JP2007504215A - 生体分子を急速に結晶化するための方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)少なくとも1つの生体分子種を提供するステップと、
(b)少なくとも1つの生体分子種のpIを含むpH範囲を有するIEFバッファーを含む、少なくとも1つの結晶化リアクターを提供するステップと、
(c)前記少なくとも1つの生体分子種と少なくとも1つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
(d)前記少なくとも1つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも1つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
(e)前記少なくとも1つの結晶化リアクター内で少なくとも1つの結晶を得るステップと
を含む上記方法を提供する。
(a)複数の生体分子を含む媒体を提供するステップと、
(b)支持体上の複数の生体分子を選別し、それによって少なくとも1つの生体分子種を含む支持体上に少なくとも1つの位置を得るステップと、
(c)少なくとも1つの位置を含む部分を前記支持体から回収するステップと、
(d)少なくとも1つの生体分子種のpIを含むpH範囲を有するIEFバッファーを含む、少なくとも1つの結晶化リアクターを提供するステップと、
(e)(c)の部分と少なくとも1つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
(f)少なくとも1つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも1つの結晶化リアクター内に、前記少なくとも1つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
(g)前記少なくとも1つの結晶化リアクター内で少なくとも1つの生体分子結晶を得るステップと
を含む上記方法を提供する。
少なくとも1つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも1つの結晶化リアクターにおいて、前記少なくとも1つの生体分子種の濃縮バンドを生成させることを含む。
(a)上側及び下側を有するバッファー室であって、バッファー室が流体を保持することができる少なくとも1つのバッファー区画を囲うように下側が底部で封じられているバッファー室と、
(b)少なくとも1つの結晶化リアクターであって、この少なくとも1つの結晶化リアクターはIEFバッファーを含み、この少なくとも1つの結晶化リアクターがバッファー室内に含まれる少なくとも1つの結晶化リアクターと、
(c)電場を生成させるためのデバイスと、場合によって、
(d)バッファー区画内に含まれる流体を循環させるための手段と
を含む上記装置を提供する。
(a)少なくとも1つの生体分子種を提供するステップと、
(b)少なくとも1つの生体分子種のpIに対応するpHを含むpH範囲を有するIEFバッファーを含む、少なくとも1つの結晶化リアクターを提供するステップと、
(c)前記少なくとも1つの生体分子種と前記少なくとも1つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
(d)ランニングバッファー中に電場を導入し、それによって前記少なくとも1つの結晶化リアクター内に前記少なくとも1つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
(e)濃縮溶液中の前記少なくとも1つの生体分子種を、前記少なくとも1つの結晶化リアクター内で結晶化するステップと
を含む上記方法を提供する。
(a)少なくとも1つの生体分子種を含む溶液を提供するステップと、
(b)支持体上での電気泳動によって溶液を分析し、それによって少なくとも1つの生体分子種に対応する少なくとも1つのバンドを支持体中に得るステップと、
(c)支持体から一部分を分離することであって、その部分が(b)で分析した少なくとも1つのバンドを含むステップと、
(d)あるpH範囲を有するIEFバッファーを含む少なくとも1つの結晶化リアクターを提供するステップであって、そのpH範囲が前記少なくとも1つのバンドのpIを含むステップと、
(e)前記少なくとも1つのバンドを少なくとも1つの結晶化リアクターに加えるステップと、
(f)ランニングバッファーに電場を導入し、それによって前記少なくとも1つの結晶化リアクター内に、(b)で分析した少なくとも1つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
(g)少なくとも1つの結晶化リアクター内で、(f)の濃縮溶液中の前記少なくとも1つの生体分子種を結晶化するステップと
を含む上記方法を提供する。
本発明は、急速な結晶化のための装置も提供する。さらに他の実施形態によれば、本発明は、タンパク質結晶の急速な形成を誘導するのに適した装置であって、
(a)少なくとも1つの結晶化リアクターであって、前記少なくとも1つの結晶化リアクターがIEFバッファーを含み、前記少なくとも1つの結晶化リアクターがバッファー室内に含まれる少なくとも1つの結晶化リアクターと、
(b)電場を生成させるためのデバイスと、場合によって、
(c)バッファー区画内に含まれる流体を循環させるための手段と
を含む上記装置を提供する。
急速なマクロ分子の結晶化は、保存、薬剤設計及び薬剤送達に関して非常に産業的価値がある。多量の結晶マクロ分子の調製に関する産業上の必要性も存在する。産業規模の処理に適した、当分野で知られている結晶化の方法は存在しない。何故なら、結晶が成長しない危険性が常に存在し、結晶が実際に成長し始める場合、所望の大きさの結晶を得るのに必要とされる長い時間は実用的ではないからである。
1.少量の希釈した、必ずしも精製されていないタンパク質サンプルから結晶を成長させる能力。
2.濃縮タンパク質溶液又は濃縮タンパク質バンドが、数時間以内、さらに数分間以内に直ぐに生成される。
3.結晶化リアクター中に蓄積するマクロ分子は非帯電状態であるか、或いは非常に少量の電荷を有しており、したがって静電気による反発作用は、無視できる程度であるか或いは存在しない。
4.沈降、対流又は沈殿が、濃縮したマクロ分子溶液の形成中又は結晶の形成中に生じない。
5.結晶の成長が非常に速い、約数分間又は数時間以内である可能性がある。
6.本発明の方法のIEF成分による、結晶化過程中のタンパク質サンプルの製造過程の精製によって、不純物及び他のイソ型による考えられる汚染が排除され、したがって本発明の方法は、既存の結晶化法と比較して、あまり精製されていないタンパク質サンプルを用いた作業を可能にする。
7.キャピラリー内で結晶化リアクターを使用する、本発明の方法を適用するためのオプションは、結晶学的方法に特に適している。何故なら、リアクターから異なる環境に結晶を移動させる必要がないからである。このような移動は、結晶の構造及び安定性を危うくする。
p53タンパク質の成分の結晶化
3つのタンパク質サンプルが供給された:
(a)p53ヒトDBD[pI(理論値)=8.83]
(b)C Elegansからのβ−転写因子[pI(理論値)=5.98]
(c)ヒトβ−転写因子[pI(理論値)=5.5]
LPGズームストリップを使用することによる、IEFによって分離したタンパク質の結晶化の可能性の実証
我々の結晶化技術はわずか数マイクログラムの量のタンパク質を必要とするので、IEFによる分離は結晶を得るための物質の源として働くことができる。このような実験は、図5中に見られるのと同様にp53サンプルから分離したバンドの1つで行った。
ミオグロビンの結晶化
ウマ心臓ミオグロビン(75μg)を1.5mlの水に溶かし、結晶化装置中に導入した。この溶液はIEF手順用のランニングバッファー(pH=7.00)として働いた。イモビリン(商標)バッファー(Amersham)を、直径1mm及び深さ1mmの10%ポリアクリルアミドゲルの円筒形空洞中に重合させた(pH=6.80)。IEF分離は以下の条件:1200V、30分間、及び電極間の距離0.5cmの下で行った。
ヘモグロビンSの結晶化
ヘモグロビンSの溶液(1μg/ml、水中;Sigma)、pI=7.0を、6.9〜7.05のpH範囲を有するpHバッファー(イモビリン(商標)、4%ポリアクリルアミドゲル中)中への等電点電気泳動によって濃縮した。1000V/cmの電場を、25℃の温度の下で30分間引加した。30分後、400μm長の結晶を得た(図7B)。
フィコシアニンの結晶化
1μg/mlの溶液中で約4.5のpIを有する市販のフィコシアニン(1μg;Sigma)に、4.4〜4.6のpH範囲を有するpHバッファー(イモビリン(商標)、4%ポリアクリルアミドゲル中)においてIEF手順を施した。等電点電気泳動の条件は:25℃、100V/cmの電場、及び30分の実験時間であった。30分後、結晶を得た(図8A)。
アクアポリン3の結晶化
膜タンパク質は一般に、構造決定に関する最も重要なタンパク質であるとみなされている。残念ながら、タンパク質を結晶化するための最も標準的な方法は、膜タンパク質の結晶を生成することができない。この本発明の実施例は、最も重要な膜タンパク質の1つであるアクアポリンの結晶化を可能にする本発明の方法の能力を実証する。
ウシ炭酸脱水酵素の結晶化
5.95のpIを有するウシ炭酸脱水酵素の溶液(1μg/ml;Sigma)を、IEFによって5.8〜6.0のpHを有するpHゲル区画(空洞;4%ポリアクリルアミド)中に濃縮した。この濃縮手順は、100V/cmの電場の下で25℃において40分を要した。40分後、結晶を得た(図10)。
ペプシン−4、クレアチンキナーゼ1、β−ヒト成長因子、アビジン、ヘルセプチン、Ly1リゾチーム、リボヌクレアーゼ−1及びプロスタグランジンの結晶化
ペプシン−4、クレアチンキナーゼ(CK)、β−ヒト成長因子(βhGF)、アビジン、ヘルセプチン、Ly1リゾチーム、リボヌクレアーゼ−1(RNAse−1)及びプロスタグランジンのタンパク質結晶化は、表1中に詳細に述べたように行った。生成した結晶及び/又は結晶化したタンパク質の分画の回折は図11〜15中に示す。
Claims (87)
- 生体分子を急速に結晶化するための方法であって、
(a)少なくとも1つの生体分子種を提供するステップと、
(b)少なくとも1つの生体分子種のpIを含むpH範囲を有するIEFバッファーを含む、少なくとも1つの結晶化リアクターを提供するステップと、
(c)前記少なくとも1つの生体分子種と少なくとも1つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
(d)前記少なくとも1つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも1つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
(e)前記少なくとも1つの結晶化リアクター内で少なくとも1つの結晶を得るステップと
を含む上記方法。 - ステップ(c)が少なくとも1つの結晶化リアクター及び少なくとも1つの生体分子種をランニングバッファー中に置くステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- ステップ(e)が生体分子結晶の形成を監視するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 結晶化が24時間以内、好ましくは12時間未満以内に起こる、請求項1から4までのいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの生体分子種がペプチド、タンパク質、ポリペプチド、酵素、抗体、タンパク質−DNA複合体、化学成分を含むタンパク質複合体、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 生体分子種がポリペプチド又はタンパク質から選択される、請求項6に記載の方法。
- ステップ(a)の少なくとも1つの生体分子種を支持体上に固定する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの結晶化リアクターをキャピラリー内に与える、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの結晶化リアクターを固体支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項1に記載の方法。
- IEFバッファーがポリマーをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ポリマーが直鎖ポリマー、分岐ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 少なくとも1つの結晶化リアクターが円筒形を有する、請求項11に記載の方法。
- 円筒形が約20μm〜約10mmの直径、及び約0.5mm〜約10mmの長さを有する、請求項13に記載の方法。
- IEFバッファーが0.2pH単位を超えないpH範囲を有する、請求項1に記載の方法。
- IEFバッファーが0.02pH単位を超えないpH範囲を有する、請求項15に記載の方法。
- ランニングバッファーの温度を0〜30℃の範囲内に維持する、請求項2に記載の方法。
- 電場を50V/cmと2000V/cmの間に維持する、請求項17に記載の方法。
- 電場をDC又はACとして供給する、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)において複数の結晶化リアクターを提供し、それぞれの結晶化リアクターがIEFバッファーを含む、請求項1から19までのいずれか一項に記載の方法。
- IEFバッファーが0.2pH単位を超えないpH範囲を有する、請求項20に記載の方法。
- IEFバッファーが0.02pH単位を超えないpH範囲を有する、請求項21に記載の方法。
- 複数の結晶化リアクター中のIEFバッファーが互いに異なる、請求項20に記載の方法。
- 複数のIEFバッファーのpH範囲が互いに部分的に重複する、請求項23に記載の方法。
- pH範囲が重複しない、請求項23に記載の方法。
- 1つ又は複数のIEFバッファーの間のpHステップが0.1pH単位を超えない、請求項25に記載の方法。
- 1つ又は複数のIEFバッファーの間のpHステップが0.02pH単位を超えない、請求項26に記載の方法。
- 結晶化リアクターが互いに離れている、請求項20に記載の方法。
- 複数の結晶化リアクターを支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項28に記載の方法。
- 複数の結晶化リアクターを、空間的に接触可能な方法で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項29に記載の方法。
- 支持体が生体分子不透過性である、請求項29に記載の方法。
- 支持体がイオン不透過性である、請求項29に記載の方法。
- 複数の結晶化リアクターを、固定化pH勾配ストリップ、pH膜及びプレキャストゲルからなる群から選択される形態で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項29に記載の方法。
- ステップ(a)の前に少なくとも1つの生体分子種を含む溶液を選別するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 複数の生体分子を含む溶液を選別し少なくとも1つの生体分子種を急速に結晶化するための方法であって、
(a)複数の生体分子を含む媒体を提供するステップと、
(b)支持体上の複数の生体分子を選別し、それによって少なくとも1つの生体分子種を含む支持体上に少なくとも1つの位置を得るステップと、
(c)少なくとも1つの位置を含む部分を前記支持体から回収するステップと、
(d)少なくとも1つの生体分子のpIを含むpH範囲を有するIEFバッファーを含む、少なくとも1つの結晶化リアクターを提供するステップと、
(e)(c)の部分と少なくとも1つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
(f)少なくとも1つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも1つの結晶化リアクター内に、前記少なくとも1つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
(g)(f)の前記少なくとも1つの結晶化リアクター内で少なくとも1つの結晶を得るステップと
を含む上記方法。 - 等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)技術を含めた薄層クロマトグラフィー、及びゲル電気泳動からなる群から選択される方法によってステップ(b)を行う、請求項35に記載の方法。
- 前記方法を非変性条件下で行う、請求項36に記載の方法。
- ステップ(b)中の選別が少なくとも1つの生体分子種の質量によるものである、請求項35に記載の方法。
- ステップ(e)が前記部分及び少なくとも1つの結晶化リアクターをランニングバッファー中に置くステップをさらに含む、請求項35に記載の方法。
- ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 少なくとも1つの生体分子種がタンパク質又はポリペプチドから選択される、請求項35から40までのいずれか一項に記載の方法。
- 結晶を24時間以内、好ましくは12時間未満以内に得る、請求項35から41までのいずれか一項に記載の方法。
- IEFバッファーがポリマーを含む、請求項35から42までのいずれか一項に記載の方法。
- pH範囲が0.2pH単位を超えない、請求項35に記載の方法。
- ランニングバッファーの温度を0〜30℃の範囲内に維持する、請求項35に記載の方法。
- 電場が50V/cmと2000V/cmの間である、請求項45に記載の方法。
- 電場をDC又はACとして供給する、請求項35に記載の方法。
- ステップ(b)中の支持体がゲルである、請求項35に記載の方法。
- ステップ(b)中の支持体がポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、ニトロセルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項35に記載の方法。
- ステップ(d)において複数のIEFバッファーを含む複数の結晶化リアクターを提供し、それぞれのIEFバッファーがpH範囲を確定し、少なくとも1つのIEFバッファーが少なくとも1つの生体分子のpIを含むpH範囲を確定する、請求項35に記載の方法。
- pH範囲が0.2pH単位を超えない、請求項50に記載の方法。
- 狭いpH範囲が0.02pH単位を超えない、請求項51に記載の方法。
- 複数のIEFバッファーがポリマーを含む、請求項50に記載の方法。
- 複数のIEFバッファーが部分的に重複するpH範囲を有する、請求項53に記載の方法。
- 複数のIEFバッファーが重複しないpH範囲を有する、請求項53に記載の方法。
- 複数の結晶化リアクターが互いに離れている、請求項50に記載の方法。
- 複数の結晶化リアクターを支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項56に記載の方法。
- 複数の結晶化リアクターを、空間的に接触可能な方法で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項57に記載の方法。
- 支持体が生体分子不透過性である、請求項57に記載の方法。
- 支持体がイオン不透過性である、請求項57に記載の方法。
- 複数の結晶化リアクターを、固定化pH勾配ストリップ、pH膜及びプレキャストゲルからなる群から選択される形態で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項57に記載の方法。
- 1つ又は複数のIEFバッファー間のpHステップが0.1pH単位を超えない、請求項50に記載の方法。
- 1つ又は複数のIEFバッファー間のpHステップが0.02pH単位を超えない、請求項62に記載の方法。
- 生体分子結晶の急速な形成を誘導するのに適した装置であって、
(a)上側及び下側を有するバッファー室であって、バッファー室が流体を保持することができる少なくとも1つのバッファー区画を囲うように下側が底部で封じられているバッファー室と、
(b)少なくとも1つの結晶化リアクターであって、前記少なくとも1つの結晶化リアクターがIEFバッファーを含み、前記少なくとも1つの結晶化リアクターがバッファー室内に含まれる少なくとも1つの結晶化リアクターと、
(c)電場を生成させるためのデバイスと、場合によって、
(d)少なくとも1つのバッファー区画内に含まれる流体を循環させるための手段と
を含む上記装置。 - 成分(b)が上側及び下側の2つの端部を有するホルダーであり、前記ホルダーが少なくとも1つの結晶化リアクターを含み、前記少なくとも1つの結晶化リアクターがIEFバッファーを含み、前記ホルダーがバッファー区画内に含まれる、請求項64に記載の装置。
- 2つの端部を有する2つの塩橋をさらに含み、それぞれの塩橋の1つの端部がホルダーの1つの端部と接触しており、それぞれの塩橋の1つの端部が少なくとも1つのバッファー室内に含まれる、請求項64に記載の装置。
- 2つのバッファー室を含み、それぞれのバッファー室が1つの塩橋の1つの端部を囲う、請求項66に記載の装置。
- ホルダーが少なくとも1つの結晶化リアクターを含むように適合させたキャピラリーである、請求項65に記載の装置。
- 少なくとも1つの結晶化リアクターにおいて温度を管理することができる温度制御モジュールをさらに含む、請求項64に記載の装置。
- 成分(b)が少なくとも1つの結晶化リアクターを含む支持体を支持するように適合させたホルダーを含む、請求項64に記載の装置。
- ホルダーが少なくとも1つの空洞を含み、前記少なくとも1つの空洞を結晶化リアクターを含むように適合させた、請求項65に記載の装置。
- ホルダーが、それぞれの空洞が結晶化リアクターを含むように適合させた複数の空洞を有する、請求項71に記載の装置。
- 空洞中の1つの結晶化リアクターの温度が、他の空洞中の他の結晶化リアクターの温度と異なる、請求項72に記載の装置。
- バッファー室が非導電性物質を含む、請求項64に記載の装置。
- ホルダーが、結晶化リアクター内に含まれるポリマーの抵抗より大きな抵抗を有する物質を含む、請求項65に記載の装置。
- 非導電性物質が、ポリ−N−メチルメタクリルアミド、アクリル、ルサイト、ポリスチレン、セラミック、ガラス及びポリ−メチル−メタクリレートからなる群から選択される、請求項75に記載の装置。
- ホルダーが生体分子に対して不透過性である材料を含む、請求項70に記載の装置。
- 顕微鏡下での少なくとも1つの結晶化リアクターの検出用にさらに適合させた、請求項64に記載の装置。
- 電場を生成させるためのデバイスが複数の電極を含む、請求項64に記載の装置。
- 複数の電極が、白金、チタン、クロム、金、タンタル、パラジウム、酸化パラジウム、ゲルマニウム、ニッケル及びロジウム又はこれらを含む合金からなる群から選択される金属を含む、請求項79に記載の装置。
- 電場を生成させるためのデバイスがDC又はAC電流を供給する、請求項64に記載の装置。
- バッファー区画が、ランニングバッファー及び前記ランニングバッファーによって溶解した少なくとも1つの生体分子を含む溶液を保持するように適合された、請求項64に記載の装置。
- 小型化された、請求項64に記載の装置。
- さらに自動化された、請求項83に記載の装置。
- 生体分子が、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、酵素、抗体、タンパク質−DNA複合体、化学成分を含むタンパク質複合体、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブからなる群から選択される、請求項64に記載の装置。
- 生体分子がタンパク質である、請求項85に記載の装置。
- 結晶化が24時間以内、好ましくは12時間未満以内に起こる、請求項64に記載の装置。
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