JP2000511629A

JP2000511629A - リガンドの開発および多変量タンパク質化学最適化のためのマイクロプレート熱シフトアッセイおよび装置

Info

Publication number: JP2000511629A
Application number: JP09540260A
Authority: JP
Inventors: ダブリュー．パントリアノ，マイケル; ダブリュー．リンド，アレキサンダー; アール．セイレム，フランシス; エイ．スプリンガー，バリー; エフ．ボーン，ロジャー; シー．ペトリリャ，ユジェニオ
Original assignee: ３―ディメンショナルファーマシュウティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-05-09
Publication date: 2000-09-05
Also published as: US6020141A; US6036920A; AU741049B2; US6268218B1; HUP9902418A3; US6303322B1; US6291191B1; HUP9902418A2; US20040185504A1; US20020114734A1; US6291192B1; US20030203497A1; US6849458B2; US6268158B1; US6232085B1; CA2253587C; EP0914608A1; KR20000011069A; WO1997042500A1; NZ332754A

Abstract

(57)【要約】本発明は、熱変化によって変性し得る標的分子に対する複数の異なる分子の親和性をランク付けするための方法である。この方法は、複数の容器の各々における複数の異なる分子の１つの分子に標的分子を接触させる工程、複数のコンテナーを同時に加熱する工程、コンテナーの各々の加熱から生じる標的分子の熱変性に伴う物理学的変化を測定する工程、コンテナーの各々についての温度を関数として標的分子についての熱変性曲線を作製する工程、およびそれから中点温度(T_m)を決定する工程、各々の熱変性曲線のT_mを複数の異なる分子の任意の分子の非存在下で標的分子について得られた熱変性曲線のT_mとを比較する工程、および各々の熱変性曲線におけるT_mの変化に従って、複数の異なる分子の親和性をランク付けする工程、を含む。本発明はまた、複数のサンプルを同時に加熱するための温度調節手段、およびサンプルが加熱されている間のサンプルからの発光スペクトルを受容するための受容手段を含むアッセイ装置を提供する。本発明のさらなる局面において、受容手段はサンプルからの蛍光発光、紫外線光、および可視光を受容するように構成され得る。受容手段は、種々の方法（例えば、一度に１つのサンプル、１つ以上のサンプルから同時に、または全てのサンプルから同時）においてサンプルからのスペクトル発光を受容するように構成され得る。温度調節手段は、所定のプロフィールに従って温度を変化させるための温度制御器を有して構成され得る。

Description

【発明の詳細な説明】リガンドの開発および多変量タンパク質化学最適化のためのマイクロプレート熱シフトアッセイおよび装置本出願は、米国仮出願第60/017,860号（1996年５月９日提出）に対する優先権を主張し、この全体を参考として援用する。連邦政府後援研究および開発に基づく発明に対する権利に対する報告本発明の開発の間に実施された研究の一部は、米国政府基金を利用している。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。発明の背景発明の分野本発明は、一般に、化合物のスクリーニングおよびコンビナトリアルライブラリーに関する。より詳細には、本発明はアッセイ、特に、熱シフトアッセイを実施するための方法および装置に関する。関連技術分野近年、薬学系研究者は、医薬発見の新しいリード化合物の供給源としてコンビナトリアルライブラリーへ指向し始めている。コンビナトリアルライブラリーは、化学的合成または生物学的合成のいずれかにより、試薬として数多くの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせて生成された化学化合物のコレクションである。例えば、コンビナトリアルポリペプチドライブラリーは、所定の長さの化合物（例、ポリペプチド化合物のアミノ酸数）に対してあらゆる可能な方法でアミノ酸のセットを組み合せることにより形成される。このような化学的ビルディングブロックをコンビナトリアルに混合することにより、理論的には数百万もの化学化合物が合成可能である。事実、ある研究者は100個の相互交換可能な化学的ビルディングブロックを系統だててコンビナトリアルに混合することにより、1億個の４量体化合物が、また100億個の５量体化合物が理論的に合成されるとしている（Gordon，E.M.ら、J．Med．Chem.３７：１２３３−１２５１（１９９４））。コンビナトリアルライブラリー合成の速度は、化合物の合成と評価を自動化す的および／または生物活性的性質をもつ化学的実在物を生成させるコンピュータ 64号に開示されており、本明細書ではその全体を参照として援用される。一旦ライブラリーが構築されると、ある種の生物活性あるいは薬理活性を有する化合物を同定するためには、それをスクリーニングしなければならない。化合物のライブラリーをスクリーニングするには、ライブラリーの各化合物を酵素のような目的の標的分子で平衡化する。様々な方法が、リード化合物についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするために用いられている。例えば、コードライブラリーにおいては、化学的コンビナトリアルライブラリーの各化合物を、オリゴヌクレオチドの「タグ(tag)」がそこに連結するように作製され得る。各化合物の核酸タグ配列については注意深く記録しておく。標的酵素に影響を及ぼす化合物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、その核酸タグを増幅することにより選択される。タグ配列からその化合物を同定し得る（Bren ner，S.ら、Proc.Natl.Acad．Sci.USA、８９：５３８１〜５３８３（１９９２））。しかし、この方法はオリゴヌクレオチドタグの増幅を何度も繰り返し、続いて増幅した生成物の電気泳動を必要とするので非常に時間がかかる。繊維状ファージ表示ペプチドライブラリーは、ビオチン化抗体、レセプターあるいは他の結合タンパク質に結合するかどうかスクリーニングされ得る。結合したファージは細菌性細胞の感染に用いられ、次いで表示した決定因子（すなわち、ペプチドリガンド）が同定される（Scott，J．K．ら、Science２４９：３８６〜３９０（１９９０））。この方法には幾つかの欠点がある。それは時間のかかることである。ファージあるいはバクテリアに毒性を示すペプチドは研究され得ない。さらに、研究者はペプチド化合物の研究に限定される。国際特許出願WO９４／０５３９４（１９９４）に、Hadson，D.らは、固相プレート上、４×４から４００×４００のアレー中、バイオポリマーのコンビナトリアルライブラリーを合成および、スクリーニングするための方法と装置を開示している。該ライブラリーは蛍光的標識、放射標識、または酵素結合標的分子もしくはレセプターを用いてスクリーニングされ得る。この方法の欠点は、標的分子がライブラリーのスクリーニングに使用する前に標識されなければならないことである。現在利用可能なコンビナトリアルライブラリースクリーニング技術によって示されるチャレンジは、異なるリガンドのレセプタータンパク質への相対結合親和性については、それらが何の情報も提供していないということである。コンビナトリアルライブラリーを生成する方法が、ペプチドのファージライブラリー表示 (Scott，J．K．ら、Science２４９：３８６〜３９０（１９９０））、無作為合成ペプチドアレー（Lam，K．S.ら、Nature ３５４：８２〜８４（１９９１））、コード化学ライブラリー（Brenner，S.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA８９：５３８１〜５３８３（１９９２））、Hudsonの方法（国際出願ＷＯ９４／０５３９４）、または最も最近のコンビナトリアル有機合成（Gordon，E.ら、J．Med ．Chem．３７：１３８５〜１３９９（１９９４））に関与するものであったとしても、このことは真実である。標的酵素に対するリガンド親和性のハイスループットスクリーニングから定量的結合データを得るために、研究者は酵素活性のアッセイを頼りにしている。酵素はそれ自体、そのリガンド結合効果を速度論的アッセイを用いてモニターし得るので、ハイスループットスクリーニングに適している。実験的終末点は通常分光測光法における変化である。速度論的アッセイを用いる場合、殆どの研究者が２工程法を用い化合物の発見に導いている。第一に、ライブラリー化合物のどれが活性であるかを決めるために、膨大なライブラリー化合物を標的酵素に対しスクリーニングされる。これらのアッセイは通常単一濃度（１０^-4〜１０^-6Ｍの間）で１ないし３回繰返して実施される。第二に、最初のスクリーニングから得られた有望化合物（すなわち、所定の値よりも高い活性を示す化合物）は、通常再試験され、５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）、インヒビターの会合定数（Ｋ₁）、または解離定数（Ｋ_d）を決定される。しかし、この２工程法は非常に労力集約的であり、時間を消費し、そして間違い易い傾向がある。各再試験サンプルは、最初のアッセイプレートから回収されるか、あるいは秤量され、そして再溶解されなければならない。次いで濃度曲線は各サンプルについて作成され、そして別のアッセイプレートセットは各アッセイについて作製されなければならない。コンビナトリアルライブラリーのハイスループットに対する生化学的方法と関連する他の問題がある。代表的には、所定のアッセイ法は１種を超えるレセプターには適用できない。すなわち、新しいレセプターが試験のために利用可能になる場合、新しいアッセイ法を開発しなければならない。多くのレセプターにとって、信頼できるアッセイ法は簡単には利用できない。例えアッセイ法が存在したとしても、それが自動化に適していないかもしれない。さらに、もしＫ_iが速度論的アッセイにおいて測定すべき終末点であるならば、使用するインヒビターの濃度を先ず推測し、アッセイを実施し、次いで少なくとも６種の異なる濃度のインヒビターでさらなるアッセイを実施しなければならない。もし低すぎると推測するならば、インヒビターは試験した準至適濃度でその阻害効果を発揮しない。上記の速度論的スクリーニング法の欠点に加えて、酵素の活性部位外で結合するリガンドを同定およびランクづけするために速度論的方法を用いるのは困難である。活性部位外で結合するリガンドは分光測光基質の結合を防止するものではないので、モニターすべき分光測光の変化がない。速度論的スクリーニング法に対するより深刻な欠点は、酵素不在レセプターが全くアッセイされ得ないということである。熱タンパクほどけ（または熱「シフト」）アッセイは、所定のリガンドが標的レセプタータンパク質に結合するか否かを決定するのに用いられている。物理的熱シフトアッセイにおいては、タンパク質の生物物理学的パラメーターの変化が上昇温度の関数としてモニターされる。例えば、熱量測定の研究において、測定される物理的パラメーターはタンパク質が温度誘導ほどけ転移を受けるときの熱容量の変化である。示差走査熱量測定法はストレプトアビジンに対する一団のアゾベンゼンリガンドの親和性を測定するのに用いられている（Weber，P.ら、J.A m．Chem．Soc．１６：２７１７〜２７２４（１９９４））。滴定熱量測定法は、リガンドの標的タンパク質に対する結合定数を測定するのに用いられている（Br andts，J.ら、American Laboratory２２：３０〜４１（１９９０））。しかし、熱量測定法では研究者が熱量測定装置に接近することが必要である。さらに、熱量測定技術は日に３度の熱走査が日常的であるコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニングには適していない。熱量測定技術のような特別の技術は、タンパク質ほどけを誘導する温度をモニターするのに使用されている（Bouvier，M.ら、Science ２６５：３９８〜４０２（１９９４）；Chavan,A．J.ら、Biochemistry ３３：７１９３〜７２０２（１９９４）；Morton,A.ら、Biochemistry １９９５：８５６４〜８５７５（１９９５））。上記の熱量測定および分光熱シフトの研究は全て共通の制限を有している。各研究において、唯一の結合反応が加熱され、そして適宜アッセイされた。通常行われるように、単回のサンプル加熱およびアッセイの構成が、熱シフト技術をコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニングに適用するのを妨げてきた。従って、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするのに用られ得る上に、リード化合物を同定およびランク付けするのに用いることが可能で、かつ、全てのレセプタータンパク質に適用可能な熱シフト技術が必要である。熱シフトアッセイは、リガンドがＤＮＡに結合するか否かを決定するのに用いられている。熱量測定、吸光度、円偏光二色性、および蛍光技術が用いられている（Pilch,D.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．９１：９３３２〜９３３６（１９９４）；Lee，M.ら、J．Med．Chem．３６：８６３〜８７０（１９９３）;Bu tour，J.-L.ら、Eur．J.Biochem．２０２：９７５〜９８０（１９９１）；Barce lo,F.ら、Chem.Biol．Interactions ７４：３１５〜３２４（１９９０））。しかし、通常用いられるようなこれらの技術は、高親和性で結合するリード化合物に対する核酸レセプターのハイスループットスクリーニングを妨げている。従って、目的のＤＮＡ配列に結合するリード化台物の親和性を同定し、そしてランク付けするのに用いられ得る熱シフト技術が必要である。細菌性細胞を外来タンパク質を過剰発現させるのに用いられる場合、しばしば、組換えタンパク質は細菌性細胞封入体中に隔離される。有用な組換えタンパク質は、封入体から精製されなければならない。精製工程において、組換えタンパク質は変性され、そして次に再生されなければならない。所定の組換えタンパク質の適当な再折り畳みを促進し、そして最適化する再生条件を予測することは不可能である。通常、満足し得る条件設定が見つかるまで、多くの再生条件を試みなければならない。Tachibanaらの研究においては、４つのジスフィド結合のそれぞれは、ニワトリのリゾチームから部位特異的変異誘発により１つづつ除去された(Tachibanaら、Biochemistry ３３：１５００８〜１５０１６（１９９４））。変異遺伝子は、細菌性細胞中に発現され、そして組換えタンパク質が封入体から単離された。単離したタンパク質のそれぞれは、異なる温度およびグリセリン濃度のもとで再生された。タンパク質再折り畳みの効力は、溶菌活性が再生温度の関数として測定される溶菌アッセイにより評価された。各タンパク質の熱安定性は、物理的熱シフトアッセイにより研究された。しかし、この研究では、唯一のサンプル反応が加熱され、そして適宜アッセイされた。単回のサンプル加熱およびアッセイの構成が、熱シフト技術をタンパク質再折り畳み条件多様性のハイスループットスクリーニングへの適用を妨げる。従って、種々のタンパク質再折り畳み条件の効力をランク付けるのに用いられ得る熱シフト技術が必要である。過去４０年に渡り、Ｘ線結晶学ならびにタンパク質および核酸の得られる原子モデルが、生物学的現象の構造的、分子的、および化学的局面の理解に大きく貢献してきた。しかし、結晶学的分析は、Ｘ線品質のタンパク質結晶を得るための簡単な方法論がないために難しいままである。通常の方法は、結晶化を促進する最も高い可能性を有する結晶化条件を同定するのに迅速に用られ得ない（Garavi to,R.M.ら、J.Bioenergtics and Biomembranes ２８：１３〜２７（1996））。機能的デザイン実験および連続自動化グリッドサーチ（Cox，M．J.およびWebe r，P．C.、J．Appl．Cryst．２０：３６６〜３７３（１９８７）;Cox，M．J.およびWeber，P．C.、J．Crystal Growth ９０：３１８〜３２４（１９８８））を使用しても、Ｘ線品質タンパク質結晶の結晶化を促進する生化学条件の迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするものではない。さらに、異なるタンパク質は、その折り畳みで経験しているように、タンパク質結晶化のために異なる条件を必要とすると予測される(McPherson，A、Preparation and An alysis of Protein Crystals，Wiley Interscience，New York（１９８２）)。結晶化条件を決める通常の方法は、やっかいで遅く、労力集約的である。従って、タンパク質結晶化条件の効力をランク付けするのに使用され得る迅速なハイスループット技術が必要である。コンビナトリアル分子または熱シフトアッセイにおける標的タンパク質を安定化する生化学的条件の迅速なハイスループットスクリーニングは、多くのサンプルを同時加熱することにより容易となる。しかし、今日まで、熱シフトアッセイはその方法では実施されていない。代りに、熱シフトアッセイを実施する通常のアプローチでは、単一のサンプルのみを一時的に加熱およびアッセイしている。すなわち、研究者は便宜的に、１）加熱装置中で所望の温度でサンプルを加熱し、２）物理的変化、例えば、光の吸収あるいは二次元、三次元または四次元タンパク質構造をアッセイし、３）このサンプルを次に高い所望の温度に加熱し、４）物理的変化をアッセイし、そして５）この工程をサンプルを最も所望される温度でアッセイするまで繰り返し継続する。この便宜的なアプローチは少なくとも２つの理由で不利である。第一に、この方法は労力集約的である。第二に、このアプローチは熱シフトスクリーニングアッセイを実施することのできるスピードを制限し、そしてそれによって標的レセプターに結合するコンビナトリアル分子の迅速なハイスループットスクリーニングおよび標的タンパク質を安定化する生化学的条件を妨げる。従って、全てのレセプター、例えば可逆的に折り畳み得るタンパク質を含むレセプターに対して適切な迅速なハイスループット熱シフトアッセイを実施することのできる装置が必要である。発明の要旨本発明は、熱変化に起因して変性し得る標的分子を安定化させる多数の異なる分子、または異なる生化学的条件の一つ以上の効力をランク付けするための多変量方法を提供する。この方法は標的分子を多数のコンテナー各々において、一つ以上の多数の異なる分子と、または異なる生化学的条件で接触させ、同時に多数のコンテナーを加熱し、コンテナーの各々の中で、加熱により生じた標的分子の熱変性に伴う物理的変化を測定し、コンテナーの各々について、温度の関数としての標的分子について熱変性曲線を描き、変性曲線の各々を（ｉ）他の熱変性曲線の各々および（ii）一組の参照の生化学条件下で標的分子について得られた熱変性曲線と比較し、そして多数の異なる分子の効力または異なる生化学条件の効力を熱変性曲線の各々の変化に従ってランク付けすることを含む。本発明は、熱変化に起因して変性し得る標的分子のシェルフライフを最適化する多変量方法を提供する。この方法は標的分子を多数のコンテナーの各々において、一つ以上の多数の異なる分子と、または異なる生化学的条件で接触させ、同時に多数のコンテナーを加熱し、コンテナーの各々の中で、加熱により生じた標識分子の熱変性に伴う物理的変化を測定し、コンテナーの各々について、温度の関数としての標的分子についての熱変性曲線を描き、変性曲線の各々を（ｉ）他の熱変性曲線の各々および（ii）一組の参照の生化学条件下で標的について得られた熱変性曲線と比較し、そして多数の異なる分子の効力および異なる生化学条件の効力を熱変性曲線の各々の変化に従ってランク付けすることを含む。本発明はまた、熱変化に起因して変性し得る標的分子に対し２つ以上の多数の異なる分子の組合せの親和性をランク付けする多変量方法を提供する。この方法は、多数のコンテナーの各々において標的分子を多数の異なる分子のうちの２つ以上の異なる分子の組合せと接触させ、同時に多数のコンテナーを加熱し、コンテナーの各々の中で、加熱により生じた標的分子の熱変性に伴う物理的変化を測定し、コンテナーの各々について、温度の関数としての標的分子の熱変性曲線を描き、変性曲線の各々を（ｉ）標的分子について得られた他の熱変性曲線の各々および（ii）二つ以上の異なる分子のいずれかの非存在下で標的分子に対しての熱変性曲線と比較し、そして二つ以上の多数の異なる分子の組合せの親和性を熱変性曲線の各々の変化に従ってランク付けすることを含む。本発明はまた、変性タンパク質のサンプルの再折り畳みを容易にするための一つ以上の多数の異なる生化学的条件の効力をランク付けする多変量方法を提供する。この方法は再折り畳みタンパク質サンプルの一つを多数のコンテナーの各々に入れ、その際再折り畳みタンパク質サンプルの各々はあらかじめ一つ以上の多数の条件に従って再折り畳みしてあり、同時に多数のコンテナーを加熱し、コンテナーの各々の中で、加熱により生じたタンパク質の熱変性に伴う物理的変化を測定し、コンテナーの各々について、温度の関数としてのタンパク質の熱変性曲線を描き、変性曲線の各々を（ｉ）他の熱変性曲線の各々および（ii）一組の参照の生化学条件下でネイティブタンパク質について得られた熱変性曲線と比較し、そして多数の異なる再折り畳み条件の効力を熱変性曲線の各々の物理的変化の大きさの変化に従ってランク付けすることを含む。本発明はまた、変性タンパク質のサンプルの再折り畳みを容易にするための一つ以上の多数の異なる生化学的条件の効力をランク付けするためのさらなる多変量方法を提供し、その方法はタンパク質の安定性を促進する多数の異なる条件の一つ以上の組合せを決定し、変性タンパク質をタンパク質の安定性を促進すると確認した該生化学条件の一つ以上の組合せの下で折り畳み、折り畳まれたタンパク質収量を評価し、該多数の異なる再折り畳み条件の効力を折り畳まれたタンパク質収量に従ってランク付けし、そしてこれらの工程を最適タンパク質折り畳みを促進する生化学的条件の組合せが確認されるまで繰り返すことを含む。マイクロプレート熱シフトアッセイ法を用いて、一つ以上の生化学的条件がタンパク質の安定性にさらに効果を示すかどうかを決定し得る。一旦、熱シフトアッセイを用いてタンパク質の安定性の増大を容易にする一組の生化学的条件が確認されると、同じ条件の組が組換えタンパク質でのタンパク質折り畳み実験に使用され得る。熱シフトアッセイにおいてタンパク質の安定性を促進する条件が組換えタンパク質の折り畳みを促進する条件と相関する場合、さらにタンパク質の安定性を増大するに至る安定化条件の組合せが確認されるまで、さらなる熱シフトアッセイを実施することにより条件はさらに最適化され得る。次いで、組換えタンパク質はこれらの条件下で折り畳まれる。この工程は最適折り畳み条件が確認されるまで繰り返される。本発明はまた、熱変化に起因して変性し得るタンパク質の結晶化を容易にするための一つ以上の多数の異なる生化学的条件の効力をランク付けする多変量方法を提供する。この方法は、多数のコンテナーの各々において、タンパク質を一つ以上の多数の異なる生化学的条件と接触させ、同時に多数のコンテナーを加熱し、コンテナーの各々の中で、加熱により生じたタンパク質の熱変性に伴う物理的変化を測定し、コンテナーの各々について、温度の関数としてのタンパク質について熱変性曲線を描き、変性曲線の各々を（ｉ）他の熱変性曲線の各々および（ii ）一組の参照の生化学条件を用いて得られた熱変性曲線と比較し、そして多数の異なる生化学的条件の効力を熱変性曲線の各々の変化に従ってランク付けすることを含む。本発明はまた、熱変化に起因して変性し得る標的分子に対する多数の異なる分子の各々の親和性をランク付けするための方法を提供する。この方法は、多数のコンテナーの各々において、標的分子を多数の異なる分子の一分子と接触させ、同時に多数のコンテナーを加熱し、コンテナーの各々の中で、加熱により生じた標的分子の熱変性に伴う物理的変化を測定し、コンテナーの各々について、温度の関数としての標的分子について熱変性曲線を描き、熱変性曲線の各々を多数の異なる分子の内のいずれかの分子の非存在下に標的分子に対して得られた熱変性曲線と比較し、そして各分子の親和性を熱変性曲線の各々の変化に従ってランク付けすることを含む。本発明はまた、熱変化に起因して変性し得る標的分子に結合する分子に対して多数の異なる分子のプールまたはコレクションをアッセイする方法を提供する。この方法は、多数のコンテナーの各々において、標的分子を多数の異なる分子の少なくとも２分子のコレクションと接触させ、同時に多数のコンテナーを加熱し、コンテナーの各々の中で、加熱により生じた標的分子の熱変性に伴う物理的変化を測定し、コンテナーの各々について、温度の関数としての標的分子の熱変性曲線の一組を描き、熱変性曲線の各々を多数の異なる分子の内のいずれかの分子の非存在下に標的分子に対して得られた熱変性曲線と比較し、異なる分子のコレクションの親和性を熱変性曲線の各々の変化に従ってランク付けし、標的分子に対して親和性を有する分子を含む異なる分子のコレクションを選択し、多数のコンテナーの各々において、選択したコレクションを分子のより小さいコレクションに分割し、そして多数の分子の中の最初の熱シフトの原因となる単一分子が同定されるまで上記工程を繰り返すことを含む。本発明はまた、多数の化合物を合成し、レセプター分子に結合する各化合物の能力を試験することを含む、リード化合物を生成する改良法を提供する。この改良はレセプター分子をマイクロプレートの多数のウェルの各々において多数の異なる化合物の一化合物と接触させ、同時にウェルを加熱し、各ウェル中で加熱により生じたレセプター分子の熱変性に伴う物理的変化を測定し、各ウェルについて、温度の関数としてのレセプター分子の熱変性曲線を描き、熱変性曲線の各々を多数の異なる化合物の内のいずれかの化合物の非存在下にレセプター分子に対して得られた熱変性曲線と比較し、そして各化合物の親和性を熱変性曲線の各々の変化に従ってランク付けすることを含む。本発明はまた、その中に多数のコンテナーを有する担持体およびコンビナトリアルライブラリーに存在する多数の異なる分子から選択される少なくとも一種の分子を含む製造産物を提供し、コンテナーの各々は加熱により変性させ得る標的分子を含み、異なる分子の各々は担持体中多数のコンテナーの異なる一個に存在する。タンパク質安定性、リガンド結合、タンパク質折り畳み、およびタンパク質結晶化の最適化は多変量事象である。多変量最適化問題は、どの変数が好ましい応答に影響するかを決めるために、できるだけ多くのデータを集めるための膨大な数の並行実験を必要とする。例えば、多変量最適化問題はどの変数がタンパク質安定性に影響するかを決めるために、できるだけ多くのデータを集めるための膨大な数の並行実験を必要とする。この観点において、タンパク質結晶化と定量的構造活性相関分析の両方が、生化学的または化学的組成物において増加する変化のマトリックス配列を採用する大量スクリーニング・プロトコールから大きな利益を得ている。このように、定量的構造活性相関は所与の治療的レセプターに対する結合親和性への影響に対してリガンド上の化学官能基の変化に関係するように構成されるのと殆ど同じ方法で、本発明の方法および装置は、実験的に測定されたタンパク質の安定性、リガンドの特異性、折り畳みタンパク収量、および結晶化タンパク質収量に対する種々の生化学的条件に関係する定量モデルの構築を容易にする。本発明は、タンパク質の安定性、リガンド結合、タンパク質の折り畳み、およびタンパク質の結晶化などの多変量事象を最適化するために採用される、これまでの技術を超えた、多くの利点を提供する。これらの利点の内でも第一に挙げられるのは本発明がハイスループットスクリーニングを容易にすることである。さらに、本発明はコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするために採用される、これまでの技術を超えた多くの利点を提供する。これらの利点の内でも第一に挙げられるのは本発明がリード化合物を求めるコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニングを容易にすることである。多くの現在のライブラリースクリーニング技術は単にリガンドがレセプターに結合するか否かを示すだけである。その場合には、定量的な情報は提供されない。一連のリガンドの相対結台親和性についての情報は提供されない。これに対して、本発明は標的レセプターに対する一連の化合物の相対的親和性のランク付けを容易にする。手にしたこの情報で、構造活性相関は、化合物のセットについて開発され得る。相対的結合親和性をランク付けするための中間点ほどけ温度（T_m）のリガンド依存性変化を用いることの容易さ、再現性および迅速性が本発明を医薬発見過程での有力な手段とする。代表的には、通常の動力学的スクリーニング法は、Ｋ_iを決めるインヒビターの６つの異なる濃度で少なくとも６つの追加ウェルアッセイを必要とする。本発明を用い、スループットは、一つの完全な結合実験を多穴マイクロプレートの各ウェルで実施できるので、酵素を基礎とするアッセイの約６倍まで増大する。動力学的スクリーニング法では、約１nMのタンパク質濃度で通常生じる希釈とシグナル検出間の通常の妥協点によりさらに制限される。この観点で、熱量測定法、すなわち、示差走査熱量測定法または等温滴定熱量測定法のいずれかは、それらが単一の結合実験、通常単位時間当たり１に制限されるので、なお一層不利である。それに対して、本発明では測定可能な結合親和性のダイナミック・レンジが１ウェル当たり約10^-4〜10^-15と広くなっている。本発明では放射活性標識化合物を必要としない。また、レセプターを蛍光または発色団標識物で標識する必要もない。本発明の非常に重要な利点は、医薬標的であるどのレセプターにも広く適用し得ることである。このように、新しいレセプターが試験用に入手可能になるたびに新しいアッセイ法を発明する必要はない。研究中のレセプターが酵素である場合、研究者は従来の動力学的方法を使用するよりも、より迅速に、より容易に一連の化合物の親和性ランク順位を決定し得る。さらに、研究者は、活性部位、アロステリック補因子結合部位、またはレセプター・サブユニット界面で結合が起こるか否かに拘わらず、酵素に結合するリガンドを検出し得る。本発明はタンパク質および核酸などの非酵素レセプターにも同様に適用し得る。本発明のさらなる局面において、複数のサンプルを同時に加熱するための加熱手段とサンプルを加熱している間、サンプルからのスペクトル発光を受ける受光手段とを備えるアッセイ装置を提供する。本発明のなおさらなる局面は、所定の温度プロフィールに従って複数サンプルの温度を同時に調整するための温度調整手段と、温度プロフィールに従ってサンプル温度を調整する間、サンプルからのスペクトル発光を受ける受光手段とを備えているアッセイ装置を提供する。さらなる局面において、本発明はまた、複数の熱伝導ブロックを配置した可動プラットフォームを備えているアッセイ装置を提供する。熱伝導ブロックの温度、およびそのサンプルは温度調整手段により調整される。複数の熱伝導ブロックの各々は複数のサンプルを受け入れるように適合させる。サンプルに対して励起波長を発生させる光源を備えている。サンプルの温度が調節される一方で、センサが光の励起波長に応答してサンプルからのスペクトル発光を検出する。可動プラットフォームは複数の熱伝導ブロックの各々においてサンプルからのスペクトル発光を連続的に検出するための熱伝導ブロック間を移動する。本発明のアッセイ装置はタンパク質の安定性に影響する分子および生化学的条件を迅速にスクリーニングする機会を当業者に与える。サンプルは一定の温度範囲で同時に加熱される。加熱の間、スペクトル発光を受け入れる。本発明のアッセイ装置はまた、本発明の方法を簡便に効率的に実施する機会を技術者に提供する。本発明のアッセイ装置は、標的タンパク質を安定化する分子および生化学的条件の熱シフトアッセイを実施するのに特に適合する。本発明の装置は加熱手段およびスペクトル発光受け入れ手段の両方を含むので、本発明の装置は一つの装置でサンプルを加熱し、スペクトル発光を読み取る前にサンプルを他の装置に移す必要性を除去する。結果として、本発明の装置は、増大する温度上昇および中間段階での冷却工程よりもむしろ所定の温度プロフィールに従って温度変化させるのを容易にする。このように、より多くのデータポイントが所定のサンプルについて収集され、より正確な情報が得られる。さらに、本発明のアッセイ装置は加熱手段およびスペクトル発光受け入れ手段の両方を含むので、サンプルを加熱している間中、サンプルからのスペクトル測定を実施し得る。このように、本発明のアッセイ装置を用いて、当業者は不可逆的ほどけタンパク質および可逆的折り畳みタンパク質の双方を研究し得る。本発明のさらなる特徴および利点を、添付の図面を参照しながら、以下に詳細に記載する。図面の簡単な説明本発明を、添付の図面を参照して記載する。図面において、同じ参照番号は同一のまたは機能的に同じ要素を示す。さらに、参照番号の左端の番号は、参照番号が最初に現れる図面を同定する。図１は、ヒトα−トロンビンの活性部位に結合するリガンドに対するマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す（実験シグナルとして濁りを使用）。図２は、酸性線維芽細胞成長因子（aFGF）に結合するリガンドに対するマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す（実験シグナルとして濁りを使用）。図３は、ヒトα−トロンビンの活性部位に結合するリガンドに対するマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す（実験シグナルとして蛍光発光を使用）。データポイントを結んで引いた線は、図面の下部に示す等式を用いたデータの非線形最小二乗法曲線あてはめを表す。この等式のy(T)対Ｔに対して５つのあてはめパラメーターがある：(1)y_f、天然タンパク質についての遷移前蛍光;(2)y_u 、ほどけたタンパク質の遷移後蛍光；(3)T_m、ほどけ遷移の中点での温度；(4)Δ H_u、van't Hoffほどけエンタルピー変化；(5)ΔC_pu、タンパク質ほどけに際する熱容量変化。非線形性最小二乗法曲線あてはめはKaleidaGraph^TM3.0ソフトウエア（Synergy Software，Reading PA）を用いて実施したものであるが、これはフロートに対して５つのあてはめパラメーターを可能とするが、一方で偏差の二乗の和を最小化するためのマルカート（Marquardt）法を利用した。図４は、ヒトFGFレセプタ−１のD(II)ドメイン(D(II)FGFRl)に結合するリガンドに対するマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す（実験シグナルとして蛍光発光を使用）。データポイントを結んで引いた線は、図３に記載したように、図面の下部に示す等式を用いたデータの非線形性最小二乗法曲線適合を表す。図５は、任意のリガンドの非存在下でのD因子に対する小型化マイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図６は、任意のリガンドの非存在下でのXa因子に対するマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図７は、ヒトα−トロンビンの触媒部位に結合するリガンドの小型化マイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図８は、ヒトFGFレセプター１のD(II)ドメインに結合するアプロスレート(apr osulate)の小型化マイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図９は、glu-gly-argクロロメチルケトン存在下でのウロキナーゼに対する小型化マイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図10は、アッセイ容量２μｌでのヒトα−トロンビンにおける小型化マイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。３回の実験での熱変性曲線を示す。図11はアッセイ容量５μlでのヒトα−トロンビンにおける小型化マイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。５回の実験での熱変性曲線を示す。図12は、４種の異なる化合物の存在下での、ヒトα−トロンビンの個別の４回の実験における単一温度マイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図13は、ヒトα−トロンビンの内因性トリプトファン蛍光のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。このアッセイにおいては、ブランク・ウェルの蛍光をサンプル蛍光から差し引かなかった。図14は、ヒトα−トロンビンの内因性トリプトファン蛍光のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。このアッセイにおいては、ブランク・ウェルの蛍光をサンプル蛍光から差し引かなかった。図15は、ヒトα−トロンビンの３つの異なるクラスの結合部位に対する単一リガンド結合相互作用のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図16は、ヒトα−トロンビンに対する多リガンド結合相互作用の、マイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図17A〜Dは、ヒトα−トロンビンの安定性におけるpH効果、および種々の塩化ナトリウム濃度のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図17Aにおいて、蛍光体は1,8-ANSである。図17Bにおいて、蛍光体は2,6-ANSである。図17C において、蛍光体は2,6-TNSである。図17Dにおいて、蛍光体はbis-ANSである。図18は、ヒトα−トロンビンの安定性における塩化カルシウム、エチレンジアミン四酢酸、ジチオスレイトール、およびグリセロールの効果のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図19は、ヒトD(II)FGFレセプター１の安定性におけるpH効果、および種々の塩化ナトリウム濃度についてのマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図20は、ヒトD(II)FGFレセプター１の安定性における種々の生化学的条件の効果についてのマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図21は、ヒトD(II)FGFレセプター１の安定性における種々の生化学的条件の効果についてのマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図22は、ヒトD(II)FGFレセプター１の安定性における種々の生化学的条件の効果についてのマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図23は、ヒトD(II)FGFレセプター１の安定性における種々の生化学的条件の効果についてのマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図24は、ヒトD(II)FGFレセプター１の安定性における種々の生化学的条件の効果についてのマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図25は、ヒトウロキナーゼの安定性における種々の生化学的条件の効果についてのマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図26は、タンパク質の折り畳みおよびリガンド結合の自由エネルギーの結合についての、熱力学モデルの模式図である。図27は、タンパク質折り畳みを最適化する生化学的条件をスクリーニングする方法の模式図である。図28は、種々の蛍光体を用いるヒトα−トロンビンのマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。図29は、本発明のアッセイ装置の１つの実施態様の模式図を示す。図30は、本発明のアッセイ装置の別の実施態様の模式図を示す。図31は、本発明の別の実施態様によるアッセイ装置の模式図を示す。図32A〜Eは、本発明アッセイ装置のための熱電気ステージの１つの実施態様を示す。図32Aは、熱電気ステージの側面図を示す。図32Bは熱電気ステージの平面図を示す。図32C〜Eは、熱電気ステージに取り付けられ得る挿入部の３つの形状を示す。１つの実施態様において、挿入部はマイクロタイタープレートが適応し得る。そのような実施態様において、アッセイサンプルはマイクロタイタープレートのウェル内に含まれる。図33は、本発明アッセイ装置の別の実施態様の平面図を説明する模式図である。図34は、ハウジングに組込まれた図33に示したアッセイ装置の実施態様の平面図を説明する模式図である。図35は、図33および図34に示したアッセイ装置の実施態様の側面図を例示する模式図である。図36Aおよび図36Bは、温度プロフィール、および本発明自動アッセイ装置を用いてどのように温度プロフィールを実施するかを例示する。図37は、本発明での使用に適切な例示的なコンピューターシステムを示す。図38は、本発明実施実施態様の１つを例示するフローチャートを示す。図39は、本発明の代替の実施実施態様の１つを例示するフローチャートを示す。図40は、蛍光スキャナーおよびCCDカメラを用いて実施した、ヒトα−トロンビン変性についてのマイクロプレート熱シフトアッセイ結果の比較を示す。図41Aおよび41Bは、CCDカメラを用いて実施した、ヒトα−トロンビン変性についてのマイクロプレート熱シフトアッセイの写真を示す。図41A：Ｖ底ウェルマイクロプレート。図41B：ディンプルマイクロプレート。図42は、蛍光スキャナーおよびCCDカメラを用いて実施した、ヒトα−トロンビン変性についてのマイクロプレート熱シフトアッセイ結果の比較を示す。好ましい実施態様の詳細な説明以下の記載においては、生化学および薬理学技術における当業者に公知の、種々の用語および方法論が参照される。このような用語および方法論を記載する刊行物および他の資料は、その全体が発表されているものとして本明細書に参考として援用される。本発明の方法の概観本発明は、多数の異なる分子を、熱変化によりほどけ得る標的分子に結合する能力の順にランク付けする方法を提供する。この方法の１つの実施態様において、標的分子は、複数のコンテナーのそれぞれにおいて、複数の異なる分子の１つの分子に接触される。コンテナーは同時にある温度範囲に渡って間隔をおいて加熱される。各加熱間隔の後に、標的分子の熱変性に伴う物理的変化を測定する。本発明における代替の実施態様において、コンテナーは連続様式において加熱される。各コンテナーにおける熱ほどけ曲線が、標的分子に対して温度を関数としてプロットされる。好ましくは、各熱ほどけ曲線の温度中点（T_m）を確認し、該コンテナー中の分子のいずれかが不存在の条件で標的分子に対して得た熱ほどけ曲線のT_mと比較する。あるいは、熱ほどけ曲線全体を他の熱ほどけ曲線全体とコンピューター分析手段を用いて比較され得る。用語「コンビナトリアルライブラリー」とは、所定の長さの化合物に対してあらゆる可能な方法で、構造に関係のあるもの、ないものも含め一組の化学的もしくは生化学的ビルディングブロックを組合わせることによって形成される複数の分子または化合物をいう。あるいは、この用語は、一組の特定の化学的ビルディングブロックを選択的に組み合せることにより形成される複数の化学的もしくは生化学的化合物をいう。コンビナトリアルライブラリーは、当業者に周知の方法用語「コンビナトリアルライブラリー」は、米国特許第5,463,564号に記載される、DirectedDiversityライブラリーをいう。コンビナトリアルライブラリーの構築様式に関わらず、ライブラリーの各分子または化合物は将来の参照のためにカタログ化される。用語「化合物ライブラリー」は複数の分子または化合物をいうが、それらは化学的または生化学的ビルディングブロックを組み合わせるコンビナトリアルアプローチを用いて形成されたものではない。代わりに、化合物ライブラリーは将来のリガンド−レセプター結合アッセイでの使用のために蓄積され、貯蔵された複数の分子または化合物である。化合物ライブラリー中の各分子または化合物は将来参照のためにカタログ化される。用語「多数の分子」、「多数の化合物」または「多数のコンテナー」は、少なくとも２個の分子、化合物またはコンテナーをいう。用語「多変量」は、１つ以上の実験的変量をいう。用語「スクリーニング」は、多数の分子または化合物を、変性され得る標的分子に結合する能力について試験することをいう。用語「ランク付け」は、任意の分子または化合物の非存在下での標的分子の熱変性曲線に比較して、標的分子の熱ほどけ曲線をシフトさせる分子または化合物の能力に対応して、多数の分子または化合物について標的分子への親和性に順序を付けることをいう。用語「ランク付けする」はまた、タンパク質の安定化、タンパク質の折り畳み、タンパク質の結晶化、またはタンパク質の貯蔵寿命を最適化する際の多数の生化学的条件の効率に順序を付けることをいう。タンパク質の安定化を最適化すること、タンパク質の折り畳みを最適化すること、タンパク質の結晶化を最適化すること、およびタンパク質の貯蔵寿命を最適化することという状況において、用語「ランク付けする」とは一組の参照の生化学的条件下での標的分子の熱変性曲線と比較して、標的分子の熱変性曲線をシフトさせる１つ以上の生化学的条件の組合わせの効率に順序を付けることをいう。用語「参照条件の一組」とは、標的分子に対する熱ほどけ曲線が得られる一組の参照生化学的条件をいう。参照条件とは異なる条件下で得られる熱変性曲線は互いに比較され、そして、参照条件下で標的分子について得られる熱変性曲線と比較される。上記で議論したように、熱変性曲線のT_nにおける変化に応じて、分子、化合物または生化学的条件をランク付けするのが好ましい。あるいは、分子、化合物または生化学的条件を熱変性曲線の全体の変化に対応して、標的分子を安定化する能力についてランク付けされ得る。用語「リード分子」は、標的分子に対して比較的高い親和性を示す、コンビナトリアルライブラリー由来の分子または化合物をいう。用語「リード化合物」と「リード分子」は同義語である。用語「比較的高い親和性」は10^-4〜10^-15Mまでの範囲のK_dを有する親和性に関する。用語「標的分子」はペプチド、タンパク質、核酸、および他のレセプターを包含する。この用語は酵素、および酵素でないタンパク質の両方を包含する。この用語は単量体および多量体タンパク質を包含する。多量体タンパク質は、ホモ体またはヘテロ体であり得る。この用語はオリゴヌクレオチドのような少なくとも２つのヌクレオチドを含む核酸を包含する。核酸は一本鎖、二本鎖あるいは三重鎖であり得る。この用語は合成オリゴヌクレオチドである核酸、組換えDNA分子の一部分、または染色体DNAの一部分を包含する。用語標的分子はまた、折り畳み、コイル化またはねじれ化により２次、３次または４次構造をとり得るペプチド、タンパク質および他のレセプターの部分をも包含する。標的分子は補因子、補酵素、補欠分子群、脂質、オリゴサッカライド、またはリン酸基を含む置換基で置換され得るが、これらに制限されない。用語「変性し得る」は、ほどけ、脱コイル化、または脱ねじれ化により、２次、３次または４次構造を損失することをいう。用語「標的分子」および「レセプター」は同義語である。標的分子の例は、以下の文献に開示されているものを包含するが、これらに制用語「標的分子」は、より詳細には、血液凝固カスケードに関わるタンパク質、腺維芽細胞増殖因子、および腺維芽細胞増殖因子レセプター、ウロキナーゼ、およびＤ因子などをいう。用語「分子」は、標的分子に対しての結合親和性について試験される化合物をいう。この用語は核酸およびペプチドを含むが、これらに制限されない任意の構造の化学化合物を包含する。より詳細には、用語「分子」は、化合物ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリー中の化合物を包含する。用語「分子」および「リガンド」は同義語である。用語「熱変化」および「物理的変化」は、光または熱の形態でのエネルギー放出、光または熱の形態でのエネルギー吸収、濁りの変化、および光の偏光性の変化を包含する。詳細には、この用語は蛍光発光、蛍光エネルギー転移、紫外線もしくは可視光の吸収、光の偏光性の変化、蛍光発光の偏光特性の変化、濁りの変化、および酵素活性の変化をいう。蛍光発光はタンパク質に内因性であるか、あるいは蛍光レポーター分子（下記）により得る。核酸については、蛍光はインターカレート試薬であるエチジウムブロミドにより得る。あるいは、核酸は蛍光体で標識され得る（下記）。用語「標的分子を接触させる」は、広い意味で該標的分子を、結合についてスクリーニングされるべき分子と共に溶液中におくことをいう。あまり広くない意味では、接触は、標的分子と結合について試験されるべき分子の溶液の回転、渦巻、攪拌、または振動をいう。さらに詳細には、接触は、標的分子と結合についてスクリーニングされるべき分子との混合をいう。混合は、例えば、ピペットチップへの取り込みおよび放出を反復することにより達成され得る。好ましくは、接触は、標的分子と結合についてスクリーニングされるべき分子との間の結合の平衡をいう。接触はコンテナー（下記）において、または標的分子と結合について試験されるべき分子とがコンテナーにおかれる前に生じ得る。標的分子は、結合についてスクリーニングされるべき分子との接触に先立ち、核酸と接触させ得る。標的分子は、結合についてスクリーニングされるべき分子との接触に先立ち、ペプチドと複合体化をさせ得る。標的分子は、結合についてスクリーニングされるべき分子との接触に先立ち、リン酸化または脱リン酸化され得る。炭水化物部分は、標的分子を、結合についてスクリーニングされるべき分子と接触させる前に、標的分子に付加され得る。あるいは、炭水化物部分は、標的分子を、結合についてスクリーニングされるべき分子と接触させる前に、標的分子から除去され得る。用語「コンテナー」とは、結合について試験されるべきレセプターおよび分子が配置され得る任意の容器またはチャンバーをいう。用語「コンテナー」は、反応チューブ（例えば、試験管、マイクロチューブ、バイアルなど）を包含する。好ましくは、用語「コンテナー」は、マルチウェルマイクロプレートまたはマイクロタイタープレートのウェルをいう。用語「サンプル」とは、コンテナーの内容物をいう。「熱変性曲線」は、温度の関数としての、タンパク質または核酸の変性に関係する物理的変化のプロツトである。例えば、Davidsonら、Nature Structure Bio logy ２：８５９（１９９５）；Clegg，R．M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S. A．９０：２９９４〜２９９８（１９９３）参照。「中点温度（Ｔ_m）」は、熱変性曲線の温度中点である。Ｔ_mは、当業者に周知の方法を使用して容易に決定され得る。例えば、Weber，P．C.ら、J．Am．Che m．Soc．１１６：２７１７〜２７２４（１９９４）；Clegg，R．M.ら、Proc．Na tl．Acad．Sci．U.S.A．９０：２９９４〜２９９８（１９９３）参照。用語「蛍光プローブ分子」とは、蛍光色素をいい、これは、ほどけたまたは変性されたレセプターに結合し得、そして規定された波長の光による励起後、蛍光エネルギーを発する、蛍光分子または化合物である。用語蛍光プローブ分子は、全ての蛍光色素を包含する。より具体的には、タンパク質に対して、この用語は、蛍光色素、例えば、チオイノシン、およびＮ−エテノアデノシン、ホルマイシン、ダンシル誘導体、フルオレセイン誘導体、６−プロピオニル−２−（ジメチルアミノ）ナフタレン（ＰＲＯＤＡＮ）、２−アニリノナフタレン、およびＮ− アリールアミノ−ナフタレンスルホネート誘導体、例えば、１−アニリノナフタレン−８−スルホネート（１，８−ＡＮＳ）、２−アニリノナフタレン−６−スルホネート（２，６−ＡＮＳ）、２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−フェニル−２ −アミノナフタレン、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−フェニル−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−フェニル−Ｎ−メチル−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−（ｏ−トルイル）−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−（ｍ−トルイル）−２− アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−（ｐ−トルイル）−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、２−（ｐ−トルイジニル）−ナフタレン−６−スルホン酸（２，６−ＴＮＳ）、４−（ジシアノビニル）ジュロリジン（ＤＣＶＪ）、６−ドデカノイル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＬＡＵＲＤＡＮ）、６− ヘキサデカノイル−２−（（（２−（トリメチルアンモニウム）エチル）メチル）アミノ）ナフタレンクロライド（ＰＡＴＭＡＮ）、ナイルレッド、Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミン、１，１−ジシアノ−２−［６−（ジメチルアミノ）ナフタレン−２−イル］プロペン（ＤＤＮＰ）、４，４'−ジアニリノ−１，１− ビナフチル−５，５−ジスルホン酸（ビスＡＮＳ）、およびDapoxyl^TM誘導体（M olecular Probes、Eugene、OR）を包含する。タンパク質に関して好ましくは、この用語は、１，８−ＡＮＳまたは２，６−ＴＮＳをいう。二本鎖オリゴヌクレオチドは、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイにおいて使用され得る。このオリゴヌクレオチドの一方の鎖は、ドナー蛍光色素を含む。オリゴヌクレオチドの他方の鎖は、アクセプター蛍光色素を含む。核酸がドナーまたはアクセプター蛍光色素を「含む」ために、蛍光色素は、オリゴヌクレオチド配列中に直接組込まれ得る。あるいは、蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの５'末端または３'末端のいずれにも付着され得る。ドナー蛍光色素は、光により励起された場合、蛍光エネルギーを発するものである。ドナー蛍光色素が発するエネルギーは、アクセプター蛍光色素により吸収される。用語「ドナー蛍光色素」は全ての蛍光色素を包含し、カルボキシフルオレセイン、ヨードアセトアミドフルオレセイン、およびフルオレセインイソチオシアネートを含むが、これらに限定されない。用語「アクセプター蛍光色素」は全ての蛍光色素を包含し、ヨードアセトアミドエオシンおよびテトラメチルローダミンを含むが、これらに限定されない。用語「キャリアー」は、それ自体が少なくとも２つのコンテナーを支持し得る、プラットフォームまたは他の物体（任意の形状）を包含する。キャリアーは、ガラス、プラスチック、または金属を含むがこれらに限定されない任意の物質から作製され得る。好ましくは、キャリアーはマルチウェルマイクロプレートである。用語マイクロプレートおよびマイクロタイタープレートは同義語である。キャリアーは、加熱エレメントから取り外され得る。本発明において、複数のキャリアーが使用される。各キャリアーは複数のコンテナーを保持する。用語「生化学的条件」は、物理学的、化学的、または生化学的反応の任意の成分を包含する。具体的には、この用語は、温度、圧力、タンパク質濃度、ｐＨ、イオン強度、塩濃度、時間、電流、電位差、補因子、補酵素、酸化剤、還元剤、界面活性剤、金属イオン、リガンド、またはグリセリンの濃度の条件をいう。用語「変性タンパク質」とは、処理して二次、三次、または四次構造を取り除いたタンパク質をいう。用語「ネイティブタンパク質」とは、完全な化学的および生物学的機能を有するタンパク質を提供する、二次、三次または四次構造を有するタンパク質をいう。ネイティブタンパク質は、加熱されていないもの、および変性薬剤または尿素のような化学物質で処理されていないものである。用語「変性核酸」とは、処理して、折り畳まれた、コイル状、または巻きついた構造を除いた核酸をいう。三本鎖核酸複合体の変性は、第三の鎖が２本の相補鎖から取り除かれた場合に完了する。二本鎖ＤＮＡの変性は、２本の相補鎖間の塩基対合が妨げられ、そしてランダム形態であると思われる一本鎖ＤＮＡ分子を生じた場合に完了する。一本鎖ＲＮＡの変性は、分子内水素結合が妨げられ、ＲＮＡがランダムな非水素結合形態であると思われる場合に完了する。用語「折り畳み」、「再折り畳み」、および「再生」とは、生体分子の完全な化学的および生化学的機能を与える、タンパク質または核酸の正確な二次、三次、または四次構造の獲得をいう。用語「効力」とは、ほどけたまたは変性タンパク質の再折り畳みまたは再生を容易にすることにおける、特定セットの生化学的条件の有効性をいう。用語「スペクトル測定」および「分光光度測定」とは、光吸収の変化を測定することをいう。濁り度測定、可視光吸収測定、および紫外線吸収測定は、スペクトル測定の例である。用語「旋光測定」とは、発光および蛍光発光の旋光特性の変化を測定することをいう。円二色性および旋光は、旋光計で測定され得る、光の旋光特性の例である。円二色性および旋光の測定は、分光偏光計を使用して行われる。「非旋光」測定とは、分光偏光計を使用して得られない測定である。用語「コレクション」とは、標的分子またはレセプターへの結合について試験されるべき少なくとも１つの分子のプールまたはグループである。「宿主」とは、バクテリア細胞であって、この宿主バクテリア細胞に対して異種であるタンパク質を発現させる目的で組換えＤＮＡで形質転換したものである。熱シフトアッセイは、タンパク質または核酸のようなレセプターの熱変性曲線のリガンド依存性変化に基づく。ある範囲の温度を超えて加熱される場合、レセプターはほどける。変性の程度を温度の関数としてプロットすることにより、レセプターについての熱変性曲線が得られる。熱変性曲線における有用な参照点は、温度中点（Ｔ_m）であり、この温度でレセプターは半分が変性される。リガンド結合はレセプターを安定化する（Schellman，J.、Biopolymers、１４：９９９〜１０１８（１９７５））。結合の程度および相互作用の自由エネルギーは、リガンド濃度の関数として平行なコースをたどる（Schellman，J.、Bio physical Chemistry ４５：２７３〜２７９（ｌ９９３）；Barcelo，F.ら、Chem .Biol．Interaction ７４：３１５〜３２４（１９９０））。リガンドによる安定化の結果として、より多くのエネルギー（熱）が、レセプターの折り畳みを解くために必要とされる。したがって、リガンド結合は、熱変性曲線をシフトさせる。この特性は、リガンドがレセプターに結合するか否かを決定するために利用される。熱変性曲線の変化または「シフト」、したがってＴ_mの変化または「シフト」は、リガンドがレセプターに結合することを示唆する。熱シフトアッセイのための熱力学的基礎は、Schellman，J.A．(Biopolymers １５：９９９〜１０００（１９７６）)およびBrandtsら(Biochemistry ２６：６９２７〜６９４０（１９９０）)により記載されている。Brandtsら(Biochemistr y ２６：６９２７〜６９４０（１９９０）)による示差走査熱量測定の研究は、一回のほどけ遷移がある、１：１化学量論の堅固な結合系に関して、以下の式からＴ_mでの結合親和性が推定され得ることを示している：Ｔ_m＝リガンド存在下におけるタンパク質ほどけ遷移についての中点；Ｔ₀＝リガンド非存在下におけるほどけ遷移についての中点；Ｒ＝気体定数。パラメータ一ΔＨ。およびΔC。。は、通常、示差走査熱量測定実験から観察され、そして各レセプターに対して特異的である。等式１から結合定数を計算するため、目的のレセプターについてのΔＨ_uおよびΔＣ_puを測定するための示差走査熱量測定装置を利用すべきである。目的のレセプターまたはこれと密接に関連するレセプターに関するこれらのパラメーターはまた、文献に見出され得る。これらの状況において、等式（１）は、Ｔ_mでのＫ_Lの正確な測定を可能にする。等式２を用いて、任意の温度でのリガンド会合定数（ＴでのＫ_L）を計算することもまた可能である。等式２を使用するため、Ｔでの結合エンタルピーのための熱量測定データ、ΔＨ_L、およびリガンド結合の際の熱容量変化ΔＣ_pLが既知でなければならない(Brandtsら、Biochemistry ２６：６９２７〜６９４０（１９９０）)。Ｔ_m＝リガンド存在下におけるタンパク質ほどけ遷移の中間点； ΔＣ_pL＝リガンド結合の際の熱容量変化；およびＲ＝気体定数。等式２の２番目の指数項は、通常、無視し得る程小さく、その結果、ＴでのＫ_L の近似値は、最初の指数項のみを使用して得られ得る：しかし、レセプターに対する多数の異なるリガンドの親和性をランク付けするために、等式１〜３に従って結合定数を計算する必要はない。むしろ、本発明は、熱変性曲線がリガンドによりシフトされる程度に従って、リガンドの親和性をランク付けするための方法を提供する。したがって、ΔＨ_u、ΔＣ_pu、およびΔ Ｈ_L の正確な値が無い場合でさえ、Ｔ_mでのＫ_Lの推定値を得ることが可能である。本発明は、コンビナトリアルまたは化合物ライブラリーをスクリーニングするために特に有用である。ハイスループットスクリーニングを達成するため、マルチコンテナーキャリアーまたはプラットフォームにサンプルを収容することが最良である。マルチコンテナーキャリアーは、複数のサンプルを同時に加熱することを容易にする。一つの実施態様において、マルチウェルマイクロプレート、例えば、96または３８４の異なるサンプルを収容し得る96または３８４ウェルマイクロプレートが、キャリアーとして使用される。一つの実施態様において、１サンプルが、マルチウェルマイクロプレートの各ウェルに含まれる。コントロールウェルは、レセプターを含むが、結合について試験されるべき分子は含まない。他のサンプルの各々は、結合について試験されるべき、少なくとも１つの分子を含む。コントロールウェル中のレセプターに対する熱変性曲線は、他のすべての実験に対する曲線と比較される曲線である。スクリーニング速度は、サンプルが、結合について試験されるべき１より多い分子を含む場合、加速される。例えば、スクリーニング速度は、サンプルが、２０分子のプールを含む場合、２０倍増大する。次いで、結合分子を含むサンプルは、結合について試験される分子のより小さなコレクションを含むサンプルに分割されなければならない。次いで、これらの分割されたコレクションは、標的分子への結合についてアッセイされなければならない。これらの工程は、当初の熱シフトを担う単一分子が得られるまで、繰り返されなければならない。レセプターの変性は、光分光測光法により測定され得る。溶液中のタンパク質が、加熱に応答して変性する場合、レセプター分子は凝集し、そして溶液は濁った状態になる。変性の際の熱誘導凝集は、例外というよりはむしろ通例のことである。凝集は、一般に、熱量測定実験を複雑にする。しかし、凝集は、分光測光技術を用いる場合、有利である。なぜなら、濁り度の変化は、規定された波長の可視光または紫外線の吸光度変化をモニターすることによって測定され得るからである。核酸の変性は、光分光測光法を使用してモニターされ得る。濃色度の変化は、規則的な構造の喪失に起因するポリヌクレオチド溶液による光吸収の増加であり、温度上昇の関数としてモニターされる。濃色度の変化は、代表的には、光分光測光法を使用してアッセイされる。しかし、別の実施態様において、蛍光分光測定が、熱変性をモニターするために使用される。蛍光方法は吸収法より高感度である。蛍光分光測定実験において、固有のタンパク質蛍光および蛍光プローブ分子を使用することは、当業者に周知である。例えば、Bashford，C．L.ら、Spectroph otometry and Spectrofluorometry：A Practical Approach ９１〜１１４、IRLP ress Ltd.（１９８７）；Bell，J．E.、Spectroscopy in Biochemistry、第Ｉ巻、１５５〜１９４（１９８１）CRC Press；Brand，L.ら、Ann．Rev．Biochem．４１：８４３（１９７２）参照。研究されるべき標的分子またはレセプターが核酸である場合、蛍光分光測定は、エチジウムブロマイド置換アッセイを使用して実施され得る（Lee，M.ら、J． Med．Chem．３６：８６３〜８７０（１９９３））。このアプローチにおいて、リガンド結合は、エチジウムブロマイドと置換し、そしてエチジウムブロマイドからの蛍光発光の減少を生じる。別のアプローチは、蛍光共鳴発光移動を使用することである。後者のアプローチでは、オリゴヌクレオチドの一方の鎖のドナー蛍光色素から他方の鎖のアクセプター蛍光色素への蛍光エネルギーの移動は、アクセプター蛍光色素の発光を測定することによりモニターされる。変性は、蛍光エネルギーの移動を妨げる。蛍光共鳴発光移動法は当業者に周知である。例えば、Ozaki，H.ら、Nucleic A cids Res．２０：５２０５〜５２１４（１９９２）；Clegg，R．M.ら、Proc．Na tl．Acad．Sci．U.S.A．９０：２９９４〜２９９８（１９９３）；Clegg，R．M. ら、Biochemistry ３１：４８４６〜４８５６（１９９３）を参照。サンプルキャリアーを加熱するエレメントは、サンプルを迅速および再現可能な様式で加熱し得るエレメントである。本発明において、複数のサンプルが同時に加熱される。複数のサンプルは、単一の加熱エレメントで加熱され得る。あるいは、複数のサンプルは、一つの加熱エレメントで所定の温度まで過熱され、次いで別の温度に加熱するために別の加熱エレメントに移動され得る。加熱は、規則的または不規則的間隔で実行され得る。なめらかな変性曲線を作成するため、サンプルは、１または２℃の間隔で均一に加熱されるべきである。サンプルが加熱され得る温度範囲は、２５〜１１０℃である。スペクトルの読み取りは、各加熱工程後に行われる。サンプルは、連続的様式で、加熱され、そしてスペクトル装置によって読み取られ得る。あるいは、各加熱工程の後、サンプルは、スペクトル読み取りに先立ち、より低い温度に冷却され得る。好ましくは、サンプルは、連続的に加熱され、そしてスペクトル読み取りは、サンプルを加熱しながら行われる。スペクトル読み取りは、キャリアー中の全てのサンプルについて同時に行う。あるいは、読み取りは、一度に、少なくとも二つからなる群のサンプルについて行われ得る。最後に、読み取りは、一度に１つのサンプルについて行われる。一つの実施態様において、熱変性は、アッセイ装置（例えば、図２９に示されるもの）を使用する蛍光分光測定によってモニターされ得る。この装置は、スキャナーおよびコントロールソフトウエアシステムからなる。このシステムは、溶液性蛍光発光および細胞関連蛍光発光を定量し得る。蛍光発光は、遮光性検出チャンバー中で光電子増倍管により検出される。ソフトウエアは、パーソナルコンピューター上で稼動し、そしてスキャナーの動作は、ソフトウエアを通じて制御される。精密なＸ−Ｙ機構が、高感度光ファイバープローブでマイクロプレートを走査し、各ウェル中の蛍光を定量する。マイクロプレートおよびサンプルは、各列のサンプルを走査する間静止したままであり、次いで光ファイバープローブが次の列に移動し得る。あるいは、マイクロプレートおよびサンプルは、新たな列のサンプルを光ファイバープローブ下に位置させるように移動され得る。走査システムは、１分以内に96サンプルを走査し得る。スキャナーは、最も一般的な蛍光色素を測定するための複数の励起光フィルターおよび複数の発光フィルターを保持し得る。したがって、蛍光発光の読み取りは、一度に１サンプルについて、または同時にサブセットのサンプルについて行われ得る。アッセイ装置の別の実施態様を図３３に示す。本発明のアッセイ装置は、以下により詳細に記載される。本発明はまた、その中に多数のコンテナーを有するキャリアーを含む製造物に関する。製造物は、目的のレセプターに結合するリード化合物についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。コンビナトリアルライブラリーは、本発明に従う方法を使用してスクリーニングされ得る。製造物において、各コンテナーは、均一量の目的のレセプターを含む。さらに、これらコンテナーのそれぞれは、コンビナトリアルライブラリーからの異なる化合物を、レセプター濃度を少なくとも２倍の濃度で含む。好ましくは、製造物は、１または多数のマルチウェルマイクロプレートである。レセプターがタンパク質である場合、各コンテナーは、蛍光プローブ分子をさらに含み得る。レセプターが核酸である場合、各コンテナーは、エチジウムブロマイドをさらに含み得る。あるいは、核酸は蛍光色素で標識され得る。使用に先立ち、製造物は、目的のレセプターの完全性を維持するに必要な任意の様式で保存され得る。例えば、製造物は、−９０℃と室温との間の温度で保存され得る。レセプターおよび化合物は、凍結乾燥形態、液体形態、粉末形態で保存され得るか、またはグリセロール中に保存され得る。製造物は、明所または暗所のいずれにも保存され得る。サンプルキャリアーを加熱する熱伝導エレメントまたはブロックは、サンプルを急速および再現可能に加熱し得る任意のエレメントであり得る。複数のサンプルが、単一の加熱エレメントで加熱され得る。あるいは、複数のサンプルが、ある加熱エレメントで所定の温度に加熱され、次いで別の加熱エレメントに移動されて別の温度に加熱され得る。加熱は、規則的または不規則な間隔で実行され得る。なめらかな変性曲線を作成するため、サンプルは、１または２℃の間隔で均一に加熱されるべきである。サンプルが加熱され得る温度範囲は、２５〜１１０ ℃である。本発明において、複数のサンプルは同時に加熱される。サンプルが不連続な温度間隔にて階段状様式で加熱される場合、スペクトルの読み取りは、各加熱工程後に行われる。あるいは、各加熱工程後、スペクトルの読み取りを行う前に、サンプルは、より低い温度に冷却され得る。あるいは、サンプルは、連続的様式で加熱され、そして加熱中にスペクトルの読み取りを行う。スペクトルの読み取りはキャリア上のサンプル全てについて同時に行われ得る。あるいは、読み取りを一時に少なくとも２つの群のサンプルについて行われ得る。本発明はまた、リード化合物を産生するための改善された方法を提供する。化合物または化合物コンビナトリアルライブラリーを熱シフトアッセイ法を使用してスクリーニングした後、標的に結合する化合物を化学的に修飾して化合物の第２のライブラリーを作製する。次いで、この第２のライブラリーを熱シフトアッセイ法を用いてスクリーニングする。このスクリーニングプロセスおよび新しいライブラリーの作製するプロセスを、K_dにおいて10^-4〜10^-5Mの範囲に及ぶ親和性を有する標的レセプターに結合する化合物が得られるまで続ける。蛍光発光画像システムを使用して、標的分子またはレセプターの熱変性をモニターし得る。蛍光発光画像システムは当業者に周知である。例えば、AlphaImage er^TMGel Documentation and Analysys System(Alpha Innotech，San Leandro,CA )は768×494ピクセル解像度を有する高速電荷結合デバイスカメラを採用している。電荷結合デバイスカメラはコンピューターとインターフェースして、そして画像をImage analysis software^TMで分析する。ChemiImager^TM（Alpha Innotech ）は、AlphaImager^TMの全ての機能を遂行する冷却電荷結合デバイスであり、さらに、化学発光サンプルおよび他の低強度サンプルの画像をも捉える。ChemiIma ger^TM電荷結合デバイスはPentiumプロセッサー（1.2Gb hard drive、16Mb RAM）、AlphaEase^TM分析ソフトウェア、光機密キャビネット、およびＵＶ−白色光トランスイルミネーターを含む。例えば、ＭＲＣ−１０２４ＵＶ／可視レーザー共焦画像システム（BioRad，Rlchmond，CA）は広範囲の照度波長（350〜700nm）の１より多い蛍光色素の同時画像化を容易にする。Gel Doc 1000 Fluorescent Gel Documentaion System（BioRad，Richmond，CA）は20×20cm程度の大きさ、または５×４cm程度の小ささのサンプル領域を鮮明に表示し得る。少なくとも２つの 96ウェルマイクロプレートを20×20cmの領域に取り付けることができる。Gel Do c 1000システムはまた、時間に基づく実験の遂行を容易にする。蛍光熱画像化システムは、マイクロプレート熱シフトアッセイにおいてレセプター変性をモニターするために使用され得る。この実施態様においては、複数のサンプルを25と110℃との間で同時に加熱する。蛍光発光の読み取りは複数のサンプルそれぞれについて同時に行う。例えば、96または384ウェルマイクロプレートの各ウェル中の蛍光発光が同時にモニターされ得る。あるいは、蛍光発光の読み取りは各サンプルについて連続的かつ同時に行われ得る。低温では全てのサンプルが低レベルの蛍光発光を表示する。温度が上昇するにつれて、各サンプルの蛍光が増大する。高い親和性を有する標的分子に結合するリガンドを含むウェルは、熱変性曲線を高温度側にシフトさせる。結果として、高い親和性を有する標的分子に結合するリガンドを含むウェルは、リガンドの非存在において標的分子のT_mより上の所定の温度において高親和性リガンドを含まないウェルよりも蛍光が弱い。サンプルを段階的に加熱する場合、複数のサンプル全ての蛍光が各加熱工程で同時に画像化される。サンプルを連続的に加熱する場合、複数のサンプル全ての蛍光発光が、加熱の間、同時に画像化される。熱シフトアッセイは、100μＬの容量で実施しされ得る。しかし、以下の理由で熱シフトアッセイを10μLの容量で実施するのが好ましい。先ず、小規模化したアッセイでは約10倍少ないタンパク量が要求される。従って、このアッセイのために、約５〜40pmoleのタンパク質（25kDaのタンパク質について0.1μｇ〜1.0 μｇ）が必要である（すなわち、約１〜約４μＭの標的分子濃度で５〜10μＭの作業容量）。従って、１mgのタンパク質を使用して、小規模化した方式において 1,000〜10.000回のアッセイを実施に実施得る。これは標的分子が僅かの量しか入手できない場合に特に有利である。第二に、約１０倍少ないリガンドが小規模化したアッセイで必要となる。この利点は、ライブラリー化合物が少量でしか合成されない貴重なコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするときに、研究者にとって非常に重要である。ヒトα−トロンビンの場合には、理想的なリガンド濃度は約50μＭであり、これは小規模化した方式において１アッセイ当たりリガンドの250pmole、すなわち、 100ng（500Daの分子量と仮定して）のリガンドに換算される。第三に、小規模化したアッセイはより小さな面積に適合され得るので、より少ない作業容量がより多くの配列のアッセイを可能とする。例えば、384ウェル（1 6×24配列）または864ウェル（24×36配列）プレートが96ウェルプレート（約8. 5×12.5cm）とおおよそ同じ面積を有する。384ウェルプレートおよび864ウェルプレートによって、96ウェルプレートを使用して実施し得るアッセイの、それぞれ４倍および９倍のアッセイを使用者が行うことを可能とする。あるいは、1536 ウェルプレート（32×48配列；Matrix Technologies Corp.）を使用し得る。153 6ウェルプレートは96ウェルプレートにより得られる処理能力を１６倍亢進する。従って、1536ウェルプレート配置を使用すると、アッセイを96ウェルプレート方式を用いて実施し得る速度に比べて、アッセイ速度を約１６倍まで増加させることができる。８×12アッセイの配列配列（96ウェルプレート中で）は96アッセイ／時間、すなわち約2300アッセイ／24時間の実施を容易にする。32ｘ48配列配列は約1536／時間の実施を容易にする。すなわち、32×48アッセイ配列形式を使用して、約37,000アッセイ／24時間を実施し得る。アッセイ容量は１〜100μＬであり得る。好ましくは、アッセイ容量は１〜50 μＬである。より好ましくは、アッセイ容量は１〜25μＬである。なおより好ましくは、アッセイ容量は１〜10μＬである。なおより好ましくは、アッセイ容量は１〜５μＬである。なおより好ましくは、アッセイ容量は５μＬである。最も好ましくは、アッセイ容量は１μＬまたは２μＬである。好ましくは、アッセイはＶ−底ポリカーボネートプレートまたはポリカーボネート・ディンプル（dimple）プレート中で実施される。ディンプルプレートは総容量15μＬをもつ複数の円底ウェルを含むプレートである。リガンド／標的複合体の全熱変性曲線を得るための治療上の標的T_m近辺の温度範囲でスペクトル読み取りを行う一つの別の方法は、T_mでのシフトを確認するために、標的分子のT_m近くの単一の温度でアッセイを実施することである。この実施態様において、コントロールサンプル（標的分子を含むが、候補リガンドは含まない）に比較して蛍光発光の少ないサンプルは、候補リガンドが標的分子に結合することを示している。この実施態様において、加熱によって生じる標的分子の熱変性と関連する物理的変化の大きさは、１つ以上の不連続または固定した温度の範囲で標的分子の熱変性曲線を温度関数として作成することにより決定する。熱変性と関連する物理的変化（例えば、蛍光発光）が測定される。リガンドの非存在下における標的分子に対する不連続または固定した温度での物理的変化の大きさに注目する。多数の異なる分子（例えば、コンビナトリアル化合物）のそれぞれが存在する場合の物理的変化の大きさを測定する。多数の分子のそれぞれが存在する場合の標的分子の熱変性と関連する物理的変化の大きさを、多数の異なる分子のいずれもが存在しない場合における不連続または固定した温度での標的分子に対して得られる物理的変化の大きさと比較する。多数の異なる分子の親和性を物理的変化の大きさの変化に従ってランク付けする。物理的変化を測定する不連続または固定したある範囲の温度は、熱安定性のシフトを識別するのに有用な任意の温度であり得る。好ましくは、不連続または固定した温度は、標的分子への結合について試験した多数の異なる分子が存在しない場合の標的分子の熱変性曲線の中間点温度T_mである。一連の比較的親和性の高いリガンド（これは、臨床試験の候補として好ましい化合物である）をアッセイするのに興味がある場合、単一温度構成は特に有利である。しかし、結合親和性についてあまり厳しくない要件が好まれる場合には、 2.5μＭ以上のK_dを有する親和性をもつリガンドを同定するために、リガンド濃度を500μＭまで増加させてもよい。単一温度の実施態様は多くの利点を提供する。第一に、アッセイ速度が10倍の率で増加する。従って、96ウェルプレート（８×12配列）は１時間当たり約96アッセイを容易にするので、単一温度の変動は１時間当たり約1000アッセイを容易にする。1536ウェルプレート（32×48配列）を使用して、サンプル分割が８×12 配列システムにおける速度と同じ速度で32×48配列システムについて達成され得る限り、１時間当たり約１５，０００アッセイを実施し得る。マイクロプレート熱シフトアッセイのために熱ほどけ転移を検出する別の代替の方法は、標的タンパク質の固有トリプトファン（Ｔｒｐ）蛍光によるものである。ほとんどの蛍光発光プレートリーダー（例えば、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩ）は光源としてタングステン−ハロゲンランプを使用している。これらのランプは、２８０ｎｍ付近に最大吸収を有するタンパク質の本来のＴｒｐ残基の励起を可能とする２８０ｎｍ付近に十分な光を放出しない。しかし、Ｂｉｏｌｕｍｉｎ 960（Molecular Dynamics）はXenon-Arc-lampを用いている。Xenon-Arc-lampは２８０ｎｍでの励起と３５０ｎｍでの発光の実測値を与える。本発明の方法およびアッセイ装置はリガンド−タンパク相互作用のアッセイに限定されるものではない。該方法およびアッセイ装置はタンパク質安定化に関係した任意の多変量システムを迅速にアッセイするのに用い得る。例えば、本発明の方法およびアッセイ装置は標的分子に対する１より多い化合物またはリガンドの結合を同時にアッセイするのに用い得る。このアプローチを用いて、多重リガンド結合の付加効果を評価し得る。正または負の共同性を決定し得る。この方法を実施するために、熱シフトアッセイを、リガンドの非存在下、単一リガンドの存在下、および２以上のリガンドの存在下、タンパク質などの標的分子に対して実施する。熱変性曲線はタンパク質のみに対して、およびタンパク質とリガンドの各組合せに対して作成する。次いで、中間点温度T_mを各曲線について決定する。次いで各T_mを他の曲線の他のT_mのそれぞれの曲線と比較する。あるいは、各熱変性曲線全体を他の熱変性曲線それぞれと比較する。これら方法のいずれにおいても、１より多いリガンドの結合相互作用またはタンパク質の安定性に対する付加的に寄与を決定し得る。同様の様式で、１以上の生化学的条件のタンパク質の安定性に対する付加的な寄与を決定し得る。従って、本発明はタンパク質の安定性を最適化し、結果、タンパク質の貯蔵寿命を最適化する生化学的条件を迅速に同定するために使用され得る。さらに、本発明の方法とアッセイ装置はほどけあるいは変性タンパク質を再折り畳みまたは再生するための種々生化学的条件の効力をランク付けするのに用い得る。この態様は効果的な再折り畳みと再生の条件をスクリーニングする信頼し得る方法に対する当該分野における要請に取り組む。例えば、細菌細胞中の組換えDNAの発現は、通常組換えタンパク質の細菌封入体中への封鎖を生じる（Marston，F．A．O.、Biochem．J．２４０：１〜１２（１９８６））。細菌発現システムの代りに他の発現システムを用い得るが、細菌細胞での発現は今なお組換えタンパク質の高レベル生産におけるえり抜きの方法である（Rudolph，R.、タンパク工学：原理と実際、２８３〜２９８頁、John Wi ley&Sons（１９９５））。多くの場合、組換えタンパク質の回収では、タンパク質を封入体から単離する必要がある。封入体からタンパク質を精製するプロセスは組換えタンパク質の変性を必要とする。結果として、組換えタンパク質がその天然の、完全に機能的な形態に戻るのに適切な条件下で再生または再折り畳みさせなければならない。これらの場合のそれぞれにおいて、変性タンパク質はさらなる研究または使用に有用であるために、再生または再折り畳みしなければならない。残念ながら、所定のタンパク質またはタンパク質の断片をどのような条件で再生すべきか、確かな条件を予測することは容易でない。各タンパク質は異なっている。どの組の条件が最適かを知り得る前に、多くの異なる再生条件の組合わせを常に試験してみなければならない。従って、種々の再生条件の効果をランク付けする信頼できる迅速な方法を有するのが望ましい。組換えＤＮＡ技術は細菌のタンパク発現装置の補充により比較的大量に広範な種々の目的の異種ポリペプチドの生合成を可能とする。しかし、E．coliに発現された治療価値の高い正しく折り畳まれた稀なヒトタンパク質を安価に大量に供給する見込みは、変性したまたは部分的に変性した標的タンパク質が不溶性タンパク封入体に、圧倒的に優勢に凝集するために無効とななってしまっている。最近の総説としては、Rudolph，R.およびLilie，H．FASEB J．１０：４９〜５６（１９９５）；Sadana，A.、Biotechnology and Bioengineering ４８：４８１〜４８９（１９９５）；Jaenicke，R.、Phil．Trans．Royal Soc．London Ser．B- Biol．Sci．３４８：９７〜１０５（１９９５）を参照のこと。E．coli中で自己凝集反応が優先する理由は、部分的に変性した状態が種々の程度に見出される異種タンパク質濃度が比較的高い（細胞重量の３０％程度の高さ）ことに集中している。従って、過剰に発現するE．coli株のタンパク濃度が上昇して、ほどけたタンパク質の露出した疎水性残基が、自己崩壊したポリペプチドコンフォメーションを経験するよりもより頻繁に、同様に露出した基をもつ他の分子に遭遇する（分子間反応）らしく、その場合これらの疎水性残基は完全に折り畳まれたネイティブの状態に進むように適当な方向（分子間遷移状態）に押し込められる（図２６参照）。こういった見通しから、不溶性タンパク封入体は好ましいタンパク折り畳みプロセスを妨害する、動力学的に捕捉された副反応物と見られる。封入体を単離し、封入体から組換えタンパク質を精製する技術、およびタンパク質を再折り畳みまたは再生する技術は当業者に周知である。例えば、Sambrook ，J.ら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual、17.37〜17.41頁，Cold Spri ng Harbor Press(1989);Rudolph，R.ら，FASEB J．10:49〜56(1995)。正確に折り畳まれた大量のタンパク質をE．coliで生産することの別の障害は、E．coliサイトゾルの酸化還元電位の減少がインビボでのジスルフィド結合の形成を妨害することである。ジスルフィド結合の形成は、しばしばタンパク質折り畳みに結び付く、多くの細胞外タンパク質の生合成において重要な同時翻訳事象または翻訳後事象である。さらに、シス−トランスプロリン異性化反応は、特定のタンパク質の正確な折り畳みにとっての律速段階であることが証明されている(Lin，L.-N.およびBrandts，J．F.，Biochemistry 22:564〜573(1983))。結果として、部分的に折り畳まれた中間体は、凝集および沈殿してタンパク塊となるのに充分な量でインビボで蓄積する。細胞は分子シャペロニンと呼ばれる１クラスの宿主タンパク質を用いる。このタンパク質は、封入体の形成、すなわち、凝集および不適切なジスルフィド結合の形成について上に検討した多くの非生産的副反応を見かけ上防止することにより、インビボでのタンパク質の折り畳みを援助する。しかし、E．coliのシャペロニン機構（これは、部分的にタンパク質GroELおよびGroESにより構成される）は、おそらく、大規模な過剰発現により圧倒されることになる。このシャペロニン不足を、分子シャペロニンと目的タンパク質との同時発現により正そうとする多くの試みにも拘わらず(Rudolph，R.およびLilie，H.，The FASEB J．10:49〜5 6(1995))、ポジティブな結果を報告したのは１例だけであった(Goloubinoff，P. ら，Nature 342:884〜889(1989))。 GroELおよびGroESがインビボでどのようにタンパク質の折り畳みを援助するのかの説明するために２つの仮説が奨励された。第一の仮説、Anfinsenかご仮説の下では、分子シャペロニンの機能は、タンパク質のそのネイティブ状態への折り畳みが、細胞内の凝集促進条件による干渉なしに進行し得る、防御された環境を提供することである。(Martinら、Nature 352:36〜42(1991); Ellis，R．J.，Cu rrent Biology 4:633〜635(1994))。第二の仮説、「反復アニーリング」仮説の下では、シャペロニンの機能は、基質ポリペプチドのコンフォメーションエネルギーに向けられるＡＴＰ加水分解エネルギーの一部で、誤って折り畳まれたタンパク質（すなわち、動力学的に捕捉された中間体）を部分的にほどき、それにより、ポリペプチドをより高いエネルギー状態にし、溶液中に放出された後、その状態からペプチドをもう一度正確に折り畳みしようと試み得る(Todd，M．J.ら、 Science 265:659〜666(1994);Jacksonら，Biochemistry 32:2554〜2563(1993); ら，Cell 78:693〜702(1994);Weissmann，J．S.およびKim，P．S.，Science 253 :1386〜1393(1991))。上で検討したインビボの結果はE．coliで発現した組換え異種タンパク質のインビトロ再折り畳みでのより最近の実験と多くの方法において矛盾がない。すなわち、タンパク質の一次アミノ酸配列がそのネイティブの折り畳まれたコンフォメーションを決定する充分な情報を含み得る(Anfinsen，C．B.、Science 181:22 3〜230(1973))一方で、折り畳み反応の起こる生化学的条件は、ほどけ状態、凝集状態、および正確に折り畳まれた形態の間の分配に強く影響し得る。例えば、pHは、等式（４）の第４項に合計した長距離静電相互作用へのその効果により折り畳み反応に影響すると理解され得る。但し、ΔＧ_conf＝コンフォメーション自由エネルギー（秩序項／無秩序項）； Δｇ_i,int＝短距離相互作用（Ｈ結合、ファンデルワールス相互作用、塩架橋、補因子結合など）； Δｇ_i,s＝溶媒との短距離相互作用（疎水性効果、イオン水和など）；および ΔＷ_el ＝長距離静電相互作用。 ΔＧ_bind ＝リガンド結合自由エネルギータンパク質溶液のｐＨはタンパク質のｐＩより下に低くなるので、ポリペプチド上の官能基は、官能基間の静電気斥力が自由エネルギー式（等式（４））の他の項との釣合いが最終的に外れるまで次第にプロトン化され、そしてタンパク質は最早ネイティブコンフォメーションに適合できなくなる。タンパク質折り畳みに対する別の重要な生化学的パラメーターは、溶媒である水であり、これは脂肪族および芳香族側鎖（および多分ある程度までの主鎖）を反発させ、その露出表面積を最小化する。折り畳み反応での溶媒の影響は、自由エネルギー式（等式（４））の第３項に合計される。特定の塩が水溶液中でタンパク質側鎖間での疎水性相互作用を増大させることが知られている。その効果は Hofmeister系列：カチオン：Mg²⁺>Li+>Na⁺>K⁺>NH₄ ⁺;アニオン：SO₄ ^2->HPO₄ ^2->酢酸塩＞クエン酸塩＞酒石酸塩＞Cl->NO₃ ^->ClO₃ ^->I^->ClO₄ ^->SCN^-に従うイオンの性質に依存する。Hofmeisterアニオン（例えば、SO₄ ^2-およびHPO₄ ^2-）を０．４Ｍで安定化させることは、正確に折り畳まれたタンパク質の収量を増大させることが分かっている(Creighton，T．E.，Proteins:Structures and Molecular Propa ties，Freeman，New York,(1984))。タンパク質のネイティブコンフォメーションのこの好ましい結果は、タンパク質の優先的水和を導くカチオンおよびアニオンの「塩析」効果に寄与している（Creighton，T．E.，Proteins:Structures an d Molecular Propaties，Freeman，New York,(1984)）。グリセロールは水の溶媒和特性を変えて、タンパク質のネイティブコンフォメーションに有利にする。このことが起こるメカニズムは、Hofmeister系列の塩の塩効果とは違って、タンパク質の共溶媒排除と優先水和である（TimasheffおよびArakawa、Protein Structure，A Practical Approach、T．E．Creighton編，ＩRL Press，Oxford，UK(1989)，331〜354頁）。環境がどのようにタンパク質折り畳みに影響するかの別の例は、既知リガンドおよび補因子が折り畳まれたタンパク質の収率に与える効果である。リガンドの結合は、折り畳み反応のものへの結合自由エネルギーの組み合わせを通して、ほどけた状態からネイティブリガンド複合体へと平衡をシフトさせる効果を有する。ウシの炭酸脱水素酵素II再折り畳みにおける金属イオンの役割については記載されている（BergenhemおよびCarlsson，Biochim．Biophys．Acta 998:277〜285 (l989)）。タンパク質折り畳みに影響を与えることが示されている他の生化学的パラメーターは以下のとおりである：タンパク質濃度、温度、グルタチオン酸化還元緩衝液（GSH、GSSG）、界面活性剤の存在、ならびにグリセロール、アルギニン-HCl、ポリエチレングリコール（PEG）、および有機溶媒のような他の添加物の存在。再折り畳み条件下でのインキュベーションの間に、組換えタンパク質は固相支持体に固定され得る。この配置はGroELおよびGroESの機能に対する「Anfinsenかご」仮説に似ている。ここで、ほどけたタンパク質は、ネイティブ状態への折り畳みが競合的凝集反応からの干渉を受けずに進行し得る、防御された環境内に一時的に固定されることになる。固体支持体上でのタンパク質折り畳みの確認は、文献において２つの最近の報文から生じている。ポリ−ヒスチジンタグ化TIMP-2 タンパク質は、金属キレートカラムに結合したままでの透析により再折り畳みされ得た(Negro，A.ら，FEBS Lett．360:52〜56(1995))。α−グルコシダーゼのアミノ末端またはカルボキシル末端に結合したポリイオン性融合ペプチドは、約５ｍｇ／ｍＬでヘパリン−Sepharose樹脂に結合したままでの折り畳みを可能とした(RudolphおよびLilie，FASEB J．10:49〜56(1995))。α−グルコシダーゼを固定化および再折り畳みするためのポリイオン性アルギニンタグ法が、Stempfer， G.ら，Nature Biotechnology 14:329〜334(1996)に開示されている。本発明においては、熱シフトアッセイが種々再折り畳みまたは再生条件の効力をランク付けするのに用いられる。目的のタンパク質の多数のアリコートのそれぞれは、多様な異なる生化学的折り畳み条件下でインキュベートしたものであるが、それを複数コンテナー担持体のコンテナーに入れる。既知濃度のネイティブ完全機能タンパク質のアリコートを、コントロールコンテナーに入れる。サンプルは、任意の複数コンテナー担持体に入れ得る。好ましくは、各サンプルは、複数ウェルマイクロプレートの１ウェルに入れ得る。タンパク質折り畳み反応の結果に影響し得る多くの生化学的変数を考慮すると、タンパク質折り畳みの最適化は、タンパク質結晶化および薬物発見における定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）に似ていないことはない、多変量最適化問題である。多重変換最適化問題は、有利な応答に影響を及ぼすように、できるだけ多くのデータを集めるための数多くの並行実験を必要とする。この点に関して、タンパク質結晶化およびＱＳＡＲ分析の両方は、生化学的または化学的組成物において増大する変化のマトリックス配列を採用するマススクリーニングのプロトコルから多大な利益を得ている。本発明は再折り畳みまたは再生条件の効力をランク付けするのに用い得る。そのような条件は、グリセリン濃度、タンパク質濃度、ジスルフィド結合形成を触媒する薬剤の使用、温度、ｐＨ，イオン濃度、溶媒のタイプ、還元グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）などのチオールの使用、尿素、塩化グアニジニウム、アルキル尿素などのカオトロープ、炭酸アミドなどの有機溶媒、Ｌ−アルギニンＨＣｌ，トリス緩衝液、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、両性イ才ン界面活性剤、混合ミセル、およびシクロデキストリンと組み合せた界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本発明は、変性薬剤をタンパク質から除去するために透析、カラムクロマトグラフィー技術、または吸引濾過を使用するか否かにかかわらず使用し得る。スペクトル熱シフトアッセイを用いて、最適タンパク質再折り畳みを容易にする条件を迅速に決定し得る。この実施態様において、再生タンパク質サンプルおよびコントロールタンパク質サンプル（すなわち、完全機能形態のネイティブタンパク質サンプル）を一定温度範囲で加熱する。個々の温度間隔で、スペクトルの読み取りを行う。あるいは、スペクトル読み取りを、連続的に所定の温度プロフィールの間で行い得る。熱変性曲線を各サンプルごとに作成する。ネイティブ完全機能タンパク質の熱変性曲線についてのTmを決定する。ネイティブ完全機能タンパク質のTmでのほどけと関連のある物理的変化の大きさに従って、そのTmでのネイティブ完全機能タンパク質の既知量の物理的変化の大きさに対して、再折り畳み条件の相対効力をランク付けする。ほどけの程度を測定するのに用いる物理的変化の大きさ（熱変性曲線の縦軸（ｙ−軸）に反映）は、正しく折り畳まれたタンパク質量に対応する。本発明は、タンパク質折り畳みを容易にし、そして最適化する生化学的条件をスクリーニングする方法を提供する。所与のタンパク質に対する条件をスクリーニングするために、目的のタンパク質の熱変性プロフィールを先ず決定する必要がある。これはマイクロプレート熱シフトアッセイを用いる変性曲線を作成することにより達成される。ｐＨ最適条件、イオン強度依存、ホッフマイスター系列の塩の濃度、グリセリン濃度、スクロース濃度、アルギニン濃度、ジチオスレイトール濃度、金属イオン濃度などを包含する種々の条件を最適化し得る。マイクロプレート熱シフトアッセイを用いて、タンパク質安定性に付加的効果を有する１またはそれ以上の生化学的条件を決定し得る。タンパク質の安定性増加を容易にする１組の生化学的条件を熱シフトアッセイを用いて一旦確認すると、組換えタンパク質でのタンパク質折り畳み実験にも同じセットの条件を使用し得る。図２７を参照のこと。熱シフトアッセイでタンパク質安定性を増進する条件が組換えタンパク質の折り畳みを促進する条件と相関する場合、さらにタンパク質安定性増加を生じる安定化条件の組合わせが同定されるまで、追加の熱シフトアッセイを実施することによって、条件をさらに最適化し得る。次いで、組換えタンパク質はこれらの条件下折り畳まれる。このプロセスは、最適な折り畳み条件が同定されるまで繰り返される。タンパク質の安定性はタンパク質折り畳みの改善した収量と相関すると期待される。正しく折り畳まれたタンパク質の収量は、任意の適切な技術を用いて決定し得る。例えば、正しく再折り畳みされたタンパク質の収量は、アフィニティーカラム、例えば、タンパク質のリガンドが結合したカラムに再折り畳まれたタンパク質を通過させ、サンプル中に存在するタンパク質量を定量することにより計算し得る。このようにして、正確な折り畳みへの付加的寄与について折り畳み条件を評価し得る。タンパク質折り畳み反応の遷移状態は、変性形態よりもタンパク質のネイティブ形態に似ている。このことについては多くのタンパク質にもあてはまることが証明されている（Fersht，A．R .、Curr．Op．Struct．Biol．７：３〜９（１９９７））。本発明の方法および装置は、タンパク質折り畳みに有利な生化学的条件の組合わせのスクリーニングのための迅速ハイスループットアプローチを提供する。本方法は、タンパク質折り畳みの従来のアプローチが必要とした厄介な時間の掛る工程を必要としない。例えば、本発明の方法を用いれば、組換えタンパク質再折り畳みの従来の方法と関連する凝集の問題を避けるために、タンパク質を大容量に希釈して、低タンパク質濃度（〜１０μｇ／ｍＬ）とする必要がない。タンパク質凝集の抑制は、（タンパク質のほどけ形態と折り畳み形態との間の）タンパク質折り畳み平衡を正しいネイティブコンフォメーションにシフトする生化学的パラメーターのスクリーニングを可能にする。タンパク質の安定化、タンパク質折り畳み、リガンド選択、および薬物設計のように、タンパク質結晶化を促進する条件の選択は、別の多変量最適化問題であるが、これは本発明の方法および装置を用いて解決される。本発明の方法およびアッセイ装置はまた、タンパク質結晶化を容易にする条件を決定するのに有用である。溶液から分子を結晶化することは可逆的平衡プロセスであり、その動力学的、熱力学的パラメーターは、溶媒系と目的の溶質の化学的、物理的性質の関数である（McPherson，A.、Preparation and Analysis of P rotein Crystals、Wiley Interscience（１９８２）；Weber，P．C.、Adv．Prot ein Chem．４１：１〜３６（１９９１））。過飽和条件下でのこの系は、溶質がほどけとネイティブ状態の代りに可溶相と固相との間に分配された場合、平衡化の方向に向かう。結晶相の分子は、順序だった周期的３次元配列に詰め込まれており、その配列は、タンパク質折り畳みにとって重要な多くの同じタイプの凝集力、すなわち、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用、水素結合、および共有結合によりエネルギー的に支配されている（Moore，W．J.、Physical Che mistry，第４版、Prentice Hall（１９７２）、８６５〜８９８頁）。従って、多くの様式でタンパク質結晶化は、タンパク質折り畳みの一つの高レベル変化とみなされ、そこでは全分子が個々のアミノ酸残基の代りに凝集エネルギーを最大化するように詰め込まれている。さらに、タンパク質結晶化とタンパク質折り畳みの両方にとって、溶媒の組成が可溶（ほどけ）形態と結晶（ネイティブ）形態の間の分配の程度に非常に重要な寄与をしている。タンパク質巨大分子に存在する凝集相互作用およびタンパク質折り畳みとタンパク質結晶化の両方に対して、これらの相互作用を調節する際の溶媒の担う役割は複雑であり、現時点で完全に理解されてはいない。この点に関して、タンパク質の安定性とタンパク質折り畳みを促進する生化学的条件は、タンパク質結晶化をも促進する。例えば、D(II)FGFレセプター１（図１９〜２４）の安定性を増大することが見出されている生化学的条件は、Ｘ線回折品質のタンパク質結晶の結晶化を容易にする条件と相関する。D(II)FGFR１タンパク質の結晶を得るために採用された条件（Lewankowski、Myslik、Bone，R.、Springer，B．A.、およびPantoliano，M ．W.、結果未公開（１９９７））を表１に示す。タンパク質結晶は、ホッフマイスター塩Li₂SO₄(６５〜７２％)の存在下、ｐＨ範囲７．４〜９．２で得られた。これらの結晶化条件は、図２３に示すように約８．０の最適ｐＨと相関した。Na₂ SO₄，(NH₄)₂SO₄およびMg₂SO₄など、他のホッフマイスター系列の塩も、沈殿剤として必要なLi₂SO₄の量を低下させる添加物として有用であることが見出された。明らかに、成功したD(II)FGFR１結晶化のこれらの条件は、マイクロプレート熱シフトアッセイを用いて同定した安定化条件と密接に相関する。ヒトα−トロンビン安定化を容易にすると同定した条件はまた、ヒトα−トロンビンタンパク質結晶化を容易にする。図１７Ａ〜Ｄおよび１８はヒトα−トロンビン安定化を容易にする条件のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。表２はＸ線回折品質のヒトα−トロンビン結晶の結晶化を容易にする３人の別々の研究者により同定された条件の要約を含む（Bode，W.ら、Protein Sci．１：４２６−４７１（１９９２）；Vijayalakshmi，J.ら、Protein Sci．３：２２５４〜２２２７１（１９９４）；およびZdanov，A.ら、Proteins: Struct．Fu nct．Genet．１７：２５２〜２６５（１９９３））。表２に要約した条件は、ヒトα−トロンビン安定性を容易にするとしてマイクロプレート熱シフトアッセイにおいて同定した条件と密接に相関する。結晶は約７．０の最適ｐＨ付近で形成される。さらに、０．１〜０．５Ｍ NaCl（条件の５０％）または０．１〜０．２M NaHPO₄の存在が明らかに好ましい。このことは最近発見されたNa⁺結合部位と矛盾せず（Dangら、Nature Biotechnology １５：１４６〜１４９（１９９７））、マイクロプレート熱シフトアッセイは図１7A〜 Dおよび１８を生じた。良好な結晶を生じた表２記載のヒトα−トロンビンサンプルの全てがリガンドと複合体を形成し、それによってさらに生化学的条件から得られたものを超えてこのタンパク質のネイティブ構造を安定化する。タンパク質の結晶化は、歴史的にはタンパク質および核酸構造をＸ線回折で決定する際の律速段階であった程、遅く長たらしいプロセスである。本発明の方法と装置は、所与のタンパク質安定性および従ってＸ線品質のタンパク質結晶形成を促進する条件の迅速ハイスループットの解明を容易にする。タンパク質がより安定である場合、結晶格子に詰め込むのを阻害する熱力学的運動が少ない。運動が少ないとき、タンパク質は結晶格子によりよく適合する。従来の結晶化方法を用いる場合、結晶化実験は一度に数週間、室温に設定される。経時的にタンパク質のほどけが起きる。本発明の方法を用いると、タンパク質を安定化する条件は、ある温度範囲にわたって試験される。熱ほどけ曲線を高温側にシフトする条件は、結晶化プロセスが起こる間に起こるほどけの程度を低下させる。アッセイ装置の概観本発明のアッセイ装置は、自動化温度調整およびスペクトル発光受容システムに関するものであり、これは所定の温度範囲にわたって多数のサンプル温度を同時に調整し、サンプルからのスペクトル発光を受け入れる。本発明のアッセイ装置は、タンパク質安定性のマイクロプレート熱シフトアッセイを実施するのに特に有用である。本発明のアッセイ装置は本発明方法の全てを実施するのに使用し得る。本発明のアッセイ装置は、別の加熱装置およびスペクトル発光受光装置に置換えることができる。他の装置とは対照的に、本発明のアッセイ装置は、所定の温度プロフィールに従って多数のサンプル温度を同時に調整し、そして温度調整の間サンプルからのスペクトル発光を受け入れるように配置され得る。加熱変性の後、可逆的に折り畳むタンパク質は、加熱変性後に部分的にまたは完全に再び折り畳まれる。再折り畳みは熱シフトアッセイにおける意味のある測定を不可能にする。しかし、本発明のアッセイ装置を使用することにより、可逆的に折り畳むタンパク質を、熱シフトアッセイにおいてアッセイし得る。その理由は、本発明のアッセイ装置では、タンパク質の加熱の間にスペクトルの測定を行うからである。そしてタンパク質の再折り畳みは起こらない。このような配置において、本発明のアッセイ装置は、サンプルアレーを載せてある可動性熱伝導ブロック上に配置したセンサを備えている。サーボ駆動電機子のような相対移動手段は、センサがサンプルアレー中の各サンプル上を連続的に位置を定めるようにセンサを移動させるのに用いる。センサはサンプルからのスペクトル発光を受け入れる。本発明のアッセイ装置は、単一の熱伝導ブロックを備えるように配置し得る。あるいは、アッセイ装置は、可動プラットフォーム上に複数の熱伝導ブロックを備えるように配置し得る。このプラットフォームは、例えば、サーボ駆動直線スライド装置により移動し得る移動可能なプラットフォームであってもよい。模範的な直線スライド装置は、モデルSＡＡ５Ｍ４ＯＯ（ＩＡＩAlnerica，Torrance ，CA）である。この実施態様において、センサは、所与の熱伝導ブロック上の各サンプルからのスペクトル発光を受け入れる。次いで、プラットフオームは別の熱伝導ブロックおよびそれに伴うサンプルをセンサの下に位置するように移動させ、センサは加熱ブロック上のサンプルのそれぞれからのスペクトル発光を受け取る。プラットフォームは全ての熱伝導ブロック上のサンプルからスペクトル発光を受けるまで移動する。あるいは、プラットフォームは例えば、サーボ駆動車軸により回転し得る回転式プラットフォームでもよい。後者の実施態様においては、センサは所与の熱伝導ブロック上の各サンプルからのスペクトル発光を受け取る。次いで、プラットフォームは別の熱伝導ブロックおよびそれに伴うサンプルをセンサの下に位置するように回転し、センサは加熱ブロック上のサンプルのそれぞれからのスペクトル発光を受け取る。プラットフォームは全ての熱伝導ブロック上のサンプルからスペクトル発光を受けるまで回転する。システムに関する記載図２９は、本発明のアッセイ装置２９００の一つの実施態様の模式図を示す。アッセイ装置２９００は、複数のサンプル２９１０のための複数のウェル２９２０を含む熱伝導ブロック２９１２を備える。熱伝導ブロック２９１２は、比較的高い熱伝導性係数をもつ物質、例えば、アルミニウム、ステンレススチール、真鍮、テフロン、およびセラミックから成っている。従って、熱伝導ブロック２９１２は、均一温度に加熱・冷却し得るが、温度を維持するために過剰な加熱または冷却を必要とする場合には充分な熱伝導性はない。アッセイ装置２９００はまた、サンプル用の、一般には２９１６で示される光の励起波長を発する光源２９０６を含む。光源２９０６は、励起光２９１６でサンプル２９１０を励起する。任意の適当な光源を使用し得る。例えば、タングステン−ハロゲンランプを使用し得る。あるいは、Biolumin960（Molecular Dynam ics）などのキセノン−アークランプを使用し得る。あるいは、高圧水銀（Ｈｇ）ランプを使用し得る。高圧水銀ランプは、キセノン（Ｘｅ）ランプよりも高い強度の光を放出する。高圧水銀ランプからの光の強度は、特定の線に集中し、Ｈｇ線は、特定の蛍光色素の励起に対して適当な波長にある場合のみ有用である。一部の蛍光プレートリーダーは、電磁スペクトルの可視領域での励起にレーザーを採用している。例えば、FluorImager^TM（Molecular Dynamics，Palo Alto， CA）はそのような装置である。この技術は、４８０ｎｍ付近でエネルギーを吸収し、５９０ｎｍ付近でエネルギーを放出する蛍光色素を使用する場合に有用である。次いで、そのような色素を標準的なアルゴン、アルゴン／クリプトンレーザーの４８８ｎｍ照明で励起し得る。例えば、１，１−ジシアノ−２−［６−（ジメチルアミノ）ナフタレン−２−イル］プロペン（ＤＤＮＰ）はそのような色素である。レーザーを使用する利点は、レーザーが非常に高い強度の光により特徴づけられるものであり、これはシグナル対ノイズ比を改善する。励起光２９１６は、サンプル２９１０からスペクトル発光２９１８をもたらす。スペクトル発光２９１８は、電磁スペクトルにおけるいずれの波長の電磁放射であってもよい。好ましくは、スペクトル発光２９１８は、蛍光、紫外線、または可視光である。最も好ましくは、スペクトル発光２９１８は、蛍光発光である。スペクトル発光２９１８は、光電子増倍管２９０４により受光する。光電子増倍管２９０４は電気結線２９０２により交信目的および操作目的をもってコンピューター２９１４に連結されている。コンピューター２９１４は、スペクトル発光を温度関数として分析するためのデータ分析手段として機能する。上に検討したように、本発明のアッセイ装置のスペクトル受け取り手段またはセンサは、光電子増倍管を含み得る。あるいは、スペクトル受け取り手段またはセンサは、電荷結合デバイスまたは電荷結合デバイスカメラを含み得る。さらに別の代替法において、スペクトル受け取り手段またはセンサはダイオードアレーを含み得る。本発明アッセイ装置の別の実施態様を図３０に示す。図３０に示す実施態様においては、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ３０００は、サンプル２９１０からのスペクトル発光２９１８を検出するのに用いあれる。ＣＣＤカメラ３０００は蛍光発光を画像化するのに適したいずれのＣＣＤカメラであってもよい。例えば、適当なＣＣＤカメラはAlpha Innotech（San Leandro，CA）、Stratagene（L a Jolla，CA）、およびBioRad（Richmond，CA）から入手可能である。マイクロプレート熱シフトアッセイでの蛍光発光を測定するために、蛍光プレートリーダーに替わり得るのは、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）である。例えば、高分解ＣＣＤカメラは、極少量の電磁エネルギーを、それが遠隔の星々から発生しているものか、結晶により回折されたものか、あるいは蛍光色素による発光なのかを検出し得る。ＣＣＤは半導体シリコンで作られている。光の光子がそこにあたると、遊離電子を放出する。電子画像装置としては、ＣＣＤカメラが蛍光発光画像形成にとって特に適している。なぜなら、ＣＣＤカメラが微弱な対象を検出できて、広いスペクトル範囲にわたって感度の高い検出が可能であり、電磁ノイズが低いレベルであり、そして広い動的範囲にわたりシグナルを検出する、すなわち、電荷結合デバイスは明るい対象および光の弱い対象を同時に検出し得るからである。さらに、アウトプットは収集した電子量が受容した光子数に正比例するように直線である。このことは、画像輝度が対象の実輝度の測定値であり、例えば、写真乳剤によっては生じない性質であることを意味する。蛍光画像カメラまたはＣＣＤカメラを用いる場合は、励起光２９１６は複数のサンプル２９１０上に位置する適当なランプであり得る。あるいは、励起光２９１６は、複数のサンプル２９１０の下に位置する適当なランプであってよい。別の実施態様において、励起光２９１６は、複数の光ファイバーケーブルにより各サンプル２９１０に配送され得る。各光ファイバーケーブルは、伝導ブロック２９１２に設けた複数の穴の一つを通して設置する。従って、サンプル２９１０のそれぞれは、光ファイバーケーブルを通して励起光２９１６を受ける。図３０に示したように、光源２９０６は、励起光２９１６でサンプル２９１０を励起する。励起光２９１６は、サンプル２９１０からスペクトル発光２９１８を発生させる。スペクトル発光２９１８は発光フィルター３００２を通して濾過する。発光フィルター３００２は、ＣＣＤカメラ３０００がモニターしない、あるいは受け付けないスペクトル発光２９１８の波長を濾去する。ＣＣＤカメラ３０００は、サンプル２９１０の全てから濾過したスペクトル発光２９１８を同時に受け取る。理解を簡単にかつ容易にするために、サンプル２９１０の一列からのスペクトル発光のみを図３０に示す。ＣＣＤカメラ３０００は電気結線２９０２を介して交信目的および操作目的をもってコンピューター２９１４に連結されている。図３１を参照すると、アッセイ装置２９００の１つの実施態様がより詳細に示されている。図３１に示すように、多くの装置構成部品が基台３１００に配置されている。熱伝導ブロック相対移動手段３１２８を、３１５０および３１５２の方向に熱伝導ブロック２９１２が移動するように用いる。熱伝導ブロック相対移動手段３１２８は、交信可能および作動可能にサーボコントローラー３１４４に接続されている。熱伝導ブロック相対移動手段３１２８のサーボコントローラー３１４４による活動は、熱伝導ブロック２９１２を３１５０および３１５２の方向に移動させる。サーボコントローラー３１４４を、コンピューターコントローラー３１４２によって制御する。あるいは、コンピューター２９１４を、サーボコントローラー３１４４を制御するために使用し得る。センサを、センサ電機子３１２０にリムーバブルに取り付ける。例示的なセンサは光ファイバープローブ３１２２である。光ファイバープローブ３１２２は、励起光２９１６を受け、サンプル２９１０に伝送することのできる光ファイバー、およびサンプル２９１０からのスペクトル発光２９１８を受け取ることのできる光ファイバーを含む。電磁放射は励起光源２９０６から励起光入力光ファイバーケーブル３１０８を介して光ファイバープローブ３１２２に伝送される。本発明の１つの実施態様によると、光電子増倍管２９０４から成るスペクトル受容手段を、サンプル２９１０からのスペクトル発光を検出するのに使用する。この実施態様では、電磁放射が光ファイバープローブ３１２２から光ファイバーケーブル３１１０を介して光電子増倍管２９０４に伝送される。本発明の別の実施態様において、ＣＣＤカメラ３００２を、サンプル２９１０からのスペクトル発光を検出するのに用いる。この実施態様において、光ファイバーケーブル３１１０は必要ではない。温度センサ３１２４はセンサ電機子３１２０にリムーバブルに取り付けられている。温度センサ３１２４は、交信可能および作動可能に温度制御器３１６２に結合されている。温度センサ３１２４は熱伝導ブロック２９１２の温度をモニターし、そして温度情報を温度制御器３１６２にフィードバックする。温度制御器３１６２は熱電結線３１６４を介して熱伝導ブロック２９１２に接続されている。温度制御器３１６２の作動の下で、熱伝導ブロック２９１２の温度が上昇し、下降し、あるいは一定に維持され得る。特に、熱伝導ブロック２９１２の温度は予め定めた温度プロフィールに従って温度制御器３１６２により変化させることができる。好ましくは、温度コンピューター制御器３１６２を、図３７に関して以下に記載するようにコンピューターシステムを用いて稼動させる。本明細書で使用するように、用語「温度プロフィール」とは経時的温度変化をいう。用語「温度プロフィール」は連続的な温度の上昇または下降変化を包含し、直線的および非直線的変化の両方を含む。この用語はまた任意の段階的温度変化プロトコールを包含し、これは、温度が漸進的に上昇または下降する間に温度の上昇または下降が一時期中断され、その間温度は一定に維持されることを特徴とするプロトコールを含む。本発明の装置においては、温度プロフィールは温度コンピューター制御器３１６２をプログラムすることにより予め決めることができる。温度プロフィールは、例えば、温度制御器３１６２の記憶装置に貯えるか、あるいは温度制御器３１６２にオペレーターが入力することができる。センサ電機子相対移動手段３１３０を、センサ電機子３１２０を３１５４および３１５６の方向に移動するために用いる。センサ電機子サーボコントローラー３１１８は励起光フィルターハウジング３１６０にしっかりと接合されている。センサ電機子サーボコントローラー３１１８の活動は、光ファイバープローブ３１２２を３１５４および３１５６の方向に移動させる。サーボコントローラーを、熱伝導ブロック２９１２およびセンサ電機子３１２０を移動させるためにどのように形成すべきかは、関連の当業者には容易に理解される。本発明は熱伝導ブロック２９１２およびセンサ電機子３１２０を移動させるためのサーボコントローラーに限定されるものではなく、モーターなどの当業者公知の他の適切な手段も使用し得ることが理解されるべきである。サーボコントローラー３１１８および３１４４は、両方とも、交信可能および作動可能にコンピューター制御器３１４２に接続されている。コンピューター制御器３１４２は、センサ電機子３１２０の３１５４および３１５６の方向への移動を制御する。さらに、コンピューター制御器３１４２は、熱伝導ブロック相対移動手段３１２８の３１５０および３１５２の方向への移動を制御する。本発明のアッセイ装置において、励起光源２９０６を、サンプル２９１０を励起するのに用いる。励起光源２９０６は、交信可能および作動可能に励起光フィルター３１０４に接続されており、上記のフィルターは励起光フィルターハウジング３１６０内に収められている。励起光フィルター３１０４は、光ファイバープローブ３１２２によってサンプル２９１０に送達されることが望ましい光の波長を除いて、励起光源２９０６からの光の波長全てを濾去する。励起光フィルターサーボコントローラー３１０６は励起光フィルター３１０４の開口を制御する。励起光源２９０６および励起光フィルターサーボコントローラー３１０６は、交信可能および作動可能に励起光コンピューター制御器３１０２に接続される。コンピューター制御器３１０２は、励起光フィルターサーボコントローラー３１０６を制御することによりサンプル２９１０に送達した励起光の波長を制御する。励起光２９１６は励起光入力光ファイバーケーブル３１０８を介して、サンプル２９１２に転送するための光ファイバープローブ３１２２に伝送される。サンプル２９１０からのスペクトル発光２９１８は光ファイバープローブ３１２２により受け取られ、そして出力光ファイバーケーブル３１１０を介してスペクトル発光フィルター３１１４に送達される。スペクトル発光フィルター３１１４はスペクトル発光フィルターハウジング３１６６に内蔵されている。スペクトル発光フィルターハウジング３１６６は、光電子増倍管ハウジング３１６８上に設置されている。光電子増倍管ハウジング３１６８は、光電子増倍管２９０４を内蔵している。スペクトル発光サーボコントローラー３１１２はスペクトル発光フィルター３１１４の開口を制御し、それによって光電子増倍管２９０４に送達されるスペクトル発光２９１８の波長を制御する。スペクトル発光サーボコントローラー３１１２はコンピューター制御器３１７０により制御する。サンプル２９１０からのスペクトル発光２９１８は光電子増倍管２９０４から送達される。電気出力３１４０は光電子増倍管２９０４を電気結線２９０２に接続する。電気結線２９０２は電気出力３１４０をコンピューター２９１４に接続する。適切なソフトにより駆動すると、コンピューター２９１４はサンプル２９１０からのスペクトル発光シグナルを処理する。代表的なソフトは、サンプル２９１０から得られた蛍光データを自動的に分析するグラフィックインターフェースである。そのようなソフトは当業者に周知である。例えば、CytoFluor^TMII蛍光マルチウェル・プレート・リーダー（PerSeptive Biosystems，Framingham，M A）は、Cytocalc^TMデータ分析システム（PerSeptive Biosystems，Framingham， MA）を利用する。他の適切なソフトは、マイクロソフト・エクセルまたは任意のソフトを含む。図３２Ａ〜Ｃは本発明のアッセイ装置用の熱電気ステージまたは熱伝導ブロックの１つの実施態様を説明する。図３２Ａは熱伝導ブロック２９１２および熱伝導線３２０６の側面図を示す。図３２Ｂは熱伝導ブロック２９１２および熱伝導線３２０６の平面図を示す。熱伝導線３２０６は熱伝導ブロック２９１２の温度を調節する温度調整要素である。当業者に周知の手段により、温度制御器３１６２は熱伝導線３２０６を温度上昇または下降させ、それによって熱伝導ブロック２９１２の温度を変化させる。例えば、例示的な温度制御器は、電気エネルギーを熱エネルギーに変換する抵抗デバイスである。あるいは、熱素子は米国特許第５，２５５，９７６号に開示のような循環水システムであり得、米国特許第５，２５５，９７６号の内容は本明細書中に参考として援用される。他の代替法では、温度調整素子が熱伝導ブロック２９１２を設置する熱伝導表面であり得る。特に、熱伝導線３２０６の温度は、予め定めた温度プロフィールに従って温度制御器３１６２により変化させることができる。温度制御器３１６２は、好ましくは、図３７に関して以下に記載したように、コンピューターシステムを用いて実施に供される。あるいはコンピューター２９１４を使用して温度制御器３１６２を作動させ得る。温度制御器３１６２および熱伝導ブロック２９１２について、例示的なセットの詳細は以下のとおりである。分解能 0.1℃ 精度＋0.5℃ 安定性 0.1℃ 反復性 0.1℃ 温度制御器３１６２は、図３６Ａおよび３６Ｂに関して以下に論ずるような温度プロフィールに従って温度を変化させる。熱伝導ブロック２９１２の温度は、熱伝導ブロック全般が均一温度で維持されるように制御することができる。あるいは、熱伝導ブロック２９２１の温度は、熱伝導ブロックの一端から他端に温度勾配が成立するように制御され得る。そのような技術は、米国特許第５，２５５，９７６号および同第５，５２５，３００号に開示されており、その全体が本明細書に参考として援用される。熱伝導ブロック２９１２は、好ましくは、アッセイすべきサンプル２９１０について、複数のウェル２９２０に対応するように設定される。１つの実施態様において、各ウェル２９２０は、複数のサンプル２９１０の1つを収容するコンテナーを受け容れるように設定されている。あるいは、熱伝導ブロック２９１２は、複数のサンプル２９１０を収容するコンテナーを受け容れるように設定されている。複数のサンプル２９１０を収容するための例示的なコンテナーは、マイクロタイタープレートである。なおさらに別の実施態様においては、熱伝導ブロック２９１２は、１またはそれ以上のサンプル２９１０を収容するコンテナーを受け容れるように設定された熱伝導アダプターを受け容れるように設定されている。熱伝導アダプターは、熱伝導ブロック２９１２上に設置され、そしてサンプル２９１０を収容しているコンテナーを熱伝導アダプターに適合させる。図３２Ｃ〜Ｅは、３種の例示的な熱伝導アダプターの形状を示す。アダプター３２００は丸底型ウェルに形状化したものである。アダプター３２０２は角底型ウェルに形状化したものである。アダプター３２０４はＶ字型ウェルに形状化したものである。例えば、アダプター３２００は、それぞれ１つのサンプルを含む複数の丸底型コンテナーを収容することができる。同様に、アダプター３２０２は複数の角底型コンテナーを収容することができ、そしてアダプター３２０４は複数のＶ字型底コンテナーを収容することができる。また、アダプター３２００、３２０２、および３２０４は複数の丸底型コンテナーの担持体を収容することができる。例示的な担持体は複数のウェルを有するマイクロタイタープレートであり、各ウェルはサンプルを容れている。熱伝導ブロック２９１２を加熱すると、熱伝導アダプター３２００、３２０２、または３２０４もまた加熱される。従って、アダプター３２００、３２０２、または３２０４内に適合するコンテナーに容れたサンプルもまた加熱される。アダプター３２００、３２０２、および３２０４は標準的なマイクロプレートの形状を受け容れることができる。本発明アッセイ装置の他の実施態様を図３３に示す。この実施態様では、複数の熱伝導ブロック２９１２を、回転可能なプラットフォームまたは回転体３３０６上に載せる。あるいは、プラットフォームは移動可能なプラットフォームであってもよい。プラットフォームまたは回転体３３０６は、熱伝導ブロック２９１２を構成している物質のような熱伝導物質から成る。６つの熱伝導ブロックを図３３に示してあるが、この数値は例示的なものであり、熱伝導ブロックの数がいくつであっても使用できることを理解すべきである。図３３に示すように、回転軸３３０８は回転し得るように基台３１００に接続されている。回転可能なプラットフォーム３３０６は軸に載せられ、回転軸３３０８の回りを回転する。回転軸３３０８の回転はサーボコントローラー３３１２により制御される。サーボコントローラー３３１２は関連技術の当業者に周知の方法でコンピューター制御器３３１４により制御される。コンピューター制御器３３１４はサーボコントローラー３３１２が回転軸３３０８を回転させるように働き、それによって回転プラットフォーム３３０６を回転させる。この方法で、熱伝導ブロック２９１２が、順次光ファイバープローブ３１２２の下に置かれる。複数の熱伝導ブロック２９１２のそれぞれは、温度制御器３１６２により独立に制御することができる。このように、第一熱伝導ブロック２９１２の温度は、第二熱伝導ブロック２９１２の温度よりも高くあるいは低くすることができる。同様に、第三熱伝導ブロック２９１２の温度は、第一あるいは第二熱伝導ブロック２９１２のいずれかの温度よりも高くあるいは低くすることができる。図３１について上記したのと同様の方法で、相対移動手段３１３０はまた、センサ電機子３１２０を３１５０および３１５２の方向に移動させ、その結果、光ファイバープローブ３１２２がサンプル２９１０からのスペクトル発光を検出するように移動させ得る。第二センサ電機子相対移動手段３３１６は、センサ電機子３１２０を３１５４および３１５６の方向に移動させるために用いる。熱伝導ブロック２９１２の温度を温度制御器３１６２により制御する。温度制御器３１６２は、結線３１６４を介して回転プラットフォーム３３０６に接合し、熱伝導ブロック２９１２に接合される。温度制御器３１６２の作動の下で、熱伝導ブロック２９１２の温度を上昇させ、下降させることができる。あるいは、温度制御器３１６２は、回転プラットフォーム３３０６の温度を調整するように設定することができる。このような設定において、回転プラットフォーム３３０６を加熱すると、熱伝導ブロック２９１２もまた加熱される。あるいは、熱伝導ブロック２９１２のそれぞれの温度は、上に示したような水循環方式によって制御することができる。図３１に説明したのと同様の方法で、励起光源２９０６をサンプル２９１０を励起するために使用する。励起光源２９０６は交信可能および作動可能に励起光フィルター３１０４に接続され、これは励起光フィルターハウジング３１６０に収容される。励起光フィルター３１０４は光ファイバープローブ３１２２によりサンプル２９１０に送達しようとする光の波長（単数または複数）を除いて、励起光源２９０６からの光の波長全てを濾去する。励起光フィルターサーボコントローラー３１０６は励起光フィルター３１０４の開口を制御する。励起光源２９０６および励起光フィルターサーボコントローラー３１０６は、交信可能および作動可能に励起光コンピューター制御器３１０２に接続される。コンピューター制御器３１０２は、励起光フィルターサーボコントローラー３１０６を制御することによりサンプル２９１０に送達した励起光の波長を制御する。励起光２９１６は励起光入力光ファイバーケーブル３１０８を介して、サンプル２９１２に転送するための光ファイバープローブ３１２２に伝送される。サンプル２９１０からのスペクトル発光２９１８は光ファイバープローブ３１２２により受け取られ、出力光ファイバーケーブル３１１０を介してスペクトル発光フィルター３１１４に送達される。スペクトル発光サーボコントローラー３１１２はスペクトル発光フィルター３１１４の開口を制御し、それによって光電子増倍管２９０４に送達されるスペクトル発光の波長を制御する。図３１で説明したものと同様の方法で、スペクトル発光サーボコントローラー３１１２はコンピューター制御器３１７０により制御される。本発明のアッセイ装置は、サンプル２９１０からのスペクトル発光を１回に１サンプルあるいはサンプル２９１０のサブセットから同時に検出することができる。本明細書で使用する場合、用語「サンプルのサブセット」は、サンプル２９１０の少なくとも２つをいう。光電子増倍管２９０４を含む本発明のアッセイ装置の１つの実施態様において、サンプルのサブセットから同時にスペクトル発光を検出するために、複数の励起光フィルター３１０４、励起光入力光ファイバーケーブル３１０８、発光出力光ファイバーケーブル３１１０、および発光フィルター３１１４を用いなければならない。スペクトル発光シグナルは光電子増倍管２９０４からコンピューター２９１４に伝達される。光電子増倍管２９０４は、交信可能および作動可能に電気結線２９０２を介してコンピューター２９１４に結合されている。結線２９０２は電気出力３１４０を介して光電子増倍管２９０４に接続されている。コンピューター２９１４は温度の関数としてスペクトル発光を分析するためのデータ分析手段として機能する。図３４は、装置を被うハウジング３４００を有する、図３３に示したアッセイ装置の平面図を説明する。扉３４０２はサンプル２９１０を見るために開く。扉３４０２はスイング式に開く蝶番扉であってもよい。あるいは、扉３４０２はスライド式に開く引き戸であってもよい。図３３および３４に示されたアッセイ装置の側面図を図３５に説明する。カバー３４００は基台３１００の上に設置されている。カバー３４００は任意の適切な材料で作製され得る。例えば、カバー３４００はプレキシガラス、ファイバーガラスまたは金属で作製され得る。図３６Ａおよび３６Ｂは、温度のプロフィール、および本発明のアッセイ装置を使用してどのように温度プロフィールを実施するかを説明する。図３６Ａは、温度プロフィール３６００を説明し、熱伝導ブロック２９１２の温度を時間関数として示す。熱伝導ブロック２９１２およびサンプル２９１０は、温度プロフィール３６００に従って連続様式で加熱する。あるいは、回転プラットフォーム３３０６は熱伝導ブロック２９１２と一緒に加熱することができる。好ましくは、温度プロフィール３６００は直線的であり、温度幅は約２５℃から約１１０℃である。あるいは、温度プロフィール３６００は温度の漸増、階段状上昇により特徴づけられ、その際、熱伝導ブロック２９１２およびサンプル２９１０は予め定められた温度に加熱され、予め定められた時間その温度を維持し、次いで、予め定められたより高い温度に加熱される。例えば、温度を、１分間に０．５℃から２０ ℃まで上昇させることができる。約２５℃から約１１０℃の温度範囲が開示されているが、所定の標的分子（例えば、タンパク質）を加熱して熱変性曲線を作成する温度範囲は当業者に容易に決定され得ることが理解されるはずである。温度プロフィール３６００を実施する時間の長さは、どのくらい多くのサンプルをアッセイすべきか、およびスペクトル発光２９１８を受け容れるセンサがどのくらい迅速にサンプル２９１０からのスペクトル発光２９１８を検出し得るかにより変化する。例えば、６個の熱伝導ブロック２９１２のそれぞれが総量96サンプル２９１０を保持し（総量５７６サンプルに対して）、サンプルを単一の光ファイバープローブを有する蛍光リーダーデバイスを用いて走査し、そして温度プロフィールが３８℃から７６℃までである実験を、図３３に示した装置を用いて実施するには約３８分を要する。温度プロフィール３６００に従って加熱する一方で、第一熱伝導ブロック２９１２中の各サンプル２９１０からのスペクトル発光２９１８が、光ファイバープローブ３１２２を通して受け入れられる。図３６Ｂに説明したように、第一熱伝導ブロック２９１２における全てのサンプル２９１０からの発光を受光した後、プラットフォーム３３０６が回転して光ファイバープローブ３１２２の下で次の熱伝導ブロック２９１２に移動し、そしてサンプル２９１０からのスペクトル発光２９１８を光ファイバープローブ３１２２により受光する。この過程を、全ての熱伝導ブロック２９１２における全てのサンプルからのスペクトル発光の受光が完了するまで続ける。各熱伝導ブロック２９１２上のサンプル２９１０からのスペクトル発光は、一度に１個のサンプルから、あるいはサンプル・サブセットから同時に、一度に１列のサンプルから同時に、あるいは一度に全てのサンプルから受けることができる。好ましい実施態様のコンピュータープログラム実施本発明はハードウェア、ソフトウェアまたはその組み合せにより実施可能であり、そして、コンピューターシステムまたは他の処理装置により実施することができる。本発明１つの実施態様の実施についてのフローチャート３８００を図３８に示す。フローチャート３８００は出発段階３８０２から始まる。段階３８０４において、温度プロフィール３６００が開始される。例えば、温度制御器３１６２が熱伝導ブロック２９１２の温度を上昇させる。段階３８０６において、光ファイバープローブ３１２２またはＣＣＤカメラ３０００などのセンサが、１つのサンプル２９１０、サンプル２９１０の１列または全てのサンプル２９１０上を移動する。段階３８０８において、励起光が、励起光源２９０６を使用して１個または複数のサンプル２９１０に伝送される。段階３８１０において、１個または複数のサンプル２９１０からのスペクトル発光を、センサーによって受光する。判定段階３８１２において、スペクトル発光２９１８が全てのサンプル、すなわち、１個の熱伝導ブロック２９１２におけるサンプル配列の全てから受けたものであるか否かを決定する。もしスペクトル発光２９１８をサンプルの全てあるいはサンプルの列から受けていないならば、センサは次のサンプルあるいはサンプル列を飛び越して段階３８１４に移動する。次いで、段階３８０８で処理が継続し、励起光２９１６を伝導する。さらに処理が段階３８１０まで継続し、１個または複数のサンプル2910からのスペクトル発光２９１８を受光する。スペクトル発光2918を全サンプルまたはサンプル列から受けた場合、処理(pro cessing)は決定段階3816に続く。決定段階3816において、スペクトル発光2918を全ての熱伝導ブロック中のサンプルから受けているかどうかが決定される。受けていない場合、回転性プラットフォーム3306が、段階3818において、次の熱伝導ブロック2912およびそれらに含まれるサンプル2910をセンサーの下へ置くために回転される。段階3806から3818は、スペクトル発光2918を全ての熱伝導ブロック 2912中の全てのサンプルから受光するまで続く。次に、処理は段階3820へ続き、ここで温度プロフィール3600は完了し、そして処理は段階3822で終了する。本発明の代わりの実施態様の実行フローチャート3900を、図３９に示す。この実施態様では、熱伝導ブロック2912上の全サンプル2910からスペクトル発光2918 を同時に受けるセンサー（例えば、CCDカメラ3000）が、熱伝導ブロック2912の上方に位置する。フローチャート3900は開始段階3902で開始する。段階3904で、温度プロフィール3600が開始される。例えば、温度制御器3162が熱伝導ブロック 2912の温度を上昇させる。段階3906で、励起光が励起光源2906を用いて（単数または複数の）サンプル2910に透過される。段階3908で、スペクトル発光が、CCD カメラ3000によって、（単数または複数の）サンプル2910から受けられる。決定段階3910で、スペクトル発光2918を全熱伝導ブロック2912から受けたかどうかが決定される。受光されなかった場合、回転プラットフォーム3306が、段階3912において、次の熱伝導ブロック2912およびそれらに含まれるサンプル2910をCCDカメラ3000の下方へ置くように回転される。段階3906から3912を、スペクトル発光 2918を全熱伝導ブロック2912中のサンプル2910から受けるまで続ける。次に、処理は、段階3914に続く。段階3914で、温度プロフィール3600は完了し、そして処理は段階3916で終了する。上記のように、本発明は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組合せを用いて実行され得、そしてコンピューターシステムまたは他の処理システムにおいて実行され得る。模範的なコンピューターシステム3702を、図３７に示す。コンピューターコントローラー3102、3142、3162、3170、または3314は、コンピューターシステム3702のような１つ以上のコンピューターシステムを用いて実行され得る。この説明を読んだ後では、当業者には、他のコンピューターおよび／または他のコンピューターアーキテクチャを用いる本発明の実行の仕方が明らかになる。コンピューターシステム3702は、プロセッサ3704のような１つ以上のプロセッサを含む。プロセッサ3704は、通信バス3706に接続される。コンピューターシステム3702はまた、メインメモリー3708、好ましくはランダムアクセスメモリー(RAM)を含み、そしてまた、二次メモリー3710を含み得る。二次メモリー3710は、例えばハードディスクドライブ3712および／またはフロッピーディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブなどに代表されるリムーバブル記憶ドライブ3714を含み得る。リムーバブル記憶ドライブ3714 は、周知の様式で、リムーバブル記憶ユニット3716から読み出しかつ／またはリムーバブル記憶ユニット3716に書き込む。リムーバブル記憶ユニット3716は、フロッピーディスク、磁気テープ、光ディスクなどに代表され、それらはリムーバブル記憶ドライブ3714によって読み出され、そしてリムーバブル記憶ドライブ37 14によって書き込まれる。理解されるように、リムーバブル記憶ユニット3716は、そのコンピューターソフトウェアおよび／またはデータがその中に記憶されたコンピューター使用可能記憶媒体を含む。別の実施態様では、二次メモリー3710は、コンピュータープログラムまたは他の命令をコンピューターシステム3702にロードさせる他の類似の手段を含み得る。このような手段は、例えばリムーバブル記憶ユニット3718およびインターフェース3720を含み得る。このような例は、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース（例えば、ビデオゲームデバイスに見られるような）、リムーバブルメモリーチップ(例えば、EPROMまたはPROM)、および連結ソケット、ならびに他のリムーバブル記憶ユニット3718およびインターフェース3720（ソフトウェアおよびデータをリムーバブル記憶ユニット3718からコンピューターシステム3702へ転送する）を含む。コンピューターシステム3702はまた、通信インターフェース3722を含む。通信インターフェース3722は、ソフトウェアおよびデータをコンピューターシステム 3702と外部デバイスとの間で転送することを可能にする。通信インターフェース 3722の例は、モデム、ネットワークインターフェース（例えば、イーサネットカード）、通信ポート、PCMCIAスロットおよ抑CMCIAカードなどを含み得る。通信インターフェース3722を介して連送されるソフトウェアおよびデータは、通信インターフェース3722によって受信され得る、電気的、電磁気的、光学的、または他の信号であり得る信号3724の形態である。これらの信号3724は、チャネル3726 を介して通信インターフェースに与えられる。このチャネル3726は、信号3724を輸送し、そして金属線またはケーブル、光ファイバー、電話線、携帯電話リンク、RFリンクおよび他の通信チャネルを用いて実行され得る。本発明のアッセイ装置において、チャネル3726の一例は、スペクトル発光2918の信号3724をコンピューター2914へ搬送する電気的接続2902である。本明細書において、用語「コンピュータープログラム媒体」および「コンピューター使用可能媒体」は、一般的に、例えば、リムーバブル記憶デバイス(3716 および3718)、ハードディスクドライブ3712においてインストールされたハードディスク、および信号3724のような媒体を呼ぶものとして使用される。これらのコンピュータープログラム製品は、ソフトウェアをコンピューターシステム3702 へ提供するための手段である。コンピュータープログラム（コンピューターコントロールロジックとも呼ばれる）は、メインメモリー3708および／または二次メモリー3710中に記憶される。コンピュータープログラムはまた、通信インターフェース3722を介して受信され得る。このようなコンピュータープログラムは、実行される場合、コンピューターシステム3702が、本明細書中で説明されるような本発明の機能を実行することを可能にする。特に、このコンピュータープログラムは、実行される場合、プロセッサ3704が本発明の機能を実行することを可能にする。従って、このようなコンピュータープログラムは、コンピューターシステム3702のコントローラーを意味する。本発明がソフトウェアを用いて実行される実施態様では、ソフトウェアはコンピュータープログラム製品中に記憶され得、そしてリムーバブル記憶ドライブ37 14、ハードドライブ3712、または通信インターフェース3722を用いてコンピューターシステム3702内にロードされる。コントロールロジック（ソフトウェア）は、プロセッサ3704により実行される場合、プロセッサ3704に本明細書中に記載のような発明の機能を実行させる。別の実施態様では、本発明は、例えば、ハードウェア構成要素(例えば、特定用途向け集積回路(ASIC))を用いて、ハードウェア内で主に実行される。本明細書中に記載の機能を行うためのハードウェア状態(state)機械の実行は、当業者らに明らかである。さらに別の実施態様では、本発明は、ハードウェアおよびソフトウェアの両方の組合せを用いて実行される。本発明のアッセイ装置は、本発明の方法を実行するために特に適する。本発明の方法および装置を使用するマイクロプレート温度変化アッセイを行うために、サンプルを熱伝導ブロック中に配置し、予め決定した温度プロフィールに従って加熱し、励起波長の光で刺激し、そしてこのサンプルを予め決定した温度プロフィールに従って加熱する一方、サンプルからのスペクトル発光を検出する。本発明のアッセイ装置は、本発明の方法を用いる使用に限定されず、また生物学的ポリマー、タンパク質、または核酸においてアッセイを行うことに限定されないことが理解されるべきである。例えば、本発明のアッセイ装置はサンプルを予め決定した温度へインキュベートするのに使用し得る。あるいは、本発明のアッセイ装置は、化合物（例えば、薬物）の温度安定性をアッセイする、任意の目的のためのポリメラーゼ連鎖反応温度循環工程を実行するため、化合物を安定化する条件を決定するため、または化合物の結晶化を促進する条件を決定するために使用され得る。ここでは本発明を一般的に記載したが、本発明は、以下の特定の実施例を参照することにより、より容易に理解できるようになる。実施例は、例示の目的のみのために本明細書中に含まれ、そして別で特定されない限り、限定することを意図しない。実施例１ヒトαトロンビンの活性部位に結合するリガンドのランク付け参照のこと）を用いて、3-Dimentional Pharmaceuticals，Inc.の科学者は、ヒトαトロンビンの活性部位に指向する化合物のコンビナトリアルライブラリーを作製した。約400の化合物を合成し、そしてスクシニル-Ala-Ala-Pro-Arg-p-ニトロアニリド(Bachem，King of Prussia，PA)が基質として働く従来の分光光度的速度論アッセイによってアッセイした。これらの化合物のうち５つ（結合親和性においてほぼ４桁の大きさにわたるK_iにより特徴づけられる）を、熱シフトアッセイの検出の範囲および限界を試験するために用いた。これら５つの所有化合物 (proprietary compounds)を、各それぞれの化合物のK_i（速度論アッセイによって測定した(最後の列)）とともに表３に列挙した。これらの化合物のK_iは、3dp- 4026の7.7nMから3dp-3811の20.0μＭまでの範囲である。 Enzyme Research Labsからの貯蔵ヒトαトロンビン溶液(1.56mg/mL)を、最初に50mM Hepes，pH7.5，0.1M NaCl（別に言及しない限り、アッセイ緩衝液）で0. 5mg/ml(11μＭ)に希釈し、そして氷上で保存した。５つのリガンド（質量分析およびNMRにより特徴づけられた再結晶固体）を、1.5〜2.0mgであるように正確に量り分け、そして濃度が1.8mMから3.8mMの間であるように、1.0mLの100％DMSO 中に希釈した。次いで、96ウェルＶ底Costarマイクロプレートを、100μＬの11 μＭヒトαトロンビン溶液がA1からA6のウェル中にピペットされるように設置した。この後、２μＬの３dp-3811をウェルA2中に、２μＬの３dp-3959をウェルA3 中に、２μＬの３dp-4077をウェルA4中に、２μＬの３dp-4076をウェルA5中に、２μＬの３dp-4026をウェルA6中に、そして２μＬの100％DMSOをコントロールウェルA1中に添加した。内容物を、100μＬのピペットチップを用いて吸入および排出を繰り返すことにより混合した。最後に、高温におけるサンプルの蒸発を減少するために、１滴のミネラルオイル(Sigma，St．Louis，MO)をウェルの頂上に添加した。次いで、マイクロプレートを、RoboCycler Gradient 96 Temperature Cycler(Stratagene，La Jolla，CA)の加熱ブロック４上に設置し、25℃、１分間セットした。次に、プレートを、SPECTRAmax^TM250分光光度計（30℃にセットした）に設置し、350nmにおける吸光度を、各サンプルについて測定した。この読みとり値をブランクまたは対照として供し、より高い温度における全ての他の読みとり値と比較した。アッセイを、加熱ブロック１を38℃にセットし、マイクロプレートを加熱ブロック１へ移動させるように温度サイクラーをプログラムし、そして、マイクロプレートをそこで３分間保つことにより開始した。38℃での平衡化に続き、プレートを25℃ブロック（ブロック４）へ30秒間移動させ、分光光度計内に挿入し、そして、吸光度を350nmで読みとった。次いで、マイクロプレートを、温度サイクラーへ戻し、そして40℃で予め平衡化していた加熱ブロック２へ移動させた。40℃で30分おいた後、プレートを25℃（ブロック４上）へ30 秒間戻し、そして、350nmでの吸光度の測定のために分光光度計に戻した。このプロセスを、温度が２℃の区切りで76℃に上昇するまで、もう18回繰り返した。ブランク吸光度（25℃でのA₃₅₀）の減算後、濁度（吸光値において反映される）を、温度の関数としてプロットした。本実験の温度変性曲線を、図１に示す。２％DMSO中に11μＭヒトαトロンビンのみを含むコントロール(ウェルA1）は、A₃₅₀の大きな増加において反映されるように、約50℃で温度変性転移開始を受けることが見出された。この転移における中点は、約55℃であると観察された。この結果は、ウシプロトロンビン１についての示差走査熱量測定値と一致した。この示差走査熱量測定値は、T_m=58℃での変性転移を示した（Lentz，B．R.ら，Bio chemistry 33:5460-5468(1994)）。試験されたインヒビター化合物の全ての温度変性曲線が、転移のシフトがより高温に向うことを示した。3dp-4026は、T_m:約９℃において最も大きなシフトを示した。この結果は、試験された化合物のうちで、3dp-4026が、基質としてスクシニル-Ala-Ala-Pro-Arg-p-ニトロアニリドを用いる速度論的測定によって判断されたように、最も大きな結合親和性を示したことと一致する。事実、図１に示すT_mにおけるシフトの順番は、従来の酵素学によって測定された結合親和性の順序に相当した。これらの結果は、コントロールに対する一連の化合物のT_mにおけるシフトを単に観察することで、一連の化合物を、目的のタンパク質に対する結合親和性の増加の順序で容易にかつ正確にランク付けし得ることを示す。マイクロプレート熱シフトアッセイをさらに一工程すすめ、T_mでの各リガンドの結合親和性を概算することが可能であった。これは、式（１）にT_O、T_m、_ΔH_u 、および_ΔC_puを代入することにより行った。仮に_ΔH_u、および_ΔC_puが、熱量デバイスが利用可能でないために測定され得なければ、治療標的について_ΔH_uおよび_ΔC_puでの経験的推測をたて得る。ヒトαトロンビンの場合、_ΔH_u=200.0kcal/ mol（密接に関連したタンパク質であるウシプロトロンビン１について計測された値である（Lentz，B.R.ら、Biochemistry 33:5460-5468(1994)）を使用することが可能である。_ΔC_pu=2.0kcal/mol-°Kの値を、T_mでK_Lを計算するために使用した。これは、このサイズの類似のタンパク質が同様の値を生じることが示されていたからである。５つの試験リガンドのT_mでの結合親和性は、分光光度基質を用いて計測したK_iと密接に相当した（表３）。 ^aT_mでのK_dの計算は、式（１）を用いて、Lentz，B.R.ら、Biochemistry 33:5460 -5468(1994)によってプロトロンビン１について観察された_ΔH^T0 _u=200.0kcal/mo l、ならびに概算_ΔC_pu-2.0kcal/mol‐°K;およびK_d=1/K_aで行った。^b T=310°KでのK_dの概算は、式（３）を用いて行い、ここで_ΔH^T _Lを-10.0kcal/mo lであると概算した。^c K_iは、310°K(50mM Hepes，pH 7.5，0.2M NaCl，0.05％βオクチルグルコシド）での分光光度的基質スクシニル-Ala-Ala-Pro-Arg-p-ニトロアニリドの酵素的加水分解の[インヒビター]依存性を見出す古典的な酵素学的方法によって測定した。実施例２ヒトαトロンビンのヘパリン結合部位に結合するリガンドのランク付けヒトαトロンビンのヘパリン結合部位に結合するリガンドのアッセイは、ヒト αトロンビンの活性部位に結合するリガンドのアッセイよりも実行が困難である。ヘパリン結合部位では、どの基質も加水分解されず、従ってどの分光光度信号も機器検出のために増幅され得ない。ヘパリン活性は、通常、生物学的血液凝固時間アッセイにより概算される。代わって、ヒトαトロンビンについてのヘパリン結合親和性は、15〜20の単一点アッセイ(single point assay)（ここで、低分子量ヘパリンの濃度は、２logにわたって変動する）を面倒にも行い、そしてヒトαトロンビンの活性部位に結台する蛍光プローブ（p-アミノベンザミジン）のクエンチングをモニターすることによって決定され得る（Olson，S.T.ら、J．Bi ol.Chem．266:6342-6352(1991)）。従って、ヒトαトロンビンへのヘパリン結合は、大量の非酵素レセプター／リガンド結合事象（ホルモン／レセプター相互作用、リプレッサー／DNA相互作用、神経伝達因子／レセプター相互作用などについて通常観察される）に出会う挑戦の性質を表す。いくつかのヘパリン様硫酸化オリゴサッカライドおよび硫酸化ナフタレン化合物を、マイクロプレート熱シフトアッセイによりアッセイした。熱シフトアッセイを用いることで、ウェルあたり単一の化合物を用いて、結合親和性（３桁の大きさにわたるK_dを伴う（表４を参照のこと)）の増加の順序で化合物を即座に順序付けることが可能であった。実施例１の実験のように、熱シフトアッセイの結果は、別の方法を介して得られた結果に密に一致した。この別の方法は、低分子量ヘパリンの広範な濃度にわたって一連の面倒な（15〜20の単一決定）蛍光クエンチングアッセイを必要とする(Ols on，S.T.ら,J．Biol．Chem．266:6342-6352(1991))。これらの結果は、単に一連の化合物の（コントロールに対する）T_mの変化を観察することで、一連の化合物を、目的のタンパク質に対する結合親和性の増加の順序で容易にかつ正確にランク付けし得ることを確認する。文献を検索したが、他のリガンドについて別に測定された結合結果を突き止められなかった。このことは、これらの実験の困難さを証明し得る。しかし、文献は、ペントサンポリ硫酸(PSO₄)(Sigma，St．Louis，MO)、デキストランSO₄(Sigm a，St．Louis，MO)、およびスラミン（CalBiochem，LaJolla，CA）が抗血液凝固特性を有することが観察されていることを明示した。確かに、ペントサンポリ硫酸およびスラミンは、抗血管形成活性について臨床試験において以前に試験されたが、毒性作用のために考慮されなかった。この毒性作用の多くは、血液凝固異常として記載されている(Pluda，J.M.ら、J．Natl．Cancer Inst．85:1585-1592 (1993);Stein，C.A.，Cancer Res．53:2239-2249(1993))。熱シフトアッセイにより測定されたような、T_mでのペントサンPSO₄およびスラミンの親和性は、ヘパリン5000の親和性よりも、それぞれ、７倍および5700倍高いことが見出された（表４）。これらの結果は、これらのリガンドが、ヒトαトロンビンの抗トロンビンIII(AT III)（ヒトαトロンビン活性のタンパク質補因子）へのヘパリン媒介結合を妨害することにより、血液凝固速度を変え得ることを示唆した。表４の結果は、化合物ライブラリーのスクリ−ニングのためのマイクロプレート熱シフトアッセイの別の利点を明らかにした：このプロセスは、それが活性部位、アロステリック補因子結合部位、またはタンパク質サブユニット界面でのいずれであるかにかかわらず、リガンド結合を検出するという意味で、盲目的でありかつ偏りがない。酵素の活性部位の外側の部位に高親和性で結合するリガンドを検出できることにより、リード分子の発見が非常に促進される。 ^aT_mでのK_dの計算は、式（１）を用いて、Lentz，B.R.ら、Biochemistry 33:5460 -5468(1994)によってプレトロンビン１について観察された_ΔH^TO _u=200.0kcal/mo l、ならびに概算_ΔC_pu=2.0kcal/mol‐°K;およびK_d=1/K_aで行った。トロンビン（ヒトαトロンビン（第IIa因子）Enzyme Research Labs(South Bend，IN)から入手）は、50mM Hepes，pH7.5、0.1M NaCl(３倍希釈)を用いて0.5mg/mL(11μＭ) に希釈した。全てのリガンドを同じ緩衝液に溶解した。^b T=298°KでのK_dの概算は、式（３）を用いて行い、ここで_ΔH^T _Lを-10.0kcal/mo lであると概算した。 ^cOlson,S.T. ら，J.Biol.Chem.266:6342-6352(1991)。実施例３ aFGFリガンドのランク付けマイクロプレート熱シフトアッセイにおいて試験した第２の治療レセプターは、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF)であった。これは、血管形成において重要な役割を果たす成長因子である(Folkman，Jら，J．Biol．Chem．267:10931-10934(19 92))。このタンパク質の合成遺伝子を、R&D System（Minneapolis，MN）から購入し、そして塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)について記載された方法（Thomps on,L.D．ら，Biochemistry 33:3831-3840(1994);Pantoliano,M.W.ら、Biochemis try 33:10229-10248(1994);Springer,B.A.ら，J.Biol.Chem.269:26879-26884(19 94)）と同様の方法を用いて、E．coliにおいてクローン化し、そして発現した。次いで、組換えaFGFを、記載のように、ヘパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィーにより精製した(Thompson，L.D．ら，Biochemistry 33:3831-384 0(1994))。aFGFはまた、ヘパリン／ヘパランに結合することが知られる。このヘパリン／ヘパランは、分裂促進的な活性のための補因子である。ペントサンPSO₄ およびスラミンのようなヘパリン様分子は、成長因子の生物学的活性を阻害する。これらの化合物のマイクロプレート熱アッセイは、ヒトαトロンビンについて上述したのと類似の様式で設定した。リガンドスラミン、ヘパリン5000、およびペントサンPSO₄のそれぞれの濁度の変化を、温度の関数として、図２に示す。これらの結果は、表５に要約する。親和定数は、結合親和性のかなり広い範囲を網羅し、ペントサンPSO₄が最も高い親和性を示す。ペントサンPSO₄、ヘパリン5000 、およびスラミンのリガンド結合親和性の順序は、等温性力価熱量測定法を用いて測定された、bFGFで見出された順序（Pantoliano，M.W.ら，Biochemistry 33: 10229-10248(1994)）に相当した。これらの化合物について別に測定された結合親和性がないことは、物理的、温度依存的変化をモニターしないアッセイを用いるこれらの測定を行う困難さを証明する。表５の結果は、表３および表４の結果と一致する。コントロールに対する一連の化合物についてT_mのシフトを単に観察することで、一連の化合物を、目的のタンパク質に対する結合親和性の増加の順序で容易にかつ正確にランク付けし得る。 ^aT_mでのK_dの計算は、式（１）を用いて、_ΔHu^TO _u=60.0kcal/mol、ならびに概算_Δ C_pu=0.95kcal/mol‐°K;およびK_d=1/K_aで行った。β-CD 14 SO₄以外の全てのリガンドは、Sigmaから購入し、そしてさらに精製することなく使用した。β-CD 14 SO₄は、American Maize Products Co.(Hammond，IN)から購入した。aFGFは、50mM Hepes，pH7.5、0.1M NaClを用いて0.25mg/mLに希釈した。全てのリガンドを同じ緩衝液に溶解した。^b T=298°KでのK_dの概算は、式（３）を用いて行い、ここで_ΔH^T _Lを-10.0kcal/mo l であると概算した。^c これらのリガンドについての公開された結合親和性データは、文献には見られなかったので、等温性力価熱量測定法によって測定された、bFGFへのこれらのリガンド結合についての親和性を示す（Thompson，L.D．ら，Biochemistry 33:383 1-3840(1994);Pantoliano,M.W. ら，Biochemistry 33:10229-10248(1994)）。実施例４ bFGFリガンドのランク付けマイクロプレート熱シフトアッセイを、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)のヘパリン活性部位への結合についてリガンドを評価するために用いた。bFGFの遺伝子を、R&D Systemsから購入し、そして既出のように、E.coliにおいてクローン化し、そして発現した（Thompson，L.D．ら，Biochemistry 33:3831-3840（1994 );Pantoliano,M.W.ら，Biochemistry 33:10229-10248(1994);Springer,B.A.ら， J．Biol．Chem．269:26879-26884(1994)）。ペントサンPSO₄およびスラミンが、それぞれ55nMおよび3.5μＭの結合親和性でbFGFに結合することが見出された。P SO₄についてのこの結果は、等温性力価熱量測定法によって決定された、bFGFに結合するPSO₄について観察された88nMの親和性と非常によく匹敵した。実施例５蛍光発光を用いるヒトαトロンピンリガンドのランク付け蛍光測定法は吸光測定法より感度が高いので、蛍光熱シフトアッセイを、ヒト αトロンビンへのリガンド結合を評価するのに用いた。多くの蛍光剤(fluoropho re)の蛍光発光スペクトルは、周囲環境の極性に感受性であり、そしてそれ故、タンパク質についての相転移（すなわち、ネイティブ(native)から変性(unfoldi ng)相への転移）の有効なプローブである。これらの環境に依存する蛍光剤の最も研究された例は、8-アミノナフタレン-1-スルホネート(1,8-ANS)である。これについては、溶媒の極性が減少するにつれて、より短い波長への発光スペクトル変化（青色変化）が観察されている。これらの青色変化には、通常、蛍光剤の蛍光量子収率の増加が伴う。ANSの場合、量子収率は、水中で0.002であり、そして ANSが血清アルブミンに結合した場合、0.4に増加する。 ANSを、タンパク質変性をモニターするための蛍光プローブ分子として用いた。蛍光アッセイにおいて、ヒトαトロンビンの最終濃度は0.5μＭであり、これは、濁度アッセイにおいて使用した濃度より20倍以上の希釈である。このヒトα トロンビン濃度は、速度論スクリ−ニングアッセイについて使用した範囲内である。 ANSを、波長360nmの光で励起した。蛍光発光を、CytoFluor II蛍光マイクロプレートリーダー（PerSeptive Biosystems，Framingham，MA）を用いて460nmで測定した。温度を、濁度アッセイについて上述したように上昇させた(ramp up)（実施例１を参照のこと）。蛍光のプロットを、ヒトαトロンビンのみおよび3dp- 4026/ヒトαトロンビン複合体について、温度の関数として、図３に示す。ヒト αトロンビンについての変性転移は、57℃で明らかに観察された。これは、濁度実験において観察された温度よりわずかに高いだけの温度であった。それにもかかわらず、蛍光アッセイからの結果は、示差走査熱量測定実験からのプロトロンビン１で観察された、58℃のT_mと密に一致している。重要には、3dp-4026(67μ Ｍ)は、変性転移を約66℃にシフトさせ、９℃のT_mのシフトを与えることが見出された、このことは、検出信号として濁度（表３）を用いて見出されたのと同一である。図３および表４の結果は、いくつかの重要な点を示す。第１に、感度の少なくとも20倍の増加が、吸光度から蛍光発光検出システムへの切り替えによって得られ得る。これは、供給が限定されるこれらのレセプタータンパク質にとって重要であり得る。第２に、蛍光アッセイにおいて、変性転移信号は、濁度アッセイの信号よりずっときれいである。濁度アッセイでは、高い濃度のタンパク質では、変性タンパク質の沈殿が生じた。沈殿タンパク質は、雑な(noisy)信号の原因となった。第３に、マイクロプレート熱シフトアッセイからのT_m測定値におけるシフトは、一つの検出システムから別の検出システムで再現可能である。実施例６ FGFR1のＤ（II）ドメインに対するリガンドのランク付けマイクロプレート熱シフトアッセイを使用して、ヘパリン5000およびペントサンPSO₄の、線維芽細胞増殖因子レセプター１（FGFR1）のD(II)ドメインにおける既知のヘパリン結合部位に対する結合を試験した。D(II)FGFR1は、bFGFに対する結合の自由エネルギーのほとんどについての原因である124残基ドメインである。D(II)FGFR１をクローン化して、E.coli中で発現させた。組換えD(II)FGFR1を、ヘキサヒスチジンタグがNi²⁺キレートカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる回収を容易にするためにＮ末端に含まれることを除いて（Janknech t,R.ら、Natl.Acad．Sci.USA 88:8972-8976(1991)）、本質的に記載（Wetmore， D.R.ら、Proc.Soc.Mtg.,San Diego,CA(1994)）の通りに封入体から再生した。D( II)FGFR1をヘパリンセファロースカラム（Kan,M.ら、Science 259:1918-1921(19 93)；Pantoliano，M.W.ら、Biochemistry 33:10229-10248(1994)）でさらに精製した。純度は、SDS-PAGEで評価した場合、＞95％であった。D(II)FGFR1タンパク質を12mg/mL（約1mM）に濃縮し、そして４℃で保存した。 D(II)FGFR1タンパク質を、1.0mg/mL（70μＭ）の濃度でANS溶液に溶解した。D (II)FGFR1の変性形態に結合したANSについての量子収率は、ヒトα-トロンビンに結合したANSについての量子収率よりは低かった。ANS蛍光は、非常に環境依存性であるので（Lakowicz,I.R.,Principles of Fluorescence Spectroscopy，Ple numPress，New York(1983)を参照のこと）、異なるタンパク質の変性について観察される量子収率は変化する。しかし、D(II)FGFR1については、アッセイの濁りバージョンについてのシグナルはほとんど検出不可能であった。D(II)FGFR1についての低減した感度にもかかわらず、ANSは、マイクロプレートアッセイのためのこのシステムをレスキューした。第Xa因子については、変性第Xa因子に結合したANSについての蛍光量子収率がヒトα-トロンビンについての得られたものとほとんど同程度に良好であったという以外は、同様の結果が得られた。変性bFGFに結合したANSについての蛍光量子収率は、ヒトα-トロンビンに結合しているANS についての量子収率と同程度に高いことが見い出された。マイクロプレート熱シフトアッセイにより決定される場合、D(II)FGFR1結合実験の結果を、図４および表６に示す。以前に上記の他のレセプタータンパク質すべてについて実証したように、マイクロプレート熱シフトアッセイは、D(II)F GFR1についてのリガンド結合親和性のランク付けを容易にした。 ^aT_mにおけるK_dについての計算は、等式（1）を用いて推定ΔH^TO _u=60.0kcal/モル、および推定ΔC_pu＝0.95kcal/モル−°K;およびK_d＝1/K_aで行った。D(II)FGFR1 を50mM Hepes，pH7.5、0.1M NaCl中で136μＭ ANS存在下で1.0mg/mL（70μＭ）に希釈した。すべてのリガンドを同じ緩衝液に溶解し、そしてタンパク質溶液中に50倍に希釈した。^b Ｔ＝298°KにおけるK_dについての推定は、等式（3）を使用して行った。ここで、等温滴定熱量測定法（Pantoliano，M.W.ら、Biochemistry 33:10229-10248(19 94)）により決定した場合、ペントサンPSO₄およびヘパリン5000について、それぞれΔH^T _L＝−12.1kcal/モル、および-7.48kcal/モルである。^c 滴定熱量測定法により決定した場合の、D(II)-D(III)FGFR1に結合しているこれらのリガンドについての公開された結合親和性データ（Pantoliano、M.W.ら、Biochemistry 33:10229-10248(1994) 。実施例７Ｄ因子のマイクロプレート熱シフトアッセイマイクロプレート熱シフトアッセイの交叉標的利用性をさらに実証するために、別の酵素であるＤ因子を熱ほどけ遷移を経験する能力について試験した。Ｄ因子は、補体系の副経路の活性化に関連する必須のセリンプロテアーゼであり、侵入する病原体に対する主要な宿主防御のエフェクターシステムである。Ｄ因子をファンコーニ症候群を患った患者の尿から精製し（Narayanaら、J.Mol.Biol．235: 695-708(1994)）、そしてアッセイ緩衝液（50mM Hepes，pH7.5、0.1M NaCl）中に４μＭに希釈した。アッセイ容積は10μｌであり、そして1,8-ANSの濃度は100 μＭであった。実験を、15μＬの丸底ディンプルプレート（８×12ウェル配列）を用いて実施した。タンパク質を、Robocycler^TM温度サイクラーを用いて42℃〜 62℃の間で２℃ずつ加熱した。各加熱工程の後で、そしてCytoFluor II^TM蛍光プレートリーダーを用いた蛍光スキャンの前に、サンプルを25℃に冷却した（実施例１を参照のこと）。非線形最小二乗曲線のあてはめおよび他のデータ解析を図３に記載のように実施した。Ｄ因子のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を図５に示し、そしてタンパク質の非リガンド型について324K(51℃)付近で生じる熱ほどけ遷移を明らかにした。Ｄ因子について、有意に親和性の可逆的リガンドは知られていない。図５に示される結果は、マイクロプレート熱シフトアッセイを使用してＤ因子リガンドについての化合物のライブラリーをスクリ−ニングし得ることを示す。図５における結果はまた、マイクロプレート熱シフトアッセイが、一般に任意の標的分子に適用可能であることを示す。実施例８第Xa因子のマイクロプレート熱シフトアッセイ血液凝固経路における重要な酵素である、ヒト第Xa因子を、マイクロプレート熱シフトアッセイの交叉標的有用性のさらに別の試験として選択した。第Xa因子をEnzyme research Labs（South Bend,IN）から購入し、そしてアッセイ緩衝液（50mM Hepes、pH7.5、0.1M NaCl）中で1.4μＭに希釈した。アッセイ容積は100 μＬであり、そして1,8-ANSの濃度は100μＭであった。タンパク質を、Robocycl er^TM温度サイクラーを用いて50℃〜80℃の間で２℃ずつ加熱した。各加熱工程の後で、CytoFluor IITM蛍光プレートリーダーを用いた蛍光スキャンの前に、サンプルを25℃に冷却した（実施例１を参照のこと）。第Xa因子のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を図６に示す。熱ほどけ遷移は338K（65℃）で観察された。データ解析は図３について記載のように記載された。図６における結果は、タンパク質安定性のマイクロプレート熱シフトアッセイが、一般に任意の標的分子に適用可能であることを示す。実施例９ヒトαートロンピンに対するリガンド結合のマイクロプレート熱シフトアッセイのミニチュア化マイクロプレート熱シフトアッセイのミニチュア形態を開発して、アッセイに必要な高価な治療用タンパク質およびリガンドの量を最小化した。アッセイ容積を低減させる最初の試みにおいて、蛍光シグナルに悪影響を与えることなく、アッセイ容積を100μＬから50μＬに低減させた。アッセイ容積を５μＬまで、さらに10倍低減させた場合、ヒトα-トロンビンについて好ましい結果が得られた。図７に示すように、ヒトα-トロンビンほどけ遷移を、その通常のT_mにおいて容易に観察し得た。より重要なことに、活性部位インヒビターがほどけ遷移のT_m を8.3°Kシフトさせたことを観察し、T_mにおいて15nMのK_dという推定値を得た。 T_mにおけるK_aを、以下の関係式を使用して計算した： 25℃または37℃付近の温度でのKdは、結合のエンタルピーΔH_bがこのリガンドにネガティブである場合、より高い親和性である。分光測定アッセイを用いると、37℃（310°K）においておよそ８nMの見かけ上のK_iが観察された。 CytoFluorII蛍光プレートリーダー（PerSeptive Biosystems,Framingham，MA ）を用いて、図７に示した測定を得た。実験において、光の励起波長は360nmであり、そして発光を460nmにおいて測定した。このミニチュア化アッセイに使用されたマイクロプレートは、従来のポリカーボネートＶ底96ウェルプレート（St ratagene、またはCostar）または８×12配列での15μＬディンプルを含むポリカーボネートプレート（Costar plate lids）のいずれかであった。反応において、ヒトα-トロンビンの濃度は、アッセイ緩衝液（50mM Hepes、pH7.5、0.1M NaC l）中μＭであった。アッセイ容積は５μＬであり、そして1,8-ANSの濃度は100 μＭであった。タンパク質を、Robocycler^TM温度サイクラーを用いて44℃〜64℃ の間で２℃ずつ加熱した。各加熱工程の後で、そしてCytoFluor II^TM蛍光プレートリーダーを用いた蛍光スキャンの前に、サンプルを25℃で30秒間冷却した（実施例１を参照のこと）。非線形最小二乗曲線のあてはめおよび他のデータ解析を図３について記載のように実施した。実施例10 D(II)FGFR1へのリガンド結合のマイクロプレート熱シフトアッセイのミニチュア化組換えD(II)FGFR1を封入体から精製し、そしてヘパリンセフアロース上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。D(II)FGFR1（15mg/mL；1.1mM ）のストック溶液を、アッセイ緩衝液（50mM Hepes，pH7.5、0.1M NaCl）中で50 μＭに希釈した。アッセイ容積は10μＬであり、そして1,8-ANSの濃度は250μＭであった。リガンドの非存在下でのほどけ遷移は、図８に示すように約312K（3 9℃）であることが見出された。ヘパリン模倣物アプロスレート（aprosulate）（300μＭ）の存在下で、ほどけ遷移が約８Ｋ〜約320Ｋ上昇したことが観察された。この温度中点T_mを使用して、T_mにおけるアプロスレートのD(II)FGFR1への結合親和性が約18μＭであると推定することが可能である（表６）。これらの結果は、酵素でない標的分子に対するリガンド結合親和性を推定するマイクロプレート熱シフトアッセイの能力を実証する。実施例11 ウロキナーゼのマイクロプレート熱シフトアッセイのミニチュア化解析した別の標的分子は、ヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ u-PA）であった。u-PAは、プラスミノーゲンを活性なプロテアーゼプラスミンに酵素的に変換する。u-PAは組織再構築、細胞移動、および転移に関与している。 u-PAについての遺伝子をATCC（Rockville,MD）から得、そして改変してE.coliにおいて活性な酵素を適切に発現させた。u-PAをクローン化し、E.coliで過剰発現し、そしてWinklerら（Biochemlstry 25:4041-4045(1986)）によって記載される手順に類似の手順を用いて精製した。u-PA精製の最後の工程を、活性部位インヒビターglu-gly-arg-クロロメチルケトン（CMK）の存在下で実施して、これによりこの実験に利用したu-PAはCMK-u-PA複合体であった。実験をミニチュア化した形式で５μＬのウェル容積中で実施した。１μＬの濃縮CMK-u-PA（13g/L、371.4 μＭ）を、96ウェルポリカーボネートＶ底マイクロタイタープレートの複数ウェル中の４μＬの62.5mM MOPS,pH7、125mM NaCl、および250μＭ 1,8-ANSに添加した。熱変性曲線をトロンビン、aFGF、D(II)FGFR1、Ｄ因子、および第Xa因子について以前に記載したように、マイクロプレートの漸増加熱に続く各温度上昇後の蛍光読み取りにより描いた。この実験についてのデータの解析および非線形最小二乗あてはめは、これらの条件下でのCMK-u-PAについてのT_mが81℃であり、これは、トロンビン、aFGF，D(II)FGFR1、Ｄ因子、および第Xa因子について見られた T_m（それぞれ、55℃、44℃、40℃、51℃、55℃、および65℃）よりもかなり高いことを示す。この実験は、比較的熱安定性のタンパク質またはリガンド（単数または複数）の高親和性結合により安定化されるタンパク質についてのT_mを決定する際の本発明の有用性を実証し、そしてミニチュア化形式におけるこのような実験を実施する能力をさらに実証する。実施例12 ヒトα-トロンピンのマイクロプレート熱シフトアッセイのさらなるミニチュア化トロンビンのストック溶液を、50mM Hepes,pH7.5、0.1M NaClおよび100μＭ 1 ,8-ANS中で１μＭに希釈した。電子マルチチャネルピペッターを使用して、２μ Ｌまたは５μＬのいずれかの希釈トロンビン溶液を96ウェルポリカーボネートマイクロタイタープレートのウェルに配分した。プレートを、マイクロプレートを横切って温度勾配を確立し得るサーマルブロック中で３分間の加熱をし、続いて 25℃で30秒間冷却し、そして次にCytoFluor II蛍光プレートリーダーにおいて読みとった。データを、非線形最小二乗あてはめにより解析し、そして図10および 11において示すようにプロットした。各曲線は、反復実験を表す。T_m決定についての標準偏差は、５μＬまたは２μＬのいずれかの容積を利用する実験についても非常に良好であり（それぞれ、+/-1.73および+/-0.90K）、これは、非常に低容積で操作する本発明の能力を実証する。実際に、本発明において使用し得る容積は、小容積を正確に配分するために利用可能な技術によってのみ制限されるようである。アッセイ容積を、図11においてヒトα-トロンビン（1.0μＭ）について示すように２μＬにまで低減させた。96ウェル配列において再現性のある２μＬのピペッティングは、特殊化したピペッティングの道具（例えば、Matrix Technologie s Corp.(Lowell，MA)から入手可能なマルチチャネルピペッターの使用を必要とする。これは、0.5〜12.5μＬの容積について±2.0％もしくは0.15μＬの精密度および±2.5％もしくは0.15μＬの正確さを有する）の使用を必要とする。実施例13 マイクロプレート熱シフトアッセイの単一温度モード単一温度アッセイの結果を図12に示す。化合物3DP-3811、3DP-3959、3DP-4076 、および3DP-4660は、ヒトα-トロンビンの活性部位に結合する。これらの４化合物のヒトα-トロンビンについてのK_i（酵素的に決定した）は、それぞれ、20,00 0nM、250nM、25nM、および８nMである。これら４つの各化合物を、96ウェルプレート中の別々の５μｌアッセイ容積中でヒトα-トロンビンと平衡化させた。最終リガンド濃度は50μＭであった。より高い親和性でヒトα-トロンビンに結合するリガンドについて、55℃におけるコントロール反応（ヒトα-トロンビン単独）と比較して低レベルの蛍光発光を観察した。弱く結合するリガンド3DP-3811を含むサンプルについての結果は、コントロールサンプルについて得られる結果とはほとんど異ならなかった。3D P-4076についての蛍光発光における減少は、ヒトα-トロンビンの高親和性（25n MのK_i）から考えて予測したほど大きくなかった。この結果は、部分的には、この化合物の塩化物塩のより低い溶解性に起因し得る。図12におけるデータは、単一温度実施態様の250nMの結合親和性（のK_d）（またはリガンド濃度が50μＭの場合、より良好な）を有するリガンドを迅速に同定することに対する、マイクロプレート熱シフトアッセイの有用性を明らかに実証する。実施例１４内因性タンパク質トリプトファン蛍光発光のマイクロプレート熱シフトアッセイヒトα-トロンビンの内因性Trp蛍光を、マイクロプレート熱シフトアッセイでアッセイした。100μＬのサンプルは２μＭのヒトα-トロンビンを含んでいた。サンプルをXenon-Arcランプからの280nmの光に曝露した。発光を350nmにおいてB io Lumin 960（Molecular Dynamics）を用いて検出した。44℃と66℃との間の温度サイクルを以前の実施例に記載のように実施した。アッセイの結果を図13および14に示す。蛍光発光における小さな増加を、温度を上昇させながら350nmにおいて観察した。しかし、蛍光発光におけるこの増加は、タンパク質を含まないブランクウェルにおける蛍光のレベルより上でかろうじて検出可能であった（図13 ）。平均ブランクの減算はシグナル対ノイズ比を改善した（図14）が、しかし観察されたほどけ遷移は、1,8-ANSを使用するアッセイにおいて代表的に観察されたものとは異なっていた。1,8-ANSを用いて観察された遷移とは対照的に、図14における遷移は、より広いようであり、334.4±5°Kにおいて中点温度T_mを有し、いくつかは、1,8-ANSで実施したアッセイにおけるヒトα-トロンビンについて観察されたT_mよりも５度ほど高かった。実施例15 複数リガンド結合相互作用のアッセイ以前に実証したように、熱シフトアッセイを使用して、標的タンパク質における単一部位への結合についてのリガンドをスクリーニングし得る。マイクロプレート熱シフトアッセイが基づく、根底にある物理原則である、リガンド結合およびタンパク質ほどけの自由エネルギーのおよその相加性の観点から、標的タンパク質との複数リガンド結合相互作用を解析するためにマイクロプレート熱シフトアッセイを使用することが可能である。同じタンパク質に対する異なるリガンド結合の結合の自由エネルギーが、ほとんど相加的である場合、リガンドが協同的（正）な様式でまたは非協同的（負）な様式で結合するかどうか、複数リガンド結合システムを解析し得る。ヒトα-トロンビンに対する複数のリガンド結合をマイクロプレート熱シフトアッセイでアッセイした。ヒトα-トロンビンは、少なくとも４つの異なるリガンド結合部位を有する：（1）触媒結合部位；（2）フィブリン結合部位（エキソ部位Ｉ）；（3）ヘパリン結合部位（エキソ部位II）；および（4）触媒部位から約15Åに位置するNa⁺結合部位。第一に、３つの個々のリガンドの独立結合をアッセイした：3DP-4660、Hirugen(ヒルジン53-64)（Bachem）、およびヘパリン50 00（CalBiochem）。これらのリガンドは、それぞれ、触媒部位、フィブリン結合部位、およびヘパリン結合部位に結合する。トロンビンのストック溶液を、50mM Hepes,pH7.5、0.1M NaCl、１mM CaCl₂および100μＭ 1,8-ANS中で、１μＭに希釈した。各トロンビンリガンドは、単独でおよび種々の組合せで、1μＭのトロンビン溶液に、ヘパリン5000（これは200 μＭである）を除いておのおの50μＭの最終濃度で含まれていた。100μＬのトロンビンまたはトロンビン/リガンド溶液を、96ウェルＶ底ポリカーボネートマイクロタイタープレートのウェルに配分した。プレートを、マイクロプレートを横切って温度勾配を確立し得るサーマルブロック中で３分間の加熱をし、続いて25℃で 30秒間冷却し、そして次に蛍光プレートリーダーにおいて読みとった。データを、非線形最小二乗あてはめにより解析した。これらの個々の結合反応の結果を図15および16に示す。結合親和性のランク順位は、3DP-4660＞Hirugen＞ヘパリン5000であった（各T_mにおけるリガンド結合についてのそれぞれの15nM、185nM、および3434nMのK_d値に対応する（等式（4）を参照のこと））。この結果は、結合の自由エネルギーが完全に相加性だった場合に予測されるよりもわずかに小さな熱ほどけシフトを明らかにする。例えば、Hirugen単独では、5.8℃のΔT_mを示し、そして3DP-4660単独では7.7℃のΔT_mを示す。しかし、組合せでは、Hirugenおよび3DP-4660は、12.2℃のΔT_mを示す。この結果は、両方のリガンドが結合している場合、一方あるいは両方のリガンドの結合親和性が低減することを意味し、そしてフィブリン結合部位と触媒結合部位との間の結合における負の協同性の例である。このような負の協同性効果は、ヒトα-トロンビンの文献と首尾一貫する。この文献において、種々の色素生産性の基質の加水分解動力学が、エキソ部位Ｉに結合しているリガンドに依存しているということが見い出された。実際、Hirugenが存在する場合、D-フェニルアラニルピペコリルアルギニル-p-ニトロアニリドの加水分解についてのK_mにおいて60％の低減が観察された（Dennisら、Eur.J.Biochem．188:61-66(1990)）。さらに、触媒部位とエキソ部位Ｉとの間の協同性についての構造的証拠もまた存在する。PPACK（ヒトα-トロンビン触媒部位インヒビター）およびHirugenに結合するヒトα-トロンビンの同型構造の比較は、エキソ部位ＩでのHirugenの結合の結果として活性部位に生じるコンフォメーショナル変化を明らかにした（Vijayalakshmiら、Pro tein Science 3:2254-2271(1994)）。従って、マイクロプレート熱シフトアッセイにおいて、触媒中心とエキソ部位Ｉとの間で観察される見かけの協同性は、文献での機能および構造のデータと首尾一貫する。同様に、３つすべてのリガンドの結合をアッセイした場合、12.9℃のΔT_mが観察された（図16）。結合の自由エネルギーが完全に相加性であった場合、17.7℃ のΔT_mを観察すると予測する。観察された結果は、３つすべてのタンパク質結合部位におけるリガンド結合を介して、さらなる負の協同性が生じていることを意味する。この結果は、文献と首尾一貫する。ヘパリンおよびフィブリンモノマーとの三元複合体において、ヒトα-トロンビンがトリペプチド色素発色性基質およびプロトロンビンに対して低減した活性（HoggおよびJackson,J.Biol.Chem.26 5:248-255(1990)）および顕著に低減したアンチトロピンとの反応性（HoggおよびJackson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3619-3623(1989)）を有する。また、最近の観察は、三元複合体がまた、血漿において形成し、ヘパリン抗凝固活性を顕著に弱めることを示す（Hotchkissら、Blood 84:498-503(1994)）。これらの複数リガンド結合の結果の要約を、表７に示す。図15、図16、表７における結果は、多変量解析を実施するためにマイクロプレート熱シフトアッセイを使用することの以下の利点を示す。第一に、同じマイクロプレート熱シフトアッセイを使用して、標的タンパク質における複数の結合部位に対する複数のリガンドの結合を同時に検出し得る。第二に、マイクロプレート熱シフトアッセイを使用して、治療上の標的における２つ以上の部位に対する同じリガンド結合を検出し得る。第三に、マイクロプレート熱シフトアッセイは、リガンド結合における協同性の検出を提供する。リガンド結合協同性についての情報を収集し得、そして非常に迅速に解析し得る。従って、代替技術を使用すれば実施するのに数カ月かかる複数リガンド結合実験は、マイクロプレート熱シフトアッセイを使用すれば実施するのに数時間かかるだけである。 ^aT_mにおけるK_dについての計算は、等式（1）を用いてΔH_u ^T ^°＝200.0kcal/モル（プレトロンビン１についてLentzら（1994）によって観察されるように）および推定ΔC_pu=2.0kcal/モル−°K;およびK_d＝1/K_aで行った。^b Ｔ＝298°KにおけるK_dについての推定は、等式（3）を使用し、ここでΔH_L ^T−1 0.0kcal/モルであると推定して行った。実施例16 ヒトα-トロンピン安定性を増大させる生化学的条件のスクリーニングマイクロプレート熱シフトアッセイを４つの異なる蛍光色素とともに使用して、複数のpH値、塩化ナトリウム濃度、および還元酸化化合物のヒトα-トロンビン安定性における影響を同時にスクリーニングした。トロンビン溶液を、50mM H epes，pH7.5、0.1Mまたは0.5MのいずれかのNaCl，10mM EDTA、10mM CaCl₂、10mM ジチオスレイトール、10 1mM CaCl₂、および100μＭ 1,8-ANS、10％（v/v）グリセロール、または0.1％(w/v)ポリエチレングリコール（PEG）6000中に１μＭに希釈した。反応容積は100μＬであった。これらの多変量実験の結果を図17A〜Dおよび図18に示す。図17A〜Dは、ヒトα -トロンビンについて単一の96ウェルプレートにおいて収集された安定性データをまとめる。図17Aにおいて、蛍光色素は1,8-ANSである。図17Bにおいて、蛍光色素は2,6-ANSである。図17Cにおいて、蛍光色素は2,6-TNSである。図17Dにおいて、蛍光色素はbis-ANSである。図17A〜Dにおける結果は、約7.0の至適pHおよび NaCl濃度の増大に伴う安定性の増加を示す。NaCl濃度がOから0.5Mに増大した場合、約12℃のΔT_mを観察した。図18は、10％グリセロールの安定化効果およびジチオスレイトールの不安定化効果を示す。図17A〜Dおよび18から、蛍光色素1,8- ANSおよび2,6-TNSがマイクロプレート熱シフトアッセイにおいて最も効果的であることは明らかである。 NaClの安定化効果は、特に興味深い。なぜなら、トロンビンの触媒中心からおよそ15Åの弱いNa⁺結合部位（5mMトリス緩衝液pH8.0、0.1％PEG、25℃において3 0±３mMのK_d）の、文献における最近の報告があるからである（Dangら、Nature Biotechnology 15:146-149(1997)）。等式（1）を使用すれば、50mM Hepes pH8. 0緩衝液（０および0.10M NaCl）中でT_m（53℃）付近でNaCl結合が約６mMであると推定することが可能である。 0.10Mを超えるNaCl濃度において生じるさらなる安定化は、ヒトα-トロンビンの全体構造において合算された、さらなるNa⁺および／またはCl^-結合事象に由来し得る。あるいは、このさらなる安定化の供給源は、通常0.5〜２M NaClで観察されるより特異的でない塩析効果に由来し得、そして塩により誘導されるタンパク質の優先的な水和に起因する（TimasheffおよびArakawa，Protein Structure, A Practical Approach，T.E．Creighton編、IRL Press，Oxford，UK(1989)331 〜354頁）。グリセロールのタンパク質における安定化効果は、グリセロールの優先的な除外（すなわち、タンパク質の優先的な水和）とタンパク質の表面における極性領域への特異的な結合との間の平衡に起因するとされている（TimasheffおよびAra kawa,Protein Structure，A Practical Approach，T.E．Creighton編、IRL Pres s，Oxford，UK(1989)331〜354頁）。実施例17 D(II)FGFレセプター1の安定性を増大させる生化学的条件のスクリーニングマイクロプレート熱シフトアッセイを使用して、D(II)FGFレセプター1安定性における多数の生化学的条件の効果を同時にスクリーニングした。アッセイを、１μｇのD(II)FGFR1（50mM HEPES pH7.5中の500μＭ濃縮ストック由来）と４μ Ｌの各生化学的条件とを96ウェルのポリカーボネートのマイクロタイタープレートのウェルにおいて混合することにより実施した。混合後の最終タンパク質濃度は100μＭであり、そして最終1,8-ANS濃度は200μＭであった。生化学条件は以下のように試験した：試験したpHは、５（酢酸ナトリウム）、６（MES）、７（M OPS）、８（HEPES）、および９（CHES）で、最終緩衝液濃度は50mMであった。試験した塩濃度は、0,1Mまたは0.5M NaClであった。添加剤を、50mM MOPS,pH7 、0.1M NaCl中で1mM(EDTA、ジチオスレイトール)、10mM（CaCl₂、MgCl₂、MgSO₄ 、NiSO₄）、50mM（アルギニン）、100mM（(NH₄)₂SO₄、LiSO₄、NaSO₄、ZnSO₄）、５％w/v（ポリエチレングリコール6000）、および10％v/vグリセロールの最終濃度で試験した。熱変性プロフィールを、トロンビン、aFGF、Ｄ因子、および第Xa因子について、前記のように、マイクロプレートの漸増加熱に続く各温度上昇後の蛍光読み取りにより描いた。データを、以前に記載のように非線形最小二乗あてはめにより解析した。これらの多変量実験の結果を図19〜24に示す。図19に示すように、安定性は、 NaCl濃度が増大するのに従って増大した。NaCl濃度が0.lから0.5Mに増大した場合約５℃のΔT_mを観察した。図20に示すように、MgSO₄およびアルギニンの両方が、タンパク質を安定化した。図21に示すように、10％グリセロールは、タンパク質を安定化した。さらに、ホフマイスター系列の塩（例えば、Li₂SO₄、Na₂SO₄ 、(NH₄)₂SO₄およびMgSO₄）はすべて、安定化効果を有した（図21）。図22に示すように、ジチオスレイトールはタンパク質を不安定化した。これらの結果は、ヒトα-トロンビンの結果とはそれほどは異なる形式ではない。図23に示すように、約8.0の至適pHを観察した。EDTA、CaCl₂、MgCl₂、MgSO₄、アルギニン、(NH₄)₂ SO₄、Li₂SO₄、Na₂SO₄、グリセロール、ポリエチレングリコール6000、およびジチオスレイトールの相対安定化効果を図24に示す。実施例18 ウロキナーゼ安定性を増大させる生化学的条件のスクリーニングマイクロプレート熱シフトアッセイを使用して、複数の生化学的条件のヒトウロキナーゼ安定性における影響を同時にスクリーニングした。この実験を、１μ Ｌのウロキナーゼ（20mM Tris pH8中の371 ５M濃縮ストック由来）と４μＬの各生化学的条件とを96ウェルのポリカーボネートのマイクロタイタープレートのウェルにおいて混合することにより実施した。混合後の最終タンパク質濃度は74 μＭであり、最終1,8-ANS濃度は200μＭであった。生化学条件は以下のように試験した：試験したpHは、５（酢酸）、６（MES）、７（MOPS）、８（HEPES）、および９（CHES）で、最終緩衝液濃度は50mMであった。試験した塩濃度は、0,1Mまたは0.5M NaClであった。グリセロールを、50mM MOPS、pH７、0.1M NaCl中で1 0％v/vで試験した。熱変性プロフィールを、トロンビン、aFGF、Ｄ因子、D(II)FGFR1、および第Xa 因子について、前記のように、マイクロプレートの漸増加熱に続く各温度上昇後の蛍光読み取りにより描いた。データを、以前に記載のように非線形最小二乗あてはめにより解析した。これらの多変量実験の結果を図25に示す。約7.0の至適pHを観察した。塩化ナトリウム濃度の増大は、タンパク質を安定化した。10％グリセロールもまた、タンパク質を安定化した。これらの結果は、文献に報告された結果と一致する（Ti masheffおよびArakawa,Protein Structure，A Practical Approach，T.E．Crei ghton編、IRL Press，Oxford，UK(1989)331〜354頁）。図17〜25は、タンパク質安定性を最適化する多変量生化学的条件を同時にスクリーニングするためにマイクロプレート熱シフトアッセイを使用することの利点を図示する。本発明の方法および装置を用いて、タンパク質の安定性に影響する条件についての生化学的条件の巨大な配列を迅速にスクリーニングし得る。従って、本発明を使用して、タンパク質の寿命を最適化する生化学的条件を迅速に同定し得る。実施例19 タンパク質折り畳みを容易にする生化学的条件のスクリーニング要因配置実験を実施して、正確に折り畳まれたHis₆-D(II)-FGFR1の収率を増大させる生化学的条件を同定した。His₆-D(II)-FGFR1は、組換えD(II)-FGFレセプター1タンパク質であり、Ｎ末端にポリヒスチジンタグが付着している。結果を表８にまとめる。塩酸グアニジンの最終濃度が0.38Mの場合、pH8.0および0.5M N aClにて13.5±0.2％の再び折り畳まれたタンパク質収率を得た。この収率は、グリセロールが７％（v/v）で存在した場合、15.5±0.3％にまで増大し得た。His₆ -D(II)-FGFR1再折り畳み収率の18％までのさらなる増大を、pHを8.9にまで増大させた場合に観察した。事実、すべての実験において、pHの8.0から8.9への増大は、収率を改善した。これらの結果は、８と９との間のpH、および７％のグリセロールが、D(II)-FGFR1折り畳みを容易にする２つの重要な条件であることを実証する。これらの各条件は、折り畳みタンパク質収率を、pH8.0および0.5M NaCl の出発条件から約15〜20％増大させた。重要なことに、pHおよびグリセロールの効果は、ほとんど相加的であるようである。pH8.9および７％グリセロールでの再折り畳みタンパク質の増大した収率は、17.8％であることが見い出され、これはpH8.0および0.5M NaCl（13.5±0.2 ％収率）で得られる収率より32％、より高い。再折り畳みの決定因子のおよその相加性は、重要な結果を有する。なぜなら、全体の折り畳みの自由エネルギーを含む小さな個々の自由エネルギー成分が折り畳みタンパク質の収率を最適化するために漸増的に組み合わせられ得ることを示唆するからである。 ^a再折り畳みを、Gdn-HC1の最終濃度が0.38Mになるように、それぞれの再折り畳み緩衝液において3.2mLのNi²⁺NTA/6M Gdn-HCl懸濁液を50mLに希釈すること（１：15.6希釈）により開始した。^b 収率は、ヘパリンセファロースカラムから溶出した画分についての測定A₂₈₀値に基づく。固定化タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイにより測定される場合1.2mg/mLであった。カラムサイズが21mLであるので、25.2mgのD(II)-FG FR1が樹脂に結合した。 0.09MのGdn-HCl最終濃度における再折り畳み実験の第二回目の結果は、Gdn-HC lがHis₆-D(II)-FGFR1の折畳みに影響するさらに一層重要な因子であることを明らかにした（表９）。pH8.0および0.5M NaClにおいて、Gdn-HCl濃度を0.09Mにまで低減させると、再折り畳みタンパク質収率は、pH8.0、0.5M NaClおよび0.38M Gdn-HClにおいて得られた収率と比較して２倍になる（表９）。0.38MのGdn-HCl 濃度において得られた結果に従って、0.09M Gdn-HCl濃度における再折り畳みHis₆ -D(II)-FGFR1の収率はまた、グリセロールの存在下で増大した。これらの結果は、グリセロール（５〜10％）および低Gdn-HCl濃度における再折り畳みHis₆-D( II)-FGFR1の収率改善が相加的であることを示唆する。さらに、表９における結果は、ホフマイスター塩NaSO₄が、再折り畳みタンパク質の収率を５〜10％のグリセロールとほとんど同じくらいに増大することを明らかにする。 ^a再折り畳みを、Gdn-HClの最終濃度が0.09Mになるように、それぞれの再折り畳み緩衝液において7.5mLのNi²⁺NTA/6M Gdn-HClの懸濁液を5OmLに希釈すること（１：6.7希釈）により開始した。^b 収率は、ヘパリンセファロースカラムから溶出した画分についての測定A₂₈₀値に基づく。固定化タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイにより測定される場合、1.6mg/mLであった。カラムサイズが20mLであるので、32mgのD(II)-FG FR1が樹脂に結合した。再折り畳みNi²⁺-NTA結合His₆-D(II)-FGFR1の収率を増大させる生化学的条件（表８および９）およびHis₆-D(II)-FGFR1の全体的なタンパク質の安定性を増大する条件（図19〜24）の比較によれば、タンパク質折り畳みの結果とタンパク質安定性の結果との間には、強度な相関性が存在することは明らかである。グリセロール、ホフマイスター系列の塩、およびpH8.5〜8.9は、His₆-D(II)-FGFR1のタンパク質折り畳み収率およびHis₆-D(II)-FGFR1のタンパク質全体の安定性を改善する。これらの結果は、図26におけるタンパク質折り畳みのモデルと一致している。ほどけたHis₆-D(II)-FGFR1の凝集が、Ni²⁺-NTAで固定化される場合に抑制され、そして単純二状態平衡がUとNとの間に存在する場合、UとNとの間の平衡の相対位置に影響する因子は、U（再折り畳み実験において）から出発するかまたはN（マィクロプレート熱シフトアッセイタンパク質安定性スクリーニングにおいて）から出発するかに関わらず、同じであるはずである。熱力学は経路に非依存性なので、この反応の最初および最後の状態のみが重要であるはずである。類似の生化学的条件がタンパク質安定性および再折り畳みタンパク質収率を容易にするので、このタンパク質について、図26に示したタンパク質折り畳みの単純モデルは正確である。従って、マイクロプレート熱シフトアッセイは、タンパク質折り畳みを最適化する生化学的条件をスクリーニングするための迅速かつ一般的な方法として役立ち得る。実施例20 図28は、４つの各蛍光プローブ分子:bis-ANS、2,6-TNS、1,8-ANS、および2,6- ANSを用いたマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。トロンビン溶液を50mM Hepes，pH7.5、および0.1M NaCl中で１μＭに希釈した。実施例21 蛍光スキャナーおよび電荷結合装置カメラについてのアッセイ結果の比較 Gel DocumentationおよびAnalysis System（Alpha Innotech Corp.、San Lean dro，CA）を使用して、マイクロプレート熱シフトアッセイを実施した。この系は、CCDカメラを使用して、染色したゲル、ドットブロットアッセイ、および96 ウェルプレートからの蛍光発光を検出する。励起光源は、CCDカメラの下に直接配置された長波長UVトランスイルミネーターボックスであった。アッセイすべき 96ウェルプレートを、CCDカメラの焦点視界領域（21×26cm）内のトランスイルミネーターボックスに配置した。２μMのヒトα-トロンビン溶液を、50mM Hepes，pH7.5、0.1M NaCl中で、精製ヒトα-トロンビン（Enzyme Research Labs，Madison，WI）の34μＭストック溶液を希釈する（１：17）ことにより調製した。ヒトα-トロンビン溶液はまた、1 00μＭの1,8-ANSを含んだ。100μＬのヒトα-トロンビン-1,8-ANS溶液を、Ｖ底ポリカーボネートマイクロプレート（Costar）の単一列（列Ａ）の12の各ウェルにアリコートした。勾配ブロック（RoboCycler^TM、Stratagene）を使用して、12 のサンプルを、44℃から66℃にマイクロプレートの列を横切って加熱した（すなわち、ウェルあたり２℃の温度勾配を確立した）。従って、ウェルA1は66℃であり、A12は44℃であった。同じ緩衝液（タンパク質なし）中に100μM1,8-ANSを含むコントロール溶液をB1〜B12の各ウェルに配置した。各ウェルに蒸発を防ぐため鉱物油１滴を添加した後、プレートを勾配ブロックで３分間加熱した。次いで、各ウェルの内容物を放置して室温に戻し、そして平底マイクロプレートに移した。この実験において、励起波長を約360nmに、そして発光波長を約460nmに狭める（それらは、1,8ANS蛍光色素についての最適波長である）ためにはフィルターは使用しなかった。次いで、平底プレートをUVトランスイルミネーターボックスの近くに配置し、そしてCCDカメラを使用して、発光量を測定した。プレートはまた、従来型の蛍光プレートリーダー（CytoFluor II）でも読み、２つの異なる検出方法によって得られる結果を比較した。２つの検出方法についての結果を、図 40に示す。図40における結果は、CCDカメラが、マイクロプレート熱シフトアッセイにおけるタンパク質のほどけをモニターするための蛍光発光検出器として有用であることを示す。実施例22 電荷結合装置カメラを用いたマイクロプレート熱シフトアッセイ発光フィルターを使用して、1,8-ANSについての発光領域（約460nm）の領域外のすべてのストレイライトを遮断した。さらに、マイクロプレート熱シフトアッセイの５μＬのミニチュア化形式を使用して、このコンフィギュレーションにおけるCCDカメラ検出方法を試験した。ポリカーボネートのＶ底およびディンプルプレートの両方を試験した。実験は、アッセイの容積がＶ底またはディンプル96 ウェルプレートのいずれかにおいて５μＬであることを除いて、実施例21に記載の実験と本質的に同じ様に行った。温度範囲は、Ｖ底プレートについて44℃〜66 ℃（右から左）であり、ディンプルプレートについて46℃〜70℃（右から左）であった。CCD画像の写真を図41に示す。Ｖ底ウェルマイクロプレート画像を図41A に示す。ディンプルプレート画像を図41Bに示す。図41Aにおいてプレートから得られた結果を図42に示す。図42における結果は、CCDカメラを用いて得られた結果が、蛍光検出のために光電子増倍管（PMT）を使用する蛍光プレートリーダーを用いて得られたデータと非常に良好に匹敵することを示す。本明細書中上記で言及されるすべての刊行物および特許は、本明細書中でその全体を参考として援用される。上記の発明は、明瞭性および理解の目的のためにいくらか詳細に記載されているが、本開示の解釈から、形式および詳細において種々の変化が、本発明および添付の特許請求の範囲の真実の範囲から逸脱することなく、なされ得ることが当業者により理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＣ１２Ｎ 15/00 Ｚ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者リンド，アレキサンダーダブリュー. アメリカ合衆国イリノイ 60048，リバティービル，ハーバードレーン 604 (72)発明者セイレム，フランシスアール. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19067, ヤードレイ，ティンバーレイクス 1970 (72)発明者スプリンガー，バリーエイ. アメリカ合衆国デラウエア 19808，ウィルミントン，チャールストンドライブ 208 (72)発明者ボーン，ロジャーエフ. アメリカ合衆国ニュージャージー 08807，ブリッジウォーター，ガーフィールドアベニュー 797 (72)発明者ペトリリャ，ユジェニオシー. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19087, ウェイン，フェアファックスコート 304

Claims

【特許請求の範囲】１．熱変化によってほどけ得る標的分子を安定化するための、１つ以上の複数の異なる分子または１つ以上の異なる生化学的条件の効率をランク付けするための多変量方法であって、以下の工程 (a)該標的分子を、１つ以上の該複数の異なる分子または１つ以上の該複数の異なる生化学的条件に、マイクロプレートの複数のウェルの各々において接触させる工程； (b)工程(a)からの該複数のウェルを同時に加熱する工程； (c)該ウェルの各々において該加熱による該標的分子の熱ほどけに伴う物理学的変化を測定する工程； (d)該ウェルの各々の温度を関数として、該標的分子についての熱ほどけ曲線を作製する工程； (e)工程(d)の該ほどけ曲線の各々と、(i)該他のほどけ曲線の各々と、および(ii )生化学的条件の参照セット下、または該複数の異なる分子における任意の該分子の非存在下での該標的分子から得られたほどけ曲線とを比較する工程；および (f)該複数の異なる分子または該複数の異なる生化学的条件の効率を、該熱ほどけ曲線の各々における変化によって、ランク付けする工程を含む、方法。２．前記ほどけが変性であり、そして前記熱ほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項１に記載の方法。３．前記工程(d)がさらに該熱ほどけ曲線から中点温度(T_m)を決定することを含み；前記工程(e)が、 (el)工程(d)からの該ほどけ曲線の各々のT_mと、(i)該他の熱ほどけ曲線の各々の T_mと、および(ii)該異なる分子における任意の該分子の非存在下での該標的分子から得られた、または生化学的条件の参照セット下から得られた、該熱ほどけ曲線の該T_mとを比較することを含み、そして前記工程(f)は、 (f1)該複数の異なる分子または該複数の異なる生化学的条件の効率を、該熱ほどけ曲線の各々のT_mにおける変化によってランク付けすることを含む、請求項１に記載の方法。４．前記標的分子がタンパク質である、請求項１に記載の方法。５．前記工程(c)が、前記ウェルの各々の該内容物による光吸収を測定することを含む、請求項１に記載の方法。６．前記工程(a)が、前記タンパク質と、前記１つ以上の異なる分子または異なる生化学的条件とを、前記複数のウェルの各々に存在する蛍光プローブ分子の存在下で接触させることを含み、そして前記工程(c)が、 (c1)該複数のウェルの各々における該蛍光プローブ分子を、光で励起させること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項４に記載の方法。７．前記蛍光が蛍光発光である、請求項６に記載の方法。８．前記標的分子が核酸である、請求項１に記載の方法。９．前記工程(c)が前記核酸の濃色度における変化を測定することを含む、請求項８に記載の方法。１０．前記標的分子が蛍光標識された２本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項８に記載の方法。１１．前記オリゴヌクレオチドの１つの鎖が、ドナー蛍光色素を含み、そして該オリゴヌクレオチドの他の鎖がアクセプター蛍光色素を含む、請求項１０に記載の方法。１２．前記工程(a)が、前記オリゴヌクレオチドを、前記複数のウェルの各々において前記複数の異なる分子、または前記複数の異なる生化学的条件に接触させることを含み、そして前記工程(c)は、 (c1)該複数のウェルの各々において前記ドナー蛍光色素を、光で励起させること；および (c2)該複数のウェルの各々において前記アクセプター蛍光色素からの蛍光を測定することを含む、請求項１０に記載の方法。１３．前記蛍光が蛍光発光である、請求項１２に記載の方法。１４．前記工程(c2)が、１回に１つずつ該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。１５．前記工程(c2)が、前記複数のウェルのサブセットからの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。１６．前記工程(c2)が、前記複数のウェルの各々からの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。１７．前記工程(c)が、 (c1)前記複数のウェルの各々の前記タンパク質におけるトリプトファン残基を、光で励起すること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項４に記載の方法。１８．前記蛍光が蛍光発光である、請求項１７に記載の方法。１９．熱変化によってほどけ得る標的分子の、１つ以上の複数の異なる分子の組合せの親和性をランク付けするための多変量方法であって、以下の工程(a)該標的分子を、該複数の異なる分子の２つ以上の異なる分子の組合せに、マイクロプレートの複数のウェルの各々において接触させる工程； (b)工程(a)からの該複数のウェルを同時に加熱する工程； (c)該ウェルの各々の該加熱により生じる概評的分子の熱ほどけに伴う物理学的変化を測定する工程； (d)該ウェルの各々の温度を関数として、該標的分子についての熱ほどけ曲線を作製する工程； (e)工程(d)の該熱ほどけ曲線の各々と、(i)該標的分子について得られた該他の熱ほどけ曲線の各々と、および(ii)該複数の異なる分子における任意の該分子の非存在下での該標的分子から得られた該熱ほどけ曲線とを比較する工程；および (f)該異なる分子の組合せの該標的分子への親和性を、該熱ほどけ曲線の各々における変化によってランク付けする工程を含む、方法。２０．前記ほどけが変性であり、そして、前記熱ほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項１９に記載の方法。２１．前記工程(d)がさらに前記熱ほどけ曲線から中点温度(T_m)を決定することを含み；前記工程(e)が、 (e1)工程(d)からの該ほどけ曲線の各々のT_mと、(i)前記他の熱ほどけ曲線の各々のTと_m、および(ii)前記複数の異なる分子における前記任意の分子の非存在下で前記標的分子から得られた該熱ほどけ曲線のT_mとを比較することを含み；そして前記工程(f)が、 (f1)該熱ほどけ曲線の各々の該T_mにおける変化に従って、前記異なる分子の組合せの効率をランク付けすることを含む、請求項１９に記載の方法。２２．前記工程(c)が、前記複数のウェルの各々の前記内容物の光の吸収を測定する工程を含む、請求項１９に記載の方法。２３．前記標的分子がタンパク質である、請求項１９に記載の方法。２４．前記工程(a)が、前記複数のウェルの各々に存在する蛍光プローブ分子の存在下で、前記標的分子と前記複数の異なる分子の前記組合せとを接触させることを含み、そして、前記工程(c)が、 (c1)該複数のウェルの各々における該蛍光プローブ分子を、光で励起すること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項１９に記載の方法。２５．前記蛍光が蛍光発光である、請求項２４に記載の方法。２６．前記標的分子が核酸である、請求項１９に記載の方法。２７．前記工程(c)が前記核酸の濃色度における変化を測定することを含む、請求項２６に記載の方法。２８．前記標的分子が蛍光標識された２本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。２９．前記オリゴヌクレオチドの１つの鎖が、ドナー蛍光色素を含み、そして該オリゴヌクレオチドの他の鎖がアクセプター蛍光色素を含む、請求項１９に記載の方法。３０．前記工程(a)が、前記オリゴヌクレオチドを、前記複数のウェルの各々において異なる分子の前記組合せに接触させることを含み、そして前記工程(c)は、 (c1)該複数のウェルの各々において前記ドナー蛍光色素を、光で励起させること；および (c2)該複数のウェルの各々において前記アクセプター蛍光色素からの蛍光を測定することを含む、請求項２９に記載の方法。３１．前記蛍光が蛍光発光である、請求項３０に記載の方法。３２．前記工程(c２)が、前記複数のウェルの蛍光を１回に１つずつ測定することをさらに含む、請求項２４または３０に記載の方法。３３．前記工程(c２)が、前記複数のウェルのサブセットからの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項２４または３０に記載の方法。３４．前記工程(c２)が、前記複数のウェルからの各々からの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項２４または３０に記載の方法。３５．前記複数の異なる分子がコンビナトリアルライブラリーを含む、請求項１９に記載の方法。である、請求項３５の方法。３７．ほどかれたタンパク質の折り畳みまたは再折り畳みを容易にするための１つ以上の複数の異なる生化学的条件の組合せの効率をランク付けするための、多変量最適化方法であって、 (a)前記折り畳みタンパク質または再折り畳みタンパク質をマイクロプレートの複数のウェルの各々に配置する工程、ここで該折り畳みタンパク質または再折り畳みタンパク質は、該複数の異なる生化学的条件の１つ以上の組合せに従って事前に折り畳まれるかまたは再び折り畳まれている； (b)工程(a)からの該複数のウェルを同時に加熱する工程； (c)該ウェルの各々において、該加熱から生じる該タンパク質の熱ほどけに関連する物理学的変化を測定する工程； (d)該ウェルの各々について温度を関数として、該タンパク質について熱ほどけ曲線を作製する工程； (e)工程(d)における該ほどけ曲線の各々と、(i)該他の熱ほどけ曲線の各々と、および(ii)生化学的条件の参照セット下での天然形態における前記タンパク質について得られた該熱ほどけ曲線とを比較する工程；および (f)各々の該熱ほどけ曲線における変化に従って、該異なる折り畳みまたは再折り畳み条件の組合せの効率をランク付けする工程、を含む方法。３８．前記ほどけが変性であり、そして前記熱ほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項３７に記載の方法。３９． (g)前記(f)工程における前記熱ほどけ曲線の各々の前記物理学的変化の大きさに比較して、該物理学的変化の大きさを増大する生化学的条件の組合せを作成する方法；および (h)最大のタンパク質折り畳みまたは再折り畳みを促進する生化学的条件の組み合わせが決定されるまで、前記工程(a)から(g)を繰り返す工程、をさらに含む、請求項３７に記載の方法。４０．前記工程(e)が、 (e1)折り畳まれたタンパク質収率を評価することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。４１．前記工程(d)が前記熱ほどけ曲線から中点温度(T_m)を決定することをさらに含み；前記工程(e)が、 (e1)工程(d)からの前記ほどけ曲線の各々のT_mと、(i)前記他の熱ほどけ曲線のT_m と、および(ii)生化学的条件の参照セット下での天然形態における前記タンパク質から得られた該熱ほどけ曲線のT_mとを比較することを含み；そして前記工程(f)が、 (f1)該熱ほどけ曲線の各々のT_mにおける変化に従って、該異なる折り畳みまたは再折り畳み条件の組合せの効率をランク付けすることを含む、請求項３７に記載の方法。４２．前記工程(c)が、前記ウェルの各々の前記内容物の光の吸収を測定することを含む、請求項３７に記載の方法。４３．前記工程(a)が、前記タンパク質と、前記複数のウェルの各々に存在する蛍光プローブ分子の存在下で、前記複数の異なる生物学的条件の組合せとを接触させることを含み、前記工程(c)が、 (c1)該複数のウェルの各々における該蛍光プローブ分子を、光で励起すること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項３７に記載の方法。４４．前記蛍光が蛍光発光である、請求項４３に記載の方法。４５．前記工程(c2)が、前記複数のウェルの各々からの蛍光を１回に１つ筒測定することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。４６．前記工程(c2)が、前記複数のウェルのサブセットからの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。４７．前記工程(c)が、 (c1)前記複数のウェルの各々の前記タンパク質におけるトリプトファン残基を、光で励起すること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項３７に記載の方法。４８．前記蛍光が蛍光発光である、請求項４７に記載の方法。４９．ほどけタンパク質の折り畳みまたは再折り畳みを容易にするための、１つ以上の複数の異なる生化学的条件の組合せの効率をランク付けするための多変量最適化方法であって、 (a)タンパク質安定性を促進する１つ以上の複数の異なる生化学的条件の組合せを決定する工程； (b)該１つ以上の生化学的条件の組み合わせの下で、タンパク質安定性を促進する該工程(a)における該ほどけタンパク質を折り畳む工程； (c)折り畳みタンパク質収率を評価する工程； (d)折り畳みタンパク質収量に従って、異なる折り畳みまたは再折り畳み条件の該組合せの効率をランク付けする工程；および (e)至適なタンパク質の折り畳みまたは該折り畳みを促進する生化学的条件の組み合わせが同定されるまで、工程(a)〜(d)を繰り返す工程、を含む方法。５０． (f)最大のタンパク質折り畳みまたは再折り畳みを促進する生化学的条件の組み合わせが決定されるまで、前記工程(a)から(g)を繰り返す工程、をさらに含む、請求項４９に記載の方法。５１．前記工程(a)が請求項４１〜４７のいずれか１つの方法をさらに含む、請求項４９に記載の方法。５２．前記ほどけが変性であり、そして前記熱ほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項５１に記載の方法。５３．タンパク質を産生する組換えDNA法において、宿主に異種であるタンパク質を発現する工程、該タンパク質を該宿主の封入体から得る工程、および該タンパク質の再折り畳みまたは再生条件下で再折り畳みまたは再生により該封入体から機能性タンパク質を回収する工程、を含み、請求項３７または４９の方法による前記再折り畳みまたは再生条件の異なる複数のセットの効率をランク付けすることを含む改良を含む、方法。５４．熱変化によってほどけ得るタンパク質の結晶化を容易にするための複数の異なる生化学的条件の１つ以上の組合せをランク付けするための多変量最適化方法であって、 (a)該タンパク質と該複数の異なる生化学的条件の組合せとを、マイクロプレートの複数のウェルの各々において接触させる工程； (b)工程(a)からの該複数のウェルを同時に加熱する工程； (c)該加熱から生じる該タンパク質の熱ほどけに伴う該ウェルの各々の物理学的変化を測定する工程； (d)該ウェルの各々について温度を関数として、該タンパク質についての熱ほどけ曲線を作製する工程； (e)工程(d)の該ほどけ曲線の各々と、(i)該他のほどけ曲線の各々および(ii)生化学的条件の参照セット下での該タンパク質について得られた熱ほどけ曲線とを比較する工程；および (f)該複数の異なる生化学的条件の効率を、該熱ほどけ曲線の各々における変化によってランク付けする工程を含む、方法。５５．前記ほどけが変性であり、そして前記熱ほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項５４に記載の方法。５６． (g)前記(f)工程における前記熱ほどけ曲線の各々の前記物理学的変化の大きさに比較して、該物理学的変化の大きさを増大する生化学的条件の組合せを作成する方法；および (h)最大のタンパク質結晶化を促進する生化学的条件の組合せが決定されるまで、前記工程(a)から(g)を繰り返す工程、をさらに含む、請求項５４に記載の方法。５７．前記工程(d)が前記熱ほどけ曲線から中点温度(T_m)を決定することをさらに含み；前記工程(e)が、 (e1)工程(d)における前記ほどけ曲線の各々のT_mと、(i)前記他の熱ほどけ曲線の各々のT_mと、および(ii)生化学的条件の参照セット下での天然形態における前記タンパク質について得られた該熱ほどけ曲線のT_mとを比較することを含み；そして前記工程(f)が、 (f1)該熱ほどけ曲線の各々のT_mにおける変化に従って、該異なる折り畳みまたは再折り畳み条件の組合せの効率をランク付けすることを含む、請求項５４に記載の方法。５８．前記工程(c)が、前記複数のウェルの各々の前記内容物の光の吸収を測定することを含む、請求項５４に記載の方法。５９．前記工程(a)が、前記標的分子と、前記複数のウェルの各々に存在する蛍光プローブ分子の存在下で、前記異なる生化学的条件の前記組合せとを接触させることを含み、そして前記工程(c)が、 (c1)該複数のウェルの各々における該蛍光プローブ分子を、光で励起すること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項５４に記載の方法。６０．前記蛍光が蛍光発光である、請求項５９に記載の方法。６１．前記工程(c2)が、前記複数のウェルの蛍光を１回に１つずつ測定することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。６２．前記工程(c2)が、前記複数のウェルのサブセットからの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。６３．前記工程(c2)が、前記複数のウェルの各々からの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。６４．前記工程(c)が、 (c1)前記複数のウェルの各々の前記タンパク質におけるトリプトファン残基を、光で励起すること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項５４に記載の方法。６５．前記蛍光が蛍光発光である、請求項６４に記載の方法。６６．熱変化によってほどけ得る標的分子に対する、複数の異なる分子の各々の親和性をランク付けするための方法であって、以下の工程 (a)該標的分子を、該複数の異なる分子の１つの分子に、マイクロプレートの複数のウェルの各々において接触させる工程； (b)工程(a)からの該複数のウェルを同時に加熱する工程； (c)該ウェルの各々の該加熱による該標的分子の熱ほどけに伴う物理学的変化を測定する工程； (d)該ウェルの各々の温度の関数として、該標的分子についての熱ほどけ曲線を作製する工程； (e)工程(d)の該熱ほどけ曲線の各々と、該複数の異なる分子における任意の該分子の非存在下での該標的分子について得られた該熱ほどけ曲線の各々と、および該標的分子から得られたほどけ曲線とを比較する工程；および (f)該標的分子に関する該複数の異なる分子の親和性を、該熱ほどけ曲線の各々における変化によってランク付けする工程を含む、方法。６７．前記ほどけが変性であり、そして前記熱ほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項６６に記載の方法。６８．前記工程(c)が、前記複数のウェルの各々の前記内容物により光の吸収を測定する工程を含む、請求項６６に記載の方法。６９．前記工程(d)が前記熱ほどけ曲線から中点温度(T_m)を決定することをさらに含み；前記工程(e)が、 (e1)工程(d)からの前記ほどけ曲線の各々のT_mと、(i)該他の熱ほどけ曲線の各々のT_mおよび(ii)前記複数の異なる分子のうち任意の該分子の非存在下で前記標的分子について得られた該熱ほどけ曲線のT_mとを比較することを含み；そして前記工程(f)が、 (f1)該熱ほどけ曲線の各々のT_mにおける変化に従って、該標的分子についての該複数の異なる分子の親和性をランク付けすることを含む、請求項６６に記載の方法。７０．前記標的分子がタンパク質である、請求項６６に記載の方法。７１．前記工程(a)が、前記標的分子を、前記複数のウェルの各々において存在する蛍光プローブ分子の存在下で前記複数の異なる分子に接触させることを含み、そして前記工程(c)が、 (c1)該複数のウェルの各々において該蛍光プローブ分子を、光で励起させること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項７０の方法。７２．前記蛍光が蛍光発光である、請求項７１に記載の方法。７３．前記工程(c)が、 (c1)前記複数のウェルの各々の前記タンパク質におけるトリプトファン残基を、光で励起すること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項７０の方法。７４．前記蛍光が蛍光発光である、請求項７３に記載の方法。７５．前記標的分子が核酸である、請求項６６に記載の方法。７６．前記工程(c)が前記核酸の濃色度の変化を測定することを含む、請求項７５に記載の方法。７７．前記標的分子が蛍光標識された２本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項７５に記載の方法。７８．前記オリゴヌクレオチドの１つの鎖がドナー蛍光色素を含み、そして該オリゴヌクレオチドの他の鎖がアクセプター蛍光色素を含む、請求項７７に記載の方法。７９．前記工程(a)が、前記オリゴヌクレオチドと、前記複数のウェルの各々における、前記複数の異なる分子とを接触させることを含み、前記工程(c)は、(c1 )該複数のウェルの各々における前記ドナー蛍光色素を、光で励起すること；および (c2)該複数のウェルの各々における前記アクセプター蛍光色素からの蛍光を測定すること含む、請求項７８に記載の方法。８０．前記蛍光が蛍光発光である、請求項７９に記載の方法。８１．前記工程(c2)が、前記複数のウェルからの蛍光を１回に１つずつ測定することをさらに含む、請求項７０または７９に記載の方法。８２．前記工程(c2)が、前記複数のウェルのサブセットからの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項７０または７９に記載の方法。８３．前記工程(c2)が、前記複数のウェルの各々からの蛍光を同時に測定する工程をさらに含む、請求項７０または７９に記載の方法。８４．前記複数の異なる分子がコンビナトリアルライブラリーを含む、請求項６６に記載の方法。ある、請求項８４に記載の方法。８６．リード化合物を作製するためのコンビナトリアル方法であって、複数の化合物を合成する工程、および該化合物がレセプター分子に結合する能力を試験する工程を含み、改良が、 (a)該レセプター分子と該複数の異なる化合物のうち１つの化合物とを、マイクロプレートの複数のウェルの各々において接触させる工程； (b)工程(a)からの該複数のウェルを同時に加熱する工程； (c)該加熱から生じる該レセプター分子の熱ほどけに伴う物理学的変化を該ウェルの各々において測定する工程； (d)該ウェルの各々について温度の関数として、該レセプター分子についての熱ほどけ曲線を作製する工程； (e)工程(d)の該熱ほどけ曲線の各々と、該複数の異なる化合物のうちの任意の化合物の非存在下での該レセプター分子について得られた該熱ほどけ曲線とを比較する工程；および (f)該レセプター分子に対する該複数の異なる化合物の親和性を、該熱ほどけ曲線の各々における変化によってランク付けする工程を含む、方法。８７．前記ほどけが変性であり、そして前記熱ほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項８６に記載の方法。８８．前記工程(d)が前記熱ほどけ曲線から中点温度(T_m)を決定することをさらに含み；前記工程(e)が、 (e1)工程(d)からの前記ほどけ曲線の各々のT_mと、(i)前記他の熱ほどけ曲線の各々のT_mおよび(ii)前記複数の異なる化合物のうちの任意の化合物の非存在下で、該標的分子から得られた該熱ほどけ曲線のT_mとを比較することを含み；そして前記工程(f)が、 (f1)該熱ほどけ曲線の各々のT_mにおける変化に従って、該異なる複数の化合物の該レセプター分子についての効率をランク付けすることを含む、請求項８６に記載の方法。８９．前記工程(c)が、前記複数のウェルの各々の前記内容物による光の吸収を測定することを含む、請求項８６に記載の方法。９０．前記標的分子がタンパク質である、請求項８６に記載に記載の方法。９１．前記工程(a)が、前記標的分子を、前記複数のウェルの各々に存在する蛍光プローブ分子の存在下で前記複数の異なる分子に接触させる工程を含み、そして前記工程(c)が、 (c1)該複数のウェルの各々において該蛍光プローブ分子を、光で励起させること；および (c2)該複数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項９０に記載の方法。９２．前記蛍光が蛍光発光である、請求項９１に記載の方法。９３．前記工程(c)が、 (c1)光で、前記多数のウェルの各々において、前記タンパク質中のトリプトファン残基を励起すること；および (c2)該多数のウェルの各々からの蛍光を測定すること、を含む、請求項８６に記載の方法。９４．前記蛍光が蛍光発光である、請求項９３に記載の方法。９５．前記標的分子が核酸である、請求項８６に記載の方法。９６．前記工程(c)が、前記核酸の濃色度における変化を測定することを含む、請求項９５に記載の方法。９７．前記標的分子が、蛍光により標識された二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項９５に記載の方法。９８．前記オリゴヌクレオチドの一方の鎖がドナー蛍光色素を含み、該オリゴヌクレオチドの他方の鎖がアクセプター蛍光色素を含む、請求項９７に記載の方法。９９．前記工程(a)が、前記オリゴヌクレオチドを、前記多数のウェルの各々中の前記多数の異なる分子と接触させることを含み、そして前記工程(c)が、 (c1)光で、該多数のウェルの各々において、前記ドナー蛍光色素を励起すること；および (c2)該多数のウェルの各々において、前記アクセプター蛍光色素からの蛍光を測定すること、を含む、請求項９８に記載の方法。１００．前記蛍光が蛍光発光である、請求項９９に記載の方法。１０１．前記工程(c2)が、前記多数のウェルからの蛍光を一度に一つずつ測定することをさらに含む、請求項９３または９８に記載の方法。１０２．前記工程(c2)が、前記多数のウェルのサブセットからの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項９３または９８に記載の方法。１０３．前記工程(c2)が、前記多数のウェルの各々からの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項９３または９８に記載の方法。１０４．前記多数のウェルから、１つ以上の化合物を、前記レセプター分子に対するそれらの最大結合親和性により選択する工程、および該レセプター分子に対して高い親和性を有する化合物の第２のライブラリーを生成する工程をさらに含む、請求項８６に記載の方法。１０５．前記多数の化合物が、コンビナトリアルライブラリーを含む、請求項８６に記載の方法。ーである、請求項１０５に記載の方法。１０７．多数のコンテナーをその中に有するキャリアを備える製造産物であって、該コンテナーの各々が、 (a)加熱に起因して変成し得る標的分子；および (b)コンビナトリアルライブラリー中に存在する多数の異なる分子から選択される１つの分子を含み、該異なる分子の各々が、該キャリア中の該多数のコンテナーの異なる１つの中に存在する、製造産物。１０８．前記標的分子がタンパク質である、請求項１０７に記載の製造産物。１０９．前記多数のコンテナーの各々に蛍光プローブ分子をさらに含む、請求項１０８に記載の製造産物。１１０．前記標的分子が核酸である、請求項１０７に記載の製造産物。１１１．前記核酸が蛍光により標識された二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１１０に記載の製造産物。１１２．前記オリゴヌクレオチドの一方の鎖がドナー蛍光色素を含み、そして該オリゴヌクレオチドの他方の鎖がアクセプター蛍光色素を含む、請求項１１１に記載の製造産物。１１３．前記多数のコンテナーが、マイクロプレート中の多数のウェルを備える、請求項１０７に記載の製造産物。ーである、請求項１０７に記載の製造産物。１１５．熱変化に起因してほどけ得る標的分子に対する、多数の異なる分子の少なくとも２つの各々の親和性をランク付ける方法であって、 (a)該標的分子を、該多数の異なる分子の少なくとも２つの分子のコレンションと、マイクロプレート中の多数のウェルの各々において接触させる工程； (b)工程(a)からの該多数のウェルを同時に加熱する工程； (c)該ウェルの各々において、該加熱から生じる該標的分子の熱によるほどけにともなう物理的変化を測定する工程； (d)該ウェルの各々について、温度の関数として、該標的分子に対する熱によるほどけ曲線のセットを生成する工程； (e)工程(d)における該熱によるほどけ曲線の各々を、該多数の異なる分子中の任意の該分子の非存在下で該標的分子について得られる熱によるほどけ曲線と比較する工程； (f)該熱によるほどけ曲線の各々における変化によって、該標的分子に対する、該異なる分子のコレクションの親和性をランク付ける工程； (g)該標的分子に対する親和性を有する分子を含む、該異なる分子のコレクションを選択する工程； (h)多数のウェルの各々において、該コレクションを、より小さなコレクションの分子に分ける工程；および (i)工程(b)から(h)までを、該標的分子に対する熱によるほどけ曲線において、該多数の異なる分子中の任意の該分子の非存在下で該標的分子について得られる熱によるほどけ曲線に対してシフトを引き起こす、該多数の異なる分子からの単一分子が同定されるまで繰り返す工程、を含む、方法。１１６．前記ほどけることが、変性することであり、そして前記熱によるほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項１１５に記載の方法。１１７．前記工程(d)が、前記熱によるほどけ曲線から中点温度(T_m)を決定することをさらに含み；前記工程(e)が、 (e1)工程(d)における該熱によるほどけ曲線の各々のT_mを、(i)該他の熱によるほどけ曲線の各々のT_m、および(ii)前記多数の異なる分子中の任意の該分子の非存在下で、前記標的分子について得られる熱によるほどけ曲線のT_mに対して比較することを含み；そして前記工程(f)が、 (f1)該熱によるほどけ曲線の各々のT_mにおける変化に応じて、前記異なる分子のコレクションの親和性をランク付けることを含む、請求項１１４に記載の方法。１１８．前記工程(c)が、前記多数のウェルの各々の内容物による光の吸光度を測定することを含む、請求項１１５に記載の方法。１１９．前記標的分子がタンパク質である、請求項１１５に記載の方法。１２０．前記工程(a)が、前記標的分子を、前記多数のウェルの各々中に存在する蛍光プローブ分子の存在下で、前記多数の異なる分子と接触させることを含み、そして前記工程(c)が、 (c1)光で、該多数のウェルの各々において、該蛍光プローブ分子を励起すること；および (c2)該多数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項１１５に記載の方法。１２１．前記蛍光が蛍光発光である、請求項１２０に記載の方法。１２２．前記工程(c2)が、前記多数のウェルのサブセットからの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項１２０に記載の方法。１２３．前記工程(c2)が、前記多数のウェルの各々からの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項１１５に記載の方法。１２４．前記工程(c)が、 (c1)光で前記多数のウェルの各々において、前記タンパク質中のトリプトファン残基を、励起すること；および (c2)該多数のウェルの各々からの蛍光を測定すること、を含む、請求項１１９に記載の方法。１２５．前記蛍光が蛍光発光である、請求項１２１に記載の方法。１２６．前記多数の異なる分子がコンビナトリアルライブラリーを含む、請求項１１５に記載の方法。性化学ライブラリーである、請求項１２６に記載の方法。１２８．前記工程(c)が、前記多数のウェルのすべてにおける前記物理的変化を同時に測定することを含む、請求項１１５に記載の方法。１２９．熱変化に起因してほどけ得る標的分子に対する、多数の異なる分子の各々の親和性をランク付ける方法であって、 (a)加熱により生じる該標的分子の熱によるほどけにともなう物理的変化の大きさを、該標的分子に対する熱によるほどけ曲線を、１つ以上の別の温度の範囲にわたって温度の関数として生成すること、該加熱から生じる該標的分子の熱によるほどけにともなう物理的変化を測定すること、および該温度範囲内の該別の温度の各々で該物理的変化の大きさを記録することにより測定する工程； (b)該標的分子を、該多数の異なる分子の１つと、マイクロプレート中の多数のウェルの各々において接触させる工程； (c)工程(b)からの該多数のウェルを、該温度範囲内の１つ以上の別の温度まで同時に加熱する工程； (d)該ウェルの各々において、該加熱から生じる該標的分子の熱によるほどけにともなう物理的変化を測定し、そしてそこから該１つ以上の別の温度における該物理的変化の大きさを測定する工程； (e)該１つ以上の別の温度での工程(d)における該物理的変化の大きさを、該多数の異なる分子中の任意の該分子の非存在下で、該同じ１つ以上の別の温度で該標的分子について得られる該物理的変化の大きさと比較する工程；および (f) 該ウェルの各々の物理的変化の大きさの変化に応じて、該標的分子に対する該多数の異なる分子の親和性をランク付ける工程；を含む、方法。１３０．前記ほどけることが、変性すること、そして前記熱によるほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項１２９に記載の方法。１３１．前記別の温度が、前記多数の異なる分子中の任意の前記分子の非存在下で、前記標的分子に対する前記熱によるほどけ曲線についての中点温度(T_m)である、請求項１２９に記載の方法。１３２．前記工程(d)が、前記多数のウェルの各々の内容物による光の吸光度を測定することを含む、請求項１２９に記載の方法。１３３．前記標的分子がタンパク質である、請求項１２９に記載の方法。１３４．前記工程(b)が、前記標的分子を、前記多数のウェルの各々中に存在する蛍光プローブ分子の存在下で、前記多数の異なる分子と接触させることを含み、そして前記工程(d)が、 (d1)該多数のウェルの各々において、該蛍光プローブ分子を光で励起すること；および (d2)該多数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項１２９に記載の方法。１３５．前記蛍光が蛍光発光である、請求項１３２に記載の方法。１３６．前記工程(d)が、 (d1)前記多数のウェルの各々において、該タンパク質中のトリプトファン残基を、光で励起すること；および (d2)該多数のウェルの各々からの蛍光を測定すること、を含む、請求項１３３に記載の方法。１３７．前記蛍光が蛍光発光である、請求項１３６に記載の方法。１３８．前記標的分子が核酸である、請求項１２９に記載の方法。１３９．前記工程(c)が、前記核酸の濃色度における変化を測定することを含む、請求項１２９に記載の方法。１４０．前記標的分子が、蛍光により標識された二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１２９に記載の方法。１４１．前記オリゴヌクレオチドの１つの鎖がドナー蛍光色素を含み、そして前記オリゴヌクレオチドの他の鎖が、アクセプター蛍光色素を含む、請求項１４０に記載の方法。１４２．前記工程(d2)が、前記多数のウェルからの蛍光を一度に測定することをさらに含む、請求項１３４または１３６に記載の方法。１４３．前記工程(d2)が、前記多数のウェルのサブセットからの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項１３４または１３６に記載の方法。１４４．前記工程(d2)が、前記多数のウェルの各々からの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項１３４または１３６に記載の方法。１４５．前記工程(c)が、 (d1)前記多数のウェルの各々において、該タンパク質中のトリプトファン残基を、光で励起すること；および (d2)該多数のウェルの各々からの蛍光を測定すること、を含む、請求項１２９に記載の方法。１４６．前記蛍光が蛍光発光である、請求項１４５に記載の方法。１４７．前記多数の異なる分子がコンビナトリアルライブラリーを含む、請求項１２９に記載の方法。１４８．前記コンビナトリアルライブラリーが、DirectedDiversity（登録商標）特異的多様性化学ライブラリーである、請求項１４７に記載の方法。１４９．熱変化に起因してほどけ得るタンパク質のシェルフライフを最適化するための、多数の異なる分子または異なる生化学的条件の組合せの効力をランク付ける多変量最適化方法であって、 (a)該タンパク質を、該多数の異なる分子または生化学的条件の１つまたはそれ以上と、マイクロプレート中の多数のウェルの各々において接触させる工程； (b)工程(a)からの該多数のウェルを同時に加熱する工程； (c)該ウェルの各々において、該加熱から生じる該タンパク質分子の熱によるほどけにともなう物理的変化を測定する工程； (d)該ウェルの各々について、温度の関数として、該タンパク質に対する熱によるほどけ曲線を生成する工程； (e)工程(d)から(i)における該熱によるほどけ曲線の各々を、(i)該他の熱によるほどけ曲線、および(ii)任意の該異なる分子の非存在下または生化学的条件の参照セット下で、該タンパク質について得られる熱によるほどけ曲線に対して比較する工程；および (f)該熱によるほどけ曲線の各々における変化に応じて、該多数の異なる分子または該異なる生化学的条件の効力をランク付ける工程、を含む、方法。１５０．前記ほどけることが、変性すること、そして前記熱によるほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項１４９に記載の方法。１５１．(g)前記工程(f)における前記熱によるほどけ曲線の各々の前記物理的変化の大きさに対して、前記物理的変化の大きさを増加する生化学的条件の組合せを生成する工程；および (h)前記工程(a)から(g)までを、最大のシェルフライフを促進する生化学的条件の組合せが決定されるまで繰り返す工程をさらに含む、請求項１４９に記載の方法。１５２．前記工程(d)が、熱によるほどけ曲線から中点温度(T_m)を決定することをさらに含み；前記工程(e)が、 (e1)工程(d)における該熱によるほどけ曲線の各々のT_mを、(i)該他の熱によるほどけ曲線の各々のT_m、および(ii)任意の該異なる分子の非存在下で該標的分子について得られるか、または生化学的条件の参照セット下で得られる、該標的分子に対する熱によるほどけ曲線のT_mに対して比較することを含み；そして前記工程(f)が、 (f1)該熱によるほどけ曲線の各々のT_mにおける変化に応じて、該多数の異なる分子または該異なる生化学的条件の効力をランク付けることを含む、請求項１４９に記載の方法。１５３．熱変化に起因してほどけ得る標的分子を安定化するための、２つまたはそれ以上の多数の異なる生化学的条件の１つ以上の組合せの効力をランク付ける多変量方法であって、 (a)該標的分子を、該多数の異なる生化学的条件の２つまたはそれ以上の組合せと、マイクロプレート中の多数のウェルの各々において接触させる工程； (b)工程(a)からの該多数のウェルを同時に加熱する工程； (c)該ウェルの各々において、該加熱から生じる該標的質分子の熱によるほどけにともなう物理的変化を測定する工程； (d)該ウェルの各々について、温度の関数として、該標的分子に対する熱によるほどけ曲線を生成する工程； (e)工程(d)から(i)における該熱によるほどけ曲線の各々を、(i)該他の熱によるほどけ曲線、および(ii)生化学的条件の参照セット下で、該標的分子について得られる熱によるほどけ曲線に対して比較する工程；および (f)該熱によるほどけ曲線の各々における変化に応じて、該異なる生化学的条件の該組合せの効力をランク付ける工程、を含む、方法。１５４．前記ほどけることが、変性すること、そして前記熱によるほどけ曲線が熱変性曲線である、請求項１５３に記載の方法。１５５．前記工程(d)が、熱によるほどけ曲線から中点温度(Tｍ)を決定することをさらに含み；前記工程(e)が、 (e1)工程(d)における該熱によるほどけ曲線の各々のT_mを、(i)該他の熱によるほどけ曲線の各々のT_m、および(ii)生化学的条件の参照セット下で該標的分子について得られる熱によるほどけ曲線のT_mに対して比較することを含み；そして前記工程(f)が、 (f1)該熱によるほどけ曲線の各々のT_mにおける変化に応じて、該異なる生化学的条件の該組合せの効力をランク付けることを含む、請求項１５３に記載の方法。１５６．前記標的分子がタンパク質である、請求項１５３に記載の方法。１５７．前記工程(c)が、前記ウェルの各々の内容物による光の吸光度を測定することを含む、請求項１５３に記載の方法。１５８．前記工程(a)が、前記タンパク質を、前記多数のウェルの各々中に存在する蛍光プローブ分子の存在下で、前記異なる生化学的条件の組合わせと接触させることを含み、そして前記工程(c)が、 (c1)該多数のウェルの各々において、該蛍光プローブ分子を光で励起すること；および (c2)該多数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項１５６に記載の方法。１５９．前記蛍光が蛍光発光である、請求項１５８に記載の方法。１６０．前記標的分子が核酸である、請求項１５８に記載の方法。１６１．前記工程(c)が、前記核酸の濃色度における変化を測定することを含む、請求項１５８に記載の方法。１６２．前記標的分子が、蛍光により標識された二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１５３に記載の方法。１６３．前記オリゴヌクレオチドの１つの鎖がドナー蛍光色素を含み、そして前記オリゴヌクレオチドの他の鎖が、アクセプター蛍光色素を含む、請求項１６２に記載の方法。１６４．前記工程(a)が、前記オリゴヌクレオチドを、前記多数のウェルの各々において、前記異なる生化学的条件の組合せと接触させることを含み、そして前記工程(c)が、 (c1)前記多数のウェルの各々において、光で、前記ドナー蛍光色素を励起すること；および (c2)該多数のウェルの各々において、前記アクセプター蛍光色素からの蛍光を測定することを含む、請求項１５３に記載の方法。１６５．前記蛍光が蛍光発光である、請求項１６４に記載の方法。１６６．前記工程(c2)が、前記多数のウェルの各々のウェルからの蛍光をある時間に測定することをさらに含む、請求項１５８に記載の方法。１６７．前記工程(c2)が、前記多数のウェルのサブセットからの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項１５８に記載の方法。１６８．前記工程(c2)が、前記多数のウェルの各々からの蛍光を同時に測定することをさらに含む、請求項１５８に記載の方法。１６９．前記工程(c)が、(c1)前記多数のウェルの各々において、前記タンパク質中のトリプトファン残基を光で励起すること；および(c2)該多数のウェルの各々からの蛍光を測定することを含む、請求項１５６に記載の方法。１７０．複数の加熱された試料から蛍光発光を感知する装置であって、第１の複数の試料を受けるように構成された第１の熱伝導ブロック；該第１の熱伝導ブロックに連結された温度制御器；該第１の熱伝導ブロックに隣接して配置された光源；該第１の熱伝導ブロックに隣接して配置された蛍光発光センサー；およびその中に埋め込まれた制御論理を有するコンピューターが使用可能な媒体を備えるコンピュータープログラム製品であって、該制御論理が、コンピューターシステムに、該蛍光発光センサーから受けた、熱によりほどけたデータを記録させる、熱的にほどけたデーターの記録手段、該コンピューターシステムに、該熱によりほどけたデータからの熱曲線を生成させる熱曲線生成手段、および該コンピューターシステムに熱曲線を比較させる、熱曲線比較手段、を備える、装置。１７１．前記温度制御器が、温度プロフィール制御器を備える、請求項１７０に記載の装置。１７２．前記温度制御器が、温度勾配制御器を備える、請求項１７０に記載の装置。１７３．前記温度制御器が、温度プロフィール制御器；および温度勾配制御器を備える、請求項１７０に記載の装置。１７４．第２の複数の試料を受けるように構成された第２の熱伝導ブロックをさらに備える、請求項１７０に記載の装置。１７５．前記温度制御器が、前記第１および第２の熱伝導ブロックのそれぞれの温度を独立に制御する手段を備える、請求項１７４に記載の装置。１７６．前記蛍光発光センサーが、ある時間に、１つの試料からの蛍光発光を受けるように構成される、請求項１７０に記載の装置。１７７．前記蛍光発光センサーが、ある時間に、２つまたはそれ以上の試料からの蛍光発光を受けるように構成される、請求項１７０に記載の装置。１７８．前記蛍光発光センサーが、ある時間に、第１の複数の試料のすべてからの蛍光発光を受けるように構成される、請求項１７０に記載の装置。１７９．前記第１の熱伝導ブロック内に配置された第１の熱伝導アダプターをさらに備え、該第１の熱伝導アダプターが、前記第１の複数の試料を保持するための第１の熱伝導コンテナーを受けるように構成される、請求項１７０に記載の装置。１８０．前記第１の熱伝導コンテナーが、マイクロタイタープレートを備える、請求項１７０に記載の装置。１８１．その中に埋め込まれた制御論理を有するコンピューターが使用可能な媒体を含むコンピュータープログラム製品をさらに備える請求項１７０に記載の装置であって、該制御論理が、該コンピューターシステムに、該温度制御器を制御させる温度制御手段；該コンピューターシステムに該光源を励起させる光源制御手段；および該コンピューターシステムに該蛍光発光センサーからの蛍光発光を受けさせる蛍光発光を受ける手段を備える、装置。１８２．前記熱によりほどけるデータの記録手段が、前記コンピューターシステムに、前記１つ以上の試料の熱変性データを記録させる熱変性データ記録手段を備える、請求項１７０に記載の装置。１８３．前記熱曲線生成手段が、前記コンピューターシステムに、前記熱変性データから熱変性曲線を生成させる熱変性曲線生成手段を備える、請求項１９１に記載の装置。１８４．前記熱曲線比較手段が、前記コンピューターシステムに熱変性曲線を比較させる熱変性曲線比較手段を備える、請求項１７０に記載の装置。１８５．前記曲線比較手段が、前記コンピューターシステムに２つまたはそれ以上の試料の熱によりほどける温度の中点を比較させる中点温度比較手段を備える、請求項１７０に記載の装置。１８６．前記中点温度比較手段が、前記コンピューターシステムに２つまたはそれ以上の試料の熱変性温度中点を比較させる中点変性温度比較手段を備える、請求項１８５に記載の装置。１８７．前記光源がタングステン−ハロゲンランプを備える、請求項１７０に記載の装置。１８８．前記光源がキセノン−アークランプを備える、請求項１７０に記載の装置。１８９．前記光源が水銀ランプを備える、請求項１７０に記載の装置。１９０．前記光源がレーザーを備える、請求項１７０に記載の装置。１９１．前記光源が光ファイバーケーブルを備える、請求項１７０に記載の装置。１９２．前記蛍光発光センサーが蛍光プレートリーダーを備える、請求項１７０に記載の装置。１９３．前記蛍光発光センサーが電荷結合装置を備える、請求項１７０に記載の装置。１９４．前記蛍光発光センサーが光ファイバープローブを備える、請求項１７０に記載の装置。１９５．前記蛍光発光センサーが光子増幅管を備える、請求項１７０に記載の装置。１９６．前記蛍光発光センサーが蛍光スキャナーを備える、請求項１７０に記載の装置。１９７．前記蛍光発光センサーが蛍光造影カメラを備える、請求項１７０に記載の装置。１９８．前記蛍光発光センサーが蛍光偏光センサーを備える、請求項１７０に記載の装置。１９９．前記蛍光発光センサーが電荷結合装置蛍光造影カメラを備える、請求項１７０に記載の装置。２００．前記蛍光発光センサーがダイオードアレイを備える、請求項１７０に記載の装置。２０１．前記温度制御器に連結された温度センサーをさらに備える、請求項１７０に記載の装置。２０２．前記温度センサーが、赤外温度センサーを備える、請求項２１７に記載の装置。２０３．前記温度センサーが、前記蛍光放出センサーに隣接して配置される、請求項２１７に記載の装置。２０４．複数の加熱された試料から蛍光発光を感知する装置であって、複数の熱伝導ブロック；該複数の熱伝導ブロックに連結された温度制御器；該複数の熱伝導ブロックに隣接して配置された光源；該複数の熱伝導ブロックに隣接して配置された蛍光発光センサー；および該複数の熱伝導ブロックと該蛍光発光センサーとの間に連結された位置決めシステム、を備える装置。２０５．複数の加熱された試料から蛍光発光を感知する方法であって、 (1)蛍光発光センサーを、その上に配置された第１の複数の試料を有する第１の熱伝導ブロックと並べる工程； (2)該第１のブロックを加熱する工程； (3)第１のブロックに向かって励起光を照射する工程； (4)該第１の複数の試料からの蛍光発光を感知する工程；および (5)該第１の複数の試料から熱によりほどけたデータを記録する工程、を含む、方法。２０６．さらに、 (6)前記蛍光発光センサーを、その上に第２の複数の試料を有する第２の熱伝導ブロックと並べる工程、 (7)該第２のブロックを加熱する工程、 (8)該第２のブロックに向かって励起光を照射する工程； (9)該第２の複数の試料から蛍光発光を感知する工程；および (10)該第１の試料から熱によりほどけたデータを記録する工程、を含む、請求項２０５に記載の方法。２０７．前記温度制御器が、温度ランプ制御器を備える、請求項１７０に記載の装置。２０８．前記第１の熱伝導ブロックと前記蛍光発光センサーとの間に連結された位置決めシステムをさらに備える、請求項１７０に記載の装置。２０９．前記位置決めシステムが、前記第１の熱伝導ブロックを受けるように構成された変形可能なプラットホームを備える、請求項２０８に記載の装置。２１０．前記位置決めシステムが、前記蛍光発光センサーに連結された変形可能なアーマチュアをさらに備える、請求項２０９に記載の装置。２１１．前記変形可能なプラットホーム上に配置された第２の熱伝導ブロックであって、第２の複数の試料を受けるように構成された該第２の熱伝導ブロックをさらに備えた、請求項２０９に記載の装置。２１２．前記温度制御器が、前記第１と第２の熱伝導ブロックのそれぞれの温度を独立に制御する、第１および第２の温度制御器を備える、請求項２１１に記載の装置。２１３．前記位置決めシステムが、前記第１の熱伝導ブロックを受けるように構成された回転可能なプラットホームを備える、請求項２０８に記載の装置。２１４．前記位置決めシステムが、前記蛍光発光センサーに連結された変形可能なセンサーアーマチュアをさらに備える、請求項２１３に記載の装置。２１５．前記回転可能なプラットホーム上に配置された第２の熱伝導ブロックであって、第２の複数の試料を受けるように構成された該第２の熱伝導ブロックをさらに備える、請求項２１３に記載の装置。２１６．前記温度制御器が、前記第１と第２の熱伝導ブロックのそれぞれの温度を独立に制御する、第１および第２の温度制御器を備える、請求項２１５に記載の装置。２１７．前記制御論理が、前記コンピューターシステムに、前記位置決めシステムを制御させる位置決め制御手段をさらに備える、請求項２０８に記載の装置。２１８．前記工程(4)が、 (a)ある時間に試料の１つから蛍光発光を感知することを含む、請求項２０５に記載の方法。２１９．前記工程(4)が、 (a)ある時間に多数の試料から蛍光発光を感知する工程を含む、請求項２０５に記載の方法。２２０．前記工程(4)が、 (a)ある時間にすべての試料から蛍光発光を感知する工程を含む、請求項２０５に記載の方法。