese von Cyanobakterien und Rotalgen beteiligtes Pigment sowie ein heller Fluoreszenzfarbstoff.
  • Allophycocyanin kann an einen Antikörper gekoppelt werden, sodass nach dessen Bindung spezifische Antigene von Zielzellen fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden können.
  • Ein EpCAM bindender fluoreszenzmarkierter Antikörper ist beispielsweise Anti-EpCAM-Allophycocyanin. Ein Cytokeratin bindender fluoreszenzmarkierter Antikörper ist beispielsweise Anti-Cytokeratin-Allophycocyanin. Vorteilhaft bei der Verwendung der beiden genannten Antikörper ist, dass mit deren Hilfe gezielt zu detektierende Zellen detektiert werden können. Zudem sind diese für die zu detektierenden Zellen ungiftig und erhalten deren Viabilität. Außerdem müssen die zu detektierenden Zellen für die Markierung nicht fixiert werden.
  • Desweiteren können zellkernhaltige von zellkernlosen Zellen mittels bestimmter Markierungen bzw. Färbungen der DNA innerhalb der Zellkerne, unterschieden werden. Kernhaltige Zellen können beispielsweise mittels des Fluoreszenzfarbstoffs 4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI), detektiert werden, welcher die DNA markiert. DAPI durchdringt intakte Zellmembranen, allerdings nur langsam. Vorteilhaft hierbei ist, dass die Viabilität der zu detektierenden Zellen erhalten bleibt und eine Fixierung der zu detektierenden Zellen für die Markierung nicht notwendig ist.
  • Desweiteren kann der Fluoreszenzfarbstoff 2'-(4-Ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-bi-1H-benzimidazol trihydrochlorid (Hoechst 33342) zur Anfärbung von DNA verwendet werden. Hoechst 33342 hat sich in Experimenten mit lebenden Zellen bewährt und bietet die Vorteile, dass die Viabilität der zu detektierenden Zellen erhalten bleibt und diese zudem sehr schnell angefärbt werden. Zudem vorteilhaft ist, dass die zu detektierenden Zellen für die Markierung nicht fixiert werden müssen.
  • Ferner ist es von Vorteil, wenn in Schritt c) zumindest einer der nachfolgenden Parameter detektiert wird: Anzahl der zu detektierenden Zellen und/oder Durchmesser der zu detektierenden Zellen und/oder Zellkontur der zu detektierenden Zellen und/oder Durchtrittszeit der zu detektierenden Zellen durch das Rückhalteelement und/oder Bestimmung der Deformation der zu detektierenden Zellen beim Durchtritt durch das Rückhalteelement und/oder Homogenität des in die zu detektierenden Zellen eingelagerten oder gebundenen Mittels zur Markierung. Vorteilhaft hierbei ist, dass im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen zur Separierung von Zellen, in welchen die zu detektierenden Zellen erst nach dem Rückhaltevorgang detektiert werden, viele zusätzliche Informationen über die Zellen, die nur während des Durchtrittsvorgangs in Echtzeit in dieser Form ermittelt werden können, gesammelt werden. Solche Informationen sind beispielsweise die Durchtrittszeit und das Deformationsvermögen einer Zelle, welche zunächst durch das Rückhalteelement zurückgehalten wird und nach einer gewissen Zeit doch durch dieses hindurchtritt.
  • Desweiteren ist es von Vorteil, dass auf diese Weise umfangreiche Informationen zu den zu detektieren Zellen gesammelt werden können, aufgrund welcher präzisere Aussagen beispielsweise über ein Krankheitsbild, einen Krankheitsverlauf oder weitere Therapiemöglichkeiten getroffen werden können. Zudem lassen sich auf diese Weise Zusammenhänge zwischen den zu detektierenden Zellen, deren Merkmalen und einem typischen Krankheitsbild ermitteln, wie beispielsweise Aussagen über die Heterogenität eines Tumors bei Krebspatienten.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform erfolgt die Detektion der zu detektierenden Zellen durch Aufnahme von Einzelbildern in definierten Zeitabständen, insbesondere nach 0,1 - 60 Sekunden, bevorzugt nach 1 - 10 Sekunden. Die Bildrate ist hierbei ein individuell einstellbarer Parameter.
  • Vorteilhaft bei der Aufnahme von Einzelbildern ist, dass insbesondere die gesamte Fläche des Rückhalteelements optisch erfasst wird und auf diese Weise viel mehr zu detektierende Zellen identifiziert werden können im Vergleich zu herkömmlichen Methoden. Solche herkömmliche Methode sind beispielsweise die Messung mittels eines Durchflusszytometers, wo Zellen beim Vorbeiströmen an einem Messpunkt optisch erfasst werden oder Filtrationsansätze, in welchen oft diejenigen zu detektierenden Zellen verloren gehen, die die Poren des Rückhalteelement sofort, oder nach einer kurzen Rückhaltezeit aufgrund von Zelldeformation passieren.
  • Desweiteren vorteilhaft bei einer Detektion durch Aufnahme von Einzelbildern ist, dass sehr präzise Ergebnisse ermittelt werden. Zudem ist eine Einzelzellcharakterisierung möglich, wobei einzelnen Zellen beobachtet werden, sodass Rückschlüsse über die Durchtrittsdauer durch das Rückhalteelement und die Deformierbarkeit der zu detektierenden Zellen gezogen werden können.
  • Desweiteren ist die Zellsuspension beispielsweise eine Blutprobe. Aus den Zellen, welche sich im Blut befinden können beispielsweise klinisch relevante Informationen gewonnen werden, die ein aktuelles Bild der Gesundheit oder Krankheit des Blutspenders erlauben.
  • Die Blutprobe ist beispielsweise vorbehandelt, zum Beispiel durch selektive Lyse der Erythrozyten.
  • Die zu detektierenden Zellen sind beispielsweise zirkulierende Tumorzellen. CTCs sind Zellen epithelialen Ursprungs, welche sich von einem Primärtumorzellverband abgelöst haben und in die Lymphgefäße oder den Blutkreislauf gelangt sind und dort zirkulieren. Einige CTCs sind in der Lage, in entfernte Organe einzuwandern und dort Metastasen zu bilden. CTCs haben einen Zellkern und tragen auf ihrer Zelloberfläche oftmals die Proteine EpCAM und Cytokeratine. CTCs sind gegenüber anderen Blutzellen oftmals größer und weniger deformierbar. So können CTCs mittels eines Rückhalteelements mit geeignetem Porendurchmesser von anderen, kleineren Blutzellen abgetrennt werden. Die Größe der CTCs hängt jedoch stark von ihrem Ursprungsort und der Tumorart ab. Selten gibt es auch CTCs, die kleiner sind als Blutzellen. Bei konventionellen Filtrationsansätzen, wird die Anzahl der vom Rückhalteelement zurückgehaltenen Zellen nach dem Filtrationsvorgang bestimmt. Nicht erfasst werden hierbei CTCs, welche vom Rückhalteelement zunächst zurückgehalten werden, dieses aber nach kurzer Zeit doch passieren. Vorteilhaft bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass die CTCs in Echtzeit während des Rückhaltevorgangs detektiert werden, und somit auch solche CTCs erfasst werden, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement verzögert ist. Auf diese Weise kann eine größere Anzahl an CTCs erfasst werden. Dies führt zu einem präziseren Ergebnis, welches wiederum wertvolle Informationen für die Einstufung und Behandlung eines Tumors liefert.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform pumpt eine Pumpe die Zellsuspension mit einer konstanten Flussrate durch die Rückhaltevorrichtung, wobei die Flussrate insbesondere zwischen 0,01 µl/s und 100 µl/s, bevorzugt zwischen 0,2 µl/s und 5 µl/s liegt.
  • Vorteilhaft hierbei ist, dass die wirkenden Scherkräfte die Zellen der Zellsuspension, beispielsweise im mikrofluidischen Umfeld, in diesem Flussratenbereich nicht dahingehend verändern, dass sie nicht mehr vom Rückhalteelement zurückgehalten oder optisch detektiert werden können.
  • Vorteilhaft hierbei ist, dass unter Berücksichtigung der wirkenden Scherkräfte bei derartigen Flussraten sicher gestellt ist, dass die zu detektierenden Zellen der Zellsuspension, beispielsweise in einem mikrofluidischen Umfeld, durch das Rückhalteelement zurückgehalten werden und optisch detektiert werden können und nicht so verändert werden, dass sie nicht mehr vom Rückhalteelement zurückgehalten oder optisch detektiert werden können. Weiterhin ist die Gesamtzeit, in der die Zellsuspension durch die Rückhaltevorrichtung gepumpt wird möglichst reduziert, wobei die zu detektierenden Zellen jedoch weiterhin durch das optische System erfasst werden.
  • Auch können bei mehreren Durchläufen zur Separierung von Zellen mittels der erfindungsgemäßen Rückhaltevorrichtung unterschiedliche konstante Flussraten eingestellt werden, sodass verschiedene Dynamiken und Verhaltensweisen der zu detektierenden Zellen beim Durchtritts durch das Rückhalteelement beobachtet werden können, wie beispielsweise Unterschiede in der Verweildauer auf dem Rückhalteelement vor dem Durchtritt oder Unterschiede in der Deformierbarkeit der zu detektierenden Zellen.
  • In einer alternativen vorteilhaften Ausführungsform pumpt eine Pumpe die Zellsuspension mit einer variierenden Flussrate durch die Rückhaltevorrichtung, wobei die Flussrate insbesondere zwischen 0,01 µl/s und 100 µl/s, bevorzugt zwischen 0,2 µl/s und 5 µl/s liegt.
  • Eine variierende Flussrate bedingt, dass auch die Druckdifferenz vor und nach dem Rückhalteelement variiert.
  • Vorteilhaft hierbei ist, dass die Zellen, die bereits von dem Rückhalteelement zurückgehalten werden nicht kontinuierlich mit Druck beaufschlagt sind und dadurch länger auf dem Rückhalteelement verweilen können, sodass sie länger detektierbar sind und bei Bedarf auch wieder von dem Rückhalteelement abgelöst werden können indem die Flussrate erhöht wird.
  • In vielen gängigen Chiplabor-Systemen (engl. Lab on a chip, LoC), welche mikrofluidische Systeme zur automatisierten Analyse von Proben auf einem Chip darstellen, sind oftmals nur pulsatile Flussratenverläufe möglich. Vorteilhaft bei der beschriebenen Ausführungsform der Erfindung mit pulsatilem Flussprofil ist, dass dieses Verfahren in ein solches LoC-System integrierbar ist.
  • Die Pumpe ist bei der beschriebenen Ausführungsform mit pusatilem Flussprofil beispielsweise eine peristaltische Pumpe.
  • Im Generellen kann zur Ausführung der vorliegenden Erfindung an Stelle einer Pumpe auch ein anderes Beförderungselement verwendet werden.
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird die Zellsuspension dem Rückhalteelement portionsweise als Aliquots zugeführt und die vom Rückhalteelement rückgehaltenen Zellen werden nach jedem Aliquot oder nach einer vorbestimmten Anzahl an Aliquots, vom Rückhalteelement entfernt. Vorteilhaft bei der portionsweisen Zuführung als Aliquots ist, dass die Druckdifferenz, die entsteht, sobald ein Großteil der Fläche des Rückhalteelement mit Zellen bedeckt ist, möglichst klein gehalten wird. Auf diese Weise werden möglichst viele zu detektierenden Zellen möglichst lange auf dem Rückhalteelement zurückgehalten, wodurch mehr zu detektierende Zellen detektiert werden können. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Separation und Erfassung von zu detektierenden Zellen aus einem wesentlich größeren Volumen an Zellsuspension möglich ist. Zudem können die zu detektierenden Zellen vor einem höheren Hintergrund an nicht zu detektierenden Zellen identifiziert und erfasst werden.
  • Desweiteren ist es vorteilhaft, wenn die vom Rückhalteelement zurückgehaltenen Zellen nach jedem Aliquot oder nach einer vorbestimmten Anzahl an Aliquots vom Rückhalteelement entfernt werden, da auf diese Weise genauere Ergebnisse für Analysen des nächsten Aliquot oder der nächsten Aliquots erhalten werden. Die Entfernung der vom Rückhalteelement rückgehaltenen Zellen kann beispielsweise durch Erhöhung der Druckdifferenz über dem Rückhalteelement oder durch Lyse der vom Rückhalteelement zurückgehaltenen Zellen erfolgen.
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, wie beispielsweise in DE102016222072A1 oder DE102016222075A1 beschrieben, umfassend die vorstehend beschriebene Rückhaltevorrichtung. Die beschriebenen Verfahrensschritte zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen Zellen erfolgen dann beispielsweise alle innerhalb der Kartusche. Ebenfalls innerhalb der Kartusche kann eine Vorbehandlung der Zellsuspension erfolgen, sowie Verfahrensschritte zur Markierung der zu detektierenden Zellen. Zudem können die durch das Rückhalteelement zurückgehaltenen Zellen nach der Detektion innerhalb der Kartusche lysiert werden und das Zelllysat dann beispielsweise in eine zusätzliche Probenkammer auf der Kartusche transportiert werden. In dieser können beispielsweise die DNA und/oder RNA der lysierten Zellen für weitere Analysen extrahiert werden ohne, dass ein zusätzliches externes System hierfür notwendig ist.
  • Figurenliste
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:
    • 1a: die schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine erfindungsgemäße Rückhaltevorrichtung in einer ersten Ausführungsform mit Rückhalteelement und einer Zuführeinheit mit einem Zuführkanal,
    • 1b: die schematische Darstellung einer Aufsicht auf die erfindungsgemäße Rückhaltevorrichtung gemäß 1,
    • 2: die schematische Darstellung einer Aufsicht auf eine erfindungsgemäße Rückhaltevorrichtung in einer zweiten Ausführungsform mit Rückhalteelement und einer Zuführeinheit mit zwei Zuführkanälen,
    • 3a: die schematische Darstellung einer Aufsicht auf ein Rückhalteelement gemäß 1 oder 2 nach einem ersten Zeitabschnitt,
    • 3a: die schematische Darstellung einer Aufsicht auf ein Rückhalteelement gemäß 1 oder 2 nach einem zweiten Zeitabschnitt,
    • 3a: die schematische Darstellung einer Aufsicht auf ein Rückhalteelement gemäß 1 oder 2 nach einem dritten Zeitabschnitt, und
    • 4: die schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine erfindungsgemäße Kartusche umfassend eine Rückhaltevorrichtung gemäß 1a.
  • Ausführungsformen der Erfindung
  • In 1a ist eine erfindungsgemäße Rückhaltevorrichtung 4 zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen Zellen in einer ersten Ausführungsform in einem Querschnitt gezeigt. Die Rückhaltevorrichtung 4 umfasst eine Zuführeinheit 1, beispielsweise einen Zulaufkanal, und ein Rückhalteelement 2 mit Poren, beispielsweise einen Mikrofilter und/oder ein Mikrosieb, sowie eine Ablaufeinheit 3, beispielsweise einen Ablaufkanal. Das Rückhalteelement 2 ist zumindest teilweise aus einem optisch transparenten Material gefertigt, wie beispielsweise einem Polycarbonat und/oder einem Cycloolefin-Copolymer und/oder einem Glas. Die Poren des Rückhalteelements 2 weisen beispielsweise einen Durchmesser von 3 µm bis 20 µm und bevorzugt von 4 µm bis 8 µm auf. Das Rückhalteelement 2 weist beispielsweise eine einer Zellsuspension aussetzbare Fläche von 1 mm2 - 500 mm2, und bevorzugt von 3 mm2 - 100 mm2 auf. Das Rückhalteelement 2 weist beispielsweise eine Dicke von 0,9 µm - 20 µm, und bevorzugt von 1 µm - 12 µm auf. Desweiteren umfasst die Rückhaltevorrichtung 4 eine optische Detektionseinheit 5, welche so angeordnet ist, dass sie die Fläche des Rückhalteelements 2 optisch erfasst. Die optische Detektionseinheit 5 ist beispielsweise eine CMOS (engl. Complementary Metal Oxide Semiconductor, dt. komplementärer Metall-Oxid-Halbleiter) oder CCD (engl. Charge-Coupled Device, dt. ladungsgekoppeltes Gerät) basierte Kamera mit einer Auflösung von beispielsweise 1-4 MP je nach Fläche des Rückhalteelements sowie mit 1-10 fps je nach Flussrate. Die in der Zellsuspension vorliegenden Zellen werden beispielsweise markiert, insbesondere mittels Fluoreszenzfarbstoffen, bevor sie der Rückhaltevorrichtung 4 zugeführt werden. Die Zellsuspension, in welcher die, beispielsweise markierten, zu detektierenden Zellen vorliegen, wird der Rückhaltevorrichtung 4 über die Zuführeinheit 1 zugeführt. Mittels einer nicht in den Figuren dargestellten Pumpe wird die Zellsuspension mit einer konstanten Flussrate oder mit einer variierenden Flussrate durch das Rückhaltevorrichtung 4 gepumpt. Hierbei liegt die Flussrate jeweils beispielsweise zwischen 0,01 µl/s und 100 µl/s, und bevorzugt zwischen 0,2 µl/s und 5 µl/s. Die Zellsuspension wird dem Rückhalteelement 2 beispielsweise auf einmal zugeführt. Alternativ wird die Zellsuspension dem Rückhalteelement 2 portionsweise als Aliquots zugeführt und die vom Rückhalteelement 2 rückgehaltenen Zellen werden nach jedem Aliquot oder nach einer vorbestimmten Anzahl an Aliquots vom Rückhalteelement 2, beispielsweise durch Erhöhung der Druckdifferenz über dem Rückhalteelement oder durch Lyse der zurückgehaltenen Zellen, entfernt. Die Zellsuspension durchströmt das Rückhalteelement 2, welches Zellen, die beispielsweise zu groß und zu steif sind, um die Poren des Rückhalteelements 2 zu passieren zurückhält und welches Zellen, die beispielsweise klein genug oder deformierbar genug sind, um die Poren des Rückhalteelements 2 zu passieren, hindurchtreten lässt. Während des Durchströmens der Zellsuspension durch das Rückhalteelement 2 werden die durch das Rückhalteelement 2 rückgehaltenen, beispielsweise markierten, Zellen und/oder Zellen, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement 2 verzögert ist, in Echtzeit von der optischen Detektionseinheit 5 optisch erfasst. Die in Echtzeit Detektion der zu detektierenden Zellen erfolgt beispielsweise durch Aufnahme von Einzelbildern in definierten Zeitabständen, insbesondere nach 0,1 - 60 Sekunden, und bevorzugt nach 1 - 10 Sekunden während das Rückhalteelement 2 von der Zellsuspension durchströmt wird. Bei fluoreszenzmarkierten zu detektierenden Zellen erfolgt die in Echtzeit Detektion beispielsweise durch Aufnahme von Einzelbildern in definierten Zeitabständen in jedem zur Detektion der jeweiligen Fluoreszenzmarkierung benötigten Farbkanal. Je nach Markierung erfolgt die Detektion also gleichzeitig in unterschiedlichen Farbkanälen.
  • Die aufgenommenen Einzelbilder werden beispielsweise von einer Auswertesoftware mit einem algorithmischen Verfahren ausgewertet. Die Ergebnisse dieser Analyse können in Echtzeit oder alternativ nach einem Durchlauf der Zellsuspension durch die Rückhaltevorrichtung 4 ausgegeben werden. Die Anzahl der Zielzellen kann zu jedem aufgenommenen Zeitpunkt bestimmt werden.
  • Bei markierten Zellen kann anhand der spezifischen Markierung rückgeschlossen werden, um was für eine Zelle es sich handelt. Auf diese Weise erhält man je nach Markierung beispielsweise Aufschluss über die Anzahl an lebenden und toten Zellen, zellkernhaltigen und zellkernlosen Zellen und Zellen, deren spezifischen Oberflächenantigene markiert sind, sodass eine Unterscheidung zwischen Zielzelle und nicht-Zielzelle möglich ist. Zudem erhält man beispielsweise Aufschluss darüber, wie viele detektierte Zielzellen in der gesamten Zellsuspension vorhanden sind und vom Rückhalteelement 2 zurückgehalten oder vorübergehend zurückgehalten wurden.
  • Es können bei der in Echtzeit Detektion durch die optische Detektionseinheit 5 auch weitere Parameter ermittelt werden wie beispielsweise der Durchmesser der detektierten Zellen und/oder Zellkontur der detektierten Zellen und/oder Durchtrittszeit der detektierten Zellen durch das Rückhalteelement 2 und/oder Bestimmung der Deformation der detektierten Zellen beim Durchtritt durch das Rückhalteelement 2 und/oder Homogenität des in die detektierten Zellen eingelagerten oder gebundenen Mittels zur Markierung.
  • Im Folgenden wird ein Beispiel zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, wobei CTCs aus einer Blutprobe mittels der erfindungsgemäßen Rückhaltevorrichtung 4 separiert werden. Zunächst wird die Blutprobe mit der 4 - 8fachen Menge, bevorzugt mit der 5fachen Menge, eines selektiven Erythrozyten-Lysepuffers vermischt und inkubiert. Dadurch werden die im Blut enthaltenen Erythrozyten lysiert, und der Blutfarbstoff Hämoglobin in die Lösung abgegeben. Die erhaltene Suspension enthält die intakten Zellen, also unter anderem die Leukozyten und CTCs und die lysierten Erythrozyten sowie freies Hämeglobin. Die lysierten Erythrozyten und das freie Hämoglobin werden später durch das Rückhalteelement 2 von den zurückgehaltenen Leukozyten und CTCs getrennt. Nach der Erythrozytenlyse oder aber gleichzeitig mit Zugabe des Erythrozyten-Lysepuffers erfolgt beispielsweise eine Markierung der in der Zellsuspension enthaltenen Zellen, ohne dass deren Lebensfähigkeit beeinträchtigt wird und ohne, dass diese fixiert werden müssen. Hierzu wird beispielswiese der Fluoreszenzfarbstoff CFSE, welche nur in lebenden Zellen nachgewiesen werden kann und/oder der Fluoreszenzfarbstoff PI zu der Zellsuspension gegeben. Desweiteren werden beispielsweise Desoxyribonukleinsäure-bindende Marker, wie die Fluoreszenzfarbstoffe DAPI und/oder Hoechst3342, welche zellkernhaltige Zellen markieren, zu der Suspension gegeben. Zudem werden beispielsweise Oberflächenantigene wie beispielsweise EpCAM und/oder Cytokeratine, wie sie auf CTCs vorkommen, markiert, beispielsweise durch Zugabe der fluoreszenzmarkierten Antikörper Anti-EpCAM-Allophycocyanin und/oder der fluoreszenzmarkierten Antikörper Anti-Cytokeratin-Allophycocyanin. Die die beispielsweise fluoreszenzmarkierten Zellen enthaltende Suspension wird dann der Rückhaltevorrichtung 4 über die Zuführeinheit 1 zugeführt. Die Zellsuspension durchströmt das Rückhalteelement 2, welches Zellen, die zu groß und zu steif sind, um die Poren des Rückhalteelements 2 zu passieren zurückhält und welches Zellen, die klein genug oder deformierbar genug sind, um die Poren des Rückhalteelements 2 zu passieren, hindurchtreten lässt. Während des Durchströmens der Zellsuspension durch das Rückhalteelement 2 werden die durch das Rückhalteelement 2 rückgehaltenen, markierten Zellen und/oder markierte Zellen, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement 2 verzögert ist, in Echtzeit von der optischen Detektionseinheit 5 optisch erfasst. Die in Echtzeit Detektion erfolgt beispielsweise durch Aufnahme von Einzelbildern in definierten Zeitabständen in jedem zur Detektion der jeweiligen Fluoreszenzmarkierung benötigten Farbkanal.
  • Anhand der spezifischen Markierung der detektierten Zellen der Zellsuspension erhält man Aufschluss über die Anzahl an lebenden und toten Zellen, zellkernhaltigen und zellkernlosen Zellen und Zellen, deren spezifischen Oberflächenantigene markiert sind. Anhand dieser Informationen ist eine Unterscheidung zwischen einer CTC und einem Leukozyten möglich. Zudem erhält man beispielsweise Aufschluss darüber, wie viele detektierte CTCs, in der gesamten Zellsuspension vorhanden waren und vom Rückhalteelement 2 zurückgehalten oder vorübergehend zurückgehalten wurden. Die Anzahl der CTCs, kann zu jedem aufgenommenen Zeitpunkt bestimmt werden. Es können zudem weitere Parameter der CTCs ermittelt werden, wie beispielsweise die Lokalisierung der detektierten CTCs auf dem Rückhalteelement 2 und/oder der Durchmesser der detektierten CTCs und/oder die Zellkontur der detektierten CTCs und/oder die Durchtrittszeit der detektierten CTCs durch das Rückhalteelement 2 und/oder Bestimmung der Deformation der detektierten CTCs beim Durchtritt durch das Rückhalteelement 2 und/oder Homogenität des in die detektierte CTCs eingelagerten oder gebundenen Mittels zur Markierung. Alle vorstehend zu 1 beschriebenen Varianten sind mit dem beschriebenen Ausführungsbeispiel zur Separierung von CTCs aus einer Blutprobe vereinbar.
  • In 1b ist die Rückhaltevorrichtung 4 gemäß 1a in einer Aufsicht gezeigt. Es sind die Zuführeinheit 1, das Rückhalteelement 2 mit Poren, sowie die Ablaufeinheit 3 zu sehen. Nicht dargestellt ist die optische Detektionseinheit 5.
  • 2 zeigt eine Aufsicht auf eine erfindungsgemäße Rückhaltevorrichtung 4 in einer zweiten Ausführungsform. Die Rückhaltevorrichtung 4 weist eine Zuführeinheit 1 mit einem ersten Zuführkanal 1a und mit einem zweiten Zuführkanal 1b auf. Beim Durchströmen des Rückhalteelements 2 mit der Zellsuspension wird so eine homogenere Verteilung der Zellsuspension auf dem Rückhalteelement 2 erzielt im Vergleich zu einer Rückhaltevorrichtung 4 mit nur einem Zuführkanal. Die Zuführkanäle 1a, 1b verbinden sich über dem Rückhalteelement zu einem großen Zuführkanal. Alternativ und nicht in der Figur dargestellt verbinden sich die Zuführkanäle 1a, 1b nicht über dem Rückhalteelement.
  • Desweiteren weist die Rückhaltevorrichtung 4 eine Ablaufeinheit 3 mit einem ersten Ablaufkanal 3a und einem zweiten Ablaufkanal 3b auf, über welche die Zellsuspension abläuft, nachdem sie das Rückhalteelement 2 passiert hat. Alternativ und nicht dargestellt umfasst die Ablaufeinheit 3 nur einen Ablaufkanal. Dieser weist beispielsweise einen größeren Durchmesser auf als die Zuführkanäle 1a und 1b der Zuführeinheit 1.
  • in einer weiteren, nicht dargestellten Ausführungsform umfasst die Rückhaltevorrichtung 4 mehrere Zuführkanäle sowie einen oder mehrere Ablaufkanäle.
  • Alle vorstehend zu den 1a und 1b beschriebenen Varianten sind mit der beschriebenen zweiten Ausführungsform der Rückhaltevorrichtung 4 vereinbar.
  • In den 3a - 3c ist jeweils ein Rückhalteelement 2 gemäß einer der 1 oder 2 in einer Aufsicht dargestellt. Das Rückhalteelement 2 wird von einer Zellsuspension durchströmt. In 3a ist das Rückhalteelement 2 nach einem ersten Zeitabschnitt dargestellt, in 3b ist das Rückhalteelement 2 nach einem zweiten Zeitabschnitt dargestellt und in 3c ist das Rückhalteelement 2 nach einem dritten Zeitabschnitt dargestellt.
  • In 3a werden nach einem ersten Zeitabschnitt eine erste Zelle 6a und eine zweite Zelle 6b von dem Rückhalteelement 2 zurückgehalten, da die Zellen beispielsweise einen größeren Durchmesser aufweisen als die Poren des Rückhalteelements 2. In 3b werden nach einem zweiten Zeitabschnitt noch immer die erste Zelle 6a und die zweite Zelle 6b sowie eine dritte Zelle 6c von dem Rückhalteelement 2 zurückgehalten. Auch die dritte Zelle 6c weist beispielsweise einen größeren Durchmesser auf, als die Poren des Rückhalteelement 2. In 3c werden nach einem dritten Zeitabschnitt noch immer die erste Zelle 6a sowie die dritte Zelle 6c von dem Rückhalteelement 2 zurückgehalten. Die zweite Zelle 6b befindet sich nicht mehr auf dem Rückhalteelement 2. Sie hat das Rückhalteelement 2 verzögert passiert, beispielsweise durch eine Zelldeformation.
  • Die dargestellten Zeitabschnitte entsprechen beispielsweise den Zeitpunkten, zu welchen bei der in Echtzeit Detektion Einzelbilder aufgenommen werden während das Rückhalteelement 2 mit der Zellsuspension durchströmt wird. Hierbei werden sowohl von dem Rückhalteelement 2 dauerhaft zurückgehaltenen Zellen, hier die Zellen 6a und 6c detektiert, als auch Zellen, welche das Rückhalteelement 2 zeitverzögert passieren, hier die Zelle 6b.
  • Die Zellen 6a, 6b und 6c weisen unterschiedliche Durchmesser und Zellkonturen auf. Diese Parameter können untere anderen beispielsweise ebenfalls bei der in Echtzeit Detektion durch die optische Detektionseinheit 5 erfasst werden.
  • 4 zeigt einen Querschnitt durch eine erfindungsgemäße, insbesondere mikrofluidische, Kartusche 10, welche eine Rückhaltevorrichtung 4 gemäß 1a aufweist. Die Rückhaltevorrichtung 4 ist als mikrofluidisches System ausgebildet und umfasst eine Zuführeinheit 1, beispielsweise einen Zulaufkanal, ein Rückhalteelement 2 mit Poren, beispielsweise einen Mikrofilter und/oder ein Mikrosieb, sowie eine Ablaufeinheit 3, beispielsweise einen Ablaufkanal. Alternativ und nicht in 4 dargestellt, umfasst die Kartusche 10 eine Rückhaltevorrichtung 4 in der zweiten Ausführungsform wie in 2 dargestellt. Die zu den 1a-3c beschriebenen Schritte zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen Zellen erfolgen dann beispielsweise alle innerhalb der Kartusche 10. So kann beispielsweise eine Vorbehandlung der Zellsuspension innerhalb der Kartusche 10 erfolgen, wie beispielsweise eine Lyse der Erythrozyten im Falle einer Blutprobe, sowie Verfahrensschritte zur Markierung der zu detektierenden Zellen in der Zellsuspension. Zudem können die durch das Rückhalteelement 2 zurückgehaltenen Zellen nach der Detektion in Echtzeit innerhalb der Kartusche 10 lysiert werden und das Zelllysat dann beispielsweise in eine zusätzliche Probenkammer auf der Kartusche 10 transportiert werden. In dieser werden die DNA und/oder RNA der lysierten Zellen beispielsweise für weitere Analysen extrahiert ohne, dass ein zusätzliches externes System hierfür notwendig ist.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2012/159820 A1 [0002]
    • WO 0006702 A1 [0003]
    • DD 222827 A5 [0004]
    • DE 102011076238 A1 [0005]
    • DE 102016222072 A1 [0057]
    • DE 102016222075 A1 [0057]

Claims (15)

  1. Rückhaltevorrichtung (4) zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen Zellen, umfassend zumindest eine Zuführeinheit (1) und ein Rückhalteelement (2), insbesondere einen Mikrofilter und/oder ein Mikrosieb, mit Poren, dadurch gekennzeichnet, dass die Rückhaltevorrichtung (4) desweiteren eine optische Detektionseinheit (5) zur optischen Detektion in Echtzeit von durch das Rückhalteelement (2) rückgehaltenen Zellen und/oder von Zellen, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement (2) verzögert ist, umfasst.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Rückhalteelement (2) zumindest teilweise aus einem optisch transparenten Material gefertigt ist, insbesondere aus einem Polycarbonat und/oder einem Cycloolefin-Copolymer und/oder einem Glas.
  3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren des Rückhalteelements (2) einen Durchmesser von 3 µm -20 µm, bevorzugt von 4 µm - 8 µm, aufweisen.
  4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Rückhalteelement (2) eine einer Zellsuspension aussetzbare Fläche von 1 mm2 - 500 mm2, bevorzugt von 3 mm2 - 100 mm2, aufweist.
  5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Rückhalteelement (2) eine Dicke von 0,9 µm - 20 µm, bevorzugt von 1 µm - 12 µm aufweist.
  6. Verfahren zur Separierung von sich in einer Zellsuspension befindlichen, insbesondere lebenden, Zellen mittels einer Rückhaltevorrichtung (4) gemäß einem der Ansprüche 1-5 mit nachfolgenden Schritten: b) Zuführen der Zellsuspension zu der Vorrichtung (4) mit Rückhalteelement (2) c) Optische Detektion der durch das Rückhalteelement (2) rückgehaltenen Zellen und/oder der Zellen, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement (2) verzögert ist, wobei die Detektion in Echtzeit während des Durchströmens der Zellsuspension durch das Rückhalteelement (2) erfolgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei Schritt b) ein zusätzlicher Schritt a) vorangeht: a) Markierung der zu detektierenden Zellen in der Zellsuspension, wobei insbesondere die Viabilität der zu detektierenden Zellen erhalten bleibt, und wobei in Schritt c) die optische Detektion der durch das Rückhalteelement (2) rückgehaltenen, markierten Zellen und/oder der markierten Zellen, deren Durchtritt durch das Rückhalteelement (2) verzögert ist, erfolgt und wobei die Detektion in Echtzeit während des Durchströmens der Zellsuspension durch das Rückhalteelement (2) erfolgt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Markierung der zu detektierenden Zellen durch Anfärben mit Carboxyfluoresceinsuccinimidylester und/oder mit Propidiumiodid und/oder durch Markieren von Oberflächenantigenen, insbesondere durch fluoreszierende Antikörper und/oder mittels einer Desoxyribonukleinsäure-bindenden Markierung erfolgt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6-8, wobei in Schritt c) zumindest einer der nachfolgenden Parameter detektiert wird: Anzahl der zu detektierenden Zellen und/oder Durchmesser der zu detektierenden Zellen und/oder Zellkontur der zu detektierenden Zellen und/oder Durchtrittszeit der zu detektierenden Zellen durch das Rückhalteelement (2) und/oder Bestimmung der Deformation der zu detektierenden Zellen beim Durchtritt durch das Rückhalteelement (2) und/oder Homogenität des in die zu detektierenden Zellen eingelagerten oder gebundenen Mittels zur Markierung
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6-9, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der zu detektierenden Zellen durch Aufnahme von Einzelbildern in definierten Zeitabständen erfolgt, insbesondere nach 0,1 - 60 Sekunden, bevorzugt nach 1 - 10 Sekunden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6-10, wobei die Zellsuspension eine, insbesondere vorbehandelte, Blutprobe ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6-11, wobei die zu detektierenden Zellen zirkulierende Tumorzellen sind.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6-12, wobei eine Pumpe die Zellsuspension mit einer konstanten Flussrate oder mit einer variierenden Flussrate durch die Rückhaltevorrichtung (4) pumpt, und wobei die Flussrate insbesondere zwischen 0,01 µl/s und 100 µl/s, bevorzugt zwischen 0,2 µl/s und 5 µl/s liegt.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 6-13, wobei die Zellsuspension dem Rückhalteelement (2) portionsweise als Aliquots zugeführt wird und die vom Rückhalteelement (2) rückgehaltenen Zellen nach jedem Aliquot oder nach einer vorbestimmten Anzahl an Aliquots, vom Rückhalteelement (2) entfernt werden.
  15. Kartusche (10), insbesondere mikrofluidische Kartusche, umfassend eine Rückhaltevorrichtung (4) nach einem der Ansprüche 1-5.
DE102020215567.4A 2020-12-09 2020-12-09 Rückhaltevorrichtung und Verfahren zur Separierung von Zellen Pending DE102020215567A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102020215567.4A DE102020215567A1 (de) 2020-12-09 2020-12-09 Rückhaltevorrichtung und Verfahren zur Separierung von Zellen
PCT/EP2021/079852 WO2022122246A1 (de) 2020-12-09 2021-10-27 Rückhaltevorrichtung und verfahren zur separierung von zellen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102020215567.4A DE102020215567A1 (de) 2020-12-09 2020-12-09 Rückhaltevorrichtung und Verfahren zur Separierung von Zellen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102020215567A1 true DE102020215567A1 (de) 2022-06-09

Family

ID=78516786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102020215567.4A Pending DE102020215567A1 (de) 2020-12-09 2020-12-09 Rückhaltevorrichtung und Verfahren zur Separierung von Zellen

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102020215567A1 (de)
WO (1) WO2022122246A1 (de)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD222827A (de)
WO2000006702A1 (de) 1998-07-27 2000-02-10 Michael Giesing Krebszellen aus zellhaltigen körperflüssigkeiten, deren isolierung, verwendung sowie diese enthaltende mittel
DE102011076238A1 (de) 2011-05-20 2012-11-22 Siemens Ag Anordnung und Verfahren zur optischen Analyse und spezifischen Isolierung von biologischen Proben
WO2012159820A1 (de) 2011-05-20 2012-11-29 Siemens Aktiengesellschaft Automatisierter ctc nachweis
DE102016222075A1 (de) 2016-11-10 2018-05-17 Robert Bosch Gmbh Prozessiersystem und Verfahren zur Prozessierung einer mikrofluidischen Kartusche mit einer Prozessiereinheit
DE102016222072A1 (de) 2016-11-10 2018-05-17 Robert Bosch Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur geneigten Prozessierung von mikrofluidischen Kartuschen

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9103754B2 (en) * 2011-08-01 2015-08-11 Denovo Sciences, Inc. Cell capture system and method of use
WO2013158044A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Agency For Science, Technology And Research Apparatus and method for separating a biological entity from a sample volume
US10370630B2 (en) * 2014-02-10 2019-08-06 Technion Research & Development Foundation Limited Method and apparatus for cell isolation, growth, replication, manipulation, and analysis
EP3248018B1 (de) * 2015-01-22 2020-01-08 Becton, Dickinson and Company Vorrichtungen und systeme zum molekularen barcoding von nukleinsäuretargets in einzelzellen

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD222827A (de)
WO2000006702A1 (de) 1998-07-27 2000-02-10 Michael Giesing Krebszellen aus zellhaltigen körperflüssigkeiten, deren isolierung, verwendung sowie diese enthaltende mittel
DE102011076238A1 (de) 2011-05-20 2012-11-22 Siemens Ag Anordnung und Verfahren zur optischen Analyse und spezifischen Isolierung von biologischen Proben
WO2012159820A1 (de) 2011-05-20 2012-11-29 Siemens Aktiengesellschaft Automatisierter ctc nachweis
DE102016222075A1 (de) 2016-11-10 2018-05-17 Robert Bosch Gmbh Prozessiersystem und Verfahren zur Prozessierung einer mikrofluidischen Kartusche mit einer Prozessiereinheit
DE102016222072A1 (de) 2016-11-10 2018-05-17 Robert Bosch Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur geneigten Prozessierung von mikrofluidischen Kartuschen

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022122246A1 (de) 2022-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102011076221B3 (de) Automatisierter CTC Nachweis
EP1262776B1 (de) Verfahren zum quantitativen Nachweis vitaler ephithelialer Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit
EP1136822B1 (de) Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Zielstrukturen
EP1693109A1 (de) Behältnis zur Separation von Tumorzellen
DE102010032081A1 (de) Nachweis lebender, zirkulierender oder disseminierter Zellen bzw. Zellbestandteile in Blut oder Knochenmark nach Filtration von Blut
DE3109252A1 (de) Verfahren und zusammensetzung zur bestimmung einzelner leukozyten durch metachromatische farbstoffdifferentialabsorption
WO2008135452A2 (de) Detektionsvorrichtung zur detektion von biologischen mikropartikeln wie bakterien, viren, sporen, pollen oder biologische toxine, sowie detektionsverfahren
EP2696956B1 (de) Anordnung und verfahren zur optischen analyse und spezifischen isolierung von biologischen proben
DE212013000295U1 (de) Vorrichtungen zum Einfangen von Zielmolekülen
DE3226407A1 (de) Mikro-analyse-kapillar-system
DE102009043426B4 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Gewinnung, zum Nachweis und zur Analyse von Zellen in einem mikrofluidischen System
DE102011086235A1 (de) Mikrofluidisches Filterelement zum Abscheiden von Probenbestandteilen aus einem biologischen Probenfluid
EP3479122A1 (de) Schnelltest für den erreger- und zellnachweis und verfahren
DE102020215567A1 (de) Rückhaltevorrichtung und Verfahren zur Separierung von Zellen
EP2504698B1 (de) Verfahren zum vorhersagen des ansprechens einer tumorerkrankung auf eine therapeutische massnahme
EP3973288B1 (de) Mikrofluidisches analysesystem zur analyse von blutproben
EP1498492A1 (de) Probenzubereitungseinheit
WO2022223593A1 (de) Verfahren zum erkennen von kernhaltigen zellen in einer probenflüssigkeit eines patienten unter verwendung einer mikrofluidischen vorrichtung und mikrofluidische vorrichtung
DE10222979B4 (de) Verfahren zur Verstärkung eines Signals
WO2020178134A1 (de) Verfahren zum zählen von zelltypen oder zellmarkern in einer probe, insbesondere in einer blutprobe
DE102017128627B4 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Untersuchung einer Zellsuspension
DE19801090A1 (de) Lysis-Filtrations-Assay LYFA
EP1880017B1 (de) Verfahren zur herstellung von liganden, liganden und test-kit
WO2007028380A1 (de) Funktioneller in vitro immunassay
Greenberg The comparative histologic application of Phorwite Fabric brighteners

Legal Events

Date Code Title Description
R163 Identified publications notified