WO2022223593A1

WO2022223593A1 - Verfahren zum erkennen von kernhaltigen zellen in einer probenflüssigkeit eines patienten unter verwendung einer mikrofluidischen vorrichtung und mikrofluidische vorrichtung

Info

Publication number: WO2022223593A1
Application number: PCT/EP2022/060378
Authority: WO
Inventors: Samir KADIC; Tianxing Du; Franz Laermer; Jochen Hoffmann; Anne SEROUT
Original assignee: Robert Bosch Gmbh
Priority date: 2021-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2022-10-27
Also published as: CN117241887A; EP4326440A1; DE102021203897A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit (105) eines Patienten unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), wobei das Verfahren einen Schritt des Bereitstellens, einen Schritt des Ausgebens und einen Schritt des Identifizierens umfasst. Im Schritt des Bereitstellens wird ein Mischsignal an eine Mischeinrichtung bereitgestellt, wobei das Mischsignal ein Mischen der Probenflüssigkeit (105) mit einem Lysepuffer in einer Mischkammer (110) der mikrofluidischen Vorrichtung (100) bewirkt, um ein Lysat zu erhalten. Im Schritt des Ausgebens wird ein Aufbringsignal ausgegeben, das ein Aufbringen des Lysats auf ein Trägersubstrat (115) der mikrofluidischen Vorrichtung (100) bewirkt, um ein Zellsediment und eine Zellsuspension des Lysats zu erhalten. Im Schritt des Identifizierens werden die kernhaltigen Zellen aus dem Zellsediment identifiziert.

Description

Beschreibung

Titel

Verfahren zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit eines Patienten unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung und mikrofluidische Vorrichtung

Stand der Technik

Die Erfindung geht von einem Verfahren zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit eines Patienten und einer mikrofluidischen Vorrichtung nach Gattung der unabhängigen Ansprüche aus. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Computerprogramm.

Zirkulierende Tumorzellen (Circulating Tumor Cells, CTCs) haben sich in den vergangenen Jahren als vielversprechende und klinisch relevante Biomarker zur Untersuchung von bösartigen Tumoren etabliert. Deren möglichst frühzeitige Detektion in geeigneten menschlichen Körperflüssigkeiten, in der Regel Blut, jedoch ist z. B. aber auch Lymphflüssigkeit analysierbar, bietet gegenüber typischerweise invasiven Gewebebiopsien zahlreiche Vorteile. Sie ist - bekannt als Liquid Biopsy - daher einer der Forschungsschwerpunkte der modernen Onkologie. So erlaubt zum Beispiel eine zeitlich aufgelöste Quantifizierung von CTCs je normiertem Volumen Blut eines Krebspatienten, dessen Krankheitsverlauf präzise und in Echtzeit zu verfolgen (Real-Time Monitoring), an die individuelle Krankheitssituation angepasste Therapieentscheidungen zu treffen oder sogar Prognosen über ein progressionsfreies Überleben liefern zu können.

Die WO 2012/138882 A2 beschreibt eine Mikrofluidikvorrichtung mit Mikrokavitäten zum Erkennen von biologischen Zellen unter Verwendung von Magnetelementen. Offenbarung der Erfindung

Vor diesem Hintergrund werden mit dem hier vorgestellten Ansatz ein verbessertes Verfahren, weiterhin eine verbesserte mikrofluidische Vorrichtung, die dieses Verfahren verwendet, sowie schließlich ein entsprechendes Computerprogramm gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Durch die in den abhängigen Ansprüchen aufgeführten Maßnahmen sind vorteilhafte Weiterbildungen und Verbesserungen der im unabhängigen Anspruch angegebenen Vorrichtung möglich.

Durch den hier vorgestellten Ansatz kann vorteilhafterweise eine medizinische Analyse einer Patientenprobe automatisiert durchgeführt werden, die vorteilhafterweise in Verbindung mit zeitkritischen Untersuchungen stehen kann. Durch den vorgestellten Ansatz kann demnach Zeit eingespart werden.

Es wird ein Verfahren zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit eines Patienten unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung vorgestellt, wobei das Verfahren einen Schritt des Bereitstellens, einen Schritt des Ausgebens und einen Schritt des Identifizierens umfasst. Im Schritt des Bereitstellens wird ein Mischsignal an eine Schnittstelle zu einer Mischeinrichtung bereitgestellt, wobei das Mischsignal ein Mischen der Probenflüssigkeit mit einem Lysepuffer in einer Mischkammer der mikrofluidischen Vorrichtung bewirkt, um ein Lysat zu erhalten. Im Schritt des Ausgebens wird ein Aufbringsignal ausgegeben, das ein Aufbringen des Lysats auf ein Trägersubstrat der mikrofluidischen Vorrichtung bewirkt, um ein Zellsediment und eine Zellsuspension des Lysats zu erhalten. Im Schritt des Identifizierens werden die kernhaltigen Zellen aus dem Zellsediment identifiziert.

Das Verfahren kann vorteilhafterweise automatisiert durchgeführt werden, um die kernhaltigen Zellen, wie beispielsweise Tumorzellen, Leukozyten, Endothelzellen oder Stammzellen, zu erkennen. Unter „kernhaltigen Zellen“ können gemäß dem hier vorgestellten Ansatz Zellen verstanden werden, die einen Zellkern aufweisen. Speziell enthalten diese Zellen eine Erbinformation in dem Zellkern, die eine Reproduktion der Zelle aus der Erbinformation in diesem Zellkern ermöglicht. Zellen ohne Zellkern können dagegen beispielsweise rote Blutkörperchen (Erythrozyten) oder Blutplättchen (Thrombozyten) sein. Die Probenflüssigkeit kann beispielsweise eine Blutprobe des Patienten sein. Die mikrofluidische Vorrichtung kann beispielsweise als eine Lab-on-Chip- Kartusche ausgeformt sein oder eine solche zumindest umfassen. Die Probenflüssigkeit kann im oder vor dem Schritt des Bereitstellens beispielsweise in der Mischkammer hin- und hergepumpt werden, sodass eine gleichmäßige Konzentration und Verteilung des Lysats erfolgt. Der Lysepuffer kann beispielsweise als ein chemisches Fluid ausgeformt sein, das solche Eigenschaften aufweist, um Erythrozyten beispielsweise von Leukozyten und zusätzlich oder alternativ von Tumorzellen trennen zu können. Vorteilhafterweise kann der Lysepuffer als ein Ammoniumchlorid-Lysepuffer (ACK- Lysepuffer) ausgeformt sein, um beispielsweise einen Dichteunterschied der Zellen zu erzeugen. Vorteilhafterweise kann das Lysat für eine vorbestimmte Zeitdauer und insbesondere mindestens fünf Minuten innerhalb der Mischkammer bewegt werden, um eine homogene Konzentration der Bestandteile des Lysats zu erreichen. Das Trägersubstrat kann beispielsweise als ein Chip ausgeformt sein. Vorteilhafterweise wird das Lysat auf das Trägersubstrat aufgebracht, wo es für eine vorbestimmte Zeitdauer ruhen kann. Während dieser Zeitdauer kann vorteilhafterweise eine Sedimentation erfolgen, sodass sich das Zellsediment, das bedeutet noch intakte Zellen, auf dem Trägersubstrat ablagern und schließlich im Schritt des Identifizierens identifiziert werden können.

Gemäß einer Ausführungsform kann das Verfahren einen Schritt des Waschens des Lysats vor dem Schritt des Identifizierens unter Verwendung eines Waschpuffers umfassen, um eine optische Transparenz des Lysats zu bewirken. Vorteilhafterweise kann dadurch das Lysat derart gereinigt werden, dass es klar wird und entsprechend eine genauere Identifizierung der kernhaltigen Zellen erfolgen kann. Folglich können dadurch Fehlerquellen reduziert werden. Der dazu verwendete Waschpuffer kann vorteilhafterweise als eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ausgeformt sein.

Weiterhin kann im Schritt des Waschens das Lysat unter Verwendung des Waschpuffers gewaschen werden, der isoton und zusätzlich oder alternativ pH- neutral ausgeformt ist. Vorteilhafterweise kann dadurch sichergestellt und gewährleistet werden, dass die zu identifizierenden kernhaltigen Zellen nicht geschädigt werden.

Gemäß einer Ausführungsform kann im Schritt des Bereitstellens das Mischsignal bereitgestellt werden, das ein Mischen einer von einer Menge der Probenflüssigkeit abhängigen Menge des Lysepuffers bewirkt. Vorteilhafterweise kann ein entsprechendes Mischverhältnis der Probenflüssigkeit und des Lysepuffers vorgegeben sein. Weiterhin können die Mengen der beiden Flüssigkeiten vorteilhafterweise automatisiert bereitgestellt werden.

Ferner können im Schritt des Identifizierens die kernhaltigen Zellen aus dem Zellsediment optisch detektiert und zusätzlich oder alternativ quantifiziert werden. Vorteilhafterweise kann dadurch beispielsweise eine Krankheit und zusätzlich oder alternativ eine Schwere der Krankheit ermittelt werden.

Gemäß einer Ausführungsform kann im Schritt des Bereitstellens das Mischsignal bereitgestellt werden, um die Probenflüssigkeit mit dem Lysepuffer zu vermischen. Dabei kann der Lysepuffer ein fluoreszierendes Färbemittel zum Bestimmen einer Zellenart der kernhaltigen Zellen aufweisen. Vorteilhafterweise kann das Färbemittel auf die kernhaltigen Zellen des Lysats wirken, sodass sich das Zellsediment gegenüber der Zellsuspension farblich unterscheidet und somit vorteilhafterweise vereinfacht erkennbar ist, ob und in welcher Menge sich beispielsweise Tumorzellen in dem Lysat befinden.

Gemäß einer Ausführungsform kann das Verfahren einen Schritt des Zuführens des fluoreszierenden Färbemittels in den Lysepuffer vor dem Schritt des Bereitstellens umfassen. Vorteilhafterweise können dadurch zeitliche Einsparungen erfolgen.

Das Verfahren kann außerdem einen Schritt des Einbringens der Probenflüssigkeit in die mikrofluidische Vorrichtung umfassen. Vorteilhafterweise kann das Einbringen der Probenflüssigkeit manuell durch einen Nutzer oder alternativ maschinell erfolgen. Von Vorteil ist ferner eine Ausführungsform des hier vorgestellten Ansatzes als Verfahren zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit eines Patienten unter Verwendung einer hier Variante einer hier vorgestellten mikrofluidischen Vorrichtung, wobei das Verfahren einen Schritt des Mischens der Probenflüssigkeit mit einem Lysepuffer in einer Mischkammer der mikrofluidischen Vorrichtung aufweist, um ein Lysat zu erhalten. Ferner umfasst das Verfahren einen Schritt des Aufbringens des Lysats auf ein Trägersubstrat der mikrofluidischen Vorrichtung, um ein Zellsediment und eine Zellsuspension des Lysats zu erhalten. Schließlich umfasst das Verfahren einen Schritt des Identifizierens der kernhaltigen Zellen aus dem Zellsediment. Auch durch eine solche Ausführungsform lassen sich die Vorteile des hier vorgestellten Ansatzes schnell und effizient realisieren.

Hierbei ist es von Vorteil, wenn das Verfahren einen Schritt des Waschens des Lysats vor dem Schritt des Identifizierens unter Verwendung eines Waschpuffers umfasst, um eine optische Transparenz des Lysats zu bewirken.

Hierbei ist der Waschpuffer beispielsweise isoton und/oder pH-neutral ausgeformt. Hieraus ergeben sich die bereits oben genannten Vorteile.

Zudem ist es von Vorteil, wenn im Schritt des Mischens das Mischen einer von einer Menge der Probenflüssigkeit abhängigen Menge des Lysepuffers erfolgt. Hieraus ergeben sich die bereits oben genannten Vorteile.

Weiterhin ist es von Vorteil, wenn im Schritt des Identifizierens die kernhaltigen Zellen aus dem Zellsediment optisch detektiert und/oder quantifiziert werden. Hieraus ergeben sich die bereits oben genannten Vorteile.

Auch ist es vorteilhaft, wenn im Schritt des Mischens der Probenflüssigkeit mit dem Lysepuffer der Lysepuffer ein fluoreszierendes Färbemittel zum Bestimmen einer Zellenart der kernhaltigen Zellen aufweist, insbesondere wobei ein Schritt des Zuführens des fluoreszierenden Färbemittels in den Lysepuffer vor dem Schritt des Mischens vorgesehen ist. Hieraus ergeben sich die bereits oben genannten Vorteile. Weiterhin vorteilhaft ist es, wenn das Verfahren einen Schritt des Einbringens der Probenflüssigkeit (105) in die mikrofluidische Vorrichtung umfasst. Hieraus ergeben sich die bereits oben genannten Vorteile.

Des Weiteren wird eine mikrofluidische Vorrichtung zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit eines Patienten vorgestellt, wobei insbesondere die mikrofluidische Vorrichtung als eine Lab-on-Chip- Kartusche ausgeformt sein kann. Die mikrofluidische Vorrichtung weist eine Mischkammer zum Aufnehmen der Probenflüssigkeit und eines Lysepuffers, um ein Lysat zu erhalten. Ferner weist die mikrofluidische Vorrichtung ein Trägersubstrat zum Aufnehmen des Lysats, um ein Zellsediment und eine Zellsuspension des Lysats zu erhalten sowie eine Detektionskammer auf. Dabei ist das Trägersubstrat in der Detektionskammer angeordnet und/oder anordenbar.

Vorteilhafterweise kann die mikrofluidische Vorrichtung in Verbindung mit Schnelltests eingesetzt werden, da sie einen zeitlich vorteilhaften Verfahrensablauf eines Verfahrens zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Patientenprobe in einer der zuvor genannten Varianten ermöglicht. Vorteilhafterweise kann die mikrofluidische Vorrichtung ausgebildet sein, um beispielsweise eine Blutprobe zu analysieren. Das Trägersubstrat kann beispielsweise chipartig ausgeformt sein.

Gemäß einer Ausführungsform kann die Detektionskammer eine Höhe aufweisen, die geringer ist als eine Breite und eine Länge der Detektionskammer. Die Detektionskammer kann beispielsweise eine Höhe von 320 Mikrometer und beispielsweise quadratische Grundfläche mit beispielsweise Kantenlängen von 12,5 mm x 12,5 mm aufweisen. Zusätzlich oder optional können Abmessungen der Mischkammer 13 mm x 13 mm x 10 mm betragen.

Gemäß einer Ausführungsform kann das Trägersubstrat eine Mehrzahl von Mikrokavitäten aufweisen. Vorteilhafterweise kann sich das Zellsediment in den einzelnen Mikrokavitäten ablagern. Weiterhin können die einzelnen Mikrokavitäten wabenförmig angeordnet sein. Weiterhin kann die mikrofluidische Vorrichtung eine Pufferlagerkammer aufweisen, die ausgebildet ist, um den Lysepuffer zu lagern und in die Mischkammer abzugeben. Die Pufferlagerkammer kann vorteilhafterweise ein vorbestimmtes Fassungsvermögen aufweisen, welches der benötigten Menge des Lysepuffers entsprechen kann.

Es wird ferner eine Auswerteeinrichtung zur Auswertung eines Zellsediments in einer mikrofluidischen Vorrichtung in einer zuvor genannten Variante vorgestellt, wobei die Auswerteeinrichtung eine Mischeinrichtung und eine Identifiziereinheit aufweist. Die Mischeinrichtung ist ausgebildet, um die Probenflüssigkeit mit dem Lysepuffer in der Mischkammer zu mischen, um ein Lysat zu erhalten. Die Identifiziereinheit ist ausgebildet, um die kernhaltigen Zellen aus dem Zellsediment zu identifizieren.

Vorteilhafterweise kann die Auswerteeinrichtung eine Steuereinheit oder ein Steuergerät zum Ansteuern und/oder Ausführen der Schritte des Verfahrens in einer der zuvor genannten Varianten aufweisen. Die Mischeinrichtung kann eine Pumpeinheit aufweisen oder beispielsweise als solche ausgeformt sein. Dadurch können vorteilhafterweise die Probenflüssigkeit und der Lysepuffer zu einem homogenen Lysat vermischt werden. Die Identifiziereinheit kann vorteilhafterweise eine Mikroskopeinheit und zumindest eine Lichtquelle umfassen oder als solche ausgeformt sein.

Das zuvor genannte Verfahren kann beispielsweise in Software oder Hardware oder in einer Mischform aus Software und Hardware beispielsweise in einem Steuergerät oder einer Steuereinheit implementiert sein.

Der hier vorgestellte Ansatz schafft ferner ein Steuergerät, das ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen, anzusteuern bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form eines Steuergeräts kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden. Hierzu kann das Steuergerät zumindest eine Recheneinheit zum Verarbeiten von Signalen oder Daten, zumindest eine Speichereinheit zum Speichern von Signalen oder Daten, zumindest eine Schnittstelle zu einem Sensor oder einem Aktor zum Einlesen von Sensorsignalen von dem Sensor oder zum Ausgeben von Steuersignalen an den Aktor und/oder zumindest eine Kommunikationsschnittstelle zum Einlesen oder Ausgeben von Daten aufweisen, die in ein Kommunikationsprotokoll eingebettet sind. Die Recheneinheit kann beispielsweise ein Signalprozessor, ein Mikrocontroller oder dergleichen sein, wobei die Speichereinheit ein Flash-Speicher, ein EEPROM oder eine magnetische Speichereinheit sein kann. Die Kommunikationsschnittstelle kann ausgebildet sein, um Daten drahtlos und/oder leitungsgebunden einzulesen oder auszugeben, wobei eine Kommunikationsschnittstelle, die leitungsgebundene Daten einiesen oder ausgeben kann, diese Daten beispielsweise elektrisch oder optisch aus einer entsprechenden Datenübertragungsleitung einiesen oder in eine entsprechende Datenübertragungsleitung ausgeben kann.

Unter einem Steuergerät kann vorliegend ein elektrisches Gerät verstanden werden, das Sensorsignale verarbeitet und in Abhängigkeit davon Steuer- und/oder Datensignale ausgibt. Das Steuergerät kann eine Schnittstelle aufweisen, die hard- und/oder softwaremäßig ausgebildet sein kann. Bei einer hardwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen beispielsweise Teil eines sogenannten System-ASICs sein, der verschiedenste Funktionen des Steuergeräts beinhaltet. Es ist jedoch auch möglich, dass die Schnittstellen eigene, integrierte Schaltkreise sind oder zumindest teilweise aus diskreten Bauelementen bestehen. Bei einer softwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen Softwaremodule sein, die beispielsweise auf einem Mikrocontroller neben anderen Softwaremodulen vorhanden sind.

Von Vorteil ist auch ein Computerprogrammprodukt oder Computerprogramm mit Programmcode, der auf einem maschinenlesbaren Träger oder Speichermedium wie einem Halbleiterspeicher, einem Festplattenspeicher oder einem optischen Speicher gespeichert sein kann und zur Durchführung, Umsetzung und/oder Ansteuerung der Schritte des Verfahrens nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen verwendet wird, insbesondere wenn das Programmprodukt oder Programm auf einem Computer oder einer Vorrichtung ausgeführt wird.

Ausführungsbeispiele des hier vorgestellten Ansatzes sind in den Zeichnungen dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel; Fig. 2 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens gemäß einem

Ausführungsbeispiel zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit eines Patienten;

Fig. 3 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer

Probenflüssigkeit eines Patienten;

Fig. 4 ein schematisches Ausführungsbeispiel eines Querschnitts einer Detektionskammer einer mikrofluidischen Vorrichtung;

Fig. 5 ein schematisches Ausführungsbeispiel eines Querschnitts einer Detektionskammer einer mikrofluidischen Vorrichtung;

Fig. 6 eine Auswerteeinrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel und eine mikrofluidische Vorrichtung;

Fig. 7 ein schematisches Ausführungsbeispiel eines Querschnitts einer Detektionskammer einer mikrofluidischen Vorrichtung; Fig. 8 ein schematisches Ausführungsbeispiel eines Querschnitts einer

Detektionskammer einer mikrofluidischen Vorrichtung; und

Fig. 9 eine schematische Darstellung eines Strömungsverlaufs in einer Mikrokavität gemäß einem Ausführungsbeispiel. In der nachfolgenden Beschreibung günstiger Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Die mikrofluidische Vorrichtung 100 ist dabei ausgebildet, um kernhaltige Zellen in einer Probenflüssigkeit 105 eines Patienten zu erkennen. Dabei ist die mikrofluidische Vorrichtung 100 insbesondere als eine Lab-on-Chip- Kartusche ausgeformt. Die mikrofluidische Vorrichtung 100 weist dazu eine Mischkammer 110 zum Aufnehmen der Probenflüssigkeit 105 und eines Lysepuffers auf, welche gemeinsam ein Lysat bilden. Hierzu wird allgemein angemerkt, dass die in der Fig. 1 dargestellten Elemente im Wesentlichen nur eine Übersicht über Komponenten wiedergegeben, die auf der mikrofluidischen Vorrichtung 100 realisiert sein können; eine genauere Darstellung oder Beschreibung der Lage oder Position dieser Elemente oder Komponenten ist aus der Fig. 1 nicht zu entnehmen.

Hierzu wird nachfolgend der funktionelle Aufbau samt der Lage der einzelnen Komponenten zueinander näher beschrieben. Weiterhin weist die mikrofluidische Vorrichtung 100 ein Trägersubstrat 115 zum Aufnehmen des Lysats, um ein Zellsediment und eine Zellsuspension des Lysats zu erhalten, sowie eine Detektionskammer 120 auf. Das Trägersubstrat 115 ist dabei in der Detektionskammer 120 angeordnet und/oder anordenbar. Die mikrofluidische Vorrichtung 100 ist ausgebildet, um beispielsweise eine Analysedauer der Probenflüssigkeit 105 zu verkürzen, da sie als Kartusche in Verbindung mit beispielsweise Schnelltests einsetzbar ist. Die Probenflüssigkeit 105 ist beispielsweise als Blut des Patienten realisiert, das beispielsweise auf Tumorzellen (CTCs) untersucht wird. Eine Analyse der Probenflüssigkeit 105 wird dabei beispielsweise automatisiert durchgeführt, sodass sich auch dadurch die Analysedauer verkürzt, was insbesondere in zeitkritischen Situationen vorteilhaft ist. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel weist die mikrofluidische Vorrichtung 100 eine Einlassschnittstelle 125 auf, die ausgebildet ist, um die Probenflüssigkeit 105 in ein Inneres der Vorrichtung 100 einzulassen, wo sie letztendlich mittels eines Verfahrens zum Erkennen von kernhaltigen Zellen untersucht wird, wie es in einer der nachfolgenden Figuren näher erläutert wird. Die Probenflüssigkeit 105 wird beispielsweise manuell oder alternativ automatisiert unter Verwendung einer Einfülleinrichtung 130, wie beispielsweise mittels einer Pipette, in die mikrofluidische Vorrichtung 100 eingelassen.

Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist die Mischkammer 110 gegenüber der Detektionskammer 120 gemäß diesem Ausführungsbeispiel flacher ausgestaltet. Gemäß einem alternativen Ausführungsbeispiel ist es denkbar, dass sich die Abmessungen der Kammern 110, 120 voneinander unterscheiden. In der Detektionskammer 120 ist dabei das Trägersubstrat 115 angeordnet, das beispielsweise als ein entnehmbarer oder einsetzbarer Mikrochip realisiert oder realisierbar ist. Alternativ ist das Trägersubstrat 115 beispielsweise als ein fest installierter Chip ausgeformt. Das Trägersubstrat 115 weist dabei lediglich optional eine Mehrzahl von Mikrokavitäten 135 auf, die beispielsweise als Vertiefungen an einer Fläche des Trägersubstrats 115 ausgeformt sind. Die Mikrokavitäten 135 sind beispielsweise wabenförmig auf dem Trägersubstrat 115 angeordnet. Lediglich optional weist die mikrofluidische Vorrichtung 100 eine Pufferlagerkammer 140 auf, die ausgebildet ist, um den Lysepuffer zu lagern und in die Mischkammer 110 abzugeben.

Der hier vorgestellte Ansatz ermöglicht in anderen Worten ausgedrückt eine vollautomatisierte und isolationsfreie Quantifizierung von zirkulierenden Tumorzellen aus Vollblut in einer mikrofluidischen Umgebung. Genauer gesagt wird ein mikrofluidisches Pendant zu einer isolationsfreien und bislang lediglich manuellen Methode zur Verfügung gestellt, welche eine Vorbereitung der Blutprobe bis zur CTC-Quantifizierung umfasst. Der Einsatz ist vor allem interessant für automatisierte Mikrofluidiksysteme wie die hier beschriebene mikrofluidische Vorrichtung 100, die Analysen an einem so genannten Point-of- Care (PoC) anbieten, das heißt insbesondere zeitkritischen Randbedingungen untererliegen und nur beschränkten Platz für Reagenzien und Probenmaterial zur Verfügung stellen.

Das in der nachfolgenden Fig. beschriebene Verfahren und die mikrofluidische Vorrichtung 100 erlauben weiterhin generell eine Detektion aller kernhaltigen Zellen aus Vollblut, das hier als Probenflüssigkeit 105 bezeichnet ist. Dies betrifft insbesondere Leukozyten, aber auch Endothelzellen und/oder Stammzellen, sodass auch alternative Blutanalysen durchführbar sind.

Die Kernelemente des vorgestellten Ansatzes umfassen dabei gemäß diesem Ausführungsbeispiel eine chronologische Zusammensetzung einzelner Schritte und/oder Komponenten. Beispielsweise wird in einem Anwendungsbeispiel eine selektive Lyse der Probenflüssigkeit 105 unter Verwendung beispielsweise eines ACK- Lysepuffers zur Maximierung der Dichteunterschiede zwischen lysierten Erythrozyten und nicht-lysierten, noch intakten kernhaltigen Zellen durchgeführt. Für eine zusätzliche Zeitersparnis werden dem Lysepuffer beispielsweise parallel bereits an dieser Stelle die für die spätere Detektion erforderlichen und noch zu inkubierenden Farbstoffe eingegeben, sodass ein „AII-in-One-Buffer“ entsteht.

Die Kerninformation muss dabei nicht zwingend über eine Hellfeld- Durchlichtmikroskopie erfolgen, insbesondere nicht für den Fall, dass diese Möglichkeit in der mikrofluidischen Vorrichtung 100 nicht besteht oder der zugehörige optische Pfad nicht transparent genug zu gestalten ist. Stattdessen ist es denkbar, dass der Zellkern für den Nachweis „Kern vorhanden oder nicht?“ äquivalent mit einem Standard-DNA-Farbstoff fluoreszent angefärbt wird. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel erfolgt ein Transfer des entstandenen und bereits teilweise angefärbten Lysats, das auch als Blutlysat bezeichnet wird, in die relativ flache und großflächige Detektionskammer 120, wobei darin die natürliche und über die Detektionsfläche homogen verteilte Sedimentation aller intakten kernhaltigen Zellen unter lysierten Erythrozyten gleichmäßig in eine am Boden der Kammer 120 befindliche Struktur aus Mikrokavitäten 135 oder Mikrowannen abgewartet wird. Dadurch wird eine Negativ-Selektion „quasi isolationsfrei“ und damit in möglichst idealer Form gestaltet. Zu beachten ist, dass die Sedimentationszeit als verbleibende Inkubationszeit für die eingesetzten Farbstoffe genutzt wird, beispielsweise in Form einer Parallelisierung.

Eine CTC-Detektion per Fluoreszenzmikroskopie wird beispielsweise nach sanftem Wegspülen der durch die Lyse entstandenen und größtenteils noch nicht am Boden der Kammer befindlichen Produkte Erythrozytenhäutchen, kurz „EH“und Hämoglobin, kurz „Hb“, die als optische Barriere wirken, möglich, wobei die sedimentierten kernhaltigen Zellen in den Mikrokavitäten 135 verbleiben und/oder durch diese vor dem Wegspülen geschützt sind. Ist der Lichtpfad dagegen transparent genug, das bedeutet das Mikrofluidiksystem transparent, und liegt weiterhin keine Neigung des Systems vor, so ist sowohl der Chip mit Mikrokavitäten 135, als auch der Waschvorgang optional. Die Zellen können in diesem Fall direkt auf ein planares und transparentes Trägersubstrat 115 sedimentieren. Sämtliche Informationen, auch die Kerninformation, lassen sich dann durch fluoreszente Färbungen und optische Detektion auf der Substratunterseite extrahieren, da die optische Barriere in diesem Fall quasi nicht vorhanden ist. Ist die optische Barriere durch das Lysat insgesamt dünn und damit transparent genug, erfolgt die beschriebene Analyse ohne Chip mit Mikrokavitäten 135 und ohne Waschvorgang über Fluoreszenzkanäle beispielsweise via Auflichtmikroskopie. Durch den vorgestellten Ansatz werden Zellverluste und/oder Zellschäden reduziert, da eine CTC-Detektion (quasi) isolationsfrei erfolgt, womit nur noch geringste Probenvolumina verarbeitet werden und die CTC-Quantifizierung standardisierbar ist. Des Weiteren ist dank der mikrofluidischen Integrierbarkeit die Automatisierung möglich, da der Bedarf für klassisches und nicht oder nur schwer mit mikrofluidischen Umgebungen kombinierbares Laborequipment, wie beispielsweise Zentrifugen, Gebinde, Gefäße, usw., sowie manuelle Verarbeitungsschritte mit Totzeiten zwischen verschiedenen Prozessstationen reduziert wird. Weiterhin optional wird ein Volumen von notwendigen Reagenzien und Probenflüssigkeit 105 reduziert, da durch Mikrofluidikkanäle und minimierte Abmessungen der Detektionskammer 120 sowie durch das als Chip bezeichenbare Trägersubstrat 115 mit Mikrokavitäten 135 als deren Boden ein effektives Waschen und die anschließende Quantifizierung von angefärbten Zellen auch beispielsweise durch ein konventionelles Auflichtmikroskop oder optisches Detektionssystem nach einem Auflicht-Setup mit reduziertem Arbeitsabstand möglich ist. Mikrokavitäten 135 bieten den Vorteil, die mikrofluidische Vorrichtung 100 entgegen einer Neigung betreiben zu können.

Fig. 2 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 200 gemäß einem Ausführungsbeispiel zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit eines Patienten. Das Verfahren 200 wird beispielsweise in Verbindung mit einer mikrofluidischen Vorrichtung angesteuert oder durchgeführt, wie sie in Fig. 1 beschrieben wurde. Die zu erkennenden kernhaltigen Zellen sind beispielsweise Tumorzellen, Leukozyten, Endothelzellen oder Stammzellen. Das Verfahren 200 umfasst dazu einen Schritt 205 des Bereitstellens, einen Schritt 210 des Ausgebens und einen Schritt 215 des Identifizierens. Im Schritt 205 des Bereitstellens wird ein Mischsignal an eine Schnittstelle zu einer Mischeinrichtung bereitgestellt, wobei das Mischsignal ein Mischen der Probenflüssigkeit mit einem Lysepuffer in der Mischkammer der mikrofluidischen Vorrichtung bewirkt, um ein Lysat zu erhalten. Beispielsweise wird die Probenflüssigkeit mit dem Lysepuffer für eine vorbestimmte Zeitdauer gemischt, die gemäß diesem Ausführungsbeispiel mindestens fünf Minuten beträgt. Im Schritt 210 des Ausgebens wird ein Aufbringsignal ausgegeben, das ein Aufbringen des Lysats auf das Trägersubstrat der mikrofluidischen Vorrichtung bewirkt, um ein Zellsediment und eine Zellsuspension des Lysats beispielsweise nach Ablauf einer Mindestsedimentationszeit zu erhalten. Im Schritt 215 des Identifizierens werden die kernhaltigen Zellen aus dem Zellsediment identifiziert, um beispielsweise gefärbte Zellen zu erkennen.

Lediglich optional umfasst das Verfahren 200 einen Schritt 220 des Einbringens der Probenflüssigkeit in die mikrofluidische Vorrichtung, wodurch das Verfahren 200 beispielsweise initiiert wird. Eine Menge der Probenflüssigkeit umfasst beispielsweise 500 pl, von denen beispielsweise 100 mI im Schritt 205 des Bereitstellens mit dem Lysepuffer gemischt werden. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel weist der Lysepuffer ein fluoreszierendes Färbemittel zum Bestimmen einer Zellenart der kernhaltigen Zellen auf. Das fluoreszierende Färbemittel ist dabei optional bereits in dem Lysepuffer enthalten oder wird in einem optionalen Schritt 225 des Zuführens vor dem Schritt 205 des Bereitstellens dem Lysepuffer zugeführt. Dadurch wird erreicht, dass die kernhaltigen Zellen das Färbemittel aufnehmen und somit optisch erkennbar werden.

Gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 205 des Bereitstellens das Mischsignal bereitgestellt, das ein Mischen einer von einer Menge der Probenflüssigkeit abhängigen Menge des Lysepuffers bewirkt. Das bedeutet, dass die Mengen des Lysepuffers und der Probenflüssigkeit im Idealfall ein vorgegebenes Mischverhältnis aufweisen, um im Schritt 215 des Identifizierens ein aussagekräftiges Ergebnis zu erhalten. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren 200 einen Schritt 230 des Waschens des Lysats vor dem Schritt 215 des Identifizierens unter Verwendung eines Waschpuffers, um eine optische Transparenz des Lysats zu bewirken. Der Waschpuffer ist dabei beispielsweise isoton und/oder pH-neutral realisiert. Folglich ist es leichter, im Schritt 215 des Identifizierens die kernhaltigen Zellen zu detektieren. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel werden die kernhaltigen Zellen im Schritt 215 des Identifizierens aus dem Zellsediment optisch detektiert und/oder quantifiziert, beispielsweise unter Verwendung einer Mikroskopeinrichtung.

In anderen Worten ausgedrückt wird gemäß diesem Ausführungsbeispiel im Schritt 220 des Einbringens die auch als Blutprobe bezeichnete Probenflüssigkeit in die mikrofluidische Vorrichtung gegeben. Alle nachfolgenden Schritte erfolgen weiterhin vollautomatisiert on-Chip. Insbesondere mikrofluidische Einheitsoperationen wie beispielsweise Probentransport, Mischen, Waschen, usw. geschehen nach programmiertem Ablauf und ohne Einwirken eines Menschen. Im Schritt 205 des Bereitstellens wird innerhalb der relativ hohen Mischkammer Vollblut in einem passenden Arbeitsverhältnis mit dem ACK- Lysepuffer versetzt und während einer notwendigen Lysezeit für eine homogene Konzentration kontinuierlich vermischt. Dem Lysepuffer sind bereits die erforderlichen Fluoreszenzfarbstoffe, die für eine optische Detektion bzw. Klassifizierung von CTCs aus Leukozyten erforderlich sind, in der jeweiligen Arbeitskonzentration beigemischt. Da es sich um ein abgeschlossenes Mikrofluidiksystem handelt, erfolgt die Inkubation der Farbstoffe parallel, bzw. im Schritt 225 des Zuführens. Für die Inkubation ist somit keine zusätzliche separate Wartezeit erforderlich.

Der Prozess der Hämolyse findet so lange statt, bis eine Hämoglobin- Konzentration (Hb) außerhalb des roten Blutkörperchens mit der Hb- Konzentration innerhalb des roten Blutkörperchens in einem Gleichgewicht steht. Ab diesem Zeitpunkt wird die Membran impermeabel für einen weiteren Fluss von Hb sowie andere vergleichbar große Proteine. Ist die Hämolyse beendet, wird das entstandene Lysat im Schritt 210 des Ausgebens in die flache und großflächige Detektionskammer gepumpt. Die Höhe der Kammer ist derart gewählt, dass die Sedimentationszeit der enthaltenen kleinsten kernhaltigen intakten Zellen auf einen vorgegebenen Maximalwert beschränkt wird, was auch als PoC-Tauglichkeit bezeichnet wird. Da Erythrozyten durch die selektive Lyse einen diffusiven Medienaustausch zwischen Zellinnerem und Zelläußerem erfahren haben, setzt sich ein Netto-Dichte-Unterschied zwischen ihnen und dem umgebenden Medium effektiv nur noch durch die Zellmembran zusammen und ist damit quasi vernachlässigbar klein. In der Folge besitzen solche lysierten Zellen eine Sedimentationsgeschwindigkeit von nahezu Null und „schwimmen im Medium umher“. Unlysierte Zellen, also insbesondere kernhaltige Zellen, die weiterhin eine intakte Membranfunktion besitzen, behalten hingegen einen relativ großen Dichteunterschied zum umgebenden Medium bei und sedimentieren im Vergleich zu Erythrozytenhäutchen mit hohen Geschwindigkeiten. Am Boden der Kammer befindet sich optional das mit Mikrokavitäten strukturierte Trägersubstrat. Die effektive Detektionsfläche des Chips sowie die Abmessungen und damit auch die Gesamtanzahl der Kavitäten auf dem Trägersubstrat innerhalb dieser effektiven Fläche sind derart gewählt, dass eine Vereinzelung von Zellen auf dem Boden in einer Monolage gut erreichbar ist, sobald die intakten kernhaltigen Zellen in die Kavitäten sedimentiert sind und das Zellsediment bilden. Dem Beladen kann durch ein sanftes „Hin- und Herpumpen“ der Zellsuspension nachgeholfen werden, womit auch Zellen in die Kavitäten gebracht werden, die sich zuvor beispielsweise auf Stegen abgelagert haben. Idealerweise werden alle CTCs innerhalb der Kavitäten im Schritt 215 des Identifizierens problemlos identifiziert und von Leukozyten unterschieden. Weiterhin wird eine Scandauer für beispielsweise ein Mikroskop durch die effektive Detektionsfläche des Chips auf einen vorgegebenen Maximalwert beschränkt.

Im optionalen Schritt 230 des Waschens wird weiterhin ein sanfter Waschvorgang mit Waschpuffer durchgeführt. Der Waschvorgang ist derart auszulegen, dass eingefangene Zellen nicht aus den Mikrokavitäten gewirbelt werden. Dazu ist darauf zu achten, dass eine Flussgeschwindigkeit klein genug gewählt ist. Nichtsdestotrotz erfolgt der Waschvorgang schnell genug, um die Gesamtprozessdauer kurz zu halten. Weiterhin wird genügend optische Transparenz erreicht, um die fluoreszent angefärbten Zellen innerhalb der Mikrokavitäten, die auch als Wannen bezeichnet sind, beobachten und zuverlässig vom Hintergrund zu unterscheiden. Dadurch wird beispielsweise eine möglichst robuste Negativselektion sowie eine Reduktion einer Grenzflächenstreuung durch die homogene Verteilung des Hb erreicht. Somit wird eine Intensitätsschwächung beim Durchlaufen des Lichts durch die optische Barriere infolge von Streueffekten ebenfalls drastisch gesenkt und eventuell zurückbleibende Spuren des Lysats durch einen nicht idealen Waschvorgang sind hinnehmbar.

Fig. 3 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 200 gemäß einem Ausführungsbeispiel zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit eines Patienten. Das hier abgebildete Verfahren 200 entspricht dem in Fig. 2 beschriebenen Verfahren 200. Lediglich ist das Verfahren 200 gemäß diesem Ausführungsbeispiel in einem zeitlichen Verlauf dargestellt. Das bedeutet, dass der Schritt 205 des Bereitstellens gemäß diesem Ausführungsbeispiel nach dem Schritt 220 des Einbringens der Probenflüssigkeit durchgeführt wird, was auch als Vorbereitung bezeichnet ist. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird eine Dauer des Verfahrens 200 ab dem Schritt 205 des Bereitstellens gemessen. Laut des hier dargestellten Ablaufdiagramms erfolgt der Schritt 210 des Ausgebens, der auch als „Chip Loading“ bezeichnet werden kann, nach dem Ablauf der vorbestimmten Zeitdauer, die gemäß diesem Ausführungsbeispiel fünf Minuten beträgt. Weiterhin optional wird in das Trägersubstrat gemäß diesem Ausführungsbeispiel 50 pl Blutlysat in die flache Detektionskammer gepumpt (welche effektiv 10 pl Blut enthalten kann). Gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird der Schritt 230 des Waschens nach weiteren 10 Minuten durchgeführt, die als Mindestsedimentationszeit bezeichnet sind. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird der Schritt 215 des Identifizierens nach Ablauf von mindestens 20 Minuten nach Beginn der Zeitmessung durchgeführt.

Im Folgenden wird das Verfahren 200 unter Verwendung von lediglich beispielhaften Abmessungen und Eigenschaften beschrieben:

Für eine möglichst komfortable Handhabung und einen möglichst reproduzierbaren mikrofluidischen Probentransport wird ein zunächst „großzügiges“ Blutvolumen von beispielsweise > 500 mI in das Mikrofluidiksystem eingegeben. Dies ist beispielsweise, zusammen mit der Blutentnahme, der einzige manuell durchführbare Verarbeitungsschritt im gesamten Verfahren 200. Unmittelbar nach der Probeneingabe werden beispielsweise 100 mI des Bluts für die weitere Verarbeitung in die Mischkammer des Systems mit den Abmessungen ~ 13 mm x ~ 13 mm x ~ 10 mm überführt. Das mindestens für eine selektive Lyse notwendige Volumen des ACK-Puffers beträgt in diesem Fall beispielsweise 400 pl. Der „AII-in-One-Buffer“ enthält alle für die fluoreszente Detektion notwendigen Farben in den jeweiligen Arbeitskonzentrationen für die Tumorzell-Spezifität, Propidiumiodid (PI) für eine Lebend-Tot-Färbung und/oder ein für die Zellkernerkennung vorteilhaftes Färbemittel. Um einer Sedimentation und damit ungleichmäßigen Zellkonzentrationen entgegenzuwirken, wird die Zellsuspension bis zur vollständigen Lyse kontinuierlich durchmischt, wobei eine Mindestlysezeit ca. 5 min beträgt. Der notwendige hydrodynamische Druck ist dabei derart auszulegen, dass keine Beschädigung der Zellen induziert werden kann, beispielsweise durch Erzeugung einer reduzierten Scherkraft.

Im Anschluss werden beispielsweise 50 pl des gefärbten Lysats in die flache Detektionskammer mit gleichem Fassungsvermögen gepumpt. Das Volumen ist derart gewählt, dass nach der Sedimentation aller intakten kernhaltigen Zellen für eine finale Quantifizierung 10 mI Blut auf dem Kammerboden analysierbar sind. Die Dimensionen einer solchen beispielhaften Kammer lauten für eine effektive Detektionsfläche des Trägersubstrats 12,5 mm x 12,5 mm, sodass die Detektionsfläche annähernd 156 mm² aufweist. Eine Kammerhöhe liegt beispielsweise bei 320 pm. Betragen die Dichte und der Radius der leichtesten und kleinsten zu erwartenden kugelähnlichen CTC p_p=1070 kg/m³ und r= 3 pm zur Berechnung der kleinsten Sedimentationsgeschwindigkeit, so sind nach der Stokes ^'sehen Sedimentationsgleichung

in Blutlysat mit der Dichte p_f=1012 kg/m³ und Viskosität h=1,68 mPa-s (Daten aus Messungen) innerhalb einer solchen Kammer maximale Sedimentationszeiten von ca. 7 min 52 s zu erwarten. Dadurch ist der Schritt 210 des Ausgebens in < 10 min durchführbar. Beträgt der Durchmesser der größten zu erwartenden CTCs aus soliden Tumoren in einer Analyse 30 pm, dann sind beispielsweise Kavitäten mit 40 pm Durchmesser und 28 pm Tiefe vorteilhaft. Kavitäten sind beispielsweise in einer klassischen Matrix oder auch hexagonal dichtest gepackt als Kreise, Hexagone oder Quadrate anzuordnen. In allen Konfigurationen gilt es, für eine möglichst effiziente Beladung des Trägersubstrats die Grundfläche der Kavitäten relativ zur Gesamtfläche des Chips zu maximieren, also die Stege, die auch als Trennwände bezeichnet sind, zwischen benachbarten Kavitäten möglichst klein zu wählen, vorzugsweise < 10 pm, wie beispielsweise 3 pm.

Ein strukturierter Chip mit Mikrokavitäten umfasst beispielsweise Silizium, welches an den entsprechenden Stellen geätzt wurde. Zur Erzeugung von Kavitäten ist beispielsweise aber auch ein fotosensitiver Lack mit der passenden Dicke einsetzbar, der beispielsweise entweder als fertiger Dry- Resist auf ein geeignetes Substrat laminiert oder als Lack auf dieses aufgeschleudert und ausgehärtet und in einem letzten Verarbeitungsschritt fotolithographisch per Fotomaske und UV-Licht an den erwünschten Stellen geöffnet wurde. Alternativ sind die Kavitäten auch per Laser, wie beispielsweise mittels eines UKP-Lasers, aus einer Polymerfolie ausformbar, die in der passenden Dicke auf ein Substrat aufgebracht wurde.

Wird ein Chip mit der Detektionsfläche 12,5 mm x 12,5 mm mit Kavitäten eingesetzt, die als Hexagone und somit wabenförmig dichtest gepackt angeordnet sind und beträgt der Innendurchmesser solcher Kavitäten beispielsweise 40 pm und die Stegbreite 3 pm, so erhält man ein Trägersubstrat mit insgesamt ca. 97600 Kavitäten. 10 pl Blut enthält zwischen 40000 und 110000 Leukozyten, was einem Ziel-Blutäquivalent bei der finalen optischen Detektion im Schritt 215 des Identifizierens entspricht. Damit sind bei einer idealen Beladung durchschnittlich je Wanne zwischen 0,41 bis 1,13 Zellen zu erwarten, was einer relativ guten Vereinzelung entspricht. Idealerweise ist eine Zelle pro Wanne aufzufinden.

Der eingesetzte Waschpuffer ist dabei klar, das bedeutet optisch transparent, isoton und pH-neutral, um eine biologische Verträglichkeit mit den Zellen zu gewährleisten. Hierfür eignet sich beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), welche kostengünstig und problemlos langzeitstabil in Reagenzienriegeln der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelagert sein kann.

Soll das 50 pl große Kammervolumen für eine ausreichende optische Transparenz beispielsweise innerhalb von 5 Minuten sicherheitshalber 3 mal ausgetauscht, das bedeutet mit dem Waschpuffer ausgespült werden, ergibt sich ein im Durchschnitt konstant einzustellender Volumenstrom von beispielsweise 0,5 mI/s. Für eine Kammer mit einer Stirn- Eingangs- und Stirn-Ausgangsfläche von 12,5 mm x 320 pm ist damit eine mittlere Flussgeschwindigkeit von 125 pm/s verbunden. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird also die zuvor betrachtete Tumorzelle nicht aus einer Kavität mit 40 pm Breite, 28 pm Tiefe und 3 pm breiten Stegen herausgewirbelt, nachdem sie einmal vollständig auf den Boden sedimentiert ist. Ein solcher Waschvorgang ist damit also praktikabel.

Die Quantifizierung, das bedeutet der Schritt 215 des Identifizierens, erfolgt beispielsweise unter Verwendung eines Auflicht- Fluoreszenzmikroskops. Auch hier sind die für die Statistik relevanten Zellen, in Abgrenzung zu Leukozyten, lebende Tumorzellen mit Kern. Insgesamt wird der Schritt 215 des Identifizierens beispielsweise bereits nach etwa 20 min begonnen, was gegenüber einer manuellen Verarbeitung einer Zeitersparnis um einen Faktor ~ 3 entspricht.

Dabei würden (deutlich) kleinere Reagenzien- und Probenvolumina eingesetzt.

Alternativ ist vor Probeneingabe bzw. hier der Ausgabe entsprechend dem Schritt 210 eine selektive Erythrozyten -Lyse (RBC) denkbar, welche RBCs hydrodynamisch und biologisch betrachtet in eine für den Detektionsprozess günstige Form überführt. Die Steifheit und der effektive Zelldurchmesser von RBCs werden dabei deutlich reduziert und lysierte RBCs können die Expression von Antigenen nicht länger aufrechterhalten, wodurch eine Klumpenbildung vermieden wird.

Des Weiteren ist beispielsweise die Zelleigenschaft, welche für die Beseitigung von RBCs aus Leukozyten (WBC) und CTCs als Unterscheidungskriterium eingesetzt wird, die Zelldichte. Intakte RBCs weisen eine mittlere Dichte von ca. 1110 kg/m³ auf und sind damit etwas schwerer als kernhaltige Zellen (WBCs und CTCs) mit Dichten zwischen 1070 kg/m³ und 1090 kg/m³. Festzuhalten ist, dass in diesem Zustand beide Zellarten, das bedeutet kernlose RBCs sowie kernhaltige WBCs und CTCs, einen signifikanten Dichteunterschied zum umgebenden Medium besitzen, welches wasserähnlich ist. Das Medium weist in der Regel ~ 1000 kg/m³ auf. In der Folge sedimentieren beide Zellarten auch etwa gleich schnell zu Boden und eine Spezifität, welche für eine räumliche Trennung einsetzbar ist, ist noch nicht vorhanden. Sind die RBCs aber lysiert, weisen sie nur noch ca. 1 bis 3 % der Dichte eines intakten Erythrozyten auf, weshalb sie nach diffusivem Medienausgleich zwischen Zellinnerem und Zelläußerem während der Lyse in Suspension einen Dichteunterschied von nahezu Null annehmen. Dabei setzt sich der tatsächlich noch verbleibende Dichteunterschied effektiv nur noch durch die dünne Zellmembran zusammen. Während kernhaltige Zellen von der Lyse unbetroffen bleiben und ihren Dichteunterschied zum Medium beibehalten (Sedimentationsgeschwindigkeit konstant), besitzen RBCs daher eine Sedimentationsgeschwindigkeit von nahezu Null und schweben in Suspension. WBCs und CTCs sedimentieren durch diese schwebenden RBC-Häutchen hindurch bis an den Boden. Dieser Zustand ist nach einer ausreichend großen Sedimentationszeit und Sedimentationshöhe nun spezifisch genug, um ihn zumindest annähernd isolationsfrei nennen zu dürfen, denn auch die kleinsten WBCs und CTCs können somit verlustfrei auf einer Detektionsfläche ausgelegt werden. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist daher eine einfache Prozess-Standardisierung unter Einsatz von minimalen Probenvolumina und Systemdimensionen möglich.

Fig. 4 zeigt ein schematisches Ausführungsbeispiel eines Querschnitts einer Detektionskammer 120 einer mikrofluidischen Vorrichtung. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel sind ein Trägersubstrat 115 und ein Lysat 400 in der Detektionskammer 120 angeordnet, wie sie beispielsweise in Fig. 1 beschrieben wurde. Dabei weist das Lysat 400 ein fluoreszierendes Färbemittel zum Erkennen und/oder Identifizieren von kernhaltigen Zellen 402 auf. Das bedeutet, dass beispielsweise anhand des gewählten Färbemittels eine Zellenart der kernhaltigen Zellen 402 erkennbar ist, beispielsweise Tumorzellen 403, da sie die in dem Färbemittel enthaltene Farbe besser aufnehmen als andere kernhaltige Zellen 402, beispielsweise Leukozyten 404.

Die Detektionskammer 120 weist eine Höhe 405 von beispielsweise 320 pm auf in der das Lysat 400 angeordnet ist. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist also ein Zustand dargestellt, welcher durch den Schritt des Ausgebens erreicht wird, wie er beispielsweise in einer der Figuren 2 oder 3 beschrieben wurde. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel weist das Trägersubstrat 115 die Mehrzahl von Mikrokavitäten 135 auf, die gemäß diesem Ausführungsbeispiel gleichmäßig verteilt auf dem Trägersubstrat 115 angeordnet sind. Die Mikrokavitäten 135 sind dabei durch Trennwände 410 von benachbarten Mikrokavitäten 135 getrennt. Die Mikrokavitäten 135 sind dabei als Teil des Trägersubstrats 115 ausgeformt. Sie weisen dabei eine Tiefe 415 von beispielsweise 28 pm auf und sind dabei ausgebildet, um nach Ablauf einer Sedimentationszeit die kernhaltigen Zellen 402 als Zellsediment aufzunehmen, wie es in der nachfolgenden Fig. dargestellt ist.

Fig. 5 zeigt ein schematisches Ausführungsbeispiel eines Querschnitts einer Detektionskammer 120 einer mikrofluidischen Vorrichtung. Das hier dargestellte Trägersubstrat 115 entspricht beispielsweise dem in Fig. 4 beschriebenen Trägersubstrat 115. Lediglich abweichend wird in Fig. 5 ein Zustand innerhalb der Detektionskammer 120 gezeigt, der gemäß diesem Ausführungsbeispiel im Schritt des Ausgebens nach der Mindestsedimentationszeit erreicht wird. Das bedeutet, dass sich gemäß diesem Ausführungsbeispiel die kernhaltigen Zellen 402 inklusive Tumorzellen 403 aufgrund ihres Dichteunterschieds in einer Zellsuspension 500 sinken und als Zellsediment 505 in den Mikrokavitäten 135 ablagern.

Fig. 6 zeigt eine Auswerteeinrichtung 600 gemäß einem Ausführungsbeispiel und eine mikrofluidische Vorrichtung 100. Die Auswerteeinrichtung 600 ist ausgebildet, um ein Zellsediment in der mikrofluidischen Vorrichtung 100 auszuwerten. Die hier dargestellte mikrofluidische Vorrichtung 100 entspricht beispielsweise der in Fig. 1 beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtung 100.

Die Auswerteeinrichtung 600 weist eine Mischeinrichtung 605 zum Mischen der Probenflüssigkeit mit dem Lysepuffer in der Mischkammer auf, wie sie beispielsweise in Fig. 1 beschrieben wurde, um ein Lysat zu erhalten. Weiterhin weist die Auswerteeinrichtung 600 eine Identifiziereinheit 610 auf, die ausgebildet ist, um die kernhaltigen Zellen aus dem Zellsediment zu identifizieren. Weiterhin weist die Auswerteeinrichtung 600 gemäß diesem Ausführungsbeispiel eine Steuereinheit 615 auf, die ausgebildet ist, um die Schritte eines Verfahrens zum Erkennen von kernhaltigen Zellen in einer Probenflüssigkeit eines Patienten anzusteuern und/oder auszuführen, wie es in einer der Figuren 2 oder 3 beschrieben wurde. Die Mischeinrichtung 605 ist dabei beispielsweise als eine Pumpeinrichtung ausgeformt, die ausgebildet ist, um die Probenflüssigkeit mit dem Lysepuffer zu mischen. Die Identifiziereinheit 610 ist beispielsweise als eine Mikroskopiereinheit ausgeformt, welche beispielsweise eine Lichtquelle umfasst. Dadurch wird das Lysat vorteilhafterweise quantifiziert, nachdem es auf das Trägersubstrat 115 gebracht wurde. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägersubstrat 115 viereckig, genauer gesagt quadratisch ausgeformt, sodass eine Breite 620 und eine Länge 625 des Trägersubstrats 115 gleiche Maße aufweisen. Eine Tiefe 630 des Trägersubstrats 115 ist dabei kleiner als die Länge 625 und/oder die Breite 620. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägersubstrat 115 in einem Vergrößerungsabschnitt 635 vergrößert dargestellt, sodass die Mehrzahl von Mikrokavitäten 135 verdeutlicht ist.

Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist die Steuereinheit 615 ausgebildet, um ein Mischsignal 640 an eine Schnittstelle zu der Mischeinrichtung 605 bereitzustellen. Das Mischsignal 640 bewirkt das Mischen der Probenflüssigkeit mit dem Lysepuffer in der Mischkammer der mikrofluidischen Vorrichtung 100, um das Lysat zu erhalten. Weiterhin ist die Steuereinheit 615 gemäß diesem Ausführungsbeispiel ausgebildet, um ein Aufbringsignal 645 auszugeben, beispielsweise an eine Schnittstelle zu einer vorrichtungsexternen Aufbringeinheit 650, um ein Aufbringen des Lysats auf das Trägersubstrat 115 der mikrofluidischen Vorrichtung 100 zu bewirken, um das Zellsediment und eine Zellsuspension des Lysats zu erhalten, beispielsweise nach Ablauf einer Mindestsedimentationszeit. Weiterhin ist die Steuereinheit 615 ausgebildet, um die kernhaltigen Zellen aus dem Zellsediment beispielsweise unter Verwendung eines Identifiziersignals 655 und der Identifiziereinheit 610 zu identifizieren.

Fig. 7 zeigt ein schematisches Ausführungsbeispiel eines Querschnitts einer Detektionskammer 120 einer mikrofluidischen Vorrichtung. Die hier dargestellte Detektionskammer 120 entspricht beispielsweise der in einer der Fig. 1, 4 oder 5 beschriebenen Detektionskammer 120. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist eine Momentaufnahme während des optionalen Schrittes des Waschens dargestellt. Das bedeutet, dass gemäß diesem Ausführungsbeispiel ein Waschpuffer 700 in die Detektionskammer 120 eingebracht wird, welcher eine Strömung 705 zum Waschen der Zellsuspension 500 aufweist. Die Mikrokavitäten 135 und ihre Trennwände 410 verhindern dabei ein Wegspülen des Zellsediments 505. Fig. 8 zeigt ein schematisches Ausführungsbeispiel eines Querschnitts einer Detektionskammer 120 einer mikrofluidischen Vorrichtung. Die hier dargestellte Detektionskammer 120 entspricht beispielsweise der in Fig. 7 beschriebenen Detektionskammer 120. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist anders ausgedrückt eine Momentaufnahme des Schrittes des Identifizierens abgebildet. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist die in Fig. 7 dargestellte Waschphase des Lysats 400 abgeschlossen. Die hier dargestellte Lichtquelle 800 repräsentiert dabei die in Fig. 6 beschriebene Identifiziereinrichtung, die ausgebildet ist, um das Zellsediment 505 zu erkennen und/oder zu quantifizieren. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist weiterhin eine weitere Vergrößerungsdarstellung 805 der Mehrzahl der Mikrokavitäten 135 dargestellt. Dabei sind die Mikrokavitäten 135 aus der Draufsicht abgebildet. Die Mikrokavitäten 135 sind weiterhin gemäß diesem Ausführungsbeispiel rund ausgeformt und weisen einen Abstand 810 zueinander auf, der kleiner ist als ein Durchmesser 815 einer Mikrokavität 135. Der Abstand 810 entspricht dabei einer Dicke zumindest einer der Trennwände 410. Die im Zellsediment 505 vorhandenen kernhaltigen Zellen 402 sind dabei lediglich optional unterschiedlich gefärbt, wodurch die Zellart erkennbar ist.

Fig. 9 zeigt eine schematische Darstellung eines Strömungsverlaufs 900 einer Flüssigkeit für eine mikrofluidische Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel. Der Strömungsverlauf 900 tritt dabei beispielsweise in einer mikrofluidischen Vorrichtung auf, die eine Mehrzahl von Mikrokavitäten aufweist, wie sie in einer der Figuren 1 oder 4 bis 8 beschrieben wurde. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist ein Kavitätenabschnitt 905 und ein Kammerabschnitt 910 der Detektionskammer dargestellt. Die Flüssigkeit strömt dabei gemäß diesem Ausführungsbeispiel im Kammerabschnitt 910 linear, während sie im Kavitätenabschnitt 905 verwirbelt wird. Der Kavitätenabschnitt 905 repräsentiert dabei ein Strömungsverhalten innerhalb einer Mikrokavität, die von Trennwänden umgeben ist. Dadurch wird verhindert, dass das Zellsediment von der Strömung mitgerissen und/oder beschädigt wird.

In anderen Worten ausgedrückt besteht keine Gefahr des Zellverlusts beim Spülen zur Beseitigung des Blutlysats, welches als „optische Barriere“ die CTC- Detektion stört, wenn sich die Zelle auf dem Boden der Kavität befindet. Innerhalb einer Kavität herrschen, im Vergleich zum Bereich oberhalb des Kammerbodens, stark reduzierte Strömungsgeschwindigkeiten. Befindet sich eine Zelle also auf dem Boden einer Kavität, so erfährt diese auch nur stark reduzierte Stokes-Kräfte und wird nicht weggespült.

Umfasst ein Ausführungsbeispiel eine „und/oder“-Verknüpfung zwischen einem ersten Merkmal und einem zweiten Merkmal, so ist dies so zu lesen, dass das Ausführungsbeispiel gemäß einer Ausführungsform sowohl das erste Merkmal als auch das zweite Merkmal und gemäß einer weiteren Ausführungsform entweder nur das erste Merkmal oder nur das zweite Merkmal aufweist.

Claims

Ansprüche

1. Verfahren (200) zum Erkennen von kernhaltigen Zellen (402) in einer Probenflüssigkeit (105) eines Patienten unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), wobei das Verfahren (200) die folgenden Schritte umfasst:

Bereitstellen (205) eines Mischsignals (640) an eine Schnittstelle zu einer Mischeinrichtung (605), wobei das Mischsignal (640) ein Mischen der Probenflüssigkeit (105) mit einem Lysepuffer in einer Mischkammer (110) der mikrofluidischen Vorrichtung (100) bewirkt, um ein Lysat (400) zu erhalten;

Ausgeben (210) eines Aufbringsignals (645), das ein Aufbringen des Lysats (400) auf ein Trägersubstrat (115) der mikrofluidischen Vorrichtung (100) bewirkt, um ein Zellsediment (505) und eine Zellsuspension (500) des Lysats (400) zu erhalten; und Identifizieren (215) der kernhaltigen Zellen (402) aus dem Zellsediment (505).

2. Verfahren (200) gemäß Anspruch 1, mit einem Schritt (230) des Waschens des Lysats (400) vor dem Schritt (215) des Identifizierens unter Verwendung eines Waschpuffers (700), um eine optische Transparenz des Lysats (400) zu bewirken, insbesondere wobei im Schritt (230) des Waschens das Lysat (400) unter Verwendung des Waschpuffers (700) gewaschen wird, der isoton und/oder pH-neutral ausgeformt ist.

3. Verfahren (200) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei im Schritt (205) des Bereitstellens das Mischsignal (640) bereitgestellt wird, das ein Mischen einer von einer Menge der Probenflüssigkeit (105) abhängigen Menge des Lysepuffers bewirkt.

4. Verfahren (200) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei im Schritt (215) des Identifizierens die kernhaltigen Zellen (402) aus dem Zellsediment (505) optisch detektiert und/oder quantifiziert werden.

5. Verfahren (200) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei im Schritt (205) des Bereitstellens das Mischsignal (640) bereitgestellt wird, um die Probenflüssigkeit (105) mit dem Lysepuffer zu vermischen, wobei der Lysepuffer ein fluoreszierendes Färbemittel zum Bestimmen einer Zellenart der kernhaltigen Zellen (402) aufweist, insbesondere wobei ein Schritt (225) des Zuführens des fluoreszierenden Färbemittels in den Lysepuffer vor dem Schritt (205) des Bereitstellens vorgesehen ist.

6. Verfahren (200) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, mit einem Schritt (220) des Einbringens der Probenflüssigkeit (105) in die mikrofluidische Vorrichtung (100).

7. Verfahren zum Erkennen von kernhaltigen Zellen (402) in einer Probenflüssigkeit (105) eines Patienten unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Mischen der Probenflüssigkeit (105) mit einem Lysepuffer in einer Mischkammer (110) der mikrofluidischen Vorrichtung (100), um ein Lysat (400) zu erhalten;

Aufbringen des Lysats (400) auf ein Trägersubstrat (115) der mikrofluidischen Vorrichtung (100), um ein Zellsediment (505) und eine Zellsuspension (500) des Lysats (400) zu erhalten; und Identifizieren der kernhaltigen Zellen (402) aus dem Zellsediment (505).

8. Steuergerät, das eingerichtet ist, um die Schritte eines Verfahrens gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche in entsprechenden Einheiten auszuführen und/oder anzusteuern.

9. Mikrofluidische Vorrichtung (100) zum Erkennen von kernhaltigen Zellen (402) in einer Probenflüssigkeit (105) eines Patienten, insbesondere wobei die mikrofluidische Vorrichtung (100) als eine Lab-on-Chip- Kartusche ausgeformt ist, wobei die mikrofluidische Vorrichtung (100) die folgenden Merkmale aufweist: eine Mischkammer (110) zum Aufnehmen der Probenflüssigkeit (105) und eines Lysepuffers, um ein Lysat (400) zu erhalten; ein Trägersubstrat (115) zum Aufnehmen des Lysats (400), um ein Zellsediment (505) und eine Zellsuspension (500) des Lysats (400) zu erhalten; und eine Detektionskammer (120), wobei das Trägersubstrat (115) in der Detektionskammer (120) angeordnet und/oder anordenbar ist.

10. Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß Anspruch 9, wobei die Detektionskammer (120) eine Höhe (405) aufweist, die geringer ist als eine Breite und eine Länge der Detektionskammer (120).

11. Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10, wobei das Trägersubstrat (115) eine Mehrzahl von Mikrokavitäten (135) aufweist.

12. Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die mikrofluidische Vorrichtung (100) eine Pufferlagerkammer (140) aufweist, die ausgebildet ist, um den Lysepuffer zu lagern und in die Mischkammer (110) abzugeben.

13. Auswerteeinrichtung (600) zur Auswertung eines Zellsediments (505) in einer mikrofluidischen Vorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Auswerteeinrichtung (600) die folgenden Merkmale aufweist: eine Mischeinrichtung (605) zum Mischen der Probenflüssigkeit (105) mit dem Lysepuffer in der Mischkammer (110), um ein Lysat (400) zu erhalten; eine Identifiziereinheit (610), die ausgebildet ist, um die kernhaltigen Zellen (402) aus dem Zellsediment (505) zu identifizieren.

14. Computerprogramm, das dazu eingerichtet ist, die Schritte (205, 210, 215) des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 auszuführen und/oder anzusteuern.

15. Maschinenlesbares Speichermedium, auf dem das Computerprogramm nach Anspruch 14 gespeichert ist.