CN118302518A - 利用基因过表达建立能够有条件成熟的红系前体细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及建立一种能够有条件成熟的永生化红系前体细胞系，更具体地，本发明提供了一种用于生产其中转导E6/E7和Bcl‑xL基因的红细胞的红系前体细胞及其制备方法。

Description

利用基因过表达建立能够有条件成熟的红系前体细胞系
技术领域
本发明涉及利用基因过表达建立能够有条件成熟的红系祖细胞系。
背景技术
对于因各种原因缺血的患者来说，输血是一种非常重要的治疗方法。然而，从献血者捐献的血液存在一些问题，例如由于能够献血的人数减少和人口老龄化导致的血液供应短缺、输血导致的传染病传播风险以及输血的其他各种副作用。在用于在血液成分间输送氧气的红细胞制剂方面，曾尝试使用血红蛋白溶液或氧气载体来替代目前的输送他人血液的系统，但携氧能力较低，并显示出严重的副作用(非专利文献1和2)。因此，一直在进行体外制造红细胞(RBC)的研究(非专利文献3和4)。
红细胞由造血干细胞经过几个分化阶段产生：红系爆式形成单位(burst formingunit erythroid，BFU-E)、红系集落形成单位(colony forming unit erythroid，CFU-E)、原红细胞(proerythroblast)、早幼红细胞(basophilic erythroblast)、中幼红细胞(polychromatic erythroblast)和晚幼红细胞(orthochromatic erythroblast)；在此期间，细胞核逐渐浓缩，细胞尺寸变小。浓缩的细胞核去核后，成为网织红细胞。当剩余的RNA和微小细胞器消失以及两侧变凹时，就成为成熟的RBC。这一分化过程在体外一般持续三周，在中幼红细胞(即成熟的成红血细胞)阶段之后，细胞增殖受到限制(非专利文献5)。
造血干细胞可从骨髓、脐带血和外周血中分离出来，但它们的数量有限。因此，努力从诱导多能干细胞或胚胎干细胞制造RBC，这些细胞在分化成造血干细胞后，理论上可以无限增殖，但目前仍处于基础研究阶段(非专利文献6和7)。
造血干细胞在人体内保持自我更新，并在人的一生中产生红细胞和其他血细胞，但由于它们无法在体内形成体内干细胞生态位，因此可能无法保持自我更新，并且它们分化产生的血细胞数量有限(非专利文献8)。因此，人们努力通过诱导造血干细胞分化为红系细胞，并通过调节与细胞增殖有关的基因延长细胞增殖期，来增加红细胞的产量(非专利文献9至12)。在先前的两项研究中，利用人类乳头瘤病毒(HPV)病毒基因E6/E7建立了红系祖细胞系。在每项研究中，建立的细胞系分别被命名为HUDEP和BEL-A。就HUDEP细胞系而言，细胞系建立，且增殖期延长了约一年。然而，虽然在今后的临床应用中必须排除使用异种细胞，但在由人类诱导多能干细胞构建的红系祖细胞系HiDEP中，在诱导分化时使用了鼠基质细胞系OP9细胞作为饲养细胞(非专利文献11)。之后，在2017年使用相同载体建立的BEL-A细胞系的情况下，细胞增殖期延长至5个月，并可产生网织红细胞。由于所产生的网织红细胞的功能也得到了证实，这项研究被认为是迄今为止最先进的研究。然而，由于使用了在人体内不表达的致癌基因E6和E7的过表达，因此，当在输血时无法完全去除最终产品的细胞核，则存在安全问题(非专利文献9)。此外，在一项通过使用c-Myc和sox2基因及短发夹RNA(shRNA)抑制p53而建立细胞系的研究中，细胞增殖维持长达一年，但加入了OP9饲养细胞和10％胎牛血清以诱导细胞去核(非专利文献12)。在一项使用Bcl-XL和c-Myc组合而建立细胞系的研究中，将这些基因转导到CD71阳性成红血细胞中以使细胞增殖时间延长直至八个月，但几乎没有实现细胞去核(非专利文献13)。大多数研究已建立了红系祖细胞系，并延长了细胞增殖时间，但也存在一些问题，诸如使用人体内不存在的基因导致的安全问题、将基因转入造血干细胞/红系祖细胞时效率非常低以及在无血清培养基中无法实现细胞成熟。
相关技术文献
非专利文献：
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发明内容
技术问题
本发明的目的是提供过表达Bcl-xL和HPV16 E6/E7基因的红系祖细胞用于大量生产红细胞，以及生产红系祖细胞的方法。
技术方案
为实现上述目的，本发明提供了转导有Bcl-xL和E6/E7基因的红系祖细胞，以及生产这种红系祖细胞的方法。
本发明还提供了一种包括Bcl-xL基因和E6/E7基因的重组载体。
本发明提供了由红系祖细胞分化且成熟的红细胞。
有益效果
本发明提供了通过将表达Bcl-xL和HPV16 E6/E7基因的表达载体多次转入红系细胞而制备的用于生产红细胞的红系祖细胞。因此，可以建立一种红系祖细胞系，其中细胞数量不会因细胞死亡减少而减少，并且即使在长期培养过程中也能保持红系祖细胞的增殖。
附图说明
图1示意性地示出根据本发明的红系细胞生成和永生化红细胞系的产生的轮廓。
图2示出根据本发明的HPV E6/E6*I和E7、BMI1和Bcl-xL的信号通路。
图3示出将HPV E6/E7转导至CD34+细胞的结果。未转导的CD34+细胞作为对照，绿色荧光蛋白(GFP)转导的细胞和空载体(EV)作为模拟对照。(A)示出对照组和转导E6/E7的细胞在第7、14、24和32天的细胞形态学比较(红色箭头；未成熟成红血细胞；蓝色箭头；晚幼红细胞)。(B)示出从第5天到第33天的累积细胞数，细胞数在第28天后开始减少。(C和D)示出通过实施RT-PCR在转导的细胞中通过电泳检测到的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和E6/E7 mRNA。在第14天在对照和GFP转导细胞中以及在第28天和第32天在E6/E7转导的细胞中检测到全长E6、剪接E6*I和E7 mRNA(C)；在第40天，在对照和E6/E7转导的细胞中检测到E6/E7 mRNA(D)。在右侧标注了大小(bp，碱基对)。(E)示出在第47天转导E6/E7基因的细胞形态，可以确认未成熟成红血细胞得以维持。红色箭头；未成熟成红血细胞。(F和G)示出细胞在培养的第54天被追踪到，且在第58天增殖。(F)示出4天后增殖的细胞。(G)示出通过比较从第54天到第58天增殖的细胞数量计算出的倍增时间。(H)示出在培养的第79天，在多西环素和没有多西环素的情况下培养细胞3天的结果。三天后，没有多西环素培养的细胞死亡。(I)示出在第0、4、8和10天根据分化培养的细胞形态。红色为未成熟成红血细胞，蓝色为中幼红细胞，橙色为晚幼红细胞，绿色为红细胞。
图4(A和B)分别示出用E6/E7+E6+E7、E6+E7和E6/E7转导的细胞中通过RT-PCR的全长E6、剪接的E6*I和E7 mRNA的表达模式。(A)示出在第14天的结果，且(B)示出在第35天的结果，并对扩增子进行电泳。(C)分别示出在E6/E7+E6+E7、E6+E7和E6/E7转导的细胞中在第37天的累积细胞数。(D)示出在第14、31和41天在E6/E7转导的细胞中衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β)染色。红色：SA-β染色细胞，蓝色：死亡细胞。(E)示出在第44天用膜联蛋白(Annexin)V-FITC/PI染色的E6/E7转导细胞的共聚焦荧光图像，用于细胞死亡检测。膜联蛋白V将早期凋亡细胞的细胞膜染成绿色，PI将晚期凋亡或死亡细胞的核仁染成红色。
图5(A至D)证实了转化生长因子(TGF)-β抑制剂和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α激动剂对E6/E7转化细胞中未成熟成红血细胞的影响。(A)示出在不同增殖培养条件下的累积细胞数。脐带血来源的CD34+细胞在天使用或不使用TGF-β抑制剂和PPAR-α激动剂的情况下生长。(B)流式细胞术分析CD71标记，以展示在不同条件下培养的细胞在第10、17和20天的红系分化情况。(C和D)比较维持的未成熟成红血细胞。(C)示出在第28天和第33天使用或不使用TGF-β抑制剂和PPAR-α激动剂培养的细胞形态。在瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色后，通过细胞计数评估未成熟成红血细胞的比例。(D)在使用TGF-β抑制剂和PPAR-α激动剂的培养中，未成熟成红血细胞的比例为60％或更大。(E和F)示出在骨髓内类似环境中对未成熟成红血细胞增殖的评估。(E)示出在培养的第7、10和14天在基质胶(Matrigel)存在下的成红血细胞增殖情况。通过GFP荧光确认了未成熟成红血细胞的集落。(F)示出在培养的第7、14、28和40天时与纤连蛋白对接并增殖的细胞的GFP荧光图像。
图6示出E6/E7-或Bcl-xL-E6/E7-转导的细胞的比较与额外转导BMI1的实验结果。(A)示出在第10天通过荧光激活细胞分选(FACS)对转导细胞进行的细胞分选。在转导的细胞中，选择表达GFP并用未成熟红系标记物CD71染色的细胞(FITC+/CD71+)，FITC+/CD71+的比例为25％。(B)示出荧光显微镜下的单细胞培养。(C至F)示出E6/E7-或Bcl-xL-E6/E7转导细胞的比较。(C)示出E6/E7或Bcl-xL-E6/E7转导细胞的累积细胞数和分布。(D)示出了转导了各种基因的培养细胞的存活率。活细胞通过台盼蓝染色进行评估。(E)证实了转导细胞在第28、32和35天的Bcl-xL表达。第1泳道；E6/E7转导细胞，第2泳道；Bcl-xL-E6/E7转导细胞。右侧标注了大小(bp，碱基对)。(F)示出p53和phospho-Rb的蛋白质印迹(Western blot)分析的结果。(G至I)示出BMI1的额外转导。(G)在第33天进行RT-PCR以检测转导细胞中的BMI1，并对扩增子进行电泳。第1泳道：对照(未转导细胞)，第2泳道：Bcl-xL-E6/E7+E6+E7+BMI1，第3泳道：Bcl-xL-E6/E7+BMI1。右侧表示大小(bp，碱基对)。(H)示出BMI1转导细胞中GFP表达细胞的数量。(I)示出BMI1转导细胞在第40、71、105和131天的GFP荧光图像。
图7涉及使用外周血或骨髓进行细胞永生化。(A和B)示出转导的外周血CD34+细胞的细胞培养。(A)示出与CB CD34+细胞相比的累积细胞数。(B)示出第47天增殖的细胞。(C和D)示出转导的骨髓CD34+细胞的单细胞培养。(C)展示了第14天和第25天单细胞培养中增殖的细胞集落。(D)示出单细胞每个克隆的累积细胞数。
具体实施方式
本发明人旨在以更高的效率生产红系祖细胞系，通过增强人体内红系祖细胞中表达的基因来提高最终产物的安全性，并通过使用培养方法建立体外大规模生产用于输血的红系祖细胞的条件，该培养方法即使在长时间培养时也能维持红系祖细胞的增殖。
因此，本发明提供了Bcl-xL基因和E6/E7基因转导的红系祖细胞。
在本发明中，“造血干细胞(HSC)”是指血液中可以潜在地分化成髓系或红系细胞的细胞，包括RBC、T细胞、中性粒细胞、粒细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、B细胞、血小板和巨核细胞。例如，造血干细胞可以从来源于人类脐带血、外周血或骨髓的细胞中分离出来，且优选地，可以从来源于人类脐带血造血干细胞的细胞中分离出来。
CD34是一种糖基化跨膜蛋白，通常用作血液和骨髓来源的原始祖细胞(如造血干细胞和内皮干细胞)的标记。在本发明中，术语“CD34阳性细胞”是指表达CD34蛋白的细胞，如造血干细胞、内皮干细胞和间充质干细胞。
在本发明中，“祖细胞(progenitor cell)”是具有自我复制和分化能力的未分化细胞，但最终是分化的细胞，其中它们最终分化成的细胞类型已经确定。
在本发明中，“红系祖细胞(erythroid progenitor cell)”可指去核前的红系细胞，且可以是未成熟的红系祖细胞或对血型糖蛋白A(其是红系特异性分子)呈阳性的去核前细胞。例如，红系祖细胞可选自由原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞组成的组。
本发明人证实，造血干细胞分化成红系细胞后转导基因时，效率提高。由于造血干细胞可分化成红系细胞以外的不同谱系，因此在红系细胞状态下转导基因时，极有可能建立红系细胞系。因此，在本发明的一个实施方案中，基因转导可在红系细胞状态下进行。具体来说，在本发明中，基因转导可在造血干细胞分化成红系细胞后进行。具体地，在本发明中，基因转导可在红系细胞处于红系爆式形成单位(BFU-E)、红系集落形成单位(CFU-E)、原红细胞或早幼红细胞状态下进行。
在本发明中，基因转导包括任何将核酸转导到生物体、细胞、组织或器官中的方法，且可根据宿主细胞选择适当的标准技术进行，如本领域已知的技术。这些方法包括电穿孔、原生质体融合、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、使用碳化硅纤维搅拌、农杆菌介导的转化、聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖和脂质体，但不限于此。
在本发明中，转导的基因可以是调节与细胞增殖相关的细胞周期的基因。具体来说，细胞增殖相关的基因可以是HPV16 E6/E7和BMI1。更优选地，该基因可以是HPV16E6/E7。
此外，本发明中转导的基因可以是与抑制细胞死亡相关的促存活(pro-survival)基因。具体来说，促存活基因可以是Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1或Bfl-1。更优选地，该基因可以是Bcl-xL基因。
当仅转导与细胞增殖有关的基因时，会出现这样的问题：培养时间越长，细胞数量由于分化和细胞死亡而减少更多，红系祖细胞的增殖则无法维持。因此，在本发明中，通过将促存活基因和与细胞增殖有关的基因一起转入，可以提供一种抑制细胞死亡、增强细胞增殖并可进行长期培养的细胞系。本发明的实施例证实，在转入细胞增殖相关基因和促存活基因两者的实验组中，与仅转入细胞增殖相关基因的组相比，细胞的存活率和增殖提高。
在本发明的一个实施方案中，Bcl-xL基因和E6/E7基因可以转导到一个载体中。
在本发明的一个实施方案中，可进一步用BMI1基因转导红系祖细胞。已知BMI1通过抑制p16和p19的表达来防止细胞衰老和维持自我更新。在本发明的一个实施例中，证实当进一步转导BMI1基因时，可进行150天或更长时间的长期培养。
本发明中使用的Bcl-xL基因、E6/E7基因和BMI1基因不仅包括其cDNA序列已公布的基因，还包括根据这些已知cDNA序列的同源性在相关技术中确定的同源物。
在本发明中，还可以对参与红系祖细胞增殖和维持的其他物质进行处理。例如，可以在进一步含TGF-β抑制剂、PPAR-α激动剂或其组合的培养基中培养红系祖细胞。具体地，在本发明的实施例中，证实当在培养基中加入TGF-β抑制剂和PPAR-α激动剂时，随着培养天数的增加，与对照组相比，红系祖细胞的比例增加。
在本发明中，TGF-β抑制剂可以是A-83-01、SD-208、GW788388、RepSox、LY2109761、LY2157299、LY364947、SB505124、galunisertib、vactosertib、LY364947、SB431542、SB525334或它们的组合，但并不限于此。
在本发明中，PPAR-α激动剂可以是GW7647、WY14643、非诺贝特、氯贝丁酯、吉非罗齐、苯扎贝特或它们的组合，但不限于此。
在本发明中，TGF-β抑制剂可以100nM至500nM、150nM至450nM、150nM至400nM、或200nM至300nM的浓度包含在培养基中。此外，PPAR-α激动剂可以5μM至20μM、或5μM至15μM的浓度包含在培养基中。
此外，本发明还提供了一种生产红系祖细胞的方法，包括将Bcl-xL基因和E6/E7基因转入从造血干细胞分化的红系细胞的步骤。
上述所有关于红系祖细胞的信息都可以直接应用于生产红系祖细胞的方法，或者经过必要的修改应用于生产红系祖细胞的方法。
在本发明的一个实施方案中，红系细胞可选自BFU-E、CFU-E、原红细胞和早幼红细胞组成的组。
此外，在本发明的一个实施方案中，该方法还包括转导BMI1基因的步骤。
在本发明的一个实施方案中，该方法还包括进一步用TGF-β抑制剂和/或PPAR-α激动剂处理的步骤。
本发明提供了一种用Bcl-xL基因和E6/E7基因转导的重组载体。该载体可进一步包括BMI1基因。
在本发明中，术语“载体”是指能够转运与之相连的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是一个圆形的双链DNA，附加DNA片段可连接到其中。另一类型的载体是病毒载体，其允许附加DNA片段连接到病毒基因组中。一些载体在转导到宿主细胞中时能够在宿主细胞内自我复制(例如，具有细菌复制源的细菌载体和游离型(episomal)哺乳动物载体)。其他载体(如非游离型哺乳动物载体)可在转导到宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，并与宿主基因组一起复制。此外，一些载体还可以引导与载体可操作连接的基因的表达。在本说明书中，这些载体被称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般来说，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒的形式，且由于质粒是最常用的载体类型，因此术语“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，本发明也包括其他形式的表达载体，诸如提供同等功能的病毒载体(如腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体)。优选地，可使用逆转录病毒载体。优选地，使用慢病毒载体以提高转导效率。
此外，优选地，载体还包括选择标记物。
在本发明中，术语“选择标记物”用于便于选择转入Bcl-xL基因、HPV16 E6/E7基因和BMI1基因表达盒的转化细胞。可用于本发明载体的选择标记物并无特别限制，只要它是一种允许容易地检测或测量载体是否已被转导的基因即可，但典型的例子包括赋予可选择表型(如抗药性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性或表面蛋白表达)的标记物，例如，杀稻瘟菌素、多西环素、GFP、嘌呤霉素、新霉素(Neo)、潮霉素(Hyg)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)或鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Gpt)。
本发明还提供由上述红系祖细胞分化且成熟的红细胞。
本发明的红系祖细胞可通过在用于分化和成熟的培养基中培养而分化为成熟的红系细胞。本发明中使用的培养基可以是用于体外从红系祖细胞获得红细胞的培养基，且可以是仅含有碳源、氮源和微量元素成分的细胞培养最低限度培养基(CCMM)。换句话说，它是一种含有细胞存活所必需的糖、氨基酸和水的混合物，且是一种不含血清、营养物质和各种生长因子的基本培养基。例如，细胞培养最低限度培养基可以是杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、内皮分化培养基(EndothelialDifferentiation Medium，EDM)、最低限度必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)、基础Eagle培养基(Basal Medium Eagle，BME)、罗斯维尔公园纪念研究所(Roswell ParkMemorial Institute，RPMI)1640、F-10、F-12，它也可以是α-MEM、格拉斯哥MEM(Glasgow'sMEM，G-MEM)或伊斯科夫改良杜氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)。
此外，用于分化和成熟的培养基可以是这样的细胞培养基，其中加入血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL)-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、Flt3配体、肝素等中的任一种，或它们中的两种或更多种的组合。特别地，RBC可以在EPO(2至100U/mL，优选约10U/mL)存在下或在EPO(2至100U/mL，优选约10U/mL)和SCF(10至200ng/mL，优选约50ng/mL)存在下培养约7至15天。培养环境可以是任何适合体外诱导红细胞分化的环境，但例如，可在5％CO2和36℃至38℃(优选37℃)的条件下进行培养。
下文将通过实施例对本发明进行详细描述。然而，以下实施例仅说明本发明，本发明的内容并不局限于以下实施例。
实施例
实验材料和方法
1.源自脐带血的HSC(CD34阳性细胞)的分离
本发明中使用的脐带血来自一位事先书面同意捐献的健康母亲，本发明是在获得汉阳大学机构审查委员会批准(IRB编号：HYI-2019-07-006)后进行的。使用Ficoll-Hypaque法通过离心分离脐带血单核细胞。然后，使用免疫磁分离法(CD34+分离试剂盒(Stemcell Technologies Inc.，加拿大，温哥华))从单核细胞中分离出CD34+细胞。
2.用于细胞系建立的病毒生产
慢病毒颗粒的生产和滴度测量
293FT细胞在含有非热灭活的10％胎牛血清(Gibco)、0.1mM MEM非必需氨基酸(NEAA)(Gibco)、6mM L-谷氨酰胺(Gibco)和500μg/ml遗传霉素(Gibco)的DMEM(Gibco，Grand Island，NY)中在37℃，5％ CO2培养箱中(Thermo Fisher Scientific Inc.)培养。将冷冻保存的293FT细胞解冻，经过三次传代后用于转染。转染前一天，用不含遗传霉素的培养基在T75烧瓶中培养细胞。对于转染，使用LipofectamineTM2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)将分别含有GFP、E6/E7、Bcl-xL-E6/E7和BMI1-GFP的慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene，产品目录号12260)、包膜质粒pMD2.G(Addgene，产品目录号：12259)和FUW-tetO慢病毒载体转染293FT细胞，12h后将培养基更换为新鲜培养基。转染后48h，收集含有病毒颗粒的上清液，离心(3000rpm，15min，4℃)，并用0.45μM过滤器过滤。通过超速离心(20000g，4h，4℃)浓缩含有产生的病毒颗粒的上清液。之后，将CD34阳性细胞以1×105个细胞/ml接种在24个孔中，然后使用5倍连续稀释法用浓缩的病毒转导。24小时后，将培养基更换成新鲜培养基，且在培养的第5天，加入多西环素以表达转导的基因。在基因表达两到三天后，通过流式细胞术测量细胞中GFP的表达水平。在没有标记荧光的载体的情况下，通过将通过Lenti-XTMGoStixTM试剂盒(Takara Bio Inc.，大津，日本)测得的GFP值与通过上述流式细胞术测得的GFP病毒值进行比较来计算滴度。
3.HSC转导和培养
HSC在含有StemSpan SFEM(Stemcell Technologies)以及6IU/ml EPO(Calbiochem，San Diego，CA)、100ng/mL SCF(R&D Systems，Minneapolis，MN)和10ng/mLIL-3(R&D Systems)的培养基中培养1至3天。然后，用浓缩在上述培养基中的病毒和聚凝胺(8μg/ml，Sigma)转导5×104个细胞。转导过程中病毒的感染复数(MOI)计算为15至30。转导后24h，培养基更换成新鲜的无病毒培养基，从培养第5天起，StemSpan SFEM培养基中补充3IU/ml EPO、50ng/mL SCF、10-6M地塞米松、250nM TGF-β抑制剂(LY2157299，PeproTech，Rocky Hill，NJ)、10μM PPAR-α激动剂(GW7647，Sigma)和1μg/ml多西环素(Takara BioInc.)以诱导转导细胞中HPV16 E6/E7的选择性表达。在培养的第7天，通过GFP转导细胞的GFP荧光表达来确认转导的效率，并将细胞维持在2×105至3×105个细胞/毫升的浓度，同时每两到三天用新鲜培养基更换培养基。此外，为了获得细胞增殖率和存活率，还用台盼蓝(Gibco)对细胞进行染色和计数。
为了将转导的细胞分化为RBC，遵循以下程序。从分化的第0天到第6天，在IMDM(Gibco)中加入热激活的5％胎牛血清、6IU/ml EPO、100ng/mL SCF、10ng/mL IL-3、10-6M地塞米松和1μg/ml多西环素来培养细胞。从分化的第6天开始，细胞在添加了500mg/ml转铁蛋白、6IU/ml EPO和10-6M地塞米松的IMDM中进行分化。
为了形成体内髓内环境，将基质胶(Corning Inc.，NY)和纤连蛋白(Takara BioInc.)附着在平板上培养细胞。对于3D培养，将基质胶在培养基中稀释至8mg/ml。将稀释后的基质胶铺在平板上，在37℃静置30min。细胞在铺有基质胶的平板上培养。然后，以5μg/cm2的浓度将纤连蛋白涂覆板贴附在平板上，在室温下放置2h或在4℃放置24h。之后，除去纤连蛋白溶液，将细胞与2％牛血清白蛋白(BSA)在室温下反应30min，使用前用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞。
4.流式细胞术(FCM)/荧光激活细胞分选(FACS)
使用流式细胞仪CantoII(BD Biosciences Inc.，San Jose,CA)测量转导细胞中GFP表达的水平，以测量转导效率和慢病毒滴度。此外，还使用荧光激活细胞分选仪FACSAria II(BD Biosciences Inc.)以通过将红系标记物附着在转导的细胞上对转导的红系细胞进行分选。
使用了以下抗体：血型糖蛋白A(GPA；CD235a)-FITC(Life Technologies Inc.，Gaithersburg,MD)和CD71-PE(BioLegend Inc.，San Diego,CA)。用0.1％ BSA冲洗细胞，然后加入抗体并在4℃染色15min，同时遮光。此外，还使用荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti；Nikon Corporation)确认平板培养的细胞中表达的GFP荧光。
5.细胞衰老和死亡分析
为了分析细胞的衰老和死亡，在培养过程中收集细胞，并将衰老相关试剂和死亡检测抗体附着在细胞上。使用如下的试剂和抗体：衰老细胞组织化学染色试剂盒(Sigma)；和膜联蛋白V-FITC/PI检测试剂盒(BioLegend Inc.)
为了确认30天后的细胞衰老，在长期培养过程中细胞增殖开始减少时，细胞用PBS(Gibco)清洗并用2％甲醛在室温固定7min。然后，用PBS冲洗3次后，在细胞培养基中加入衰老相关染色试剂，在37℃培养箱(Thermo Fisher Scientific)中培养细胞24小时，不注入CO2，且在显微镜下确认染色细胞。
然后，为了确认细胞死亡，用0.1％ BSA冲洗细胞，加入抗体，遮光，室温染色细胞15min。将附着抗体的细胞涂抹在载玻片上，使用共聚焦显微镜TCS SP5(Confocalmicroscope；Leica Microsystems Inc.，维也纳，奥地利)进行确认。
6.细胞形态分析
使用细胞离心机(Cellspin；Hanil Science Industrial Co.Ltd.，Incheon，韩国)将培养的部分细胞铺到载玻片上，并用瑞氏-吉姆萨染色剂(Sigma)染色，并以盲法确认细胞的状态、形状和成熟度。使用光学显微镜(Nikon Eclipse TE2000-U；NikonCorporation)拍摄细胞照片。
7.PCR分析
根据特定的培养天数，使用Trizol试剂(Ambion Inc.，Austin，USA)从细胞中分离RNA，并使用分光光度计(Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific)测定RNA的浓度。在使用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)合成cDNA后，使用SYBR绿(TOPrealqPCR 2X PreMIX；Enzynomics Co.Ltd.，Daejeon，Korea)通过实时(RT)-PCR测量mRNA表达，一式两份。使用GAPDH校正值，且确认经转导过表达的HPV16 E6、HPV16 E7、HPV16 E6/E7、Bcl-xL、BMI1的基因表达水平。实验中使用的引物序列如下(表1)。
表1
结果
1.红系祖细胞系的建立
在本发明中，通过转导HPV16 E6/E7基因，使来自脐带血、外周血和骨髓的CD34+细胞永生化。由于在转导的红系祖细胞中持续表达该基因不会导致分化成红细胞，其是最终产物，因此尝试使用允许选择性表达的Tet诱导表达系统来表达HPV16 E6/E7基因。(图1B)。
转导后，通过瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色法确认细胞的状态和成熟度。作为对未转导的对照组进行染色的结果，在培养的第14天，未成熟成红血细胞仍在分裂，但已分化的细胞得到确认。培养第24天，当成熟的中幼红细胞占多数时，培养终止。而在转导的对照组中，直到培养第32天，大部分未成熟的成红血细胞一直在增殖，这证实了对照组与基因过表达实验组在培养日时细胞状态上的差异(图3A)。此外，在增殖率方面，直到培养第17天，未转导对照组中的细胞增加了超过613倍，然后逐渐减少，直到培养第24天终止培养。对于过表达E6/E7的实验组而言，在第17天的增殖为641倍，与对照组相似，但与对照组在第24天培养终止不同，在培养28天后，过表达E6/E7的细胞在培养中增殖超过3300倍，且从培养第31天起细胞逐渐减少(图3B)。在细胞增殖方面，E6/E7的作用得到了证实，因为其增殖是未转导对照组的至少5.5倍。然而，在细胞培养天数方面，与过表达E6/E7将通过连续的细胞周期增殖实现长期培养，从而可实现永生化的预期相反，从培养第30天起，增殖减少，细胞数量减少，出现了许多分化细胞。因此，为了找到培养30天后出现的问题，首先进行了一项实验，以确认转导细胞中是否存在E6/E7基因表达以及载体的功能。
1.1HPV16 E6/E7基因表达的确认
为了证实转导细胞中E6/E7基因的表达，提取了mRNA并进行了反转录PCR。培养14天的正常红系祖细胞作为对照组，在培养的第28天和第32天收集仅转导GFP的细胞和过表达相应基因的细胞，并分别鉴定E6和E7基因。结果，在正常红系祖细胞和GFP转导的细胞中，E6和E7基因的表达没有得到证实，而在培养28天和32天的转导细胞中，观察到了E6的全长形式和剪接形式的表达，证实培养32天的细胞中E6的全长形式比培养28天的细胞有所增加。经证实，E7在正常红系祖细胞和GFP转导细胞中也不表达，但在培养28天和32天的转导细胞中表达。结果发现，与培养28天的细胞相比，培养32天的细胞中E7的表达增加(图3D)。此外，收集了培养40天的细胞的mRNA，以确认E6/E7的总mRNA表达，结果证实E6/E7得到了表达(图3C)。上述结果表明，即使在30天后，E6/E7基因在转导细胞中也有良好的表达。
1.2HPV16 E6/E7基因的长期培养效果
试图通过培养30天后，尽管因凋亡而细胞死亡和因分化而细胞死亡，但仍存活和增殖的细胞来确认长期培养的细胞是由于转导的E6/E7基因的作用。首先，通过瑞氏-吉姆萨染色法确认细胞状态和成熟度。在培养的第47天收集细胞并进行瑞氏-吉姆萨染色，结果证实未成熟的成红血细胞正在增殖，且即使在培养的中期阶段，未成熟的成红血细胞形态也得以保持(图3E)。在培养的第54天，对增殖细胞进行为期四天的观察，以根据分裂次数计算倍增时间。结果发现，细胞从培养第54天的9个细胞增殖到4天后的21个细胞，测得的倍增时间为78.7h(图3F和3G)。此外，为了确认载体的Tet-on系统在长期培养过程中是否正常运行，将培养第79天的细胞在不含多西环素的培养基中培养3天。结果，在去除多西环素后培养的对照组中，细胞存活并增殖，但在去除多西环素后培养的实验组中，发现细胞死亡(图3H)。由于从增殖培养基而不是分化培养基中去除多西环素导致细胞死亡，而不分化成RBC，因此有必要确认是否可以通过在分化培养基中培养来生产RBC。首先，由于从长期培养转导细胞的增殖培养基到分化培养基，培养基成分的变化可能会影响细胞，因此在分化培养基中加入多西环素，持续五天。此后，从分化的第6天开始，在不添加多西环素的情况下进行分化，并用瑞氏-吉姆萨染色法分析细胞形态。将培养基更换为分化培养基的当天设定为第0天，此时大部分为未成熟的成红血细胞。分化第4天，未成熟的成红血细胞在多西环素的作用下仍在增殖，且也观察到分化成中幼红细胞的细胞。分化第8天，几乎看不到未成熟的成红血细胞，但观察到许多中幼红细胞。分化第10天，观察到中幼红细胞和红细胞，且观察到许多晚幼红细胞(图3I)。
通过这些结果，证实即使在长期培养中，Tet-on系统也能正常运行，而且由于载体表达的HPV16 E6/E7基因的作用，细胞得以存活。此外，证实了通过分化培养基去除多西环素可实现红细胞的最终分化。
1.3E6剪接与细胞死亡的确认
已知HPV E6/E7是多顺反子的，因此当E6/E7从相同启动子表达时，通过选择性剪接表达各种模式的E6 mRNA，此时，剪接后的E6*I的功能干扰现有的E6，其抑制p53。因此，试图确定在转导的细胞中表达的剪接形式和全长形式的E6的量是否会对细胞系生产具有影响。除了先前构建的由相同启动子表达的E6/E7载体外，还分别生产E6载体和E7载体，预计全长形式的E6会大量表达。通过分成E6/E7+E6+E7组、E6+E7组和E6/E7组来尝试转导。收集转导后培养14天和35天的细胞的mRNA，通过RT-PCR证实剪接型和全长型E6和E7的表达差异。首先，作为培养14天的细胞进行PCR结果，证实在两个实验组中，E6的全长形式和剪接形式之间的表达水平的差异很小，并且在E6+E7实验组中，E6的全长形式和剪接形式的表达水平低于其他两个实验组(图4A)。此外，在培养35天的细胞中，E6的全长型和剪接型表达相似，并且在E6+E7实验组中的表达水平低于其他实验组。结果发现，在第14天和第35天，E7的表达在所有实验组中没有显著差异(图4B)。
比较了在各实验组中转导细胞的增殖率。经证实，E6/E7+E6+E7实验组中的增殖最高，到第28天为900倍；E6/E7实验组中的增殖到第31天为577倍；E6+E7实验组中的增殖最低，到第31天为320倍(图4C)。由此证实，在E6+E7实验组中，全长形式和剪接形式的E6 mRNA的表达模式没有显著差异，其中，与其他两个实验组相比，全长形式预计会大量表达，而根据启动子剪接的程度可以忽略不计。由于E6+E7实验组呈现出最低的增殖率，因此得出结论：剪接对E6功能的抑制作用影响不显著。
根据上述结果，证实E6/E7在转导细胞的长期培养中表达，并证实未成熟的成红血细胞的维持和增殖是由于E6/E7基因的作用。与典型红细胞培养21天相比，增殖期延长了两到三倍甚至更多，并且平均57天且最长150天的长期培养是可能的。然而，虽然在所有培养中E6/E7基因都持续表达，但无法实现60天或更长时间的长期培养，而且无论E6 mRNA的表达模式如何，在大多数实验中，细胞数量都随着培养的继续而呈下降趋势。为了确认细胞在30天后增殖率开始下降时的状态，用衰老相关的(SA)-β半乳糖苷酶(即衰老标记物)进行了染色。经证实，在培养31天的细胞中，SA-β凝胶染色细胞的数量有所增加，而在培养41天的细胞中，大多数存活细胞均为SA-β染色细胞(图4D)。三天后，对培养44天的细胞用膜联蛋白V/碘化丙啶(PI)进行染色，然后用共聚焦激光显微镜(CLSM)进行检查，以确定细胞死亡(凋亡)的程度。染色结果显示，仅用膜联蛋白V染色的细胞处于细胞凋亡的早期阶段，而用膜联蛋白V和PI两者染色的细胞则处于细胞凋亡和细胞坏死的晚期阶段(图4E)。由此得出结论，即使表达了E6/E7，细胞也不会在第30天后迅速死亡，而是在细胞死亡前经过了几天的衰老期。
因此，除了E6/E7基因外，还试图找到比目前培养环境更好的培养条件。进行下面的实验以寻找培养红系祖细胞的最佳条件，目的是减少培养过程中细胞死亡的增加，并延长具有高自我增殖能力的未成熟成红血细胞的增殖期。
2.红系祖细胞系培养条件的研究
在生产细胞系时，为了使具有高度自我分裂和增殖能力的未成熟成红血细胞永生化，可以在转导后的初始培养中增加未成熟成红血细胞的增殖，以提高未成熟成红血细胞永生化的比例。为此，寻找了可以增加未成熟成红血细胞增殖的物质。此外，已知造血干细胞祖细胞在体内骨髓中增殖，并通过各种作用保持其自我增殖能力。由此，期望在体外创造类似骨髓的环境并在其中进行培养以持续维持未成熟成红血细胞时，将维持未成熟成红血细胞的自我增殖能力，这除了转导的遗传作用外，还有助于细胞系培养。
2.1未成熟成红血细胞的增殖
存在一种TGF-β抑制剂(LY2157299)，其已知对未成熟成红血细胞的维持和增殖有效，还开发了一种PPAR-α激动剂(GW7647)，其可能与糖皮质激素对未成熟成红血细胞的增殖有协同作用，并且对这两种物质的作用进行了实验。首先，将两种物质添加到不同条件下的典型CD34+细胞培养物中并进行培养。在细胞增殖方面，将两种物质一起添加进行培养时，细胞在培养第15天增殖最多，增殖了1500倍；而只添加TGF-β抑制剂的实验组中，细胞在培养第13天增殖了1000倍。接着，确认了只添加PPAR-α激动剂的实验组和不添加任何物质的对照组之间没有显著差异，这是因为它们的增殖率分别为500倍和400倍(图5A)。此外，增殖细胞上附着有未成熟成红血细胞标记物CD71，并通过流式细胞术确认了未成熟成红血细胞的比例。在17天后终止培养的对照组和只用PPAR-α激动剂处理的实验组中，未成熟成红血细胞的比例分别为50％和53％；而在两种物质都添加的实验组中，第17天和第20天的最高值分别为72％和65％(图5B)。由此证实，同时添加自我增殖诱导剂TGF-β抑制剂和PPAR-α激动剂有助于未成熟成红血细胞的增殖和维持。因此，为了观察转导细胞培养中的上述效果，进行了以下实验。在培养的第28天和第33天，在添加自我增殖诱导剂的实验组和未添加自我增殖诱导剂的对照组中，对细胞形态进行了确认，并对未成熟成红血细胞的比例进行了确认。结果发现，在对照组中，培养第28天未成熟成红血细胞占所有细胞的65％，培养第33天未成熟成红血细胞占所有细胞的7.7％；而只用TGF-β抑制剂处理时，培养第28天未成熟成红血细胞占所有细胞的26.7％，培养第33天未成熟成红血细胞占所有细胞的15.2％。同时使用TGF-β抑制剂和PPAR-α激动剂培养的结果证实，未成熟成红血细胞的比例在第28天平均为71.5％，在第33天平均为60％(图5C和5D)。通过上述结果，在同时使用TGF-β抑制剂和PPAR-α激动剂培养的实验组中，发现在增殖和未成熟成红血细胞比例上存在显著差异，并且还得出结论，在未成熟成红血细胞大量增殖的早期培养阶段，使用这两种物质处理可能是有帮助的。
为了在体外培养中创造类似于骨髓的环境，根据成红血细胞表面上表达的VLA-4相互作用而发生增殖的3D环境，其是在体内骨髓中增殖的未成熟成红血细胞所处的环境，使用基质胶和纤连蛋白尝试进行培养，这两种物质能够与未成熟成红血细胞的VLA-4相互作用，从而实现3D培养。当在基质胶中培养时，第7天观察到细胞，并确认细胞直到第14天一直以集落的形式增殖，这是未成熟成红血细胞增殖的特征。然而，第14天后，细胞增殖到一定数量后就不再增殖，培养终止，虽然成团的集落被释放出来，并再次尝试培养，但它们仍未能增殖(图5E)。因此，确认使用基质胶的条件对生产细胞系没有太大帮助。在纤连蛋白培养中，细胞在第7天时相对广泛地分布在涂覆有纤连蛋白的培养皿上。一周后，在第14天，可以看到细胞大量增殖，GFP荧光也大量表达。证实培养超过一定数量的细胞是可能的，纤连蛋白培养有助于维持未成熟成红血细胞，并延长增殖期(图5F)。然而，在第30天后，GFP表达细胞的数量开始减少，细胞数量没有增加。在培养第40天确认GFP荧光的结果显示，观察到荧光细胞的数量显著减少。
尝试通过改善未成熟成红血细胞的培养条件和环境，维持未成熟成红血细胞的自我增殖能力，从而延长细胞增殖和培养天数。上述结果证实，与一般的红细胞培养相比，使用有助于未成熟成红血细胞增殖和维持的物质以及创造类似于骨髓的环境，有助于延长未成熟成红血细胞的增殖，但细胞数量减少，细胞死亡的问题也没有得到解决。
2.2减少细胞死亡的研究
作为细胞系生产中存在的问题，培养过程中发生的细胞死亡和从凋亡细胞分泌的物质影响周围的正常细胞，使得它们也发生细胞死亡，这被认为是细胞死亡导致增殖率下降的原因。为了排除这种凋亡的影响，尝试只对转染细胞中的未成熟成红血细胞进行分类和培养。首先，将未成熟成红血细胞标记物CD71附着在转染细胞上，然后用荧光激活细胞分选法对显示GFP荧光并包括附着CD71的转染细胞(GFP+/CD71+)分选来进行分析。经确认，GFP+/CD71+细胞的比例为25％(图6A)。单细胞培养法(其中，可以在96孔培养板上每孔一个细胞地分布分选细胞，从而形成均匀的集落)和现有的培养条件(其中，保持恒定的细胞数量浓度)之间进行了比较。结果，在单细胞培养法中，细胞在培养10天后大量增殖，且GFP荧光表达也得到确认。4天后，在培养的第14天，发现细胞数量增加，但细胞尺寸减小，且一些细胞经历细胞死亡。培养第21天，结果显示GFP荧光不表达且细胞不增殖，培养终止(图6B)。通过单细胞培养法，细胞死亡相对减少且细胞发生增殖，但细胞数量超过一定数量没有增加的趋势。与保持恒定细胞数浓度的培养条件相比，在培养天数方面，保持浓度的培养显示出平均40天或更长时间的增殖，但在单细胞培养中，在平均20天后培养终止。因此，结论是单细胞培养法作用不大，而保持恒定的细胞数量浓度对细胞增殖很重要。
此外，除了培养方法外，还尝试通过向载体加入能够有助于细胞系生产的因和E6/E7基因，以减少细胞死亡。首先，预期Bcl-xL(一种作为内源基因表达的促存活基因)，可以通过与现有的E6/E7基因一起过表达而产生协同效应，以减少转导未成熟成红血细胞培养中观察到的细胞死亡，从而帮助细胞存活(图2)。通过在先前构建的慢病毒载体中加入Bcl-xL基因，HPV16 E6/E7和Bcl-xL被一起包括在一个载体中，并与仅转导现有的HPV16 E6/E7基因的细胞进行了比较。结果，仅转导E6/E7基因的细胞平均增殖1687倍，增殖最多的细胞增殖3355倍。额外转导Bcl-xL基因的细胞平均增殖了4640倍，最大增加为8800倍。经证实，与E6/E7相比，平均差异为2.7倍(图6C)。从培养的第4天到第32天，只表达E6/E7基因的细胞的细胞存活率保持在70％或更低，而额外转导Bcl-xL的细胞的细胞存活率保持在75％或更高(图6D)。在培养的第28、32和35天收集转导E6/E7和Bcl-xL-E6/E7的细胞的mRNA，以比较Bcl-xL的表达。虽然Bcl-xL是一种内源基因，其在没有过表达的情况下也会表达，但证实，与只转导E6/E7的细胞相比，额外转导Bcl-xL的实验组中Bcl-xL的过表达更多。然而，发现随着培养的进行，Bcl-xL的表达(内源性表达和过表达)有所下降(图6E)。此外，为了检测E6和E7的活性，尝试通过蛋白质印迹分别鉴定p53和pRb蛋白。结果发现，在额外转导Bcl-xL的E6/E7实验组中，p53蛋白减少，并且证实与对照组相比，E6/E7实验组中的p53蛋白也减少。结果发现，与对照组相比，两个实验组中的pRb均有所增加(图6F)。
通过上述结果发现，添加Bcl-xL对早期增殖率和细胞存活率有一定的效果，但是当培养进行很长一段时间时由于细胞死亡而导致细胞数量减少的问题并没有得到解决。
参考之前的研究，其中通过在红系分化各阶段的mRNA微阵列分析，选择并过表达BMI1，其表达在红系祖细胞增殖中增加且与自我增殖能力相关，除Bcl-xL-E6/E7基因外，再转导各基因，尝试产生细胞系。在本研究中，为了在细胞死亡增加和细胞存活率下降时通过额外转导BMI1进行实验，在培养的第26天和第27天进行了转导。将GFP标记到BMI1载体上，且在转导后5天，通过GFP荧光确认转导程度，并收集mRNA以确认BMI1基因的过表达(图6G)。在具有添加BMI1的细胞培养物中，发现了存活131天的细胞，并且GFP荧光证实，从培养的中期到晚期，表达GFP的细胞的数量减少，但证实直到第131天仍有细胞表达GFP(图6H和6I)。转导BMI1基因允许四个月或更长时间的长期培养，但并未显示出对细胞增殖的显著影响。
通过上述实验，用以延长未成熟成红血细胞的增殖期并减少细胞死亡的额外基因操作，显示与对照组相比在早期未成熟成红血细胞的细胞增殖方面具有显著差异，但长期培养过程中的增殖问题并没有得到解决。
3.利用外周血和骨髓细胞生产细胞系
除脐带血外，还尝试利用源自外周血和骨髓的CD34+细胞生产细胞系。首先，通过三种途径进行了实验：通过将基因转入从外周血分离出来的单核细胞中；通过诱导单核细胞以分化为未成熟成红血细胞持续四至五天后进行转导；以及通过从外周血中分离出CD34+细胞且进行转导。外周血的转导方法与脐带血的转导方法相同，但培养的结果是细胞增殖不显著，且与脐带血相比，细胞增殖有明显差异。作为用Bcl-xL-E6/E7转导从外周血中分离出来的细胞的结果，在培养第28天增殖为550倍，而用E6/E7和Bcl-xL-E6/E7转导从脐带血中分离出的细胞时，增殖分别为1600倍和8800倍，因此确认存在2.9倍和5.5倍的差异(图7A)。在增殖天数方面，增殖平均发生32天，并且可以培养长达50天。经证实，细胞在培养的第47天继续增殖(图7B)。
由于将E6/E7转导到骨髓来源的CD34+后细胞数量明显减少，因此进行单细胞培养。结果，从培养的第14天到第21天观察到细胞增殖，且在第21天后增殖开始减少，并且确认许多细胞在培养25天后已经死亡(图7C和7D)。在骨髓来源的CD34+的情况下，证实大多数培养在第30天前终止，并且长达35天的培养是可能的。
本发明已参照上述实施例和实验例进行了描述，但这些实施例和实验例仅仅是说明性的，本领域技术人员将理解由此可以进行各种修改和其他等效的实施例和实验例。因此，本发明的真正技术保护范围应根据所附权利要求书的技术精神来确定。

Claims (13)

1.一种用Bcl-xL基因和E6/E7基因转导的红系祖细胞。
2.根据权利要求1所述的红系祖细胞，其中，所述转导是在处于红系爆式形成单位(BFU-E)、红系集落形成单位(CFU-E)、原红细胞或早幼红细胞状态的红系细胞中进行的。
3.根据权利要求1所述的红系祖细胞，其中，所述红系祖细胞来源于造血干细胞。
4.根据权利要求1所述的红系祖细胞，其中，所述Bcl-xL基因和所述E6/E7基因被转导到一个载体中。
5.根据权利要求1所述的红系祖细胞，其中，进一步转导BMI1基因。
6.根据权利要求1所述的红系祖细胞，其中，所述红系祖细胞进一步使用转化生长因子(TGF)-β抑制剂和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α激动剂处理。
7.一种生产红系祖细胞的方法，包括将Bcl-xL基因和E6/E7基因转入由造血干细胞分化的红系细胞中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述红系细胞选自由红系爆式形成单位(BFU-E)、红系集落形成单位(CFU-E)、原红细胞和早幼红细胞组成的组中。
9.根据权利要求7所述的方法，还包括转导BMI1基因。
10.根据权利要求7所述的方法，还包括使用TGF-β抑制剂和/或PPAR-α激动剂处理。
11.一种重组载体，包含Bcl-xL基因和E6/E7基因。
12.根据权利要求11所述的重组载体，其中，还包括BMI1基因。
13.由权利要求1所述的红系祖细胞分化且成熟的红细胞。
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