MXPA01009999A

MXPA01009999A - Metodo para examinar las condiciones de cristalizacion en el crecimiento de cristales en solucion.

Info

Publication number: MXPA01009999A
Application number: MXPA01009999A
Authority: MX
Inventors: Lawrence J Delucas
Original assignee: Uab Research Foundation
Priority date: 1999-04-06
Filing date: 2000-04-05
Publication date: 2003-07-14
Also published as: ATE357656T1; EP1181548B1; JP2006308607A; JP3866043B2; AU4197300A; EP1181548A4; JP2002541455A; DE60034033D1; AU779792B2; EP1181548A1; DE60034033T2; WO2000060345A1; CA2369935A1; NZ514732A; US20030027348A1

Abstract

Es suministrado un método para examinar las condiciones de crecimiento de cristales de proteína con cantidades de picogramos a microgramos de proteína en volúmenes de picolitros o nanolitros. Un método preferido comprende un microarreglo con una pluralidad de micro-cámaras en el microarreglo. Una solución de proteína es colocada dentro de las micro-cámaras por un mecanismo de despachado automático. Las condiciones de crecimiento del cristal de proteína de cada micro-cámara son ajustadas de manera que las condiciones de crecimiento del cristal de proteína en al menos dos de las micro-cámaras difieren. La cristalización de la solución de proteína en las micro-cámaras es efectuada. Es entonces observado el crecimiento del cristal de proteína en las micro-cámar

Description

METODO PARA EXAMINAR LAS CONDICIONES DE CRISTALIZACION EN EL CRECIMIENTO DE CRISTALES EN SOLUCION DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la cristalización de proteinas en o a partir de soluciones proteinicas. La presente invención particularmente se refiere a un método para seleccionar un gran número de condiciones de crecimiento de cristales de proteína que pueden ser conductivos a la cristalización de proteínas. Aún más particularmente, la presente invención se refiere a un método que identifica una o más condiciones de crecimiento de cristales de proteína óptima/ mientras al mismo tiempo utiliza substancialmente menos solución de proteína. La cristalización de proteínas para los estudios de estructura-función y estructura basada en el diseño de fármaco se ha vuelto una parte importante del crecimiento de la búsqueda biotecnológica . Cuando se intenta el crecimiento cristalino para una nueva proteína, las condiciones químicas apropiadas (es decir la concentración proteínica en solución, tipo de precipitado y concentración, pH, y temperatura de crecimiento) son desconocidas y se han determinado típicamente por experimentación de ensayo y error. Típicamente 1000 o más conjuntos diferentes de condiciones de crecimiento de cristales se seleccionan para determinar las condiciones conductoras a la cristalización.

La selección implica procedimientos repetitivos que son extremadamente laboriosos y tediosos. Con el equipo de crecimiento de cristales de proteína de laboratorio presente, cada cámara de recristalización requiere aproximadamente un microlitro de solución de proteína. Las soluciones de proteína típicamente tienen concentraciones en el rango de 10 a 25 microgramos por microlitro para facilitar el crecimiento de cristales. Por lo tanto, para seleccionar 1000 muestras se requieren típicamente entre 10 y 25 miligramos de proteína. Esto es una cantidad considerable y costosa, especialmente para proteínas que son difíciles de aislar o expresar generalmente. Un porcentaje grande de las proteínas (aproximadamente 50%) no pueden expresarse fácilmente en cantidades de miligramos. De este modo, puede ser deseable proporcionar métodos para seleccionar las condiciones de crecimiento de cristal de proteína que requieran cantidades de picogramo a microgramo de proteína para cada condición de selección. Preferiblemente, los métodos pueden requerir solamente cantidades de picogramo a nanogramo de proteína en volúmenes de picolitro a nanolitro en cada muestra de condición de selección . Además, puede ser deseable proporcionar métodos de selección de alta producción para seleccionar condiciones de crecimiento de cristal de proteína en un gran número de muestras sobre una escala de sub-microgramo . Estos métodos pueden utilizar una microconjunto como una plataforma para el crecimiento de cristales de proteina. Los métodos también pueden utilizar dispensación automática de soluciones y puntuación de crecimiento de cristales. La presente invención es un método para seleccionar las condiciones de crecimiento de cristales de proteina que emplean una mínima cantidad de proteína, preferiblemente sobre una escala de picogramo a microgramo. Cada muestra de selección tiene cantidades de picogramo a microgramo de proteína en un volumen de picolitro a nanolitro. Las condiciones de crecimiento de cristales de proteína predeterminadas se mantienen y el crecimiento de cristales se analiza utilizando criterios cualitativos y cuantitativos. En una modalidad preferida, se proporciona una microconjunto para el uso en métodos de selección de crecimiento de cristales de proteína. Preferiblemente, la microconjunto tiene una pluralidad de microcámaras en la microconjunto. Las microcámaras pueden ser pasivas o una combinación de microcámaras pasivas que se conectan con elementos de control activos miniaturizados, tales como, pero no limitándose a válvulas, bombas y electrodos. Una solución de proteína se dispersa automáticamente en las microcámaras. Las condiciones de crecimiento de cristales de proteína de cada una de las microcámaras se ajusta para que las condiciones de crecimiento de cristales de proteina de por lo menos dos de las microcámara difieran. El crecimiento de cristales de proteina en las microcámaras entonces se analiza basándose en la cantidad cualitativa de la cristalización y la calidad de los cristales formados. Objetos adicionales, ventajas, y características de la presente invención se volverán evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones anexas, tomadas junto con los dibujos anexos. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las diversas ventajas de la presente invención se volverán evidentes para alguien con experiencia en la técnica al leer la siguiente especificación y las reivindicaciones adjuntas y mediante referencia a los siguientes dibujos en los cuales: la Figura 1 es una ilustración esquemática de un diseño de dos pozos en una microconjunto; la Figura 2A es una vista superior esquemática que muestra la colocación de las soluciones de proteina y precipitado en un diseño de pozos; la Figura 2B es una vista lateral esquemática que muestra la colocación de las soluciones de proteína y precipitados en un diseño de un pozo; la Figura 2C es una vista lateral esquemática que muestra una colocación alternativa de las soluciones de proteina y precipitados en un pozo; la Figura 2D es una vista lateral esquemática que muestra la colocación de las soluciones de proteina de precipitados en dos pozos; la Figura 2E es una vista superior esquemática que muestra la colocación de las soluciones de la proteina y los precipitados en un diseño de dos pozos; la Figura 3 es una fotografía que muestra una microconjunto; y la Figura 4 es una fotografía de un cristal de proteina obtenido con cantidades nanógramas de proteina en volúmenes de nanolitro. El método de la presente invención es para seleccionar condiciones de crecimiento de cristales de proteina en soluciones de proteina que emplean una cantidad mínima de proteína en un volumen mínimo, preferiblemente sobre una escala pico, nano o meso. La escala pico, nano o meso que se utiliza en la presente, preferiblemente emplea volúmenes (en promedio) picogramo (pg) , nanogramo (ng) o microgramo (pg) cantidades de proteína en picolitro (pl) o nanolitro (ni) . Preferiblemente, la cantidad de proteína en cada muestra de selección es menor de aproximadamente 5 µg. De mayor preferencia, la cantidad de proteína en una muestra de selección será menor de aproximadamente 1 µg. En una modalidad, el volumen de solución de proteína en una muestra de selección preferiblemente es de aproximadamente 0.001 ni a aproximadamente 250 ni y de mayor preferencia aproximadamente 0.01 ni a aproximadamente 10 ni. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que los volúmenes actualmente empleados para cualquier proteina particular serán una función de (sin limitación) la proteina objetivo y su concentración en la solución de proteina. La solución de proteina contiene una o más proteínas deseadas para la cristalización. Como se utiliza en la presente, el término "proteina" quiere decir que incluye todos los péptidos que se presentan naturalmente y sintéticos, polipéptidos, proteínas, y complejos de proteínas. En una modalidad preferida la concentración de proteína en la solución es de aproximadamente 0.1 µg/ l a aproximadamente 50 µ?/µ?, de mayor preferencia de aproximadamente 0.1 µg/µl a aproximadamente 10 y aún de mayor preferencia aproximadamente 0.1 ?/ 1 a aproximadamente 1.0 iq/i±. En otra modalidad preferida, la solución amortiguada a un pH de entre aproximadamente 2.0 y aproximadamente 10.0, de mayor preferencia de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 8.5. Si se desea, la solución de proteína puede contener opcionalmente agentes que ayuden a la solubilización de la proteína en la concentración de proteína deseada o condiciones. Por ejemplo, si la proteína es una proteína de membrana, la solución de proteína puede contener opcionalmente uno o más agentes activos de superficie, tal como una mezcla de detergente. En una modalidad preferida, la solución de proteina también comprende componentes que ayudan en la cristalización. Por medio del ejemplo no limitante, la solución de proteina comprenderá una solución de sal acuosa, polietilenglicol, o un alcohol. Tales componentes asi como su selección, rangos, contraindicaciones y similares se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo Gilliland, G.L. et al., Acta Crystallogr. D50:408-413 (1994); McPherson, A., Crystallization of Biological Molecules, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Y, pp. 487-524 (1999) , expresamente incorporada para referencia. La solución de proteina se dispersa sobre una plataforma. La plataforma puede ser, por medio de un ejemplo no limitante, una placa de vidrio, una placa de usos múltiples, o una microconjunto . La solución se dispersa preferiblemente utilizando un dispositivo con precisión de picolitro o nanolitro. Preferiblemente el dispositivo de dispersión tiene al menos una precisión de 90% en una escala de picolitro o nanolitro. La solución de proteina puede distribuirse manualmente utilizando, por ejemplo, una jeringa. En una modalidad altamente preferida, los dispositivos de dispersión automática se utilizan para dispersar la solución de proteina. Una segunda solución, el depósito o solución de precipitado se proporciona. La solución de precipitados es una solución que ayuda a llevar a cabo la cristalización de la proteina. Puede comprender, por ejemplo, una solución de sal, un alcohol o un polietilenglicol . La segunda solución se proporciona ya sea antes, después o simultáneamente con la solución de proteína. El volumen de la solución de precipitados es típicamente igual a o mayor que el volumen de la solución de proteína. La colocación de la segunda solución es dependiente del método de cristalización utilizado, pero típicamente está en comunicación de fluido con la primera solución. La comunicación de fluido puede ser comunicación de líquido-líquido, líquido-vapor o vapor-vapor. Generalmente, un canal se proporciona para la comunicación de fluido. Un canal se define ampliamente en la presente como un espacio que permite que ocurra la comunicación de fluido. En el método de difusión de líquido-líquido, la solución de proteína y la solución de precipitado hacen contacto entre sí en una interfaz. En la cristalización del lote, las dos soluciones se mezclan juntas. Si se desea la cristalización de difusión por vapor, las dos soluciones se mantienen separadas, pero el espacio se deja para la difusión de vapor entre las soluciones. 0, en una modalidad alternativa, una fuente individual o depósito de la segunda solución puede emplearse. En aún otra modalidad alternativa, una fuente disecante o un depósito gaseoso seco puede emplearse en lugar de la segunda solución. Las condiciones especificas y variaciones en estos métodos se conocen bien por el artesano experimentado . El crecimiento de cristales de proteina se monitorea periódicamente, ya sea en forma cualitativa, cuantitativa, o ambas. Esto puede ser una inspección manual utilizando microscopía de alta definición o microscopía por electrones. Preferiblemente, el crecimiento de cristales de proteína puede monitorearse automáticamente, por ejemplo, mediante medios ópticos de alta resolución que detectan automáticamente el crecimiento de cristales basándose en, por ejemplo el análisis de borde. Si se observa crecimiento de cristales deseable en una muestra, las condiciones de crecimiento de cristales de proteína de esa muestra pueden reproducirse en una macroescala para producir un cristal de proteína para análisis adicional. Alternativamente, si se observa un precipitado o una muestra clara, esas condiciones pueden utilizarse para optimizar las condiciones para la selección adicional. Se apreciará que la plataforma debe emplearse en al menos una trayectoria que sea visual y/u ópticamente clara para el método de detección. En al menos una modalidad preferida, el método de la presente invención para seleccionar el crecimiento de cristales de proteína emplea un microconjunto con una pluralidad de pozos o depósitos como la plataforma. Un microconjunto puede construirse, por ejemplo, similar a un chip microelectromecánico. El microconjunto preferiblemente tiene una forma plana y emplea un tamaño y espesor que son compatibles con asideras de placa manuales o automatizadas. El microconjunto puede hacerse de diferentes materiales y mediante técnicas diferentes conocidas por aquellos expertos en la técnica. El material de microconjunto que incluye los pozos o depósitos, preferiblemente es en forma mínima agua que absorbe, y es de otra manera no reactiva lo suficiente con los componentes de la solución- Esto puede hacerse como un laminado o proporcionado como recubrimiento, por ejemplo. Alternativamente, un material que absorbe agua a una velocidad predecible, puede utilizarse también para construir los pozos o depósitos. Los volúmenes de las soluciones de proteína y precipitado entonces pueden ajustarse para compensar la absorción de agua del material. Los materiales preferidos incluyen pero no se limitan a vidrio, silicio fundido, cuarzo, un disco de silicio, un polímero o una polisulfona. Alternativamente, el microconjunto puede hacerse de un material recubierto con un material hidrofóbico, tal como polisulfona, para limitar la absorción de agua en el microconjunto. Alternativamente, el microconjunto comprende más de un material. Preferiblemente, el microconjunto es un compuesto con un fondo de placa de vidrio delgada unida al plástico, vidrio, caucho de silicio u otros materiales en los que los pozos pueden fabricarse, con al menos un lado que proporciona una trayectoria óptica que es aceptable para la técnica de detección empleada. En una modalidad alternativa, las superficies de los pozos son hidrofóbicas, por ejemplo, el material del microconjunto puede tener una superficie hidrofóbica. Alternativamente, las superficies de los pozos pueden recubrirse con un recubrimiento hidrofóbico. Aunque no necesariamente, las superficies hidrofóbicas de los pozos previenen que las gotas de soluciones se propaguen. El microconjunto incluye una pluralidad de pozos de dimensiones de mieras en la superficie del chip. El término pozos abarcan pozos, microcámaras y cualquier indentación suficiente para mantener o retener un volumen deseado de aproximadamente 0.001 ni a aproximadamente 500 ni, de preferencia de aproximadamente 0.01 ni a aproximadamente 20 ni. Los pozos se separan entre si en la superficie. El número preciso de pozos en la superficie del microconjunto puede variar, y el número total de los pozos en la superficie es una importancia de selección para el usuario. Cada uno de los pozos tiene un volumen suficiente para sostener una cantidad de solución de proteina adecuado para el crecimiento de un cristal de proteina. Preferiblemente, cada uno de los pozos mantiene un volumen de aproximadamente 0.001 ni a aproximadamente 250 ni, de preferencia de aproximadamente 0.01 ni a aproximadamente 10 ni. Los pozos del microconjunto se hacen al utilizar un ácido para grabar tal como fluoruro de hidrógeno, o por otro medio conocido de grabación o técnicas de fabricación. Los pozos pueden incluir medios conocidos para controlar las condiciones, individualmente o en forma colectiva, tal como la presión, calentamiento o enfriamiento de los pozos, niveles de humedad en los pozos asi como medios conocidos para agitar los materiales cargados en los pozos. En un arreglo, los pozos del microconjunto no se conectan ni se separan entre sí. En un arreglo alternativo, los pozos adyacentes del microconjunto se conecta por uno o más canales que proporcionan comunicación de fluido entre los pozos adyacentes (Figuras 1 y 2D-E) . Preferiblemente, los canales de conexión tendrán dimensiones en corte transversal y longitud que permite el control sobre la velocidad de transporte de fluido, vapor, amortiguador, o agentes de precipitación o cristalizando a través de los canales. En una modalidad, al variar las dimensiones de los canales, controla la condición de crecimiento de cristal de esta proteína. En una modalidad alternativa, las condiciones de crecimiento de cristal de protelna se controlan al colocar material en los micro-canales que controlan la comunicación de fluido entre los pozos. Ejemplos no limitantes son membranas, acrilamida o agarosa. Por ejemplo, los micro-canales de conexión son de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 0.2 mieras de ancho y de aproximadamente 0.00005 a aproximadamente 0.1 mieras de profundidad. Alternativamente, los micro-canales son de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 2.0 mieras de ancho y de aproximadamente 0.00005 a aproximadamente 0.5 mieras de profundidad. Los micro-canales se forman en el chip de microconjunto por las técnicas de grabado conocidas. Un ejemplo de dos pozos en un microconjunto (10) conectado por un micro-canal se muestra en la Figura 1. El pozo 12 de solución de proteina se conecta al pozo 14 de solución de precipitado mediante un micro-canal 16. Las dimensiones de cada pozo se diseñan para sostener la cantidad deseada de la solución y pueden tener la misma o diferentes dimensiones. Inicialmente, la muestra de proteínas se dispersa en el pozo 12 a una altura 18 de líquido inicial y la solución de precipitado se dispersa en el pozo 14 con la altura 20 del líquido. La parte superior de los pozos y el micro-canal se sellan por una cubierta 22 ópticamente clara. En la cristalización de difusión de vapor, la solución de precipitado en el pozo 14 tiene una presión de vapor menor que la solución de proteína en el pozo 12, provocando que la difusión del solvente del pozo 12 al pozo 14 hasta la altura líquida de solución en el pozo 12 alcance una altura 24 final. La concentración de la solución de proteína en el pozo 12 precipita la formación de cristales de proteina. El microcon unto también puede incluir un medio conocido por transmitir un fluido o gas a los pozos del microconjunto desde una fuente externa. Por ejemplo, un sistema de bombeo mecánico externo, comercializado por Watson-Marlowe, Inc., bajo la designación comercial "205U" puede utilizarse. El sistema de bombeo es un cassette de canales múltiples que suministran fluido o gas en cantidades reproducibles y controladas con precisión. Opcionalmente, micro-válvulas se disponen en los pozos y micro-canales para regular el flujo de fluido o el vapor entre los pozos y a través de los micro-canales en una forma conocida. Un mecanismo de dispersión automatizado capaz de dispersar exacta y/o repetidamente volúmenes de picolitro y/o nanolitro también se proporciona. Preferiblemente el mecanismo de dispersión automatizado tiene una precisión de al menos aproximadamente 90%. El mecanismo de dispersión automatizado preferiblemente son mecanismos de dispersión piezo-basados de solenoide rápido. De mayor preferencia, el mecanismo de dispersión es un mecanismo de dispersión de solenoide rápido. El dispersador tiene un gran número de capilaridades paralelas. Los capilares están en una comunicación de fluido con una fuente de solución de proteina, una fuente de solución de precipitado, y una fuente de solución amortiguadora. Las dispersadores pueden activarse por los transductores ultrasónicos que producen eficientemente una onda de presión en los capilares que contienen las soluciones. El dispersor es análogo a las cabezas de impresoras de chorro de tinta para las impresoras de computadora pero el fluido no se calienta, de este modo, no dañando las soluciones. La solución de proteína preferiblemente comprende una solución de proteína acuosa en una concentración de aproximadamente 0.1 g/ l a aproximadamente 50 g µl. Preferiblemente, la concentración es de aproximadamente 0.1 g/µl a aproximadamente 10 µg/µl, de mayor preferencia de aproximadamente 0.1 µg/ l a aproximadamente 1.0 µg/µl. Preferiblemente, la solución de proteína comprende una mezcla de detergente cuando las proteínas de membrana se cristalizan. La solución precipitada preferiblemente comprende una solución de sal acuosa concentrada o polietilenglicol como agentes de precipitación. La solución amortiguadora preferiblemente tiene un pH de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10. El mecanismo de dispersión automático dispersa un volumen inicial de solución de proteína, un volumen inicial de solución de precipitado y un volumen inicial de solución amortiguadora desde la fuente de solución de proteina, la fuente de solución de precipitado, y la fuente de solución amortiguadora, respectivamente en pozos preseleccionados o canales de conexión del microconjunto . La colocación del volumen inicial de solución de proteina, el volumen inicial de solución de precipitado, y el volumen inicial de solución amortiguadora en los pozos o canales preseleccionados del microconjunto depende del método utilizado para efectuar la cristalización en la proteina en la solución de proteina. Los métodos preferidos para efectuar la cristalización de la proteina en la solución de proteina incluyen difusión de liquido-líquido, difusión de lote, y difusión de vapor. En el método de difusión de líquido-líquido, el volumen inicial de la solución de proteína se coloca en un conjunto de pozos preseleccionados y el volumen inicial de solución precipitada se coloca en un conjunto separado o diferente de los pozos. Los pozos de solución de proteína se conectan a los pozos de solución de precipitado mediante micro-canales. El volumen inicial de la solución amortiguadora puede colocarse en los micro-canales, o alternativamente añadirse directamente al volumen inicial de solución de proteína y/o solución de precipitado. Las cantidades de concentración, tipos de precipitado y pH de los volúmenes iniciales de solución de proteína, solución de precipitado, y solución amortiguadora son condiciones primarias que determinan el crecimiento de cristales de proteína en una solución de proteína. En la preparación de las soluciones iniciales, y en la colocación del mecanismo de dispersión automatizado, estas condiciones y la colocación de la muestra se varían de acuerdo con un programa pre-diseñado. Una placa de cubierta se ajusta al microconjunto para convertir los pozos en microcámaras y para convertir los micro-canales en una estructura tubular capilar. La placa de cubierta puede ser hecha del mismo material o diferente que el microconj nto, pero la placa de cubierta (o alguna porción del pozo o cámara) debe ser transparente para permitir el análisis óptico de las soluciones de proteína en las cámaras del microconjunto. Preferiblemente, la placa de cubierta será vidrio u otro material que sea visual u ópticamente claro, tal como una cinta ópticamente clara. Alternativamente, el ambiente que rodea el microcon unto puede controlarse para limitar la evaporación de las soluciones. Bajo condiciones controladas de, por ejemplo, temperatura y humedad, cubrir las muestras puede no ser necesario. El agente de cristalización en la solución de precipitado, en las micro-cámaras seleccionadas, difunde mediante los capilares de conexión para seleccionar las micro-cámaras que contienen la solución de proteína.

El crecimiento de cristales de proteína en las cámaras diferentes entonces se monitorea por medio de alta resolución, u otro ópticos que detecta automáticamente el crecimiento de cristal basándose en el análisis de borde conocido de pozos. Alternativamente, el crecimiento de cristales de proteína puede monitorearse por inspección manual utilizando microscopía de alta resolución o microscopía de electrones. Preferiblemente, el crecimiento de cristales de proteína en las cámaras se monitorea por un medio óptico de alta resolución que automáticamente detecta el crecimiento de cristales basándose en el análisis de borde . Una vez que se detecta el crecimiento de cristales en una cámara, estas condiciones de crecimiento de cristales de proteína en la cámara puede reproducirse en una macroescala para producir un cristal de proteína que puedan analizarse por cristalografía por rayos X. Alternativamente, si un precipitado o muestra clara se observa, las condiciones en esas muestras pueden utilizarse para optimizar las condiciones para la selección adicional. En el método de difusión de vapor, el volumen inicial de la solución de proteína se coloca en un conjunto de pozos preseleccionados, y el volumen inicial de la solución de precipitado se coloca en un conjunto separado o diferente de los pozos basándose en un programa prediseñado, como con el método de difusión de liquido-líquido (Figura 2D-E) . Los pozos de solución de proteína se conectan a los pozos de solución de precipitado por micro-canales. El volumen inicial de la solución amortiguadora se añade al volumen inicial de la solución de proteína y/o volumen inicial de la solución de precipitado. Alternativamente, la solución de proteína y la solución de precipitado puede colocarse en el mismo pozo de manera que las dos soluciones no entran en contacto (Figuras 2A-C) . Como con la difusión de líquido-líquido, el crecimiento de cristal es variado en diferentes pozos de acuerdo con un programa prediseñado en el que la colocación, concentración, cantidades, tipo de precipitado, y condiciones de pH se varían en los pozos diferentes. Una placa de cubierta entonces se fija al microconjunto como con el método de difusión de líquido-líquido. La presión de vapor de la solución de precipitado es menor que la presión de vapor de la solución de proteína. Esto provoca que la solución de proteína en una micro-cámara que se conecta mediante un capilar a una microcámara contenga una solución de precipitado para evaporar y sobresaturarse provocando la precipitación de la proteína. El crecimiento de cristales se monitorea como en la difusión de líquido-líquido. Alternativamente, la solución de proteína se coloca en los pozos de microconjunto y el microconjunto se expone a un solo depósito con la solución de precipitado. Este método permite menos dispersión de fluido, pero también menos control de las condiciones de crecimiento de cristales de proteina con respecto a cada muestra de proteina. En el método de lote, el volumen de la solución de proteína, el volumen de la solución de precipitado, y el volumen de la solución amortiguadora se colocan juntos en pozos individuales de microconjunto. En este método, el chip no tiene canales de conexión entre los pozos. Como con la difusión de líquido-líquido y los métodos de difusión de vapor, el crecimiento de cristales se varía en diferentes pozos de acuerdo con un programa prediseñado en el que la colocación, concentración, cantidades, tipo de precipitado y condiciones de pH se varían en los pozos diferentes. Como con la difusión de líquido-líquido y métodos de difusión de vapor, una placa de cubierta se ajusta al microconjunto, y el crecimiento de cristales entonces se monitorea. Si se desea, el fluido o gas puede suministrarse a las microcámaras en cantidades reproducibles y controladas con precisión a partir de una fuente externa por el sistema de bombeo mecánico interno descrito en lo anterior. El gas también puede suministrarse desde la presión generada por una botella o depósito de vidrio estándar. El fluido o gas suministrado a las microcámaras puede regularse por las micro-válvulas. El fluido o gas puede utilizarse para alterar adicionalmente las condiciones de crecimiento de cristales de la microcámara e incrementar el tamaño del crecimiento de cristales de proteina. Estos cristales de proteina pueden cosecharse y examinarse mediante cristalografía por rayos X o espectroscopia magnética nuclear u otras técnicas apropiadas. Las ventajas de la presente invención ahora serán aparentes. La presente invención proporciona un método para seleccionar condiciones de crecimiento de cristales de proteína en una escala nano o meso. El método proporciona un medio para seleccionar condiciones de crecimiento de cristales de proteína para proteínas que no pueden expresarse en cantidades de miligramos así como aquellas que no pueden expresarse en cantidades más grandes. Además, la reducción sustancial en proteína necesaria para la presente invención reduce los costos asociados con la selección de condiciones de crecimiento de cristales de proteína. También se proporciona un aparato para seleccionar condiciones de crecimiento de cristales. El aparato comprende un microconjunto para las soluciones de proteina y precipitado, un mecanismo de dispersión automático para dispersar las soluciones y un medio automatizado para analizar el crecimiento de cristales.

Las soluciones deseadas, es decir, proteina, precipitado y un amortiguador, se dispersan automáticamente preferiblemente en un volumen de picolitro o nanolitro preestablecido en el microconjunto por un mecanismo de dispersión automatizado. Preferiblemente, el mecanismo de distribución automático distribuye gotas discretas. Las condiciones de selección tal como el tipo de amortiguador y el pH pueden variarse de muestra a muestra al programar el distribuidor automático. Por ejemplo, las soluciones arbitrarias que varían el pH pueden programarse al mezclar las relaciones apropiadas utilizando diferentes conteos de gotas de diferentes soluciones existentes que tienen diferentes valores de pH. Un rango de pH de 2.0 a 10.0 entonces se selecciona en etapas de 0.2-0.5 unidades de pH. Otras condiciones, tales como los agentes de cristalización y la concentración de sales también se controla en una forma similar . La mezcla de los reactivos puede hacerse ya sea antes de distribuir o después de que se distribuyan las soluciones en el microconjunto. La mezcla en el microcon unto, por ejemplo, puede lograrse por mezclado ultrasónico, distribución de alta velocidad de gotas de picolitro, fluctuación de temperatura rápida o por difusión estática. Después de mezclar, preferiblemente los pozos del microconjunto se sellan para controlar el microambiente en los pozos y para prevenir la evaporación de las soluciones hasta sequedad. De mayor preferencia, los pozos se sellan con cinta ópticamente clara. El sello del microconjunto implica un brazo montado en un mecanismo transversal YZ. La dirección X se encuentra a lo largo de la dirección de transporte de la placa. El brazo que sostiene un carrete de cinta clara, se mueve pasando el último pozo en la fila, cae para formar presión vertical positiva (eje Z) , y después comienza a moverse de regreso en la dirección Y negativa mientras que al mismo tiempo gira el carrete de cinta. Una vez que la cinta sale del área de placa, un mecanismo de guillotina corta la cinta. La placa entonces se mueve en la dirección X sobre la siguiente fila indexada y el proceso de distribución inicia nuevamente. El grabado en cinta automatizado se realiza confiablemente en muchas industrias. El crecimiento de cristales de proteina en los diferentes pozos se monitorea por medios ópticos de alta resolución que detectan automáticamente el crecimiento de cristales basándose en análisis de borde bien conocidos. Tales sistemas de adquisiciones de imagen están comercialmente disponibles. Lo anterior y otros aspectos de la invención puede entenderse mejor junto con el siguiente ejemplo, que se presenta para el propósito de ilustración y no a manera de limitación. EJEMPLO 1 Las gotitas de proteina de nanolitro se utilizaron para la difusión de vapor, la selección de cristalización de difusión de lote y liquido. Las soluciones de proteina de lisozima, traumatina, o sintetasa NAD se aplicaron utilizando una jeringa Hamilton de 5 microlitros. Para asegurar la humectación completa de la gotita pequeña en la cámara de experimento, la punta de la jeringa Hamilton se colocó en contacto con la pared de cada cámara de experimento. Una variedad de microconjuntos se diseñaron para acomodar las gotitas de solución de proteina con rangos de volumen de 5-20 nanolitros y volúmenes de precipitado de 100-200 nanolitros. La prototipación del conjunto se logró utilizando placas MicroScope con sello permanente de las juntas de neopreno para variar el espesor (0.1 mm 0.5 mm) . Una vez que se aplicaron todas las soluciones a una cámara de experimento individual dentro de la placa microscópica, el experimento se selló con aceite o grasa) al colocar una placa de cubierta de vidrio sobre la parte superior de la junta. La Figura 3 es una fotografía de un diseño típico para un prototipo de conjunto de 60 cámaras (espesor de la junta = 0.1 mm) y la Figura 4 es una fotografía de los cristales que crecieron en gotitas de proteína de 10 nanolitros utilizando una placa de microconjunto similar.

Un sistema de distribución robótico cartesiano se utilizó para preparar las soluciones de cristalización en un conjunto de experimentos de 6 por 10. Cinco nanolitros de proteina más cinco nanolitros de precipitado se distribuyeron en una gotita combinada en una depresión en la cámara de experimento (Figura 3) y 50 nanolitros de precipitado, más 50 nanolitros de amortiguador se combinaron en una gotita en la depresión conectada. De este modo, cuatro soluciones se distribuyeron para cada experimento, y un total de 6X10X4 = 240 para todo el conjunto de 6 por 10. El instrumento cartesiano fue capaz de distribuir todas las soluciones en menos de 20 minutos. Todas las condiciones externas utilizadas fueron condiciones de cristalización conocidas por las proteínas particulares probadas. El experimento se selló manualmente y se incubó a 22°C. Durante un periodo de un día. Los cristales se observaron en el setenta por ciento de las gotitas. Mientras no se desee estar unido por la teoría, se cree que la falla en observar los cristales en el 30% de los pozos fue debido a la distribución inexacta de las gotas de cinco nanolitros de precipitado en que la piezopunta no colocó las gotas juntas. A partir de la descripción anterior, aquellos expertos en la técnica exhibirán mejoras, cambios y modificaciones. Tales mejoras, cambios y modificaciones dentro de la experiencia de la técnica se pretenden para cubrirse por las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para seleccionar condiciones de crecimiento de cristales de proteina que emplean cantidades de picogramo, nanogramo o microgramo de proteínas caracterizado porque comprende las etapas de: proporcionar un microcon unto con una pluralidad de pozos en el microconjunto distribuir con precisión un volumen de aproximadamente 0.001 ni a aproximadamente 250 ni de una solución de proteína en los pozos; controlar las condiciones de crecimiento de cristales de proteína en cada uno de los pozos para que las condiciones de crecimiento de cristales de proteína en al menos dos de las microcámaras difieran; y observar el crecimiento de cristales de proteína o precipitación de proteínas en los pozos. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución de proteína comprende un componente que consiste de amortiguadores, agentes activos de superficie, sales, alcoholes, polietilenglicol y mezclas de los mismos. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución de proteína está amortiguada. . El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque controlar el crecimiento de cristales de proteina comprende emplear una solución de precipitado que está en comunicación de fluido con el microconjunto . 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque controlar el crecimiento de cristales de proteina comprende agregar una solución de precipitado al microconjunto . 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la solución de precipitado y la solución de proteina están en diferentes pozos en el microconjunto y el microconjunto tiene canales para la comunicación de fluido entre un pozo que comprende solución de proteina y un pozo que comprende una solución de precipitado . 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque controlar el crecimiento de cristales de proteina además comprende emplear dimensiones variantes de los canales. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la solución de precipitado y la solución de proteina están en comunicación de fluido mediante micro-canales . 9. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la solución de precipitado y la solución de proteina están en comunicación de fluido. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la comunicación de fluido es mediante la difusión de líquido-líquido de la solución de precipitado y la solución de proteína. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la solución de precipitado tiene una presión de vapor menor que la solución de proteína y la comunicación de fluido es mediante difusión de vapor. 12. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la solución de proteína y la solución de precipitado están en el mismo pozo y la cristalización se efectúa mediante cristalización por lote. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los pozos además comprenden una solución amortiguadora. 14. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la solución de precipitado tiene un volumen de aproximadamente 0.001 ni a aproximadamente 250 ni. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el crecimiento de cristales de proteína o la precipitación de proteína se observa por microscopía . 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la microscopía es microscopía de contraste de interferencia diferencial. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución de proteina se distribuye en los pozos mediante distribución de solenoide rápido. 18. Un método para seleccionar condiciones de crecimiento de cristales de proteina que emplean cantidades de picogramo a microgramo de proteina caracterizado porque comprende las etapas de: distribuir con precisión un volumen de aproximadamente 0.001 ni a aproximadamente 250 ni de una solución de proteina sobre una plataforma; controlar las condiciones de crecimiento de cristales de proteina de la muestra; y observar un precipitado de proteina o cristales de proteina en la muestra. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la muestra se distribuye con precisión mediante distribución de solenoide rápida. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque controlar la condición de crecimiento de cristales de proteina comprende emplear una solución de precipitado de proteina. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la solución de precipitado tiene una presión de vapor menor que la solución de proteina y la cristalización se efectúa por difusión de vapor. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la solución de proteina y la solución de precipitado mezcladas juntas y la cristalización se efectúa por cristalización de lote. 23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la cristalización se efectúa por difusión de liquido-líquido de la solución de precipitado y la solución de proteína. 24. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la plataforma es un microcon unto . 25. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el crecimiento de cristales de proteína o la precipitación de proteína se observa por microscopía. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la microscopía es microscopía de contraste de interferencia diferencial. 27. Un microconjunto para seleccionar el crecimiento de cristales de proteína en cantidades de proteína de nanogramo o picogramo caracterizado porque comprende: una pluralidad de pozos en donde los pozos se adaptan para sostener volúmenes de solución de proteína de aproximadamente 0.001 ni a aproximadamente 250 ni; y en donde además, el pozo comprende un material absorbedor de agua en forma mínima; y una trayectoria ópticamente clara de los pozos. 28. El microconjunto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque los pozos además comprenden un material que es sustancialmente hidrofóbico. 29. El microcon unto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque además comprende una pluralidad de pozos para sostener una solución de precipitado y en donde el microconjunto tiene canales para la comunicación de fluido entre los pozos que sostienen la solución de proteina y los pozos que sostienen la solución de precipitados . 30. El microconjunto de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque por lo menos dos canales tienen diferentes dimensiones. 31. El microconjunto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque los pozos del microcon unto pueden sellarse para prevenir la evaporación de los pozos. 32. Un microconjunto para seleccionar el crecimiento de cristales de proteina en cantidades de proteina de nanogramo o picogramo caracterizado porque comprende una pluralidad de pozos en donde los pozos se adaptan para sostener volúmenes de solución de proteína de aproximadamente 0.001 ni a aproximadamente 250 ni. 33. El microcon unto de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque los pozos comprenden un material que es absorbedor de agua en forma mínima. 34. El microconjunto de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque además comprende una trayectoria ópticamente transparente de los pozos. 35. El microcon unto de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque los pozos comprenden un material que es sustancialmente hidrofóbico. 36. El microconjunto de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque además comprende una pluralidad de pozos que sostienen una solución de precipitado y en donde el microconjunto tiene canales para la comunicación fluida entre los pozos que sostienen la solución de proteína y los pozos que sostienen la solución de precipitado. 37. El microconjunto de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque por lo menos dos canales tienen dimensiones diferentes. 38. El microconjunto de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque los pozos en el microconjunto pueden sellarse para prevenir la evaporación de los pozos .