JP6385340B2 - 巨核球の成熟化促進物質 - Google Patents
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Description
その他、巨核球の分化過程に対する影響として、未成熟な巨核球を、通常の培養温度より高温の39℃で培養すると多核化した成熟巨核球の誘導及びproplateletsの形成を促進することなども示されている(非特許文献4)。
そこで、本発明は、このような巨核球株を成熟させるための物質およびその用途を提供することを課題とする。
[1] ABCトランスポーター阻害剤を含む培養液中で未熟巨核球を培養する工程を含む、成熟巨核球の製造方法。
[2] 前記ABCトランスポーター阻害剤が、ABCトランスポーターのCファミリーの阻害剤である、[1]に記載の製造方法。
[3] 前記ABCトランスポーター阻害剤が、プロベネシドである、[1]または[2]に記載の製造方法。
[4] 前記未熟巨核球が、多能性幹細胞由来の造血前駆細胞から製造された未熟巨核球である、[1]から[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5] 前記未熟巨核球が、多能性幹細胞由来の造血前駆細胞へ癌遺伝子、p16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子から成る群より選択される遺伝子を強制発現させて製造された巨核球である、[4]に記載の製造方法。
[6] 前記未熟巨核球が、多能性幹細胞由来の造血前駆細胞へ、c-Myc、Bmi1およびBcl-xLから成る群より選択される遺伝子を強制発現させて製造された巨核球である、[5]に記載の製造方法。
[7] 前記培養工程を、4日以上行う、[1]から[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8] ABCトランスポーター阻害剤を用いた未熟巨核球を成熟化する方法。
[9] 前記ABCトランスポーター阻害剤が、ABCトランスポーターのCファミリーの阻害剤である、[8]に記載の方法。
[10] 前記ABCトランスポーター阻害剤が、プロベネシドである、[8]または[9]に記載の方法。
[11] ABCトランスポーター阻害剤を含む巨核球成熟化剤。
[12] 前記ABCトランスポーター阻害剤が、ABCトランスポーターのCファミリーの阻害剤である、[11]に記載の剤。
[13] 前記ABCトランスポーター阻害剤が、プロベネシドである、[11]または[12]に記載の剤。
本発明は、ABC(ATP binding cassette)トランスポーター阻害剤を含む培養液中で未熟巨核球を培養する工程を含む、成熟巨核球の製造方法を提供する。同様に、本発明は、ABCトランスポーター阻害剤を用いた未熟巨核球を成熟化する方法を提供する。
本発明の方法によって未熟巨核球を処理すると、成熟した巨核球へと成熟することができる。そのため、成熟巨核球の含有率の高い細胞組成物を取得することができる。細胞組成物において成熟巨核球の含有率が高いか否かは、当業者が経験や文献に基づいて判断することができる。本発明の方法で成熟巨核球を製造した場合、成熟巨核球の含有率は、少なくとも、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上であり、より好ましくは100%である。従って、本発明の方法により、成熟巨核球の存在比率の高い巨核球集団を調製することが可能となる。
本発明の方法で得られた成熟巨核球から、in vitroで血小板を産生し得る。
本発明に係る血小板の製造方法は、上述の方法で得られた成熟巨核球を培養し、培養物から血小板を回収する工程を含む。
培養条件は、成熟巨核球の製造工程を継続することによって、実施し得る。また、得られた血小板を移植に用いる観点から、血清フリー及び/又はフィーダー細胞フリーの条件で行うことが好ましい。なお、フィーダー細胞を用いない場合は、conditioned mediumを使用してもよい。conditioned mediumは、特に限定されず、当業者が公知の方法等に従って作製することができるが、例えば、フィーダー細胞を適宜培養し、培養物からフィーダー細胞をフィルターで除去することによって得ることができる。
本発明の実施形態には、巨核球成熟化剤または成熟巨核球を製造するためのキットが含まれる。当該巨核球成熟化剤またはキットには、上述したABCトランスポーター阻害剤が含まれる。その他、巨核球の成熟に用いることができる試薬、例えば、培養液、(a)p53遺伝子産物の発現又は機能を阻害する物質、(b)アクトミオシン複合体機能阻害剤、(c)ROCK阻害剤 (d)HDAC阻害剤が挙げられる。当該キットには、さらに、成熟巨核球を認識するための試薬(例えば、GATA1、p45 NF-E2、beta1-tubulin、c-MPL 、MYH9に対するPCR用プライマー)が含まれ得る。巨核球成熟化剤または当該キット中に含まれる試薬等は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。
ヒトiPS細胞由来不死化巨核球株は、WO 2012/157586に記載された方法を改良して作製した。簡潔には、ヒト末梢血から作製したiPS細胞から造血前駆細胞を調製し、レトロウィルス法にてc-Myc、Bmi1およびBcl-xLを遺伝子導入して、不死化巨核球株を作製し、導入した遺伝子を発現したまま少なくとも24日以上維持培養した。また、導入した遺伝子は、Doxicyclinの添加によってc-Myc、Bmi1およびBcl-xLの発現を抑制することができる。
予めマイトマイシンCで不活化させたC3H10T1/2細胞を1x104cells/well (96well plate)で播種し、一晩以上培養してフィーダー細胞とした。このフィーダー細胞上へ上記の不死化巨核球株を3x104 cells/well (96well plate)で播種し、2.5mM Probenecid存在下または非存在下(基剤のみを添加)で50ng/mL SCF、50ng/mL TPOおよび0.5μg/mL Doxicyclin含有する基礎培地(15% Fetal Bovine Serum、1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine、1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution、0.45mM 1-Thioglycerolおよび50μg/mL L-Ascorbic Acidを含有するIMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium))にて37℃、5%CO2下で4から6日間培養した。培養後の細胞からRNAを抽出し、定量的PCR法にてGATA1, p45 NF-E2, c-MPL, β1-tubulin、MYH9、MYH10の発現を確認した(図1)。
以上より、Probenecidを添加して培養することで、ヒトiPS細胞由来不死化巨核球株の成熟化を促進することが確認された。
Claims (7)
- プロベネシドを含む培養液中で未熟巨核球を培養する工程を含む、成熟巨核球の製造方法。
- 前記未熟巨核球が、多能性幹細胞由来の造血前駆細胞から製造された未熟巨核球である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記未熟巨核球が、多能性幹細胞由来の造血前駆細胞へ癌遺伝子、p16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子から成る群より選択される遺伝子を強制発現させて製造された巨核球である、請求項2に記載の製造方法。
- 前記未熟巨核球が、多能性幹細胞由来の造血前駆細胞へ、c-Myc、Bmi1およびBcl-xLから成る群より選択される遺伝子を強制発現させて製造された巨核球である、請求項3に記載の製造方法。
- 前記培養工程を、4日以上行う、請求項1から4のいずれか一項に記載の製造方法。
- プロベネシドを用いた未熟巨核球を成熟化する方法。
- プロベネシドを含む巨核球成熟化剤。
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