JP6704848B2 - 広範囲に自己再生するヒト赤芽球(esre) - Google Patents
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Description
本発明は、国立衛生研究所(NIH)により授与されたU01 HL099656の政府支援でなされた。政府は、本発明においてある権利を有する。
本出願は、2014年5月15日出願の米国特許仮出願第61/823,677号に対する優先権を主張し、その内容全体を参照することにより、本明細書に組み入れたものとする。
特に指示のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者により理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。
本発明は、広範囲に自己再生でき、及び、未だ、赤血細胞(RBC)に分化する能力を保持することができるヒト細胞集団の生成の発見に関する。これらの細胞は、本明細書では、広範囲に自己再生する赤芽球(ESRE)と称される。本発明の細胞は、とりわけ、輸血可能なRBCの再生可能な供給源として、機能する。
一実施形態において、ESREは、本明細書の他の場所で考察したES細胞の分化手順に起因する完全赤血球前駆細胞集団に由来する。一実施形態において、完全赤血球前駆細胞集団は、表1の手順からのES細胞の分化の約17〜40日の間に発生する。これらの完全赤血球前駆細胞は、EPO(10U/ml)及びSCF(100ng/ml)を補充したメチルセルロースでコロニーアッセイを実施することにより認識できる。
一実施形態において、分化培地におけるESREの配置は、それらの後期赤芽球及び網状赤血球への成熟をもたらす。
本発明は、除核赤血細胞(RBC)を生成する能力を維持する間、形態学的に、約束された初期赤芽球を表すが、しかし、制限のない増殖能を保持すると思われるヒト細胞集団が生成されたことの予想外の発見から生じる。従って、ESREは、血液の生体外生成のための実行可能な系として機能する。一実施形態において、ESREは、少なくとも45日間、連続した自己再生を示す。
本発明は、生体外、及び、生体内の両方の設定で、本発明の細胞の使用を企図する。従って、本発明は、研究目的のための、及び、医学的/獣医学的目的のための、本発明の細胞の使用のために、提供される。研究の設定では、実用的応用の膨大な数が、技術のために存在する。このような応用の一例は、大規模なRBCを生成するために、本発明の細胞を使用することである。RBCを大量に生成することは、少なくとも臨床輸血のために有益である。
遺伝的に改変されたか否かにかかわらず本発明の細胞は、止血障害などの血液の疾患または障害を治療するために用いることができる。一実施形態において、本発明の細胞は、止血障害を有する対象における急性の出血エピソードを治療するために使用することができる。
本発明の細胞は、遺伝的に改変されたかどうかにかかわらず、任意の止血障害を治療するために用いることができる。一実施形態において、本発明の細胞を投与することにより、治療することができる止血障害は、血友病A、血友病B、フォン・ヴィレブランド病、第XI因子欠損症(PTA欠損症)、第XII因子欠損症、並びに、フィブリノゲン、プロトロンビン、第V因子、第VII因子、第X因子、または第XIII因子における欠損、または、構造異常が挙げられるが、それらに限定されない。
本発明によれば、本発明の細胞は、遺伝子プロモーターに操作可能に結合された検出可能なレポーターを含む、組換えプロモーター(例えば、グロビン遺伝子プロモーター)を含むように操作される。候補薬剤は、宿主細胞の生体外細胞培養物に加えられ、そして、レポーター遺伝子の活性を測定する。様々な生体外系は、所望のプロモーターの制御下で、レポーター遺伝子の発現に対する新規化合物の効果を分析するために使用することができる。
本発明は、以下の実験実施例を参照してさらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示のみの目的で提供され、特に指示のない限り、限定することを意図するものではない。従って、本発明は、決して、以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書中に提供される教示の結果として明らかとなるあらゆる変更も包含すると解釈されるべきである。
広範囲に自己再生する赤芽球(ESRE)
本明細書中に提示された結果は、広範囲に自己再生する赤芽球(ESRE)の開発、及び、特徴付けを示す。結果は、ESREが、初期赤芽球を表すが、除核赤血細胞(RBC)を生成する能力を維持しながら、明らかに制限のない増殖能を保持する細胞であることを示している。従って、ESREは、血液の生体外生成のための実行可能な系の基盤として機能する約束を提供する。
ヒトは、約2.5×1013のRBCの定常状態赤血球量を維持するために、秒あたり、200万以上のRBCを合成する。図1Aにまとめたように、RBCのこれらの膨大な数は、半固体培地中の赤血球細胞のコロニーを形成することが可能な、系統的に拘束された前駆細胞に分化するより少数の造血幹細胞(HSC)から誘導される。未成熟の赤血球前駆細胞(BFU−E)が、形態学的に認識可能な赤血球前駆細胞に成熟する後期赤血球前駆細胞(CFU−E)に分化する。これらの前赤芽球は、順番に、物理的に、骨髄でマクロファージ細胞と相互作用し、3〜4回の成熟細胞分裂を受け(その間にヘモグロビンを蓄積する)、サイズが減少し、そしてそれらの核を凝縮する(Bessis et al,,1978,Blood Cells 4:155−174)。CFU−E、及び、未成熟の赤血球前駆体は、その生存のためにサイトカインであるエリスロポエチン(EPO)に非常に依存している(Koury and Bondurant,1990,Science 248:378−381)。最も成熟した赤血球前駆細胞は、正染性赤芽球と呼ばれるが、若いRBC(網状赤血球)を形成するために、核押し出しを受ける。網状赤血球は、すべての細胞小器官を失い、両凹形状をとるようにその細胞骨格を再構築し、そして、血流に入り、120日間、成熟したRBCとして循環する。
赤血球「前駆細胞」は、EPO、SCF及びデキサメタゾンを用いて培養したとき、生体外での増幅が、相対的に制限されるように(105〜106倍)誘導することができる(von Lindern et al.,1999,Blood 94:550−559;図1B、上部)。グルココルチコイドが赤血球分化を阻害しながら、EPO受容体(EPOR)、及び、SCF受容体(ckit)により開始されたシグナル伝達経路は、赤血球前駆細胞の生存、及び、増殖を強化するために相乗作用する(Panzenbock et al.,1998,Blood 92:3658−3668;von Lindern et al.,1999,Blood 94:550−559)。これらの培養骨髄由来の赤血球「前駆細胞」は、EPO単独での存在下で培養したとき、除核赤血球に分化する能力を保持し、SCF及びデキサメタゾンが、赤芽球の自己再生を刺激することを示す。
成体細胞では、すべての血液細胞は、それぞれ、マウス及びヒト胚における、E10.5、及び、妊娠5週目で始まるいくつかの血管床において、「造血」内皮から細胞クラスターとして初めて出現するHSCに由来する(Muller et al.,1994,Immunity 1:291−301;Ivanovs et al.,2011,J Exp Med 208,2417−2427)。HSCは、その後、生涯造血を維持するために、胎児の肝臓及び周産期の骨髄に播種する。
HSCの前にマウス胚の卵黄嚢で生じる造血前駆細胞の2つの過渡波が同定されている(Palis et al.,1999,Development 126:5073−5084)。最初の波は、マウスで最初の大規模な、有核原始RBCを生成する原始的赤血球前駆細胞で構成されている。複数の骨髄前駆細胞を伴う第二波は、完全赤血球前駆細胞(BFU−E)で構成されている(Palis et al.,1999,Development126:5073−5084;Palis et al.,2001,Proc Natl Acad Sci USA 98:4528−4533)。赤血球生成の過渡的、原始的、及び、完全な波は、ヒト及びゼブラフィッシュの胚で同定されており(Migliaccio et al.,1986,J Clin Invest 78:51−60;Bertrand et al.,2007,Development 134:4147−4156)、プレHSC造血の進化的保存性を示す。マウスES細胞(Keller et al.,1993,Mol Cell Biol 13:473−486)、及び、ヒトES細胞(図3参照)における類似の知見は、分化ES細胞が、プレHSC胚の造血を再現するという仮定に導いた。マウス胚及びマウスES細胞の研究は、ESREが、完全赤血球系統から生成し、及び、GR発現を欠き、生体外で自己再生することができない原始赤血球系統からは、生成されないことを示す(England et al.,2011,Blood 117:2708−2717)。従って、ESREは、胚卵黄嚢に源を発し、その後、初期の胎児肝臓に移行する、完全赤血球生成の過渡波に対応して、赤血球開発の狭い範囲から排他的に誘導することができる。
生体内で分化するESREの能力をテストするために、ESRE培養物は、UBC−GFPマウスから作成した。UBC−GFPマウスの骨髄から選別した対照のLSK細胞は、他のレシピエントのNSGマウスにIV注射し、そして永続的な網状赤血球及び成熟RBCを、5日目から生じ、その生着と一貫している(図3、黒線)。重要なことに、UBC−GFP由来のESREは、77日間の自己再生培養で成長し、レシピエントのNSGマウスにIV注射した。これらのGFP+ESREは、網状赤血球及び成熟RBCの過渡波に5日目に始まる上昇を起こした(図3、赤線)。イメージングフローサイトメトリーによる、これらESRE由来のRBCの分析は、野生型(非GFP)RBCと比較した場合、それらは通常のサイズ及び形状を有することを示す(図3、右側パネル)。まとめると、これらのデータは、ESREは、長期培養にもかかわらず、変換されず、完全に成熟したRBCに生体内で分化することができるという証拠を提供する。
未分化H1(WA01、WiCell Research Institute)ヒトES細胞は、フィーダー無しで、毎日培地を変える、マトリゲル被覆プレート上の、mTeSR1培地(Stem Cell Technologies社)で培養した。表1に概略を示したとおり、細胞は、酵素により、コラゲナーゼIVで収穫し、毎週継代し、無血清条件下での血液細胞の運命に分化した。結果は、このヒトES細胞の分化手順が、赤血球前駆細胞の2波の出現につながったことを示し(図4A)、それは、一般的に、原始的で及び完全赤血球とそれぞれ関連した形態、及び、細胞の含有量を有するコロニーを含んでいた(図4B)。11日〜19日目のEBからの5つの分離したコロニーの遺伝子発現を解析した。図4Cで示す通り、11日目と14日目のEBからのコロニーは、主にε−グロビンを発現したが、グルココルチコイド受容体(GR)をコードする遺伝子であるNr3c1を発現しなかった。これらのデータは、原始的赤芽球が、主に、胚性グロビンを発現するが、GRを発現しないマウスでの知見と一致していた(England et al.,2011,Blood 117:2708−2717)。17日、及び、19日目のEBからのコロニーは、主に、γ−グロビン、並びに、GRを発現し、完全赤血球の識別と一致した(図4B)。これらのデータは、マウスの卵黄嚢で見られる原始的及び完全赤血球生成(Palis et al.,1999,Development 126:5073−5084)、及び、マウスES細胞分化(Keller et al.,1993,Mol Cell Biol 13:473−486)の連続波と一致する。実験は、さらに、正常な胚造血を通して、ヒトES細胞を分化するとき、造血の動態を特徴づけるように設計した。いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ヒトES細胞における造血可能性の出現が、原始的EMP/完全(プレHSC)造血波の重複により特徴づけられる。
H1のヒトES/EBにおける完全赤血球形成の出現を定義することにより、赤芽球の自己再生培養は、16〜19日目のEB細胞を用いて、開始した(EPO、SCF、デキサメタゾン)。最初の培養は、20〜30日間増殖し続けた未熟赤芽球の均一な集団を発生させた(図4D、上パネル)。EPO及びインスリンを含有する成熟培地に置かれたとき、これらの赤芽球は、正染性赤芽球及び網状赤血球に分化した(図4D、下部パネル)。自己再生ヒト赤芽球は、低いレベルのε−グロビンと一緒に、主として、γ−グロビンを発現し、そして、成熟時に成人β−グロビン遺伝子を上方調節した。これらのデータは、完全自己再生の赤芽球が、ヒトES/EBから生成され得ることの重要な証拠を提供する。
ヒトES細胞から大規模な自己再生能を持つ赤芽球を誘導することは、ヒト胚を使用した実際的かつ倫理的な問題を回避することができる。結果は、現在のヒトES分化手順(表1)がヒト自己再生の赤芽球のその後の発生を促進することを示している(図4D)。これらの赤芽球は、広範の期間に、自己再生可能であることを示すことが重要である。ヒト臍帯血からの赤芽球の培養物は、以前に他者が定義した通り、すべての赤芽球が自発的に分化する前に、10〜15日間維持することができ、これは、それらの制限された自己再生能力と一致する(von Lindern et al.,1999,Blood 94:550−559)。いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ESRE培養が広範な自己再生をする証拠として、少なくとも3倍長く確実に増殖し続けることが望ましい。場合によっては、45日以上の間自己再生するヒトES細胞からの赤芽球培養物を生成することが望ましい。
マウス自己再生の胚性赤芽球は、EPO及びインスリンを含む無血清培地を使用して生体外で、RBCに分化させることができる(England et al.,2011,Blood 117:2708−2717)。複数の手順が、網状赤血球へヒト未熟赤芽球を分化するために利用可能である(Giarratana 2011)。これらの手順は、2、3または4つの連続相を含む。イメージングフローサイトメトリーは、細胞サイズ、核凝縮、網状赤血球成熟に関連する細胞形状変化、RNA及びミトコンドリアの含量の進行性喪失、及び、除核率を含むRBC成熟のパラメータを定量化するために使用される。胚性、胎児及び成体ヘモグロビンは、セルロースアセテート電気泳動により定量化することができる。ベンジジン陽性、分光光度法によるヘモグロビン含有量、及び、qPCRによるグロビン遺伝子発現は、また、生体外で分化したヒトRBCで決定できる。
イメージングフローサイトメトリーは、細胞のサイズ、核凝縮、網状赤血球の成熟に関連する細胞形状の変化、RNA及びミトコンドリア含量の進行性喪失、及び、除核率を含む、RBC成熟のパラメータを定量するために使用することができる。胚性、胎児及び成体ヘモグロビンは、セルロースアセテート電気泳動によって定量化できる。ベンジジン陽性、分光光度法によるヘモグロビン含量、及び、qPCRによるグロビン遺伝子発現は、また、生体外で分化したヒトRBCで決定できる。また、RBC変形能は、マイクロピペットアッセイを用いて、分析することができる。
マウスの胚形成の間に、原始的及び完全赤血球前駆細胞の連続波が、恒常的な造血幹細胞由来の血液系が確立される前に、必要なRBCを提供するために卵黄嚢で出現する。ヒトの胚における研究は、原始的及び完全赤血球系統が同様に卵黄嚢に出現することを示す。いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ESCは、哺乳類の胚に見られる初期の造血個体発生を再現すると考えられる。卵黄嚢及びESCの中で完全赤血球前駆細胞は、ESREの供給源となる。
ヒトESC(WA01)は、酵素的(コラーゲンIVを用いて:Stem Cell Technologies社)及び機械的(セルスクレーパーを用いて)に、細胞の小さな塊に解離した。いくつかの例においては、表1に示すように、低酸素環境(5%:O2)において、H1ヒト胚性幹細胞(WA01)を解離し、無血清の培地中で、順次培養した。ヒト胚性幹細胞は、最初に胚様体(EB)を形成し、続いて、造血系統に向かって分化する。EB分化の6日目からは、造血細胞は、懸濁液中に放出され、これらの細胞は、その後の赤芽球増殖培養のために回収した。
ヒト胎児グロビン発現の活性化因子についてスクリーニングするためのESREの使用
ESREの特徴である、RBCを生成するために、高効率で最終的に成熟する能力とともに通常の倍数性の維持を有する急速な増殖は、多くの実用的な応用を提供する。例えば、ESREが、人工的に操作されたタンパク質組成物を用いてRBCを誘導するために、安定的に組み込まれた導入遺伝子から誘導できる、または、siRNAノックダウンを行うことができる、更に、ESまたはiPSからESREを誘導する能力は、内因性遺伝子座内の標的化された変更もまた可能にする。このような操作は、ESRE技術の応用を表す。
p53の生物学と広範な赤血球の自己再生
実験は、p53が制限された、及び、広範な自己再生を対比した赤芽球において、差次的に規制されているかどうかを決定するために実施した。制限された自己再生を有するをマウス赤芽球は、成体骨髄及び後期胎児の肝臓から培養し、培養の6〜9日目に分析し、E10.5の卵黄嚢由来の、199日間連続培養したESREと比較した。制限された、及び、広範囲に自己再生する赤芽球集団の両方は、毎日、同じ速度で増殖し、倍増した。培養赤芽球は、14時間の培養物に添加したマイトマイシンCを使用して、遺伝毒性傷害に供した。図5Aで示す通り、ESREは、マイトマイシンCのすべての試験濃度で、制限下での自己再生した培養物よりもより多く生存可能であった。アポトーシス率は、核小疱形成した赤芽球を同定するために、イメージングフローサイトメトリーを用いて定量した(図5B)。マイトマイシンCのすべての濃度において、アポトーシス率は、例えば、マイトマイシンCの0.1uMの用量で、制限された自己再生を受ける細胞よりESREで著しく低く、アポトーシスの割合は、ESREで17%、及び、制限された自己再生を受けた培養物に対しては52%及び62%であった。更に、いくつかのp53標的遺伝子のmRNA発現は、qPCRで定量した。マイトマイシンCの曝露は、全ての培養物中でのMdm2の、及び、ESRE中のみでのPUMAの上方調節と関連していた(図5C、それぞれ、青色及び赤色バー)。注目すべきは、アポトーシスエフェクターPERPは、その定常状態での増殖中、または、マイトマイシンC曝露後のどちらにおいてもESREにより発現されなかった(図5C、黒色バー)。
p53の機能のメカニズムのより良い理解は、赤血球前駆体の自己再生の規制への洞察を提供し、及び、臍帯血または成体末梢血の単核細胞から、ESREの生成を容易にするために潜在的な標的としてのp53を識別する。結果は、ESREが遺伝毒性ストレスに対しより寛容的であり(図5A)、そして、p53それ自体及びp53の下流経路は、広範な自己再生、対、制限された自己再生を受けた赤芽球で差次的に規制されている(図6、5C)証拠を提供する。p53、MDM2、または、MDM4のmRNAレベルにおける有意差は、制限された自己再生、対、広範な自己再生を受けたマウス、対、赤芽球において見い出されていないが、p53の翻訳後の調節は、劇的に異なるように見える。
ShRNAを含むレンチウイルスベクター(OpenBiosystems社)は、広範な自己再生能力をそれらに付与するために、成体由来の自己再生赤芽球におけるp53をノックダウンするために使用することができる。qPCR及びウェスタンブロットにより分析した種々の程度でノックダウンしたp53を有する赤芽球の培養物は、広範囲に自己再生する能力を試験することができる。ESREにおける遺伝子発現のレンチウイルスによるノックダウンは、EPO、SCF、及び、デキサメタゾンでの自己再生を受けた赤芽球で20%〜95%の遺伝子ノックダウンを達成することができる。重要なことは、ピューロマイシンの選択が、自己再生能を妨害することである。
Bmi−1は、赤血球自己再生の中心的な調節剤である
本明細書に提示される結果は、Bmi−1が赤血球自己再生の中心的な調節剤であることを示している。機能獲得型の実験は、ヒト胎児肝細胞においてBmi−1を発現するために実施した。実験は、また、骨髄由来細胞においてBmi−1を発現するように設計された。
脂質の補充及び赤芽球の自己再生
本明細書に提示した結果は、赤芽球の自己再生の脂質補充の重要性を示している。例えば、StemSpan増殖培地からの脂質補充の中止が、赤芽球増殖を鈍化させたことが観察された(図10)。StemPro34増殖培地からの脂質補充の中止は、「広範な」相に入り、そして、ESREになるためのSREの能力を封鎖した(図11)。更に、ESREが、5日間、脂質補充有り、または、なしで培養した場合、Bmi1の転写レベルは、脂質を含む対照の培養物と比較して、「無脂質」状態では、低下したことが観察された(図12)。
Claims (20)
- 培地中で増殖し、最終的に成熟する能力を維持する、広範囲に自己再生するヒト赤芽球(ESRE)の単離された集団であり、ここで、前記ESREは、不死化されていない、少なくとも30回の細胞分裂を受けることができる、完全赤血球前駆細胞の集団から誘導され、更に、ここで前記ESREの集団が、限定的な自己再生を受けた赤芽球、及び初期前赤芽球と比較して、Bmi−1のより高い発現レベルを示す、前記単離された集団。
- 1つ若しくはそれ以上の治療タンパク質を発現するように、前記ESREが遺伝的に改変される、請求項1に記載の前記ESREの単離された集団。
- 前記ESREが、因子IX、因子VIIIc、フォンウィルブランド因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、タンパク質C、タンパク質S、アンチトロンビンIII、及び、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される因子を発現するように、遺伝的に改変される、請求項1に記載の前記ESREの単離された集団。
- ヒトESREの単離された集団を含み、並びに、EPO、SCF、デキサメタゾン及び脂質混合物を含有する増殖培地を含む組成物。
- 前記増殖培地が、更に、Bmi−1タンパク質、Bmi−1ペプチド、及びBmi−1調節剤のうちの1つ若しくはそれ以上を含む、請求項4に記載の前記組成物。
- 広範囲に自己再生した赤芽球(ESRE)の集団由来のヒトRBCの単離された集団。
- ヒト細胞から広範囲に自己再生する赤芽球(ESRE)の実質的に純粋な集団を生成する方法であって:
a)完全赤血球前駆体細胞集団の生成を促進する条件下で、ヒト幹細胞及びヒト前駆体細胞からなる群より選択されるヒト細胞を培養し;
b)EPO、SCF、デキサメタゾン、及び、脂質混合物を含む増殖培地中で前記完全赤血球前駆体細胞の集団を増殖し、Bmi−1タンパク質、Bmi−1ペプチド、及びBmi−1調節剤のうちの1つ若しくはそれ以上を赤血球の自己再生を調節するために十分な量で完全赤血球前駆体細胞集団に提供し、それにより、少なくとも約45日間連続して自己再生する細胞分裂を受けて、最終的に成熟する能力を維持する、実質的に純粋なESRE集団を生成することを含む、前記方法。 - 前記ヒト細胞が、胚性幹細胞、誘導多能性幹(iPS)細胞、成体幹細胞、臍帯細胞、骨髄細胞、及び、それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項7に記載の前記方法。
- 段階a)の前記完全赤血球前駆体細胞の集団が、胚様体(EB)由来である、請求項7に記載の前記方法。
- 前記細胞が、少なくとも約20日間、a)段階で培養される、請求項7に記載の前記方法。
- 前記Bmi−1調節剤がヘッジホッグリガンドである、請求項7に記載の前記方法。
- 前記増殖培地が、約2U/mLのEPO、約100ng/mLのヒト組換えSCF、約10−6Mのデキサメタゾン、約40ng/mLのヒト組換えインスリン様成長因子−1、及び、約0.4%の脂質混合物で補充された動物成分無しの培地である、請求項7に記載の前記方法。
- 哺乳動物に遺伝子を送達するための試薬の調製における遺伝子送達ビヒクルの使用であって、ここで、前記ビヒクルは、請求項2に記載の前記遺伝子改変ESREを含む、使用。
- ヒト赤血細胞(RBC)を生成する方法であって、EPO及びインスリンを含む分化培地において、請求項1に記載される広範囲に自己再生する赤芽球(ESRE)を培養することを含む、前記方法。
- RBC輸血の必要性を有する対象を治療するための試薬の調製における請求項6に記載のRBCの単離された集団の使用。
- 前記RBCが、前記対象から得られた細胞から生成される、請求項15に記載の使用。
- 前記対象から得られた前記細胞が、胚性幹細胞、iPS細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、及び、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項16に記載の使用。
- 血液疾患を有する対象を治療するための試薬の調製における請求項1に記載されるESREの治療上有効量の使用。
- 前記ESREが、血液障害を有する対象を治療するために、一つ若しくはそれ以上の因子を発現するように遺伝的に改変される、請求項18に記載の使用。
- 前記因子が、第VIII因子、または第VIIIa因子、第V因子、第Va因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子、第XIII因子、フォンウィルブランド因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、タンパク質C、タンパク質S、アンチトロンビンIII、及び、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項19に記載の使用。
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