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Die vorliegende Erfindung wurde mit
staatlicher Unterstützung
im Rahmen des von der U.S. Army vergebenen militärischen Forschungsvertrages DAMD17-94-J-4460 gemacht. Die
Regierung besitzt gewisse Rechte an dieser Erfindung.
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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
allgemein Mikrosensoren und Methoden für die Analyse der Anwesenheit
und der Konzentration von kleinen Teilchen in Strömen, die
die kleinen Teilchen und größere Teilchen
enthalten, nach dem Diffusionsprinzip. Die Erfindung dient beispielsweise
der Blutanalyse zum Detektieren des Vorliegens von kleinen Teilchen,
wie zum Beispiel Wasserstoff-, Natrium- oder Calciumionen, in einem
Zellen enthaltenden Strom.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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In Maxwells berühmten Gedankenversuch betätigt ein
Dämon eine
Tür zwischen
zwei Gaskästen
gleicher Temperatur. Der Dämon
sortiert die Moleküle
und sammelt die schnelleren Moleküle in dem einen Kasten und
die langsameren Moleküle
in dem anderen Kasten, wobei er gegen die Grundgesetze der Thermodynamik
verstößt. Dieses
Paradoxon ist seither auf zahlreiche verschiedene Arten gelöst worden.
Leff, H. S. und Rex, A. F. (1990) "Resource letter md-1: Maxwell's demon", Am. J. Physics
58: 201–209.
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Eine ähnliche Anordnung kann verwendet werden,
um Teilchen zu trennen. Man stelle sich ein Gemisch aus Teilchen
zweier verschiedener Größen vor,
die in einem Kasten in Wasser und in dem anderen Kasten in reinem
Wasser suspendiert sind. Wenn der Dämon die Tür zwischen den Kästen schnell
genug öffnet
und schließt,
so dass keines der größeren Teilchen
Zeit hat, durch die Tür
hindurch zu diffundieren, wenn er sie jedoch lange genug öffnet und schließt, so dass
einige der kleineren Teilchen genug Zeit haben, in den anderen Kasten
zu diffundieren, wird eine gewisse Trennung erreicht werden.
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Vor kurzem wurden zwei Versuche durchgeführt, wobei
ein räumlich
asymmetrisches Potential bei Anwesenheit einer Anzahl Brownscher
Teilchen angelegt wurde. Faucheux, L. S. et al. (1995) „Optical thermal
ratchet", Physical
Rev. Letters 74: 1504–1507;
Rousselet, J. et al. (1994) "Directional motion
of Brownian particles induced by a periodic asymmetric potential", Nature 370: 446–448.
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Es wurde nachgewiesen, dass dies
zu einer gerichteten Bewegung der Teilchen führt, wobei die Geschwindigkeit
von dem Diffusionskoeffizienten abhängig ist. Ein Versuch (Rousselet,
J. et al. (1994) "Directional
motion of brownian particles induced by a periodic asymmetric potential", Nature 370: 446–448) verwendete
mikrohergestellte Elektroden auf einem Objektträger zum Anlegen eines elektrischen
Feldes für
das Potential. Dieser Gedanke ist auch das Thema der Europäischen Patentschrift 645169
vom 29. März
1995 für "Separation of particles
in a fluid using a saw-tooth electrode and an intermittent excitation
field", Adjari A.
et al. Der andere Versuch (Faucheux L. S. et al. (1995) "Optical thermal ratchet", Physical Rev. Letters
74: 1504–1507) verwendete
eine modulierte optische Pinzetten-Versuchsanordnung.
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Diffusion ist ein Prozess, der auf
großtechnischer
Ebene ohne weiteres vernachlässigt
werden kann, der jedoch im Mikromaßstab durchaus zu einem wichtigen
Faktor wird. Die durchschnittliche Zeit t, in der ein Molekül über eine
Entfernung d diffundiert, beträgt
t = d2/D, wobei D der Diffusionskoeffizient
des Moleküls
ist. Für
ein Protein oder ein anderes großes Molekül ist die Diffusion im Makromaßstab relativ
langsam (z. B. Hämoglobin
bei D gleich 7 x 10–7 cm2/s
in Wasser bei Raumtemperatur benötigt
etwa 106 Sekunden (zehn Tage), um durch
ein Ein-Zentimeter-Rohr zu diffundieren, jedoch etwa eine Sekunde,
um durch einen Kanal von zehn Mikrometer zu diffundieren).
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Unter Verwendung von von der Halbleiterindustrie
zur Miniaturisierung der Elektronik entwickelten Werkzeugen ist
es möglich,
komplizierte Fluidsysteme mit Kanalgrößen von lediglich einem Mikrometer
herzustellen. Diese Vorrichtungen können kostengünstig massengefertigt
werden und sollen schon bald für
einfache Analyseversuche verbreiteten Einsatz finden.
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Ein als Feldflussfraktionierung
(FFF) bezeichneter Prozess wurde verwendet, um Komponenten eines
einzelnen Eingangsstromes in ein nicht auf Mikromaßstabsebene
hergestelltes System, das jedoch Kanäle hat, die klein genug sind,
um eine Laminarströmung
zu erzeugen, zu trennen und zu analysieren. Verschiedene Felder,
einschließlich
von Konzentrationsgefällen,
werden verwendet, um eine Kraft senkrecht zu der Strömungsrichtung
zu erzeugen, um eine Trennung von Teilchen in dem Eingangsstrom
zu bewirken. Siehe zum Beispiel Giddings, J. C., US-Patent 3,449,938,
17. Juni 1969 "Method
for Separating and Detecting Fluid Materials"; Giddings, J. C., US-Patent 4,147,621,
3. April 1979, "Method
and Apparatus for Flow Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C., US-Patent 4,214,981,
29. Juli 1980 "Steric
Field-Flow Fractionaton";
Giddings, J. C. et al., US-Patent 4,250,026, 10. Februar 1981 "Continuous Steric
FFF Device for The Size Separation of Particles"; Giddings, J. C. et al. (1983) "Outlet Stream Splitting
for Sample Concentration in Field-Flow Fractionation", Separation Science
and Technology 18: 293–306;
Giddings, J. C., (1985) "Optimized
Field-Flow Fractionation System Based on Dual Stream Splitters", Anal. Chem. 57:
945–947; Giddings,
J. C., US-Patent 4,830,756, 16. Mai 1989, "High Speed Separation of Ultra-High
Molecular Weight Polymers by Hyperlayer Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C.,
US-Patent 4,141,651, 25. August 1992, "Pinched Channel Inlet System for Reduced
Relaxation Effects and Stopless Flow Injection in Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C.,
US-Patent 5,156,039, 20. Oktober 1992, "Procedure for Determining the Size and
Size Distribution of Particles Using Sedimentation Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C.,
US-Patent 5,193,688, 16. März
1993, "Method and
Apparatus for Hydrodynamic Relaxation and Sample Concentration in
Field-Flow Fractionation Using Permeable Wall Elements"; Caldwell, K. D. et
al., US-Patent 5,240,618, 31. August 1993, "Electrical Field-Flow Fractionation
Using Redox Couple Added to Carrier Fluid"; Giddings, J. C., (1993), "Field-Flow Fractionation:
Analysis of Macromolecular, Colloidal and Particulate Materials", Science 260: 1456–1465; Wada,
Y. et al., US-Patent 5,465,849, 14. November 1995, "Column and Method
for Separating Particles in Accordance with their Magnetic Susceptibility". Keine der genannten
Literaturstellen beschreibt die Verwendung eines separaten Eingangsstromes,
um von einem Teilchen enthaltenden Eingangsstrom diffundierte Teilchen
zu erhalten.
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Eine verwandte Methode der Teilchenfraktionierung
ist der "Split Flow
Thin Cell" (SPLITT)
genannte Prozess. Siehe z. B. Williams, P. S. et al. (1992), "Con tinuous SPLITT
Fractionation Based on a Diffusion Mechanism", Ind. Eng. Chem. Res. 31: 2172–2181; und
J. C. Giddings, US-Patent 5,039,426. Diese Veröffentlichungen beschreiben Kanalzellen
mit Kanälen,
die ausreichend klein sind, um eine Laminarströmung zu erzeugen, haben jedoch
auch wieder nur einen Eingangsstrom. Ein weiteres J. C. Giddings
erteiltes Patent, das US-Patent Nr. 4,737,268, beschreibt eine SPLITT-Strömungszelle
mit zwei Eingangsströmen
(3); der zweite Eingangsstrom
ist jedoch kein Indikatorstrom, sondern vielmehr ein teilchenfreier
Strom. Das US-Patent 4,894,146 von Giddings beschreibt weiterhin eine
SPLITT-Strömungszelle
mit zwei Eingangsströmen,
jedoch ohne Indikatorstrom. Alle genannten SPLITT-Strömungsmethoden
erfordern die Anwesenheit von mehr als einem Ausgangsstrom zum Trennen
der verschiedenen Teilchenfraktionen.
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Die deutsche Patentanmeldung DE-A-4411266
beschreibt ein Analysenverfahren und ein Analysengerät zur Umsetzung
des Verfahrens, wobei mehrere Proben nacheinander durch einen Reaktionskanal
zu einem Detektor durchgeleitet werden. Wenigstens ein Reagens wird
zwecks Reaktion mit den Proben in den Reaktionskanal eingeleitet.
Jede Probe und die zugehörigen
Reagenzien werden kontrolliert in den Reaktionskanal eingeleitet, so
dass sie einen Block bilden. Entlang der Länge dieses Blockes ist das örtliche
Mengenverhältnis
zwischen Probe und Reagens, über
ein Segment einer vorbestimmten Länge Bemittelt, im Wesentlichen konstant.
Die Vorrichtung ist so ausgelegt, dass die Diffusion zwischen den
beiden oder mehr Strömen von
Proben und Reagenzien maximiert wird, während die Diffusion zwischen
den Probenblöcken
minimiert wird. Detektion erfolgt, wenn das Gleichgewicht zwischen
Probe und Reagens erreicht wird, und im Ergebnis dessen wird der
Detektor in einem Bereich über
dem Kanal platziert, wo das Mischen abgeschlossen ist. Messstörung von
größeren Teilchen wird
eliminiert, indem ein Membransystem verwendet wird, das nur die
zu analysierenden Teilchen einer zu analysierenden Substanz in den
Analysenkanal eintreten lässt.
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Keine der vorgenannten Veröffentlichungen beschreibt
ein Kanalsystem, das in der Lage ist, kleine Teilchen in sehr geringen
Probenmengen, die größere Teilchen
enthalten, insbesondere größere Teilchen,
die den für
die Analyse verwendeten Indikator stören können, zu analysieren. Es werden
keine Vorrichtungen oder Verfahren unter Verwendung von Indikatorströmen innerhalb
des Zellensystems beschrieben.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Mikrofluid-Vorrichtungen ermöglichen
die Nutzung der Vorteile von Diffusion als raschem Trennmechanismus.
Das Strömungsverhalten
in Mikrostrukturen unterscheidet sich wesentlich von dem in der
makroskopischen Welt. Aufgrund äußerst geringer
Trägheitskräfte in solchen
Strukturen ist praktisch die gesamte Strömung in Mikrostrukturen laminar.
Dies ermöglicht
die Bewegung von unterschiedlichen Schichten von Fluid und Teilchen
nebeneinander in einem Kanal ohne Vermischung mit Ausnahme von Diffusion.
Aufgrund des geringen seitlichen Abstandes in solchen Kanälen ist
die Diffusion andererseits ein wirksames Mittel zur Trennung von
Molekülen
und kleinen Teilchen entsprechend ihrem Diffusionskoeffizienten,
der seinerseits wiederum von ihrer Größe abhängig ist.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Kanalzellensystem zum Detektieren der Anwesenheit von Teilchen
einer zu analysierenden Substanz in einem Probenstrom bereit, der
wie in Anspruch 1 definiert auch größere Teilchen beinhaltet.
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In dem einfachsten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung werden ein einzelner Indikatorstrom und
ein einzelner Probenstrom verwendet. Die Verfahren und die Vorrichtungen
der vorliegenden Erfindung können
jedoch ebenso mehrfache Proben- und/oder Indikatorströme verwenden,
ebenso wie Bezugs- oder Eichströme,
die jeweils in einer Laminarströmung
miteinander stehen.
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Die bevorzugten Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung verwenden Flüssigkeitsströme, wenngleich
die Verfahren und Vorrichtungen ebenso zur Anwendung mit gasförmigen Strömen geeignet
sind. Der Ausdruck "Fluidverbindung" bedeutet, dass Fluid
zwischen den zwei oder mehr Elementen strömt, die in einer Fluidverbindung
miteinander stehen.
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Der Ausdruck "Detektion" bei Verwendung in dieser Schrift bedeutet
die Bestimmung, dass eine bestimmte Substanz anwesend ist. Üblicherweise wird
die Konzentration einer bestimmten Substanz bestimmt. Die Verfahren
und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können genutzt werden, um die Konzentration
einer Substanz in einem Probenstrom zu bestimmen.
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Das Kanalzellensystem der vorliegenden Erfindung
kann ein externes Detektionsmittel zum Detektieren von Änderungen
in einer Indikatorsubstanz beinhalten, die in einem Indikatorstrom
als Ergebnis von Kontakt mit Teilchen einer zu analysierenden Substanz
geführt
wird. Detektion und Analyse erfolgen mittels beliebiger nach dem
Stand der Technik bekannter Mittel, einschließlich optischer Mittel, wie zum
Beispiel optischer Spektroskopie, und anderer Mittel, wie zum Beispiel
Absorptionsspektroskopie oder Fluoreszenz, mittels chemischer Indikatoren, die
die Farbe oder andere Eigenschaften verändern, wenn sie der zu analysierenden
Substanz ausgesetzt werden, mittels immunologischer Mittel, elektrischer Mittel,
wie zum Beispiel in die Vorrichtung eingesetzter Elektroden, elektrochemischer
Mittel, radioaktiver Mittel bzw. mittels praktisch beliebiger nach
dem Stand der Technik bekannter mikroanalytischer Verfahren, einschließlich von
magnetischen Resonanzverfahren oder anderen nach dem Stand der Technik bekannter
Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit einer zu analysierenden
Substanz, wie zum Beispiel Ionen, Moleküle, Polymere, Viren, DNA-Sequenz,
Antigene, Mikroorganismen oder sonstige Faktoren. Vorzugsweise werden
optische oder fluoreszierende Mittel und Antikörper, DNA-Sequenzen und ähnliches,
angebracht an fluoreszierenden Markierern, eingesetzt.
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Der Ausdruck "Teilchen" bezieht sich auf beliebige suspendierte
Partikel, einschließlich
von Molekülen,
Zellen, suspendierten und aufgelösten
Teilchen, Ionen und Atomen.
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Der Eingangsstrom kann ein beliebiger Strom
sein, der Teilchen der gleichen oder unterschiedlicher Größe enthält, wie
zum Beispiel Blut und andere Körperflüssigkeiten,
verunreinigtes Trinkwasser, verunreinigte organische Lösungsmittel,
Urin, biotechnologische Prozessproben, wie zum Beispiel Fermentationsbrühe und ähnliches.
Die zu analysierende Substanz kann ein beliebiges kleineres Teilchen
in dem Eingangsstrom sein, das in der Lage ist, in den Indikatorstrom
der Vorrichtung hinein zu diffundieren, wie zum Beispiel Wasserstoff-,
Calcium- oder Natriumionen, Proteine, wie zum Beispiel Albumin, organische
Moleküle,
Arzneimittel, Pestizide und andere Teilchen. Wenn der Probenstrom
in dem bevorzugten Ausführungsbeispiel
Vollblut ist, diffundieren kleine Ionen, wie zum Beispiel Wasserstoff
oder Natrium, rasch durch den Kanal, während größere Teilchen, wie zum Beispiel
die großer
Proteine, Blutzellen etc., langsam diffundieren. Vorzugsweise sind
die Teilchen einer zu analysierenden Substanz nicht größer als
etwa drei Mikrometer, insbesondere vorzugsweise nicht größer als
etwa 0,5 Mikrometer, bzw. sie sind nicht größer als etwa 1.000.000 MW,
insbesondere vorzugsweise nicht größer als etwa 50.000 MW.
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Das System kann ebenso einen Indikatorstrom
beinhalten, der in eines der Eingangsmittel eingeleitet wird, die
einen Flüssigkeitsträger umfassen, der
Teilchen einer zu analysierenden Substanz enthält, wie zum Beispiel Polymere
oder Kügelchen
mit einer darauf immobilisierten Indikatorsubstanz. Das System kann
weiterhin einen Strom einer zu analysierenden Substanz enthalten,
der aus Substratteilchen besteht, wie zum Beispiel Polymerkügelchen, Antikörper und ähnliches,
auf dem eine Indikatorsubstanz immobilisiert ist. Der Flüssigkeitsträger kann ein
beliebiges Fluid sein, das in der Lage ist, Teilchen anzunehmen,
die von dem Speisestrom diffundieren und eine Indikatorsubstanz
enthalten. Bevorzugte Indikatorströme sind unter anderem Wasser
und isotonische Lösungen,
wie zum Beispiel Salzwasser mit einer Salzkonzentration von etwa
10 mM NaCl, KCl oder MgCl, oder organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel
Aceton, Isopropylalkohol, Ethylalkohol oder beliebige andere Flüssigkeiten,
die nicht die Wirkung der zu analysierenden Substanz an der Indikatorsubstanz
oder dem Detektionsmittel stören.
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Die Kanalzelle kann durch nach dem
Stand der Technik bekannte Mikrofertigungsverfahren hergestellt
werden, zum Beispiel durch ein hierin beispielhaft genanntes Verfahren
der Ausbildung von Kanälen
in einem Silizium-Mikrochip, wie beispielsweise durch das Ätzen von
Rillen in die Oberfläche des
Silizium-Mikrochips und das Platzieren einer Glasabdeckung auf der
Oberfläche.
Präzisionsspritzgießen kann
ebenfalls für
die Fertigung eingesetzt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren
soll so ausgeführt
werden, dass die gesamte Strömung
laminar ist. Normalerweise wird dies in einer Vorrichtung erreicht,
die Mikrokanäle
einer solchen Größe umfasst,
dass die Reynoldssche Zahl für
Strömung
in dem Kanal unter etwa 1 liegt, vorzugsweise unter etwa 0,1. Die
Reynoldssche Zahl ist das Verhältnis von
Trägheit
zu Viskosität.
Eine niedrige Reynoldssche Zahl bedeutet, dass Trägheit im
Wesentlichen vernachlässigbar
ist und dass die Strömung
der beiden benachbarten Ströme
laminar ist, d. h. die Ströme
vermischen sich nicht zur Diffusion von Teilchen wie oben beschrieben.
Strömung
kann mit einer Reynoldsschen Zahl von größer 1 laminar sein. Jedoch entwickeln
solche Systeme rasch Turbulenz, wenn das Strömungsbild gestört wird,
zum Beispiel wenn sich die Strömungsgeschwindigkeit
eines Stromes ändert
oder wenn sich die Viskosität
eines Stromes ändert.
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Der Laminarströmungskanal ist lang genug, um
kleinen Teilchen einer zu analysierenden Substanz zu ermöglichen,
von dem Probenstrom zu diffundieren und eine detektierbare Wirkung
auf eine Indikatorsubstanz oder ein Detektionsmittel zu haben, vorzugsweise
wenigstens etwa 2 mm lang. Die Länge
des Strömungskanals
ist von seiner Geometrie abhängig.
Der Strömungskanal
kann gerade oder beliebig gekrümmt
sein. In einem Ausführungsbeispiel kann
der Strömungskanal
eine oder mehrere "Haarnadelkurven" beinhalten, wodurch
sich eine enge Treppenstufengeometrie ergibt. In einem anderen Ausführungsbeispiel
kann der Strömungskanal
die Form einer Spule aufweisen, wie bei einem sauber aufgewickelten
Gartenschlauch. Nichtgerade Kanalgeometrien ermöglichen eine Erhöhung der
Länge des
Strömungskanals,
ohne die Größe/den Durchmesser
der Substratplatte, in der der Kanal ausgebildet ist, wie z. B.
ein Silizium-Mikrochip, zu erhöhen. Der
Diffusionskoeffizient der zu analysierenden Substanz, der üblicherweise
umgekehrt proportional zu der Größe der zu
analysierenden Substanz ist, beeinflusst die gewünschte Länge des Strömungskanals. Für eine gegebene
Strömungsgeschwindigkeit
benötigen
Teilchen mit kleineren Diffusionskoeffizienten einen längeren Strömungskanal,
um entsprechend Zeit zu haben, um in den Indikatorstrom zu diffundieren.
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Alternativ dazu, um mehr Zeit für Diffusion bereitzustellen,
kann die Strömungsgeschwindigkeit herabgesetzt
werden. Mehrere Faktoren begrenzen jedoch die kleinste Strömungsgeschwindigkeit
und machen daher einen längeren
Strömungskanal
in einigen Fällen
wünschenswert.
Erstens wird die Strömungsgeschwindigkeit
durch Pumpmittel oder eine Druckquelle erzielt, von denen einige
keinen so niedrigen Druck und keine so niedrige Strömungsgeschwindigkeit
erzeugen können,
wie dies wünschenswert
sein kann, um ausreichend Zeit für
Diffusion von Teilchen mit niedrigem Diffusionskoeffizienten zur
Verfügung
zu stellen. Zweitens, wenn die Strömungsgeschwindigkeit hinreichend
gering ist und einige Teilchen von signifikant unterschiedlicher Dichte
im Vergleich zu den umgebenden Fluidströmen sind, können Teilchen mit einer höheren Dichte als
die umgebenden Fluidströme
auf den Boden des Strömungskanals
absinken, und Teilchen mit einer geringeren Dichte als die umgebenden
Fluidströme können zu dem
Oberteil des Strömungskanals
aufschwimmen. Vorzugsweise soll die Strömungsgeschwindigkeit ausreichend
groß sein,
damit hydrodynamische Kräfte
im Wesentlichen Teilchen daran hindern, an dem Boden, dem Oberteil
oder den Wänden des
Strömungskanals
haften zu bleiben. Drittens führt
eine geringe Änderung
des Druckes zu größeren Fehlern
in der Messgenauigkeit bei kleineren Strömungsgeschwindigkeiten. Viertens
können
bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten
andere Faktoren, wie zum Beispiel Änderungen der Viskosität bei Fluiden,
zu größeren Fehlern
in der Messgenauigkeit führen.
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Der Strömungskanal kann gerade oder
nichtgerade sein, zum Beispiel gewunden. Ein gewundener Strömungskanal,
wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Strömungskanal,
der nicht gerade ist. Ein gewundener Kanal kann beispielsweise in
einer Spiralform gewunden sein oder eine Vielzahl von "Haarnadelkurven" umfassen, wodurch
sich eine Rechteckwellenform ergibt. Gewundene Kanäle bieten
längere
Entfernungen für
das Auftreten von Diffusion, wodurch zu analysierende Substanzen
mit größeren Diffusionskoeffizienten,
z. B. üblicherweise größere zu
analysierende Substanzen, gemessen werden können. Bei den erfindungsgemäßen bevorzugten
Ausführungsbeispielen,
bei denen ein Silizium-Mikrochip die Substratplatte ist, in der
der Strömungskanal
ausgebildet wird, beträgt
die Kanallänge eines
geraden Strömungskanals
zwischen etwa 5 mm und etwa 50 mm. Bei den erfindungsgemäßen bevorzugten
Ausführungsbeispielen,
bei denen der Strömungskanal
gewunden ist, d. h. nichtgerade ist, wird die Länge des Strömungskanals lediglich durch die
Größe des Mikrochips
bzw. einer anderen Substratplatte, in die der Kanal geätzt oder
auf andere Weise ausgebildet wird, definiert bzw. begrenzt. Die
Kanalbreite (Diffusionsrichtung) beträgt vorzugsweise zwischen etwa
20 Mikrometern und etwa 1 mm. Der Kanal wird vorzugsweise breiter
gebildet, zum Beispiel wenigstens etwa 200 Mikrometer, wodurch die Messung
der Indikatorfluoreszenz mit einfachen optischen Systemen erleichtert
wird und wodurch das Verstopfen des Kanals durch Teilchen reduziert
wird. Jedoch kann der Kanal so eng wie möglich ausgebildet werden, solange
ein Verstopfen mit den verwendeten Teilchen vermieden wird. Wenn
die Breite des Kanals verringert wird, tritt Diffusion rascher auf,
und damit kann Detektion rascher erfolgen. Die Kanalhöhe ist ausreichend
gering, um darin Laminarströmung
zweier Ströme
zu ermöglichen,
vorzugsweise nicht größer als
etwa 1000 Mikrometer und insbesondere vorzugsweise zwischen etwa
50 Mikrometer und etwa 400 Mikrometer.
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Bei einigen Ausführungsbeispielen kann der Laminarströmungskanal
ausreichend lang sein, so dass der Indikatorstrom und der Probenstrom
ein Gleichgewicht in Bezug auf die Teilchen einer zu analysierenden
Substanz in dem Kanal erreichen. Gleichgewicht stellt sich ein,
wenn der größte Betrag kleinerer
Teilchen in den Indikatorstrom diffundiert ist.
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Das System kann auch einen Probenkanal und
Auslassmittel, wie zum Beispiel kleinere Kanäle für Durchleiten von Probenströmen von
dem Indikatorstrom in aufeinanderfolgenden Intervallen über die Länge des
Laminarströmungskanals,
und Mittel, einschließlich
von Ansichtsfenstern und Fluoreszenzdetektoren zum Messen von Änderungen
in der Indikatorsubstanz in einem jeden Probenstrom umfassen, wobei
die Konzentration der zu analysierenden Substanz in dem Probenstrom
bestimmt werden kann.
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Doppeldetektions-Ausführungsbeispiele
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
die die Detektion sowohl ungelöster
als auch gelöster
zu analysierender Substanzen ermöglichen,
werden ebenfalls bereitgestellt. Detektion sowohl ungelöster als
auch gelöster
zu analysierender Substanzen kann in einer Doppeldetektions-Vorrichtung
erzielt werden: gelöste Teilchen
können
in dem Strömungskanal
des T-Sensors detektiert werden, und ungelöste Teilchen können in
einem V-Rillenkanal oder Hüllenflussmodul detektiert
werden, von denen eines oder beide in Fluidverbindung mit einem
T-Sensor-Strömungskanal stehen
kann oder können.
Verzweigte Strömungskanäle können Fluidverbindung
zwischen einem T-Sensor-Strömungskanal
und einem V-Rillen-Kanal und/oder Hüllenflussmodul bereitstellen.
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Die erfindungsgemäßen Kanalzellensysteme können in
Fluidverbindung mit einem V-Rillen-Strömungskanal stehen, der vorzugsweise
an dem Oberteil eine Breite hat, die klein genug ist, um die Teilchen
in eine einzelne Reihe zu zwingen, die jedoch groß genug
ist, damit die größten Teilchen durchgeleitet
werden, ohne den Kanal zu verstopfen. V-Rillenkanäle werden
durch Ätzen
von Einkristall-Silizium-Mikrochips mit anisotropem Ethylendiamin-Brenzcatechin-Wasser
(EPW) ausgebildet, so dass Zugang zu Spiegelebenen mit präzise geätzten Winkeln
in Bezug auf die Oberfläche
des Mikrochips gegeben ist (Petersen, Proc. IEEE 70 (5): 420–457, 1982).
(US-Patent Nr. 5,726,751 "Silicon
Microchannel Optical Flow Cytometer", eingereicht am 27. September 1995
beschreibt ein Durchfluss-Zytometer mit einem V-Rillen-Strömungskanal,
der durch Mikrobearbeitung eines Silizium-Mikrochips ausgebildet wird.)
Der Querschnitt eines solchen Kanals ist wie ein Buchstabe V beschaffen
und der Kanal wird demzufolge als V-Rillenkanal bezeichnet. Ein
optischer Kopf mit einem Laser sowie mit klein- und großwinkeligen
Photodetektoren, die für
den Einsatz mit einem V-Rillenkanal angepasst sind, können ebenfalls
verwendet werden. Wie in dem US-Patent Nr. 5,726,751 beschrieben,
können
Detektoren, die in kleinen und großen Winkeln in Bezug auf den
Teil des Sondenstrahls, der von der V-Rillenwand reflektiert wird,
angeordnet sind, verwendet werden, um Teilchen, wie zum Beispiel
Zellen, zu zählen
und diese nach Größe (über Kleinwinkeldetektor)
und Gefüge/Morphologie (über Großwinkeldetektor)
zu unterscheiden. Unter Verwendung einer geeigneten Laser- oder LED-Quelle,
wie zum Beispiel Blaulaser, die vom Durchschnittsfachmann standardmäßig bestimmt werden
kann, kann Fluoreszenzdetektion durchgeführt werden, indem ein geeignetes
Filter vor den Großwinkeldetektor
gesetzt wird.
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Der Strömungskanal des T-Sensors kann
in Fluidverbindung mit einem V-Rillenkanal
stehen und somit Doppeldetektion von gelösten und ungelösten einreihigen
Teilchen mit einer Vorrichtung ermöglichen. Die Fluidströme können zuerst
durch einen T-Sensor-Strömungskanal
und danach über
verzweigte Strömungskanäle durch
einen V-Rillenkanal strömen.
Alternativ dazu kann der Fluidstrom zuerst durch einen V-Rillenkanal und danach
durch einen T-Sensor-Strömungskanal
strömen.
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Ein alternatives Mittel zum Erreichen
eines einreihigen Teilchenstroms durch einen Strömungskanal ist das Hüllenflussmodul,
das in dem am 26. März
1997 eingereichten US-Patent Nr. 6,159,739 "Device and Method for 3-Dimensional
Alignment of Particles in Microfabricated Flow Channels" offengelegt wird.
Das Hüllenflussmodul
umfasst eine erste Platte aus Material, in dem ein Laminarströmungskanal
ausgebildet ist; wenigstens zwei Einlässe, wobei jeder Einlass an
einer Verzweigungsstelle mit dem Laminarströmungskanal verbunden ist; und
einen Auslass von dem Strömungskanal.
Eine zweite Platte, wie zum Beispiel eine transparente Abdeckplatte, dichtet
das Modul ab und ermöglicht
optische Messungen mittels Reflexion in Fällen, in denen die erste Platte
aus einem reflektierenden Material besteht, wie zum Beispiel aus
Silizium. Ein erster Einlass ermöglicht
das Einleiten eines ersten Fluids in den Strömungskanal. Das erste Fluid
ist das Hüllenfluid. Ein
zweiter Einlass ermöglicht
das Einleiten eines zweiten Fluids in das Hüllenfluid, wenn dieses durch den
Strömungskanal
strömt.
Das zweite Fluid ist das Mittelfluid. Da die zweite Einlassverbindung
enger ist als die erste Einlassverbindung, wird das Mittelfluid auf
beiden Seiten von dem Hüllenfluid
umgeben. Nachdem alle Fluide eingeleitet worden sind und Hüllenströmung erreicht
worden ist, kann die Höhe
des Strömungskanals
verringert werden, was zu vertikaler hydrodynamischer Scharfeinstellung
führt.
Wahlweise kann die Breite des Strömungskanals verringert werden.
Die Verringerung der Höhe
bzw. der Breite kann schrittweise oder sprunghaft erfolgen. Die
hydrodynamische Scharfeinstellung in dem Hüllenflussmodul führt zu einreihiger
Teilchenströmung.
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Das Hüllenflussmodul kann in Fluidverbindung
mit dem Kanalzellensystem der vorliegenden Erfindung stehen. Die
Fluidströme
können
zuerst durch einen T-Sensor-Strömungskanal
und danach durch ein Hüllenflussmodul
strömen.
Alternativ dazu kann der Fluidstrom zuerst durch ein Hüllenflussmodul
und danach durch einen T-Sensor-Strömungskanal
strömen.
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Das Kanalzellensystem eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
der vorliegenden Erfindung umfasst Kanalrillen in Form eines "T" oder eines "Y" mit
einer Mittelrinne und zwei Verzweigungen, die in die Oberfläche eines
Silizium-Mikrochips eingeätzt sind,
wobei die Oberfläche
danach mit einer Glasscheibe abgedeckt wird. Die Mittelrille wird
aus der Rinne des "T" bzw. "Y" ausgebildet, und die Verzweigungen
sind Einlassmittel in Fluidverbindung mit dem Laminarströmungskanal
zum Durchleiten des Probenstromes und Indikatorstromes in den Laminarströmungskanal.
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Erfindungsgemäße Kanalzellen können ebenso
Mehrfacheinlassverzweigungen in Fluidverbindung mit dem Laminarströmungskanal
zum Leiten einer Vielzahl von Einlassströmen in den Kanal umfassen.
Diese können
in einer "kronleuchterartigen" Anordnung oder aufeinanderfolgend
entlang einer "Traverse" für das "T" bzw. die Verzweigungen der "Y"-Konfiguration angeordnet sein, wobei
einzig die Einschränkung
gilt, dass Laminarströmung
aller Ströme
aufrecht erhalten werden muss.
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Einlassmittel umfassen die Einlasskanäle oder "Verzweigungen" und können weiterhin
andere Mittel umfassen, wie beispielsweise Rohre, Spritzen und ähnliches,
die Mittel zum Einspritzen von Speisefluid in die Vorrichtung bereitstellen.
Aus lassmittel umfassen Sammelanschlüsse und/oder Mittel zum Entfernen
von Fluid aus dem Auslass, einschließlich von Auffangbehältern, Strömung durch
Kapillarwirkung induzierende Mittel, Druck, Schwerkraft und andere
bekannte Mittel. Die Auffangbehälter
können Bestandteil
einer Analysen- oder Detektionsvorrichtung sein.
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Ausführungsbeispiele der vorliegenden
Erfindung, die optische Messungen in Transmission ermöglichen,
werden bereitgestellt. Bei solchen Ausführungsbeispielen bildet das
Kanalzellensystem bzw. wenigstens der Detektionsbereich der zu analysierenden
Substanz die Breite der Substratplatte, in der das Kanalzellensystem
ausgebildet ist. Die erfindungsgemäße Substratplatte betrifft
den Teil von Material, in dem das erfindungsgemäße Kanalzellensystem ausgebildet
ist, wie zum Beispiel eine Siliziumscheibe und eine Kunststofffolie.
Der Detektionsbereich für
zu analysierende Substanz und wahlweise andere Teile des Kanalzellensystems
liegen zwischen optisch transparenten Platten in einem Raum, der
sich durch die gesamte Breite der Substratplatte zieht. Der erfindungsgemäße Detektionsbereich
für zu
analysierende Substanz betrifft den Teil des Indikatorstroms, in
dem Teilchen der zu analysierenden Substanz eine detektierbare Änderung
in dem Indikatorstrom erzeugen.
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Optische Messungen unter Nutzung
von Reflexlicht werden hierin als Detektion durch Reflexion bezeichnet,
wohingegen optische Messungen unter Nutzung von Durchlicht hierin
als Detektion durch Transmission bezeichnet werden.
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Ein Verfahren wird weiterhin wie
im Anspruch 10 definiert für
Detektion der Anwesenheit von Teilchen einer zu analysierenden Substanz
in einem Probenstrom bereitgestellt.
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Die Strömungsgeschwindigkeit der Eingangsströme liegt
vorzugsweise zwischen etwa 5 Mikrometern/Sekunde und etwa 5000 Mikrometern/Sekunde,
insbesondere vorzugsweise bei etwa 25 Mikrometern/Sekunde. Vorzugsweise
ist die Strömungsgeschwindigkeit
für beide
Ströme
gleich.
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Das erfindungsgemäße Verfahren und System umfassen
die Bestimmung der Konzentration der Teilchen einer zu analysierenden
Substanz in dem Probenstrom durch Detektieren der Position von Teilchen
einer zu analysierenden Substanz in dem Laminarströmungskanal,
die in den Indikatorstrom diffundieren und dabei eine detektierbare Änderung
in dem Indikatorstrom bzw. in einer Indikatorsubstanz in dem Indikatorstrom
verursachen. Der Probenstrom und der Indikatorstrom können auch
in dem Laminarströmungskanal
ein Gleichgewicht erreichen lassen. Der Ort der Grenze des Detektionsbereiches
(d. h. der Teil des Indikatorstroms, der diffundierte Teilchen in einer
detektierbaren Konzentration enthält) mit dem nicht beeinflussten
Indikatorstrom kann verwendet werden, um Informationen zu Strömungsgeschwindigkeit
und/oder Probenkonzentration bereitzustellen. Der physische Ort
dieser Grenze in dem Kanal für
eine gegebene zu analysierende Substanz bleibt über die Zeit gleich, solange
die Strömungsgeschwindigkeit
konstant ist und die Probe unverändert ist.
Der Ort und die Größe des Detektionsbereiches können nur
durch Verändern
der Strömungsgeschwindigkeit
und/oder der Konzentration einer Indikatorsubstanz verändert werden,
um das Signal für Detektion
zu optimieren.
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Für
die Bestimmung der Konzentration der Teilchen einer zu analysierenden
Substanz zweckdienliche Informationen können erhalten werden, indem
Mittel zum Leiten von Probenströmen
von dem Indikatorstrom in aufeinanderfolgenden Intervallen entlang
der Länge
des Laminarströmungskanals
bereitgestellt werden, wie zum Beispiel kleinere Kanäle, die
mit Ansichtsfenstern wie hierin beschrieben ausgerüstet sind.
Detektionsmittel wie die oben genannten werden verwendet, um Signale
von dem Indikatorstrom zu messen. Änderungen in der Intensität der Signale
von Probenkanal zu Probenkanal können verwendet
werden, um die Konzentration der Teilchen einer zu analysierenden
Substanz in der Originalprobe zu berechnen.
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Das Verfahren eines Ausführungsbeispiels der
vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung einer Indikatorsubstanz,
die auf einem Teilchensubstrat immobilisiert ist, die in dem Indikatorstrom
getragen wird. Die Indikatorsubstanz ist vorzugsweise eine Substanz,
die sich bei Anwesenheit von Teilchen einer zu analysierenden Substanz,
wie zum Beispiel einem Farbstoff, Enzymen oder anderen organischen Molekülen, die
ihre Eigenschaften in Abhängigkeit von
der Konzentration der zu analysierenden Substanz ändern, in
der Fluoreszenz bzw. in der Farbe verändern. Der Ausdruck "Indikatorsubstanz" wird auch verwendet,
um polymere Kügelchen,
Antikörper oder ähnliches
zu bezeichnen, auf denen Farbstoffe oder andere Indikatoren immobilisiert
sind. Es ist nicht notwendig, dass der Indikatorstrom eine Indikatorsubstanz
umfasst, wenn Detektionsmittel, wie zum Beispiel solche, die direkt
elektrische, chemische oder andere Änderungen in dem Indikatorstrom,
die durch die Teilchen der zu analysierenden Substanz detektieren,
verwendet werden.
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Vorteile dieses Systems sind unter
anderem der Umstand, dass zu analysierende Substanzen optisch in
trüben
und stark gefärbten
Lösungen,
wie zum Beispiel Blut, ohne die Notwendigkeit der vorhergehenden
Filterung oder des vorhergehenden Schleuderns bestimmt werden können; Querempfindlichkeiten
von Indikatorfarbstoffen gegenüber größeren Probenkomponenten
(ein häufiges
Problem) können
vermieden werden; und der Indikator kann in einer Lösung gehalten
werden, in der er seine optischen Merkmale darstellt (z. B. Querempfindlichkeiten
gegenüber
pH-Wert oder Ionenstärke
können unterdrückt werden,
indem stark gepufferte Lösungen
verwendet werden). Messungen des Indikatorstroms an verschiedenen
Orten entlang des Kanals können
einige verbleibende Querempfindlichkeiten kompensieren. Zusätzlich kann
der Strömungskanal breit
sein, wodurch es leicht ist, die Indikatorfluoreszenz mit einfachen
optischen Systemen zu messen. Es wird keine Membran benötigt; das
System ist weniger anfällig
gegenüber
biologischem Bewuchs und Verstopfung als Membransysteme. Das System
kann auch dahingehend eingestellt werden, dass die Konzentration
des Proben- bzw. Indikatorstroms und/oder die Strömungsgeschwindigkeiten
variiert werden können,
um das zu detektierende Signal zu optimieren. Wenn eine Reaktion
zum Beispiel etwa fünf
Sekunden benötigt,
kann das System so eingestellt werden, dass die Reaktion in dem
Mittelteil der Vorrichtung zu sehen ist.
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Das Verfahren kann durch kontinuierlichen Durchfluss
des Probenstroms und des Indikatorstroms durchgeführt werde.
Der stabile Zustand dieses Verfahrens ermöglicht längere Signalintegrationszeiten.
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Der Probenstrom kann größere Teilchen
als die Teilchen einer zu analysierenden Substanz enthalten, die
auch empfindlich gegenüber
der Indikatorsubstanz sind. Diese diffundieren nicht in den Indikatorstrom
und stören
somit die Detektion der zu analysierenden Substanz nicht.
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Zusätzlich wird ein Verfahren zum
Bestimmen kinetischer Geschwindigkeitskonstanten wie in Anspruch
12 definiert bereitgestellt. Normalerweise werden kine tische Messungen
durchgeführt,
indem eine physikalische Eigenschaft in Bezug auf Konzentration über Zeit,
d. h. Reaktionszeit, aufgezeichnet werden. Das hierin bereitgestellte
Verfahren zur Durchführung
kinetischer Messungen in Abhängigkeit
von der von dem Probenstrom und dem Indikatorstrom zurückgelegten
Entfernung anstelle von Abhängigkeit
von Zeit ist aus den folgenden Gründen vorteilhaft. Die Bestandteile
der Ströme,
d. h. die Teilchen, und ihre Konzentration an einer gegebenen Position
des Strömungskanals
bleiben konstant, solange die Strömungsgeschwindigkeit konstant
ist. Dieses Verfahren ermöglicht
die Integration der Daten von der Detektion, z. B. optische Messungen, über Zeit,
wobei sich die Genauigkeit der gesammelten Daten und somit der berechneten/bestimmten Geschwindigkeitskonstanten
erhöht.
Wenn weiterhin ein Versuchsfehler zu einer gegebenen Zeit während der
Detektion auftritt, wie z. B. bei der Datenerfassung, kann man einfach
die Detektionsmessung an der Position/der Entfernung in dem Strömungskanal, an
der der Fehler aufgetreten ist, erneut durchführen. Wenn bei bekannten Verfahren
kinetischer Messungen Daten an einem gegebenen Zeitpunkt aufgrund eines
Versuchsfehlers verloren gehen, können diese Daten während des
gleichen Versuches nicht erneut erfasst werden.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Schemazeichnung von Strömung
und Diffusion in dem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung mit T-Sensor-Kanalzellen.
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2 ist
eine Fluoreszenzmikrofotografie eines T-Sensors der vorliegenden
Erfindung, wobei eine Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 9 (rechter Einlass) in Richtung der Vorrichtung
strömt
und eine schwach gepufferte Indikatorfarbstofflösung (pH-Wert 5) von links
eintritt. Die klar erkennbare Umwandlung des Farbstoffes von einer
Form in die andere mit fortschreitender Diffusion ist deutlich sichtbar.
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3 zeigt
die Auslegung des Ausführungsbeispiels
der vorliegenden Erfindung mit dem Ansichtsfenster-T-Sensor. Bei
diesem Ausführungsbeispiel
kommt der Indikatorstrom von dem rechten T-Schenkel und es handelt
sich dabei um eine Lösung
eines Indikatorfarbstoffes in einem Puffer mit pH-Wert 9 und geringer
Ionenstärke.
Der hier von links eingeleitete Probenstrom ist eine Pufferlösung 0,15
M mit einem pH-Wert von 5. Mehrere Teile des Indikatorstroms, der
einen Indikatorfarbstoft enthält, werden
kontinuierlich an verschiedenen Orten als Probenstrom aus dem Kanal
entnommen.
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4 zeigt
einen an einen optischen Kopf und Durchfluss-Zytometer gekoppelten
V-Rillenkanal.
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5 zeigt
einen gewundenen Strömungskanal
in Rechteckwellenform.
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6 zeigt
einen gewundenen Strömungskanal
in gewendelter Form.
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7A zeigt
einen T-Sensor mit einem gerundeten T-Stoß.
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7B zeigt
einen Ansichtsfenster-T-Sensor mit einem gerundeten T-Stoß.
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8 zeigt
einen gewundenen Strömungskanal
mit einer Vielzahl von Detektionsbereichen zur Durchführung kinetischer
Messungen in Abhängigkeit
von der Entfernung.
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9,
umfassend die 9A bis 9C, zeigt Ausführungsbeispiele
mit verzweigten Strömungskanälen für Doppeldetektion
von gelösten
und ungelösten
zu analysierenden Substanzen.
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10,
umfassend die 10A bis 10C, zeigt ein Hüllenflussmodul.
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11 zeigt
einen T-Sensor, bei dem der Detektionsbereich für zu analysierende Substanz über die
gesamte Breite der Substratplatte geätzt ist.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Mikromaßstabs-Kanalzellen der vorliegenden
Erfindung dienen der Trennung kleinerer Teilchen von größeren Teilchen
in einem Probenstrom ausgehend von der Tatsache, dass der Diffusionskoeffizient
eines Teilchens im Wesentlichen umgekehrt proportional zu der Größe des Teilchens
ist, so dass größere Teilchen
langsamer diffundieren als kleinere Teilchen; von der Tatsache,
dass Diffusion in dem Mikromaßstab
der vorliegenden Erfindung rascher eintritt als in bekannten Trennvorrichtungen
größeren Maßstabs;
und von der Tatsache, dass laminare, turbulenzfreie Strömung in
dem Mikromaßstab
in angrenzenden Strömen
induziert werden kann.
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Wie in 1 gezeigt,
wird eine Kanalzelle in der Form eines "T" bereitgestellt,
die als T-Sensor 10 bezeichnet wird. Die Vorrichtung kann
durch Ätzen auf
einem Silizium-Mikrochip mikrohergestellt werden. Die Geometrie
muss nicht unbedingt ein "T" sein, sondern kann
ebenso ein "Y" sein. Ein beliebiger
Winkel, der hergestellt werden kann, genügt ebenso. Wie oben diskutiert,
kann es eine Vielzahl von Eingangskanälen geben. Es ist lediglich
notwendig, dass sich alle Eingangskanäle zu einem einzigen Strömungskanal
vereinigen und dass alle Kanäle
hinreichend klein sind, damit Laminarströmung unter allen Betriebsbedingungen
aufrecht erhalten wird. Normalerweise ist die Reynoldssche Zahl
des Systems kleiner als 1. Die Probe, die kleine zu untersuchende Moleküle, den
Probenstrom 80, enthält,
wird durch den Probenstrom-Einlassstutzen 30 in
die Vorrichtung eingeleitet, von wo sie in den Probenstromeinlasskanal 50 strömt, wo sie
als Probeneinlassstrom 55 bezeichnet wird. Ein Indikatorstrom 70 wird
in den Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 gebracht, von wo
er in den Indikatorstrom-Einlasskanal 40 strömt, wo er als
Indikatoreinlassstrom 45 bezeichnet wird.
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Der Probeneinlassstrom 55 trifft
an dem T-Stoß 58 an
dem Beginn des Strömungskanals 100 auf
den Indikatoreinlassstrom 45, und die beiden Ströme strömen in paralleler
Laminarströmung
als Indikatorstrom 70 und Probenstrom 80 zu dem
Ausgangsstutzen 60. Der Indikatorstrom 70 enthält eine Indikatorsubstanz,
wie zum Beispiel einen Farbstoff, der mit den Teilchen einer zu
analysierenden Substanz in dem Probenstrom 80 durch eine
detektierbare Änderung
der physikalischen Eigenschaften reagiert. Der Indikatorstrom 70 ist
in 1 in weiß dargestellt.
Aufgrund der niedrigen Reynoldsschen Zahl in dem kleinen Strömungskanal 100 tritt
keine durch Turbulenz verursachte Vermischung auf und die beiden
Ströme
strömen
parallel zueinander, ohne sich zu vermischen. Aufgrund der beteiligten
kurzen Entfernungen wirkt Diffusion jedoch rechtwinklig zu der Strömungsrichtung,
und die Probenkomponenten (Teilchen einer zu analysierenden Substanz)
diffundieren nach links in den Indikatorstrom 70 und werden
schließlich
gleichmäßig über die
Breite des Strömungskanals 100 in
gleichen Diffusionsbereichen von Teilchen zu analysierender Substanz 120 verteilt.
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Der Indikatorstrom 70 strömt in den
Strömungskanal 100,
um einen anfänglichen
Bezugsbereich 85 auszubilden, in den noch keine Teilchen
einer zu analysierenden Substanz diffundiert sind. Teilchen einer
zu analysierenden Substanz von dem Probenstrom 80, die
noch nicht in den Indikatorstrom 70 diffundiert sind, bilden
einen Detektionsbereich 90 für zu analysierende Substanz,
wo Teilchen einer zu analysierenden Substanz eine detektierbare Änderung
in dem Indikatorstrom 70 erzeugen, vorzugsweise durch Bewirken
einer detektierbaren Änderung der
Eigenschaft einer Indikatorsubstanz in dem Indikatorstrom 70.
Teilchen einer Indikatorsubstanz, zum Beispiel Farbstoffteilchen,
können
ebenfalls in den Probenstrom 80 diffundieren, um einen
diffundierten Indikatorbereich 110 auszubilden. Wenn diese Änderung
der lokalen Konzentration der Indikatorsubstanz bei einigen Anwendungen
ein Problem darstellt, kann ihre Diffusionsgeschwindigkeit durch
Immobilisierung auf Polymeren oder Kügelchen, wie zum Beispiel Indikatorkügelchen 130,
willkürlich
klein gemacht werden.
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In dem T-Sensor 10 aus 1 werden ein Probenstrom 80,
wie zum Beispiel Blut, und ein Indikatorstrom 70, der einen
Indikatorfarbstoff enthält,
an dem Schnittpunkt des Probenstrom-Einlasskanals 50 und
des Indikatorstrom-Einlasskanals 40 mit dem Strömungskanal 100 (d.
h. der T-Stoß 58)
zusammengeführt
und strömen
laminar nebeneinander in dem Strömungskanal 100,
bis sie die Konstruktion an dem Auslaufstutzen 60 verlassen.
Kleine Ionen, wie zum Beispiel H+ und Na+, diffundieren rasch über den Durchmesser des Strömungskanals 100,
wohingegen größere Ionen,
wie zum Beispiel das Farbstoffanion, nur langsam diffundieren. Größere Teilchen, wie
zum Beispiel Zuckerarten, Proteine und ähnliches und Blutzellen, weisen
eine signifikante Diffusion auf, solange der Indikatorstrom 70 und
der Probenstrom 80 miteinander in Kontakt stehen. Die kleineren
Probenkomponenten diffundieren rascher und stellen weiter oben in
dem Strömungskanal 100 ein Gleichgewicht
her. Da der Indikator weiterhin eine besondere Halbsättigungskonzentration
hat (pKa in dem Fall eines pH-Farbstoffes),
liegt bei fortschreitender Diffusion eine vordere oder Detektionsbereichsgrenze 95 aus
Indikatorfarbstoff-Farbänderung oder
Fluoreszenzänderung
den Kanal stromaufwärts vor,
um einen Detektionsbereich 90 auszubilden. Praktisch können die
Detektionsbereichsgrenze 95 und der Bezugsbereich 85 eine
gekrümmte
Linie bilden, die in 2 am
besten zu sehen ist. Die Lage und die Krümmung des vorderen Bereiches
können eine "Ruhelage" haben, die eingestellt
werden kann, indem die Strömungsgeschwindigkeit
und die Kanalbreite entsprechend verändert werden, um die Signalgröße und Signalstärke zu optimieren.
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Wenngleich es sich hierbei um ein
Strömungssystem
handelt, bleibt die physische Lage der Detektionsbereichsgrenze 95 in
dem Strömungskanal 100 für eine gegebene
zu analysierende Substanz gleich, solange die Strömungen konstant
sind und die Probe unverändert
ist. Die Konzentration der zu analysierenden Substanz wird entweder
durch Überwachung
des Indikatorsignals bei gleichmäßigem Diffusionsbereich 120 der
Teilchen der zu analysierenden Substanz nach wesentlicher Einstellung eines
Gleichgewichtes oder durch Aufzeichnen der Lage der Vorderflanke
der steilsten Indikatorfarbänderung,
zum Beispiel mit einem Mehrfachdetektor (siehe 3), bestimmt. Der Detektionsbereich 90 der
zu analysierenden Substanz kann so groß wie notwendig sein, um ein
detektierbares Bezugssignal bereitzustellen. Einstellungen dieser
Bereiche können
wie unten beschrieben auf der Grundlage der Diffusionskoeffizienten
der zu analysierenden Substanz und der Indikatorsubstanz, der Strömungsgeschwindigkeiten
und der Kanalgrößen durchgeführt werden.
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2 zeigt
eine Fluoreszenzmikroskopaufnahme des T-Sensors aus 1 mit einem Indikatoreinlassstrom 45,
der eine schwach gepufferte Indikatorfarbstofflösung mit einem pH-Wert von
5 ist, und einem einfachen Einlassstrom 55, der eine Pufferlösung mit
einem pH-Wert von 9 ist. Der helle Bereich rechts ist Licht, das
sich auf dem Silizium spiegelt und in keinem Verhältnis oder
Zusammenhang mit dem Probenstrom oder dem Indikatorstrom steht. Der
Probenstrom 80 erscheint als dunkles, klares Fluid auf
der rechten Seite. Der helle Bereich links ist der Bezugsbereich 85,
wo Teilchen einer zu analysierenden Substanz noch nicht in den Indikatorstrom 70 diffundiert
sind. Der graue Bereich in der Mitte ist der Detektionsbereich 90 für Teilchen
einer zu analysierenden Substanz, wo OH–Ionen
von dem Probenstrom 80 in den Indikatorstrom 70 diffundiert
sind, um den Detektionsbereich 90 auszubilden. Die unscharfe
rechte Ecke des grauen Detektionsbereiches 90 wird dadurch
verursacht, dass Farbstoffteilchen in den Probenstrom 80 diffundieren.
Ein gleichmäßiger Diffusionsbereich
von Teil chen einer zu analysierenden Substanz wird bei 120 gezeigt,
wo die OH–Ionen gleichmäßig diffundiert
sind. Das stärkste
Signal befindet sich in der Mitte des Detektionsbereiches 90.
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3 zeigt
ein weiteres Ausführungsbeispiel
der T-Sensor-Kanalzellenvorrichtung
der vorliegenden Erfindung mit mehreren Probenkanälen und Ansichtsfenstern,
die in Abständen über die
Länge des
Strömungskanals
angeordnet sind. In 3 tritt ein
Einlassstrom 45 von rechts (und nicht von links wie in 1 und 2) an dem Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 ein.
Eine Lösung
aus Indikatorfarbstoff in einem Puffer geringer Ionenstärke mit
einem pH-Wert von 9 wird verwendet. Ein Probeneinlassstrom 55,
der eine 0,15 M Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 5 ist, tritt von links an einem Probenstrom-Einlassstutzen 30 ein.
Die Konzentration des Farbstoffes beträgt nur etwa 10% der in 2 verwendeten Farbstoffkonzentration.
Der Indikatorstrom 45 bzw. der Probenstrom 55 strömen entlang
dem Indikatorstrom-Einlasskanal 40 bzw. dem Probenstrom-Einlasskanal 50 und
treffen sich an dem T-Stoß 58 und
strömen
gemeinsam in Laminarströmung
entlang des Strömungskanals 100.
Untersuchungsströme 145 von
dem Indikatorstrom 70, die den Indikatorfarbstoff enthalten,
werden kontinuierlich an verschiedenen Stellen aus dem Strömungskanal 100 entnommen.
Diese Untersuchungsströme 145 strömen durch
Erweiterungen, die als Ansichtsfenster 140 dienen. Aufgrund
der Größe der Ansichtsfenster 140 (mehrere
Quadratmillimeter) kann die Fluoreszenzstärke problemlos durch ein Fluoreszenzmikroskop
bzw. direkt mit einem Photodetektor überwacht werden.
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Das am nahesten an dem T-Stoß 58 gelegene
Ansichtsfenster enthält
vorwiegend ungestörte Farbstofflösung, wohingegen
das am nahesten an dem Austrittsstutzen 60 gelegene Ansichtsfenster den
Probenstrom 80 in vollständigem Gleichgewicht mit dem
Indikatorstrom 70 enthält.
Die dazwischen befindlichen Ansichtsfenster enthalten den Indikatorstrom 70 in
verschiedenen Graden von Gleichgewicht mit den Probenkomponenten.
Je näher
sie an dem T-Stoß 58 liegen,
umso wahrscheinlicher ist es, dass das Ansichtsfenster nur kleine
Ionen aus der Probe enthält.
Ein Fluoreszenz-Gefügebild der
Ansichtsfenster zeigt, dass die Farbe in dem am nahesten an dem
T-Stoß 58 gelegenen
Ansichtsfenster die rote Farbe der Basenform des ungestörten Indikatorfarbstoffes
ist, wohingegen die gelb-grüne
Farbe der am nahesten an dem Austrittsstutzen 60 gelegenen Ansichtsfenster
die Säureform
des Farbstoffes darstellt, nachdem sich der pH-Wert des Indikatorstroms 70 bei
Erreichen des diffusionsbasierten Gleichgewichts von basisch nach
sauer geändert
hat.
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Der Ansichtsfenster-T-Sensor aus 3 eignet sich für einfache
Bezugsverfahren. Die integrale Fluoreszenzstärke eines jeden Ansichtsfensters
auf einer Wellenlänge
oder mehreren Wellenlängen
kann problemlos mit einem Fluoreszenzmikroskop bzw. direkt mit Fotodioden
gemessen werden. In dem einfachsten Fall, mit einem Indikatorfarbstoff, der
keine Querempfindlichkeiten gegenüber anderen Probenkomponenten
aufweist, ergibt das Intensitätsverhältnis zwischen
ausgewählten
Ansichtsfenstern einen Messwert, der weitgehend unabhängig von
der Farbstoffkonzentration und der Erregerlichtintensität ist. Messen
an mehr als einem Ansichtsfenster erhöht die Redundanz und daher
die Messgenauigkeit.
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In Fällen von Querempfindlichkeit
des Indikators gegenüber
größeren Probenkomponenten
(z. B. größere Biomoleküle, wie
beispielsweise Albumin) kann diese Interferenz herausgenommen werden,
indem die Verhältnisse
der verschiedenen Ansichtsfenster verglichen werden. Die näher an dem
T-Stoß 58 gelegenen
Ansichtsfenster werden vorwiegend kleinere Probenkomponenten enthalten,
wohingegen die den Strömungskanal 100 weiter
stromaufwärts gelegenen
Ansichtsfenster auch größere Teilchen enthalten
werden.
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Die T-Sensor-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
kann mit Reporter-Kügelchen
verwendet werden, um den pH-Wert, die Sauerstoffsättigung und
den Ionengehalt in biologischen Fluiden zu messen. (US-Patent Nr.
5,747,349 "Fluorescent
Reporter Beads for Fluid Analysis" beschreibt fluoreszierende und absorptionsfähige Reportermoleküle und Reporter-Kügelchen.)
Reporter-Kügelchen
können
ebenso zum Detektieren und Messen von Alkoholen, Pestiziden, organischen
Salzen, wie zum Beispiel Lactat, von Zuckerarten, wie zum Beispiel
Glukose, von Schwermetallen und Arzneimitteln, wie zum Beispiel Salicylsäure, Halothan
oder Narkotika, verwendet werden. Jedes Reporter-Kügelchen
umfasst ein Substratkügelchen
mit einer Vielzahl von wenigstens einer Art darauf immobilisierter
fluoreszierender Reportermoleküle.
Vielzahl bedeutet bei Verwendung in dieser Schrift mehr als eins.
Eine fluoreszierende Eigenschaft des Reporter-Kügelchens, wie zum Beispiel
Intensität,
Lebensdauer oder Wellenlänge,
ist empfindlich gegenüber
der entsprechenden zu analysierenden Substanz. Reporter- Kügelchen werden der Fluidprobe
zugegeben, und die Konzentration der zu analysierenden Substanz
wird durch Messung der Fluoreszenz einzelner Kügelchen beispielsweise in einem
Durchfluss-Zytometer bestimmt. Alternativ dazu können absorptionsfähige Reportermoleküle, die
die Extinktion in Abhängigkeit
von der Konzentration der zu analysierenden Substanz ändern, eingesetzt
werden. Die Verwendung von Reporter-Kügelchen
ermöglicht
die gleichzeitige Messung einer Vielzahl von zu analysierenden Substanzen,
und bei biologischen Zellen kann gleichzeitig der Zellgehalt gemessen
werden, da die Kügelchen
mit verschiedenen Reportermolekülen
markiert werden kön
nen.
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Die fluoreszierenden Reportermoleküle der vorliegenden
Erfindung können
beliebige fluoreszierende Moleküle
mit fluoreszierenden Eigenschaften sein, die in Abhängigkeit
von der Konzentration einer bestimmten zu analysierenden Substanz
bzw. einer Klasse von zu analysierenden Substanzen stehen. Zahlreiche
bekannte Farbstoffe und Fluorchromarten können in der vorliegenden Erfindung
als Reportermoleküle
verwendet werden (siehe beispielsweise R. P. Haugland, Handbook
of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Handbuch der fluoreszierenden
Proben und Forschungschemikalien), 5. Ausgabe, Molecular Probes
Inc., Eugene, 1992). Die Kriterien für die Auswahl der Reportermoleküle sind,
dass die Moleküle
auf einem Substratkügelchen
immobilisiert werden können
und dass ihre Fluoreszenz in Abhängigkeit
von der Konzentration einer zu analysierenden Substanz steht. Im
Gegensatz zu bisher verwendeten fluoreszierenden Kügelchen,
bei denen sich die Anzahl der Kügelchen
in einem Aggregat ändert,
müssen
die Reporter-Kügelchen
aus dem US-Patent Nr. 5,747,349 kein Immunreagens, wie zum Beispiel
ein Ligan, Antiligand, Antigen oder einen Antikörper, auf der Oberfläche in Kombination mit
den Reportermolekülen
aufweisen.
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Fluoreszierende Reportermoleküle treten
auf eine Art und Weise in Wechselwirkung mit der zu analysierenden
Substanz, dass die fluoreszierenden Eigenschaften des Reportermoleküls geändert werden.
In einigen Fällen
reagiert das Reportermolekül mit
der zu analysierenden Substanz, wie zum Beispiel in dem Fall der
Albumin-Detektion
durch AB 580 (Spacer). In einigen Fällen ist die Wechselwirkung keine
chemische Reaktion. Zum Beispiel kann die Fluoreszenz von Reportermolekülen durch
strahlungsfreie Energieübertragung
zu den zu analysierenden Substanz gelöscht werden, wie zum Beispiel in
dem Fall der O2-Detektion durch Rutheniumdiphenylphenanthrolin. Bei
einigen Reportermolekülen
ist die Fluoreszenz empfindlich gegenüber Polaritätsänderungen in dem Fluid, was
zum Detektieren von organischen Lösungsmitteln und Kohlenwasserstoffen in
einem wässrigen
Fluid genutzt werden kann. Die Wechselwirkung kann auch durch andere
Lösungsmitteleffekte
erfolgen, wobei die Ionenstärke
des Lösungsmittels
die Fluoreszenz beeinflusst. Lösungsmitteleffekte
können
zur Bestimmung der Gesamtkonzentration aller gelösten Ionen verwendet werden.
Die Wechselwirkung kann eine Ligand/Antiligand- oder eine Antigen/Antikörper-Reaktion
sein. Die Wechselwirkung führt
vorzugsweise nicht zu einem Aggregat mit anderen Teilchen und erzeugt
insbesondere kein Aggregat, das eine Vielzahl von Reporter-Kügelchen
enthält.
Es wird bevorzugt, dass die Wechselwirkung der zu analysierenden
Substanz mit den Reportermolekülen
die Konzentration der zu analysierenden Substanz in dem Fluid nicht
signifikant stört.
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In dem Fall von fluoreszierenden
Reporter-Kügelchen
ist wenigstens eine Fluoreszenzeigenschaft der Reportermoleküle eine
Abhängigkeit
der Konzentration der zu analysierenden Substanz. Die für die Reporter-Kügelchen
gemessene Eigenschaft kann eine beliebige Eigenschaft sein, die
durch die Wechselwirkung der zu analysierenden Substanz mit den
Kügelchen
beeinflusst wird, wie zum Beispiel die Fluoreszenzintensität, die Zerfallszeit
oder das Spektrum.
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Alternativ dazu können Reportermoleküle Absorptionsindikatoren
sein, wie zum Beispiel der auf einem Substratkügelchen immobilisierte physiologische
pH-Indikator N9
(Merck Deutschland). Diese Indikatoren ändern ihr Absorptionsvermögen in Abhängigkeit
von der Konzentration der zu analysierenden Substanz. Üblicherweise ändert sich
die Farbe der Moleküle
(d. h. die Wellenlänge
ihrer größten Absorption ändert sich).
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Absorptionsfähige Reportermoleküle können in
Kombination mit fluoreszierenden Reportermolekülen auf einem Substratkügelchen
verwendet werden, und absorptionsfähige Kügelchen können in Kombination mit fluoreszierenden
Kügelchen
verwendet werden.
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Die Aufgabe des Substratkügelchens
besteht darin, die Detektion einer zu analysierenden Substanz sowie
wahlweise ihrer Konzentration mit optischen Messun gen von Einzelkügelchen
zu ermöglichen.
Mehr als eine Art von Reporter-Kügelchen,
d. h. Kügelchen
mit darauf immobilisierten verschiedenen Reportermolekülen, können zur
Analyse einer gegebenen Probe verwendet werden, solange die Art
der Kügelchen
festgestellt oder identifiziert werden kann. Kügelchen können mit verschiedenen Mitteln
festgestellt werden, unter anderem mit Mitteln unter Verwendung
der Kügelchengröße, wie
zum Beispiel Lichtstreuung; mit fluoreszierenden Markierungen, die
an das Kügelchen
angehangen werden, das eine unterschiedliche Erregungs- und/oder
Emissionswellenlänge
als das an diesem Kügelchen
angehangene fluoreszierende Reportermolekül hat; oder durch direkte Identifikation
des an das Kügelchen
angehangenen Reportermoleküls.
Damit wird die Detektion von mehr als einer zu analysierenden Substanz
gleichzeitig möglich.
Das Substratkügelchen
bewirkt weiterhin die Immobilisierung der Reportermoleküle, um deren
Diffusion in den Probenstrom hinein zu verhindern. Die Reportermoleküle können auf
der Oberfläche
des Substratkügelchens oder
aber in dem Substratkügelchen
vorliegen. Die Kügelchen
können
aus einer Reihe von Materialien hergestellt werden und eine beliebige
Form aufweisen, die nicht auf kugelförmig beschränkt ist. Geeignete Materialien
sind unter anderem Glas, Latex, Hydrogels, Polystyrol und Liposome.
Die Kügelchen können zusätzliche
Oberflächengruppen
haben, um das Anhängen
von Reportermolekülen,
wie zum Beispiel von Carboxylgruppen auf Latex und modifiziertem
Polystyrol, zu ermöglichen.
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Verschiedene Verfahren können zur
Immobilisierung der Reportermoleküle auf dem Substratkügelchen
verwendet werden. Adsorptionsbasierte Beschichtungen können durch
Eintauchen der Substratkügelchen
in eine Reportermoleküllösung und
nachfolgendes Abwaschen überschüssiger Reportermoleküle vorbereitet
werden. Reportermoleküle
können analog
in den Hohlraum gesteuerter Porenglaskügelchen diffundiert werden.
Reportermoleküle
können ebenso
kovalent immobilisiert werden, indem sie chemisch an Funktionsgruppen
geeigneter Substratkügelchen
angehangen werden. Polymerisierte Kügelchen können in einer Lösung, die
Reportermoleküle
enthält,
ausgebildet werden, wobei die Moleküle in einem festen Polymerhohlraum
eingeschlossen werden. Um Reportermoleküle in einem Liposom zu immobilisieren,
können
Lipide mit einer Reportermoleküllösung gemischt
werden, kann die Lösung
geschüttelt
werden und können
die Liposome getrennt werden.
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Um Reporter-Kügelchen für die erfindungsgemäßen Verfahren
einzusetzen, werden die Kügelchen
mit einer Fluidprobe gemischt, und die Fluoreszenz bzw. Absorption
einzelner Kügelchen
wird gemessen. Die Kügelchen
können
vor dem Vermischen mit der Probe trocken oder in einem Fluid dispergiert sein.
Für Messungen
im Mikromaßstab
sollen das zugegebene Kügelchen-Volumen
und etwaige Begleitfluide im Vergleich zu dem Probenvolumen klein
sein (zum Beispiel < 1%),
so dass sich eine nicht signifikante Probenverdünnung ergibt.
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Die erfindungsgemäßen Kanalzellen können durch
beliebige bekannte Verfahren ausgebildet werden, vorzugsweise durch Ätzen der
Strömungskanäle auf die
horizontale Oberfläche
eines Silizium-Mikrochips, und durch Platzieren eines Deckels, vorzugsweise
aus einem optisch klaren Material, wie zum Beispiel Glas oder einer
Silikongummifolie, auf dem geätzten
Substrat. Andere Mittel zum Herstellen der erfindungsgemäßen Kanalzellen
sind unter anderem die Verwendung von Siliziumstrukturen oder anderer
Materialien als Schablone für
das Formen der Vorrichtung in Kunststoff, die Mikrofertigung und
andere bekannte Verfahren, insbesondere die nachstehend beschriebenen
Verfahren.
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In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der
vorliegenden Erfindung haben erfindungsgemäße Kanalzellen wasseraufnehmende
Oberflächen, um
die Strömung
von Flüssigkeit
darin zu unterstützen
und um Betreiben der Vorrichtung ohne die Notwendigkeit der Beaufschlagung
mit Druck zu ermöglichen.
Das Substrat kann nach der Fertigung der Kanäle mit bekannten Mitteln behandelt
werden, um es wasseraufnehmend zu machen. Der Deckel wird ebenfalls
behandelt, um ihn wasseraufnehmend zu machen.
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Das erfindungsgemäße T-Sensor-Kanalsystem
kann in Fluidverbindung mit einem V-Rillenkanal oder mit mehreren
V-Rillenkanälen
stehen. Ein Silizium-Mikrochip
kann geätzt
werden, um eine V-Rille mit reflektierenden Oberflächen/Wänden der
Kanäle auszubilden.
Somit können
optische Messungen Auflicht anstelle von Durchlicht nutzen. Detektion
kann durch Reflexion erzielt werden, d. h. durch Detektieren von
Auflicht. Kleinwinkel-Streulicht (von der Oberfläche von beliebigen Teilchen
in dem Kanal gestreut) wird ebenfalls von der V-Rillenwand gestreut und
kann durch einen Kleinwinkel-Photodetektor erfasst werden. Großwinkel-Streulicht
und Fluoreszenzlicht kön nen
ohne Reflexion aus dem Kanal austreten und durch einen Großwinkel-Photodetektor erfasst
werden. Zusätzlich
verstärkt
die Reflexionswand der V-Rille hinter dem beleuchteten Teilchen die
Fluoreszenzerfassungsleistung. Beliebige Teile des Auflichts, wie
zum Beispiel Laserstrahl, die sich nicht in dem V-Rillenkanal befinden,
werden von der Siliziumoberfläche
in einer Richtung weg von dem Kleinwinkeldetektor bzw. dem Großwinkeldetektor reflektiert.
Die von dem Deckel, wie zum Beispiel einer transparenten Abdeckplatte,
reflektierte Lichtfraktion in einem Fall, wenn Licht aus der Luft
ohne direkte Kopplung in den Deckel/die Abdeckplatte eintritt, wird
ebenfalls dem Kleinwinkeldetektor und dem Großwinkeldetektor weg gerichtet,
wobei unerwünschte
Hintergrundlichtstärke
von den Messungen reduziert wird.
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Da der V-Rillenkanal das Auflicht
reflektiert anstelle es zu leiten, ist die Herstellung des erfindungsgemäßen Mikrokanalsystems äußerst einfach. Der
Mikrokanal wird aus einem einzelnen Mikrochip aus Silizium hergestellt,
der auf einer Seite gemustert ist. Eine transparente Abdeckplatte
ist an dem Oberteil des Mikrochips angebracht, um den Kanal abzudichten.
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4 zeigt
einen V-Rillen-Strömungskanal und
einen wahlweisen optischen Kopf. Der Silizium-Mikrochip 210 hat
eine V-Rille 211 darin. Der Ausdruck V-Rille wird in dieser Schrift für eine im
Wesentlichen "V"-förmige Rille
in der Oberfläche
eines Silizium-Mikrochips verwendet. Je nach Herstellungsverfahren
kann die Spitze des "V" flach sein (eine
Trapezrille), jedoch nur, wenn der flache Abschnitt nicht in den
Detektionsbereich einer zu analysierenden Substanz fällt, die
von dem Schnittpunkt des Beleuchtungsstrahles mit der Probenströmung definiert wird.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
hat der Mikrochip 210 eine Oberflächenorientierung <100> und die Wände der
Rille 211 befinden sich entlang von Ebenen <111>, wobei sich ein Winkel
von 54,7 Grad zwischen den Wänden
der Rille und der Ebene der Oberfläche des Mikrochips ergibt.
Die transparente Abdeckplatte 220 ist gegen die Oberfläche des
Mikrochips 210 abgedichtet. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
besteht die Abdeckplatte aus Pyrex und sie ist durch eine anodische
Bondverbindung mit dem Silizium-Mikrochip
verbunden. In dem veranschaulichten Ausführungsbeispiel umfasst die
Lichtquelle einen Diodenlaser 310, eine optische Faser 312 und
einen Fokussierkopf 314. Ungestreutes Licht, d. h. Licht,
das nicht von einem Teilchen gestreut wird, wird von einer Wand
des Kanals 211 spiegelreflektiert und wandert entlang des
Pfades 322. Klein winkel-Streulicht (vorwärtsgestreutes
Licht) weicht etwas von dem Pfad 322 ab und prallt auf
den Kleinwinkeldetektor 320. Ein Teil des im großen Winkel
gestreuten Lichtes wandert entlang des Pfades 332 zu dem
Großwinkel-Photodetektor 330.
Die Photodetektoren können
Photodioden oder Photovervielfacher sein. Der Großwinkeldetektor 330 kann
verwendet werden, um Großwinkelstreuung
und/oder Fluoreszenz zu messen.
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Mittel zur Beaufschlagung von Druck
auf die Strömung
des Speisefluids durch die Vorrichtung können ebenfalls bereitgestellt
werden. Solche Mittel können
an den Speiseeinlässen
und/oder dem Auslass bereitgestellt werden (z. B. als Vakuum, das durch
chemische oder mechanische Mittel erzeugt wird). Mittel für die Beaufschlagung
des Druckes sind nach dem Stand der Technik bekannt, werden zum Beispiel
in Shoji, S. und Esashi, M. (1994) "Microflow devices and systems", J. Micromechanics
and Microengineering, 4: 157–171
beschrieben und umfassen die Verwendung einer Wassersäule oder
anderer Mittel zum Beaufschlagen von Wasserdruck, elektroendosmotische
Kräfte,
optische Kräfte,
Gravitationskräfte
und Oberflächenspannungskräfte. Drücke von etwa
6,89 mPa (10–5 psi)
bis etwa 68,9 kPa (10 psi) können
verwendet werden, jeweils in Abhängigkeit von
den Forderungen des Systems. Vorzugsweise wird ein Druck von etwa
6,89 Pa (10–3 psi)
verwendet. Am bevorzugtesten liegen die Drücke zwischen etwa 19,6 Pa (2
mm) und etwa 980 Pa (100 mm Wasserdruck).
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Ein Beispiel eines Ausführungsbeispieles unter
Verwendung von Mehrfachströmen
ist eine Kanalzelle mit drei Einlassströmen, die in Laminarströmung fließen, wobei
der mittlere Strom ein Reagensstrom ist. Beispielsweise kann der
Probenstrom Blut sein, der mittlere Strom kann Glukoseoxidase sein und
der dritte Strom kann ein Indikatorstrom sein, der einen pH-Wert-empfindlichen
Farbstoff enthält. Wenn
Glukoseteilchen durch den Reagensstrom diffundieren, werden sie
zu Glukonsäure
umgesetzt, die von einem pN-Wert-empfindlichen Farbstoff detektiert
wird, wenn die Glukonsäuremoleküle in den
Indikatorstrom hinein diffundieren. Andere Beispiele von Mehrstromsystemen
sind unter anderem Systeme mit mehreren Probenströmen mit
zu analysierenden Substanzen in verschiedenen Konzentrationen zur Kalibrierung
des Detektionsmittels. Nicht neben den Probenströmen gelegene Indikatorströme können auch
als Kontrollströme
verwendet werden.
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Der Indikatorstrom kann vor und
nach erfolgter Diffusion der Teilchen in den Strom durch das Detektionsmittel
gemessen werden, und die Messungen sowie die Änderungsgeschwindigkeit des
Indikatorstromes über
seine Länge
kann verwendet werden, um die Konzentration der zu analysierenden
Substanz zu untersuchen. Zusätzlich
können
Mehrfachdetektionsmittel verschiedener Arten verwendet werden, um
den Indikatorstrom zu messen. Ionen- oder chemikalienempfindliche
Feldeffekte können
an verschiedenen Stellen in der Vorrichtung gemessen werden.
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Die erfindungsgemäßen Kanalzellen
und die Kanäle
in denselben können
entsprechend der Größe zu detektierenden
Teilchen dimensioniert werden. Wie nach dem Stand der Technik bekannt
ist, steht der Diffusionskoeffizient für die Teilchen einer zu analysierenden
Substanz in einem umgekehrten Verhältnis zu der Größe des Teilchens.
Wenn der Diffusionskoeffizient für
die zu detektierenden Teilchen einmal bekannt ist, können die
Kontaktzeit der beiden Ströme,
die Größe des Mittelkanals,
die relativen Stromvolumina, die Drücke und Geschwindigkeiten eingestellt
werden, um das gewünschte
Diffusionsmuster zu erzielen.
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Das fluiddynamische Verhalten steht
in einem direkten Verhältnis
zu der Reynoldsschen Zahl der Strömung. Die Reynoldssche Zahl
ist das Verhältnis
von Trägheitskräften zu
Zähigkeitskräften. Mit abnehmender
Reynoldsscher Zahl sind die Strömungsmuster
stärker
von Zähigkeitseffekten
und weniger von Trägheitseffekten
abhängig.
Unterhalb einer bestimmten Reynoldsschen Zahl, wie zum Beispiel
0,1, können
Trägheitseffekte
im Wesentlichen ausgeklammert werden. Die erfindungsgemäßen Mikrofluid-Vorrichtungen
benötigen
keine Trägheitseffekte,
um ihre Aufgaben zu erfüllen,
und daher sind ihrer Miniaturisierung aufgrund der Reynoldsschen Zahl
aus sich heraus keine Grenzen gesetzt. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen
benötigen
turbulenzfreie Laminarströmung,
und sie sind daher entsprechend der vorgenannten Grundsätze ausgelegt, um
Strömung
mit niedrigen Reynoldsschen Zahlen, wie zum Beispiel Reynoldsschen
Zahlen von unter etwa 1, zu erzeugen.
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Die Reynoldssche Zahl ist das Verhältnis von Trägheitskräften zu
Zähigkeitskräften. Mit
abnehmender Reynoldsscher Zahl hängen
die Strömungsmuster
stärker
von Zähigkeitseffekten
und weniger von Trägheitseffekten
ab. Unterhalb einer bestimmten Reynoldsschen Zahl, wie zum Beispiel
unterhalb von etwa 1 (auf der Grundla ge der Lumengröße für ein Kanalsystem
mit Biegungen und Änderungen
der Lumengröße) können die
Trägheitseffekte
im Wesentlichen ausgeklammert werden. Die erfindungsgemäßen Mikrofluid-Vorichtungen
benötigen
keine Trägheitseffekte,
um ihre Aufgaben zu erfüllen,
und daher gibt es an sich auch keine Begrenzung ihrer Miniaturisierung
aufgrund von Miniaturisierungseffekten. Die Kanalzellenkonstruktionen
des Anmelders weichen signifikant von früher beschriebenen Ausführungen
ab, arbeiten jedoch in diesem Bereich. Die erfindungsgemäßen Mikrofluid-Vorrichtungen
erfordern eine turbulenzfreie Laminarströmung und sind gemäß den vorstehenden
Grundsätzen
ausgelegt, um Strömungen
mit niedriger Reynoldsscher Zahl zu erzeugen.
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Die Vorrichtungen des bevorzugten
Ausführungsbeispiels
der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, eine Probe einer Größe zwischen
etwa 0,01 Milliliter und etwa 20 Mikrolitern innerhalb weniger Sekunden
zu analysieren, wie zum Beispiel innerhalb von etwa drei Sekunden.
Sie können
weiterhin wiederverwendet werden. Verstopfen wird minimiert und ist
umkehrbar. Die Größe und Geschwindigkeit
von 100 μm
breit und 100 μm/s
beispielsweise weisen eine Reynoldssche Zahl (Rc =
plv/η)
von etwa 10–2 aus,
so dass sich das Fluid in einem Regime befindet, wo die Zähigkeit über die
Trägheit
dominiert.
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Die Größe des Druckabfalls, der benötigt wird,
um eine Durchschnittsgeschwindigkeit gegen ein Fluid absoluter Viskosität ηund Dichte
p durch einen kreisförmigen
Kanal zu erzielen (Länge,
1, Durchmesser d), kann aus dem Hagen-Poiseuill'schen Gesetz (Bachelor, G. K., An Introduction
to Fluid Dynamics, Cambridge Univ. Press 1967) abgeleitet werden.
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Durch Einsetzen von v = 100 μm/s und d
= 100 μm
erhalten wir einen Druckabfall gleich etwa 2,94 Pa (0,3 mm Wassersäule) pro
Zentimeter Kanallänge.
Da das Hagen-Poiseuill'sche Gesetz streng genommen
nur für
kreisförmige
Strömungskanäle gilt und
da die erfindungsgemäßen Kanäle im Querschnitt
im Wesentlichen rechteckig sind, kann dies lediglich als annährende Beziehung
zwischen den Variablen dargestellt werden.
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Wenn eine Flüssigkeit in eine Vorrichtung eingeleitet
wird, liegt zunächst
ein Effektivdruck P
eff = P
0 +
P
eff gleich der Summe aus dem Beaufschlagungsdruck
P
0 und einem Druck aufgrund von Oberflächenspannung
vor
P
st ist eine Funktion der Oberflächenspannung
des Fluids γ,
des Randwinkels des Fluids mit der Oberfläche θ und des Krümmungsradius der Fluidoberfläche r.
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Bei wasserannehmenden Oberflächen ist cos θ nahe 1
und bei kleinen Kanälen
muss die Vorrichtung nicht mit einem Beaufschlagungsdruck benetzt
werden. Dies wird als "Benetzen
durch Kapillarwirkung" bezeichnet.
Nachdem die Vorrichtung jedoch vollständig nass ist, muss man auf
die Oberflächenspannung
in dem Austrittsbereich achten. Bei der Vorrichtung des hierin beschriebenen
Beispiels betrug der Krümmungsradius
des Fluids in dem Austrittsbereich mehrere Millimeter, so dass der
Druck aufgrund der Oberflächenspannung
ausgeklammert werden konnte.
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Bei einer Kanalbreite von 100 μm beträgt Pst etwa 98,1 Pa (1 cm Wassersäule), so
dass die Oberflächenspannung
an dem Austrittskanal signifikant ist. Wenn jedoch wie unten beschrieben
ein Ätzmittel, wie
zum Beispiel EPW F-Etch, verwendet wird, das die Ebenen <100> von Silizium angreift,
bedeutet das, dass die geätzten
Ecken nicht so scharf sind wie in den Abbildungen gezeigt. Dies
führt zu
einer schrittweisen Verbreiterung des Kanals auf etwa 1 mm, wodurch
der Effekt der Oberflächenspannung reduziert
wird.
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Durch Anpassung der Ausführung der
Kanäle
entsprechend den oben diskutierten Grundsätzen, um eine geeignete Kanallänge bereitzustellen,
können
die Strömungsgeschwindigkeit
und die Kontaktzeit zwischen dem Probenstrom und dem Indikatorstrom,
die Größe der in
dem Probenstrom verbleibenden und der in den Indikatorstrom diffundierenden Teilchen
kontrolliert werden. Die erforderliche Kontaktzeit kann als Funktion
des Diffusionskoeffizienten des Teilchens D und des Abstandes d, über den
das Teilchen diffundieren muss, durch t = d2/D
berechnet werden. Teilchen oder Moleküle mit Diffusionskoeffizienten
von größer D werden
in den Indikatorstrom diffundieren, und Teilchen oder Moleküle mit einem Diffusionskoeffizienten
im Wesentlichen kleiner als D werden dies nicht tun. Wenn der Diffusionskoeffizient der
größeren Teilchen
etwa zehn Mal kleiner ist als D, muss der Indikatorstrom vollständig frei
von den großen
Teilchen sein.
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Bei einer gegebenen Strömungsgeschwindigkeit
und einigen zu analysierenden Substanzen mit relativ kleinen Diffusionskoeffizienten
ergibt ein gerader Kanalzellensystemkanal (T-Sensor-Kanal), vorzugsweise
5 mm bis 50 mm lang, keinen ausreichend langen Strömungskanal,
damit angemessene Diffusion eintritt. Üblicherweise haben Silizium-Mikrochips
einen Durchmesser von 7,62 cm, 10,16 cm, 15,24 cm bzw. 20,32 cm
(3 Zoll, 4 Zoll, 6 Zoll bzw. 8 Zoll). Ein in einen solchen Mikrochip
geätzter
gerader Kanal kann nicht länger
als der Durchmesser des Mikrochips sein. Detektion von zu analysierenden
Substanzen mit relativ kleinen Diffusionskoeffizienten, wie zum
Beispiel relativ große
zu analysierende Substanzen oder nicht kugelförmige zu analysierende Substanzen,
arbeitet vorzugsweise mit einem gewundenen Strömungskanal. Ein wie hierin
beschrieben verwendeter gewundener Strömungskanal bezieht sich auf
einen Strömungskanal,
der nicht gerade ist. 5 und 6 zeigen zwei unterschiedliche
Kanalgeometrien, die längere
Strömungskanäle auf einem
Silizium-Mikrochip von üblicherweise
3 Zoll bis 4 Zoll ergeben.
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In dem Kanalzellensystem (T-Sensor)
aus 5 haben der linke
und der rechte Strom, zum Beispiel der Probenstrom und der Indikatorstrom,
die gleiche Gesamtweglänge.
Wenn bei diesem Ausführungsbeispiel
mehrere Messungen durchgeführt
werden, müssen
sie entlang der vertikalen Mittellinie des Sensors durchgeführt werden,
so dass beide Ströme mit
der gleichen Strömungsgeschwindigkeit
strömen und
den gleichen Strömungsweg
zurückgelegt
haben. Bei diesem Ausführungsbeispiel,
wobei der gewundene Strömungskanal
eine Rechteckwellenform wie die in 5 hat,
strömen
die Ströme
mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Kurven. Daher
ist es möglicherweise
vorzuziehen, kleinere Strömungsgeschwindigkeiten
als die in geraden Strömungskanälen verwendeten
Geschwindigkeiten zu verwenden, da die engen/schmalen Kurven und die
Scherkräfte
zwischen den mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten strömenden Strömen Bereiche verursachen
können,
in denen Laminarumwälzung auftritt.
Laminarumwälzung
ist keine Turbulenz; die Strömung
ist nach wie vor laminar und vorhersagbar. Dennoch ist Laminarumwälzung nicht
vorzuziehen und kann vermieden werden, indem eine Reynoldssche Zahl
von unter etwa 1 aufrecht erhalten wird.
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Das Kanalzellensystem (T-Sensor)
aus 6 zeigt einen gewendelten/spiralförmigen Strömungskanal.
Bei dieser Geometrie können
vier separate T-Sensoren
mit einem jeweils 220 mm langen Strömungskanal auf einem einzigen
Mikrochip von 7,62 cm (3 Zoll) hergestellt werden. Da der Biegeradius
bei dieser Geometrie größer ist
als bei der Rechteckwellengeometrie ist das Auftreten von Laminarumwälzung weniger
wahrscheinlich. Die Differenz in den relativen Strömungsgeschwindigkeiten zwischen
dem linken und dem rechten Strom (Probenstrom und Indikatorstrom)
ist minimal, wodurch geringere Scherspannung zwischen den beiden
Strömen
auftritt, wenn die beiden Ströme
unterschiedliche Viskositäten
aufweisen. Diese Kanalgeometrie erzeugt jedoch unterschiedliche
Gesamtströmungswege
für den
linken und den rechten Strom.
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7A und 7B veranschaulichen Kanalzellensysteme
(T-Sensor-Vorrichtungen)
der vorliegenden Erfindung, wobei der T-Stoß 58 abgerundet ist. 7A zeigt einen T-Sensor ähnlich dem
in 1 gezeigten, wobei
jedoch der T-Stoß 58 in 7A abgerundet ist. 7B zeigt einen Ansichtsfenster-T-Sensor ähnlich dem
in 3 gezeigten, wobei jedoch
der T-Stoß 58 in 7B abgerundet ist. Ein abgerundeter
T-Stoß ist
vorzuziehen, da er hilft, Laminarumwälzung in dem T-Stoß zu verhindern,
die bei einer Reynoldsschen Zahl von über etwa 1 auftreten kann.
Ein abgerundeter T-Stoß ist
weiterhin vorzuziehen, da er die Möglichkeit der Verunreinigung des
Probenstroms mit dem Indikatorstrom reduziert und umgekehrt.
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Das erfindungsgemäße Kanalzellensystem kann
verwendet werden, um die Konzentration einer zu analysierenden Substanz
als Funktion der Entfernung (von dem T-Stoß) und nicht der Zeit zu messen. Ein
Zuwachs an Entfernung ist proportional zu einem Zuwachs an Zeit.
Bei Laminarströmung
und einer bekannten Strömungsgeschwindigkeit
kann ein Zuwachs an Entfernung in einen Zuwachs an Zeit umgerechnet
werden.
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Bei anderen Verfahren der Durchführung kinetischer
Messungen wird die Konzentration bzw. eine physikalische Eigenschaft,
die sich aus der Konzentration er gibt, wie zum Beispiel Extinktion
oder Fluoreszenz, als Funktion der Zeit aufgezeichnet. Die Abnahme
der Konzentration eines Ausgangsmaterials bzw. der Anstieg der Konzentration
eines Produkts über
Zeit bestimmt die kinematische Geschwindigkeitskonstante für eine Reaktion.
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Die Geschwindigkeit bzw. die Geschwindigkeitskonstante
für eine
Reaktion kann unter Verwendung der erfindungsgemäßen T-Sensor-Vorrichtung bestimmt
werden. Detektion, wie zum Beispiel Absorptions- oder Fluoreszenzmessungen,
kann an einem Detektionsbereich oder an mehreren Detektionsbereichen
zu analysierender Substanz durchgeführt werden. Unter Bezugnahme
auf 8 kann eine Vielzahl
von Detektoren 410 für
zu analysierende Substanz in verschiedenen Entfernungen von dem
T-Stoß 58 angeordnet
werden. Alternativ dazu kann ein Detektor verwendet werden, um den
Strömungskanal
in verschiedenen Entfernungen von dem T-Stoß 58 zu überwachen. 8 zeigt einen rechteckwellen-/serpentinenförmigen Strömungskanal.
Jedoch kann ein T-Sensor einer beliebigen Geometrie, der Laminarströmung aufrecht
erhält,
verwendet werden, um kinetische Messungen durchzuführen, insbesondere
entsprechend den hierin beschriebenen Verfahren. Ein Probenstrom
wird über einen
Probenstrom-Einlassstutzen 30 eingeleitet, und ein Indikatorstrom
wird über
einen Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 eingeleitet. Die
beiden Ströme
treffen sich an dem T-Stoß 58.
Zu analysierende Substanzen aus dem Probenstrom beginnen, in den Indikatorstrom
zu diffundieren, und eine messbare Änderung, wie zum Beispiel eine
Zunahme der Fluoreszenz, tritt ein. Eine messbare Änderung
tritt als Ergebnis dessen, dass zu analysierende Substanzen in den
Indikatorstrom diffundieren, ein und zeigt sich in den Detektionsbereichen 90 zu
analysierender Substanz.
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Die Intensität von Fluoreszenz oder Extinktion
in dem Detektionsbereich zu analysierender Substanz und die Breite
des Detektionsbereiches zu analysierender Substanz werden in verschiedenen
Entfernungen von dem T-Stoß 58 gemessen.
Die Intensität
und die Breite des Detektionsbereiches zu analysierender Substanz
sind abhängig
von der gemessenen Konzentration zu analysierender Substanz. Wenn
die zu analysierende Substanz in den Indikatorstrom diffundiert,
tritt in dem Detektionsbereich zu analysierender Substanz eine Änderung
der Farbe (d. h. eine Änderung
der optischen Extinktion) oder der Fluoreszenz ein. Diese optische Änderung
wird mit zunehmender Entfernung von dem T-Stoß intensiver, da die zu analysierende
Substanz und der Indi kator länger
Zeit hatten, miteinander in Wechselwirkung zu treten. Die Breite
des Detektionsbereich für zu
analysierende Substanz nimmt mit zunehmender Entfernung von dem
T-Stoß ebenfalls
zu. Zwei voneinander unabhängige
Ursachen führen
zu der Erhöhung
der Breite. Erstens diffundieren die zu analysierenden Substanzen
mit zunehmender Zeit weiter, und daher auch mit zunehmender Entfernung.
Zweitens wird die Extinktion bzw. die Fluoreszenz in dem Detektionsbereich
zu analysierender Substanz größer, je
weiter die Wechselwirkung zwischen der zu analysierenden Substanz
und dem Indikator fortgeschritten ist. Daher können Extinktion bzw. Fluoreszenz
bei einer größeren Breite
in dem Detektionsbereich zu analysierender Substanz detektiert werden.
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Unter Bezugnahme auf 8 wird der Detektionsbereich 90 zu
analysierender Substanz mit zunehmender Entfernung von dem T-Stoß 58 breiter und
intensiver.
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Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
und der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann
eine Geschwindigkeitskonstante für
eine Reaktion mit lediglich einer Messung, wie zum Beispiel Fluoreszenz
in einer bestimmten Entfernung von dem T-Stoß, ermittelt werden. Bekanntermaßen führt die
Erhöhung
der Anzahl der Messungen zu erhöhter Genauigkeit
der aus den Messungen berechneten kinematischen Geschwindigkeitskonstante.
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In einem anderen Ausführungsbeispiel
kann das erfindungsgemäße T-Sensor-Kanalzellensystem verzweigte
Strömungskanäle 401 und 402 wie
in 9A veranschaulicht
umfassen. Die kleine zu untersuchende Moleküle enthaltende Probe wird durch einen
Probenstrom-Einlassstutzen 30 in die Vorrichtung eingeleitet,
von wo sie in den Probenstrom-Einlasskanal 50 strömt. Ein
Indikatorstrom wird in den Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 eingeleitet,
von wo er in den Indikatorstrom-Einlasskanal 40 strömt. Die beiden
Ströme
strömen
in Laminarströmung
parallel zueinander, und kleine Moleküle (zu analysierende Substanzen)
aus dem Probenstrom diffundieren in den Indikatorstrom. Verzweigte
Strömungskanäle, wie
sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf Strömungskanäle in Fluidverbindung
mit dem Strömungskanal 100.
Ein W-Stoß 400 wie
in 9A und 9B gezeigt kann verwendet
werden, um die verzweigten Strömungskanäle 401 und 402 mit
dem Strömungskanal 100 zu
korrigieren. Verzweigte Strömungskanäle ermöglichen
die Detektion sowohl ungelöster
wie auch gelöster
Teil chen. Ein Detektor, der vorzugsweise oberhalb oder unterhab
der Vorrichtung angeordnet wird, überwacht den Strömungskanal 100 und
die V-Rillen 403 bzw. 404. Dieses Ausführungsbeispiel
mit Doppeldetektion kann gelöste und
ungelöste
Teilchen in dem Strömungskanal 100 sowie
ungelöste
Teilchen, die einreihig in der (den) V-Rille(n) strömen, detektieren.
Teilchendetektion kann mittels standardmäßiger optischer Verfahren, wie
zum Beispiel Abbildung, Lichtstreuung oder Spektroskopie, erfolgen,
wenn die Teilchen durch eine oder beide der V-Rillen 403 bzw. 404 strömen, die
in Fluidverbindung mit den verzweigten Strömungskanälen 401 bzw. 402 stehen.
Die verzweigten Strömungskanäle 401 und 402 stehen
in Fluidverbindung mit den Austrittsstutzen 405 bzw. 406.
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Bei diesem Ausführungsbeispiel kann zum Beispiel
eine Probe, wie zum Beispiel Vollblut, über den Probenstrom-Einlassstutzen 30 eingeleitet
werden, von wo sie in den Probenstrom-Einlasskanal 50 strömt, und
eine Reporter-Kügelchen
enthaltende Pufferlösung
kann über
den Indikatorstrom-Einlassstutzen 20 eingeleitet werden,
von wo sie in den Indikatorstrom-Einlasskanal 40 strömt. Der
Probenstrom und der Indikatorstrom strömen in Laminarströmung parallel
zueinander in dem Strömungskanal 100. Kleine
zu analysierende Substanzen, wie zum Beispiel Protonen, diffundieren
in den Indikatorstrom. Unter Bezugnahme auf 9A strömt die Probe in den verzweigten
Strömungskanal 402 und
danach in die V-Rille 404, durch die Teilchen, wie zum
Beispiel rote und weiße
Blutzellen, einreihig strömen.
Gleichzeitig strömen
die Reporter-Kügelchen
in den verzweigten Strömungskanal 402 und
danach in die V-Rille 403, durch die die Kügelchen
einreihig strömen.
Ein optischer Detektor, der vorzugsweise oberhalb oder unterhalb
der Vorrichtung angeordnet ist, überwacht
gleichzeitig die beiden Ströme
in dem Strömungskanal 100 und
die ungelösten
Probenteilchen in der V-Rille 404 und
die Kügelchen
in der V-Rille 403, wobei die Kügelchen Indikatoren von gelösten Probensubstanzen
sind.
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Alternativ dazu kann der Indikatorstrom
einen gelösten
Indikatorfarbstoff enthalten, der mit der Überwachung der ungelösten Probenteilchen überwacht
wird, wenn dieses Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Vorrichtung verwendet wird. Ein gelöster Indikatorfarbstoff
muss in einer V-Rille nicht überwacht
werden. Daher müssen
nicht beide verzweigten Strömungskanäle mit V-Rillen
verbunden sein, wie in 9C veranschaulicht.
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Ein weiteres Beispiel des Ausführungsbeispiels
der vorliegenden Erfindung mit Doppeldetektion ist das Folgende.
Eine Probe aus Vollblut kann in einer V-Rille überwacht werden, um die Anzahl
von weißen
Blutzellen zu detektieren. Danach strömt die Probe in einen T-Sensor,
der in Fluidverbindung mit dem V-Rillenkanal steht. In dem T-Sensor
reagieren die weißen
Blutzellen mit den fluoreszierenden Reporter-Kügelchen,
die mit einem Antikörper
markiert sind. Danach strömt
die Probe in einen anderen V-Rillenkanal, der in Fluidverbindung
mit dem T-Sensor steht. In diesem V-Rillenkanal werden die weißen Blutzellen
durch Fluoreszenz identifiziert.
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Das T-Sensor-Kanalsystem der vorliegenden
Erfindung kann weiterhin einen Abfallstutzen 407 umfassen,
wie in 9B veranschaulicht.
Um sicherzustellen, dass ausschließlich Probenstrom in den verzweigten
Strömungskanal 402 eintritt
und dass ausschließlich
Indikatorstrom in den verzweigten Strömungskanal 401 eintritt,
kann ein Teil eines jeden Stromes zu einem Abfallstutzen 407 umgeleitet werden.
Der Abfallstutzen steht an dem W-Stoß in Fluidverbindung mit den
Strömungskanälen, um
einen Teil eines jeden Stromes zu einem Abfallauslass umzuleiten.
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9C veranschaulicht
einen Probenstrom (mit x dargestellt) und einen Indikatorstrom (mit Rechtecken
dargestellt), die durch das erfindungsgemäße Kanalsystem strömen, das
verzweigte Strömungskanäle und einen
Abfallstutzen umfasst. 9C veranschaulicht
weiterhin, dass die verzweigten Strömungskanäle nicht geschlossen geführt werden
müssen
und nicht parallel zu dem Strömungskanal 100 strömen müssen. Die
verzweigten Strömungskanäle können in
einem beliebigen gewünschten
Winkel mit dem Strömungskanal 100 verbunden
sein.
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Detektion von gelösten und ungelösten Teilchen
in einer Vorrichtung unter Verwendung des vorliegenden Ausführungsbeispieles
ist wirtschaftlich vorteilhaft, da Messungen mit nur einem Satz
Pumpen und einem Detektor durchgeführt werden können.
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Ein weiteres Mittel zum Detektieren
ungelöster
Teilchen in einer einreihigen Strömung verwendet ein Hüllenflussmodul.
Eine Probe kann zuerst durch einen Strömungskanal eines T-Sensors
strömen,
wo die Probe mit Reporter-Kügelchen
reagiert; zum Beispiel diffundiert eine zu analysierende Substanz
in der Probe in einen Re porter-Kügelchen
enthaltenden Indikatorstrom. Das Reporter-Kügelchen enthaltende Fluid kann
sodann in ein Hüllenflussmodul
strömen, das
in Fluidverbindung mit dem T-Sensor-Strömungskanal
steht. In dem Hüllenflussmodul
werden die Kügelchen
fokussiert, so dass sie für
Detektion einreihig strömen.
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Wie bei dem V-Rillenkanal kann die
Reihenfolge des Hüllenflussmoduls
und des T-Sensors umgekehrt werden, d. h. die Fluide können zuerst
durch das Hüllenflussmodul
und danach durch den T-Sensor strömen. 10A ist ein Längsschnitt durch die Mitte
eines Strömungsmoduls
gemäß Beschreibung in
dem US-Patent Nr. 6,159,739 "Device
and Method for 3-Dimensional Alignment of Particles in Microfabricated
Flow Channels" (eingereicht
am 26. März 1997).
Die Platte 501 wird maschinell gefertigt, geformt oder
geätzt,
um den Strömungskanal
auszubilden. Die Platte kann unter anderem ausgewählt werden
aus Siliziumscheiben, Kunststoffen, wie zum Beispiel Polypropylen,
und Gusswerkstoffen. Verfahren für
das Ätzen
von Siliziumscheiben, für
das Formen und für
maschinelles Bearbeiten von Kunststoffen sind hinreichend bekannt.
Ein Laminarströmungskanal 508 wird
in einer flachen Ebene der Platte ausgebildet. Ein erster Einlass 510 geht
an dem stromaufwärtigen
Ende des Kanals durch die Platte hindurch und trifft an dem ersten
Einlassknoten 511 auf den Strömungskanal. Ein Auslass 530 geht
an dem stromabwärtigen
Ende des Kanals hindurch und trifft an dem Auslassknoten 531 auf
den Strömungskanal. Ein
zweiter Einlass 520 geht zwischen dem ersten Einlass und
dem Auslass durch die Platte hindurch und trifft an dem zweiten
Einlassknoten 521, der schmaler ist als der erste Einlassknoten,
auf den Strömungskanal.
Eine zweite Platte 505 ist an die flache Ebene der ersten
Platte angeschlossen, wobei eine Seite des Laminarströmungskanals
ausgebildet wird. Eine Ansicht der Kanaloberfläche ist in 10B veranschaulicht. Die relativen Breiten
der Einlassknoten werden gezeigt, ebenso wie die Kante 512 des
Strömungskanals 508.
Der zweite Einlassknoten 521 ist schmaler als der erste
Einlassknoten 511. Unter Bezugnahme auf 10A und 10B wird ein
Hüllenfluid über einen
ersten Einlass 510 in den Strömungskanal 508 eingeleitet
und strömt
durch den Strömungskanal
zu dem Auslass 530. Ein Mittelfluid wird über den
zweiten Einlass 520, vorzugsweise bei einem niedrigeren
Druck und einer geringeren Geschwindigkeit als das Hüllenfluid
eingeleitet. 10C ist
ein Querschnitt des Strömungskanals aus 10A und 10B und veranschaulicht die in einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung erhaltene Hüllenströmung. In diesem Ausführungsbeispiel
ist der Strömungskanal 508 trapezförmig. Ein
Mittelfluid
554, das von einem Einlass 520 eingespritzt
wird, ist von beiden Seiten (links und rechts) und von oben von
einem Hüllenfluid 553 umgeben.
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Wie oben diskutiert ermöglicht die
Ausbildung des Kanalsystems in einem spiegelnden Material optische
Reflexionsmessungen. Alternativ dazu können in dem als nächstes beschriebenen
Ausführungsbeispiel
optische Transmissionsmessungen durchgeführt werden. Ein T-Sensor-Kanalsystem kann
durch die gesamte Substratplatte, wie zum Beispiel einen Silizium-Mikrochip
oder eine sonstige Materialplatte, geätzt werden. Das gesamte Kanalsystem
kann durchgehend geätzt
werden und bildet daher einen Schnittpunkt, d. h. es erstreckt sich über die gesamte
Breite der Substratplatte. Alternativ dazu kann nur derjenige Teil
des Kanalsystems, der den Detektionsbereich 90 für zu analysierende
Substanz enthält,
durchgehend geätzt
werden und erstreckt sich daher über
die Breite der Substratplatte wie in 11 gezeigt.
Der Indikatorstrom-Einlassstutzen 20,
der Probenstrom-Einlassstutzen 30 und der Austrittsstutzen 60 werden
ebenfalls gezeigt. Eine optisch transparente Platte, wie zum Beispiel
eine Abdeckplatte, ist auf beiden Seiten mit dem Mikrochip verbunden.
Wenn nur ein Teil des Kanalsystems durchgehend durch den Mikrochip
geätzt
ist, muss die transparente Platte lediglich den betreffenden Teil des
Mikrochips abdecken.
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Wie in den anderen Ausführungsbeispielen der
vorliegenden Erfindung werden die Abmessungen der Vorrichtung so
gewählt,
dass Laminarströmung
aufrecht erhalten wird. Wenn bei diesem Ausführungsbeispiel ein Silizium-Mikrochip
durch anisotropes EPW-Ätzen
geätzt
wird, soll vorzugsweise ein dünner
Mikrochip verwendet werden, so dass der Kanaldurchmesser ausreichend
klein gehalten werden kann, um Laminarströmung aufrechtzuerhalten. Anisotropes
EPW-Ätzen
erzeugt Kanäle,
die an dem Kanaloberteil breiter sind als an dem Kanalboden. Durchgehendes Ätzen eines
Mikrochips kann einen Kanal erzeugen, der an dem Oberteil unerwünscht breit
ist und der daher einen unerwünscht
großen
Kanaldurchmesser hat. Unerwünscht
große
Kanaldurchmesser halten möglicherweise
Laminarströmung
nicht aufrecht. Bevorzugte Breiten eines dünnen Mikrochips liegen zwischen
100 und 300 Mikrometern und insbesondere vorzugsweise zwischen 100
und 200 Mikrometern. Alternativ können andere Verfahren zum Ätzen von
Silizium, wie zum Beispiel reaktives Ionenätzen, verwendet werden, um
die Kanaldurchmesser ausreichend klein zu halten, damit Laminarströmung aufrecht
erhalten wird. Andere Werkstoffe, wie zum Beispiel Kunststoffe,
die maschinell bearbeitet oder geformt werden, um das Kanalsystem
auszubilden, müssen
nicht unbedingt dünn
sein, um die Kanaldurchmesser klein zu halten.
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Ein Mikrochip kann vor der Ausbildung
des Kanalsystems in demselben durch Ätzen dünner gemacht werden. Ein unbeschichteter
Mikrochip, d. h. ein Mikrochip ohne Photoresist darauf, kann dünner gemacht
werden, indem er in eine Ätzlösung eingetaucht
wird. Ein Kanalsystem bzw. wenigstens der Detektionsbereich für zu analysierende
Substanz kann danach durchgehend durch den gesamten Mikrochip geätzt werden.
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Alternativ dazu kann ein T-Sensor-Kanalsystem,
das eine niedrige Reynoldssche Zahl hat, d. h. Laminarströmung, aufrecht
erhält,
ausgebildet werden, wobei die Höhe
des Kanals größer ist
als die Breite. Da jedoch die Strömungsgeschwindigkeit parabolisch
in Bezug auf die Kanalbreite ist, d. h. sie ist in der Kanalmitte
am größten und
nähert
sich an den Wänden
an Null an, sollen die Kanalabmessungen vorzugsweise dergestalt
sein, dass Diffusion von oben nach unten und von unten nach oben
diesem parabolischen Strömungsgeschwindigkeitsprofil
entgegenwirkt. Mit zunehmender Höhe
des Strömungskanals
nimmt der Effekt von Diffusion von oben nach unten und von unten
nach oben ab.
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Zahlreiche Ausführungsbeispiele neben den hierin
erwähnten
werden für
den Durchschnittsfachmann ohne weiteres erkennbar sein und fallen
in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung. Die folgenden
Beispiele veranschaulichen die Erfindung, sollen die Erfindung jedoch
in keiner Weise einschränken.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Fertigung
von Kanalzellen
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Ein Zwei-Ebenen-Maskenverfahren wurde für die Herstellung
einer erfindungsgemäßen Kanalzelle
auf einer Siliziumscheibe verwendet. Der Strömungskanal der Kanalzelle war
400 Mikrometer breit und 20 mm lang. Die "Verzweigungen" bzw. der Querstrich des "T", die Einlasskanäle umfassend, war eine 30 mm
lange und 200 Mikrometer breite Rille. Der Kanal war 50 Mikrometer
hoch.
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Die erste Maskenebene definierte
die Einlässe
und die Auslassstutzen, die durchgehend durch die Scheibe hindurch
bis zu der Rückseite
des Siliziums geätzt
waren. Die zweite Ebene definierte die Fluidtransportkanäle.
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Chrommasken 10,16 cm (4 Zoll) wurden
von der Photo Sciences, Inc. (Torance, Kalifornien) nach diesen
Vorgaben hergestellt, und Scheiben 7,62 cm (3") ((100), n-Typ) mit 500 nm gewachsenem
SiO2 wurden verwendet.
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Die Scheiben wurden vor der Verarbeitung in
einem Piranha-Bad (H2SO4 und
H2SO2) (2 : 1) gereinigt.
Eine Grundierung (HMDS, aufgeschleudert bei 3.000 U/min.) wurde
verwendet, um die Photoresisthaftung zu verbessern. Etwa ein Mikrometer
des Photoresist AZ-1370-SF (Hoechst) wurde durch Aufschleudern (3.000
U/min.) beschichtet; dem folgte Weichbrand (30 Minuten lang bei
90°C).
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Ein Kontaktausrichter wurde verwendet,
um die Scheiben auszurichten und zu belichten. Die Belichtungszeit
wurde variiert, um bessere Ergebnisse zu erhalten. Es wurde kein
Nachbelichtungsbrennen durchgeführt.
Die Scheiben wurden eine Minute lang in AZ-351 (verdünnt im Verhältnis 4
: 1) (Hoechst) entwickelt und in Deionat gespült. Blaues Heftband (Semiconductor
Equipment Corporation, Moorpark, Kalifornien) wurde auf der Rückseite
der Scheiben angebracht, um das Oxid gegen das Oxid-Ätzmittel zu
schützen.
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Die Scheiben wurden elf Minuten lang
in ein gepuffertes Oxid-Ätzmittel
(BOE, 10 : 1 HF (49%ig) und NH4F (10%ig)
eingetaucht, um das ungeschützte Oxid
vollständig
wegzuätzen.
Das blaue Heftband wurde von Hand entfernt, und der Photoresist
wurde in einer Acetonspülung
entfernt.
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Siliziumätzen wurde in einem Gemisch
aus Ethylendiamin, Brenzcatechin und Wasser (Ätzmittel EPW F gemäß Beschreibung
in Reisman, A. et al. (1979) J. Electrochem. Soc. 126: 1406–1415) in
einem Rückfluss-Kochkolben
durchgeführt.
Dieses Ätzmittel
greift die Ebenen (100) von Silizium mit einer Geschwindigkeit von
etwa 100 um pro Stunde an. Fluidanschlussstutzen wurden in dem ersten
Schritt etwa drei Stunden lang geätzt. Der Photoresist wurde erneut
aufgebracht, und die Maske, die Strömungskanäle zwischen Fluidanschlüssen und
der Sperrschicht enthielt, wurde freige legt. Die Scheiben wurden
in diesem zweiten Schritt etwa eine Stunde lang entwickelt und geätzt.
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Nach der Endverarbeitung wurden die
Scheiben erneut in einem Piranha-Bad
gereinigt und in Deionat gespült.
Danach wurden sie in einzelne Vorrichtungen von etwa 1 cm Mal 1
cm zerteilt.
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Anodisches Bonden gemäß Wallis,
G. und Pomerantz, D. I (1969) J. Appl. Physics 40: 3946–3949 wurde
verwendet, um Pyrexglas an den Siliziumvorrichtungen anzubringen.
Quadratische Teile 2,54 cm (1 Zoll) aus Pyrexglas (100 um dick) von
der Esco Products Inc. (Oak Ridge, New Jersey) wurde verwendet.
Zuerst wurden das Silizium und das Pyrexglas in eine Lösung aus
H2O2, NH4OH und H2O (im Verhältnis 1
: 4 : 6) eingetaucht und danach auf 50°C erhitzt. Diese Behandlung
entfernt alle organischen Stoffe von der Oberfläche und macht die Oberfläche wasserannehmend.
Nach 20 Minuten in dieser Lösung
wurden das Silizium und das Pyrex mit Deionat gespült und getrocknet.
Anodisches Bonden wurde bei 400°C
durchgeführt,
wobei 400 V zwischen dem Glas und dem Silizium angelegt wurden.
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Beispiel 2: Fluoreszenzfarbenänderungen
mit pH-Wert
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Fünf
Pufferlösungen
0,01 M HEPES mit pH-Werten von 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 und 8,0 wurden
aus analysenreinen Chemikalien (Aldrich) vorbereitet. Die entstehenden
Lösungen
wurden danach nacheinander als Probenströme verwendet. Die bei diesem Versuch
zu analysierende Substanz ist H+ bzw. OH–. 1
mg des fluoreszierenden Indikatorfarbstoffes Carboxy-SNAFL (Molecular
Probes, Eugene, Oregon) wurde in 2 ml DM-SO (((,9%ig, Aldrich) aufgelöst. 0,1 ml
dieser Lösung
wurde mit 1 ml eines Puffers 0,0001 M HEPES mit einem pH-Wert von
7,0 gemischt. Die entstehende Lösung
wurde als der Indikatorstrom verwendet.
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Die T-Sensor-Kanalzelle wurde an
dem Objekttisch eines Mikroskops so angebracht, dass sich die Fuge
des T-Sensors in dem Gesichtsfeld des Objektivs befand. Die Einlassstutzen
und der Auslassstutzen wurden mit den Injektorschleifen und den
stehenden Rohren, die mit Wasser gefüllt waren, so verbunden, dass
ein Druckgefälle
von 294 Pa (30 mm Wassersäule)
zwischen den Einlassstutzen und dem Auslass stutzen vorlag. Beide
Einlassstutzen wurden dem gleichen Druck ausgesetzt, so dass sich
die beiden Ströme
in der Mitte des T-Stoßes
trafen und parallel zueinander zu dem Auslassstutzen strömten. Eine
Injektorschleife war mit Indikatorfarbstofflösung gefüllt, die andere Schleife war
mit einem der Probenströme
gefüllt.
Die Schleifen hatten ein ausreichendes Volumen, um die Vorrichtung
etwa eine Stunde lang zu betreiben.
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Nachdem beide Injektorschleifen in
den T-Sensor geströmt
waren und nach einer Minute der Einstellung eines Gleichgewichts
und Spülzeit
wurden Aufnahmen durch einen Fotozusatz an dem Mikroskop gemacht.
Die Mittelwellenlänge
des Erregungsfilters betrug 480 nm; der Emissionsfilter war ein
Langpassfilter 510 nm.
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Der Versuch ergab Aufnahmen, bei
denen die Farbe des Detektionsbereichs der zu analysierenden Substanz
zwischen dem Indikatorstrom und dem Probenstrom in Abhängigkeit
von dem pH-Wert des Probenstroms stand. Die Farbe änderte sich
von rot über
orange nach gelb in dem Maße,
in dem der pH-Wert von 8,0 auf 7,2 zurück ging. Computerverbesserte
Bilder wiesen die Farbe des Indikatorstroms von vornherein als gelb
aus und den Detektionsbereich zu analysierender Substanz von rot
bis orange, wohingegen der farblose Probenstrom schwarz erschien.
Durch Farbmapping werden Zahlenwerte den verschiedenen Farben, die
zur Kalibrierung des Systems verwendet werden, zugeordnet. Alternativ
dazu wird die Lichtstärkenänderung
bei zwei Wellenlängen gemessen,
wobei die Abnahme des roten Anteils und die Zunahme des gelben Anteils
des Spektrums bei abnehmendem pH-Wert gemessen werden.
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Beispiel 3: kinetische
Messungen in Abhängigkeit von
der Entfernung
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Alkalische Phosphatase in Serum und
0,1 M p-Nitrophenolphosphat (PNPP) (schwach gelb) in einem Puffer
0,1 M HEPES mit einem pH-Wert von 7,40 wurden in eine T-Sensor-Vorrichtung
eingespritzt. Die alkalische Phosphatase katalysierte die Reaktion
von PNPP zu p-Nitrophenol (stark gelb) und Phosphat. Die Bildung
(und Bildungsgeschwindigkeit) von p-Nitrophenol wurde durch eine
Zunahme der gelben Farbe detektiert. Die Änderungsgeschwindigkeit der
Intensität
der gelben Farbe in Abhängigkeit
von der Entfernung von dem T-Stoß war eine Abhängigkeit
von der Enzymkonzentration, wodurch die Berechnung einer Geschwindigkeitskonstanten
ermöglicht
wurde.