JPH06321700A

JPH06321700A - 結晶成長方法および装置

Info

Publication number: JPH06321700A
Application number: JP11592293A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Harada; 義則原田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1993-05-18
Filing date: 1993-05-18
Publication date: 1994-11-22

Abstract

(57)【要約】【目的】蛋白質、核酸あるいはこれらを主たる構成要
素とする生体高分子化合物の結晶化において微小な結晶
核の移動と結晶化溶液内の対流を防止し、結晶成長の核
となる微小結晶の過剰生成防止と少数の結晶の等方的成
長を促進すること。【構成】結晶化すべき物質を溶解した緩衝液５に、ア
クリルアミド、アガロース、或いは、テトラメトキシシ
ラン等を添加し、結晶化すべき物質をゲル中に固定化し
た後、冷却、加熱、或いは、ゲル中に含ませた沈殿剤６
の拡散等で、目的とする物質をゲル中において過飽和状
態にしてゲル中で結晶化させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】生体における諸々の反応は、蛋白
質や核酸などの高分子物質の働きで制御されている。こ
れら生体高分子の活性や機能を原子レベルの立体構造に
基づいて理解することにより生体反応を分子のレベルで
解釈できるので、立体構造解析は疾病の原因究明、治療
や天然の生体高分子を手本とした医薬品の分子設計、生
産に多いに寄与する。

【０００２】原子レベルの立体構造を解析する手段にお
いて最も強力なものはＸ線結晶構造解析法であるが、本
解析法を適用するためには、解析対象物質を結晶化し、
各辺の寸法が０．１〜１ｍｍ程度の大きさの単結晶を得
なければならない。生体高分子は一般的に結晶化が困難
であり、また、たとえ結晶化しても微小結晶、或いはア
モルファス結晶しか得られないことが多くＸ線構造解析
に適さない。

【０００３】本発明はＸ線結晶構造解析の他、分子、及
び結晶の物性解析を行うための分析に適した大きなサイ
ズの生体高分子の結晶を効率的に得る結晶化方法及び装
置を提供する。

【０００４】

【従来の技術】物質の溶媒からの結晶化はなんらかの方
法により溶質を過飽和状態にすることで達成される。特
に生体高分子の場合、Ｘ線結晶構造解析に適した結晶を
得ることは困難で（１）結晶核が生成しにくい、（２）
結晶核が成長しにくい、（３）単結晶になりにくい等の
性質がある。

【０００５】結晶化法は大別して外的物理条件を徐々に
変化させる方法と結晶化溶液内の化学的組成を変化させ
る方法がある。これまで溶質である生体高分子の溶解度
を下げるために様々な方法が提案されてきている。具体
的には（１）濃縮法、（２）温度勾配法、（３）静置バ
ッチ法、（４）透析法、（５）透析拡散法、（６）蒸気
拡散法、（７）自由界面拡散法（生化学実験講座、
１、日本生化学会編、東京化学同人、pp.9 - 17 （１
９７６）)などが開発されている。しかし、依然として
結晶化が極めて困難な物質が多く、構造解析研究、引い
ては生体高分子が関与する生理現象の研究の進行上の大
きなネックとなっている。

【０００６】いずれの結晶化方法においても、結晶成長
に伴う結晶近傍の密度の減少とそれにより生ずる対流、
或いは温度勾配による溶媒の密度分布の不均一性に由来
する対流が、結晶の等方的な成長を妨げている可能性が
指摘されている。そこで溶液中に生じた密度分布の不均
一性による対流が生じない微小重力環境下での結晶化に
よる拡散律速結晶化が構造解析に適した結晶を得る上で
有効であると推測され、検討されている（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４６，ｐｐ．６５１−６５４（１９８
９））。

【０００７】しかし、一般的に長時間、微小重力状態を
持続するためには宇宙空間での作業が必要であり、実験
機会を得ることは甚だ困難である。一方、結晶母液内の
対流を最小限に抑えるために、ゲル中で結晶成長させる
ことが試みられてきており、リゾチームなど結晶性の良
い蛋白質については一定の成功を収めてきた(C. R. Aca
d. Sci. Paris, t. 305, Serie II, pp.847-850 (198
7))。しかし、一般に結晶成長に要する時間は数日か
ら、数週間かかり、たとえゲル中とはいえ、その期間内
にわたり対流を完璧に抑えることはできない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】蛋白質、核酸あるいは
これらを主たる構成要素とする生体高分子化合物は本質
的に結晶化しにくく、また、たとえ結晶化したとしても
微小結晶であったり、アモルファス結晶であったりし
て、構造解析に適さない結晶である場合が多い。その大
きな原因の一つに結晶成長に伴って生ずる結晶母液内の
対流があると考えられている。即ち、対流による結晶
核、ゴミ等の散逸、生じた微結晶の非等方的成長が大き
な短結晶の成長を妨げている原因と考えられている。

【０００９】本発明はこれらの悪影響を最大限に低減し
て、通常の地上実験では生成が困難な結晶を成長させた
り、非等法的結晶成長性を示す結晶を等方的に成長させ
るためのものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】図１に示す通り、静置バ
ッチ法にて結晶を成長させる場合、通常の底のある容器
１内で結晶成長させると、成長に伴い結晶２近傍の溶液
内の溶質が結晶表面に析出することで局所的に結晶化母
液３の密度が減少する。一般に、結晶の比重は結晶化母
液より大きいので結晶は沈降し、容器の底面に接触す
る。その結果、結晶近傍において対流４が生ずる。この
対流により横方向から溶質が供給され続ける結果、本
来、等方的に成長する晶癖を持つ結晶でも等方的に成長
せずに扁平となる場合が多い。

【００１１】また、米国ＮＡＳＡによるスペースシャト
ルでの実験によれば、微小重力条件下で雪の結晶成長を
行わせると地上で通常見られる針状結晶ではなく等方的
に成長した雪の結晶が得られるという。これは結晶成長
の過程において空気の撹拌が起こらず、気中の飽和水蒸
気が自由拡散しつつ結晶核に等方的に吸着したためと考
えられている。

【００１２】これらの例のように、構造解析に適する等
方的に成長した結晶を得るためには結晶化条件を拡散律
速にすることが望ましい。通常の実験室にて、結晶化を
行う場合、本質的に重量の影響を除外することは出来な
い。

【００１３】しかし、結晶化すべき物質を溶解した緩衝
液に、アクリルアミド、アガロース、或いは、テトラメ
トキシシラン等を添加し、結晶化すべき物質をゲル中に
固定化した後、冷却、加熱、或いは、沈殿剤の添加等
で、目的とする物質をゲル中において過飽和状態にして
ゲル中で結晶化させることができる。この場合、ゲルの
篩効果により、微結晶の沈降が妨げられたり、結晶核と
なりうる微小なチリなどの拡散を防止できることで微小
な結晶の過剰生成を防止できるので、地上にても結晶化
母液内における対流の影響をある程度除去できたことに
なる（Ｊ．ＣｒｙｓｔａｌＧｒｏｗｔｈ，９０，ｐ
ｐ．３５８−３６７（１９８８））。

【００１４】しかし、ゲルの網目をくぐり抜ける溶媒、
溶質分子に起因する結晶化母液内の密度分布の不均一性
に依存する対流は依然として残る。そこでさらに、これ
らを格納する結晶化容器全体を対流をキャンセルする方
向に連続的に或いは、間歇的に回転させることで対流の
影響を最小限に抑えることが出来る。その結果、等方的
に成長した高品質の大きな単結晶を得ることが可能とな
る。

【００１５】

【作用】結晶化溶液内での対流の速度は小さいので、結
晶化の途中で結晶化容器を連続的、或いは間歇的に上下
方向を逆転させ、対流を最小限に抑えることができる。
本発明では特に、ゲル中で結晶成長させるために、結晶
化容器を回転装置に装填し、回転させても結晶化母液内
での溶液の乱れは殆ど生じない。その結果、結晶成長を
擬似的に拡散律速にすることが出来るため、結晶の等方
的成長が期待できる。また、ゲル中で、結晶成長させる
場合、不純物や、一旦生成した結晶が、機械的刺激で、
破砕し、生じた微結晶が、あらたな結晶の成長核となる
可能性も低減できる。その結果、同じ量の試料を使って
も、少数の大きな結晶を得ることが可能となる。

【００１６】

【実施例】

実施例１本発明の一実施例を図２により説明する。蓋１０で密封
できる容器１に蛋白質の沈殿剤、例えば８％の塩化ナト
リウム、及び０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ４．７）
を含む８％アクリルアミドゲル６を入れ、次いで０．１
モルのリン緩衝液のみを含む５％アクリルアミドゲル７
を重層した上に１．３％の卵白リゾチーム、及び０．１
モルのリン緩衝液を含む５％アクリルアミドゲル５を乗
せる。さらに、０．１モルのリン緩衝液を含む５％アク
リルアミドゲル７と８％の塩化ナトリウム、及び０．１
モルのリン酸緩衝液をむ８％アクリルアミドゲル６を重
層して、沈殿剤ゲル、緩衝液ゲル、蛋白質ゲル、緩衝液
ゲル、沈殿剤ゲルのサンドイッチ構造を作り、容器を密
封する。

【００１７】ゲルを充填した容器全体を恒温、例えば、
４℃、或いは、３０℃に保ちながら、連続的、或いは間
歇的に容器の上下方向を変換する。蛋白質分子の拡散速
度８は沈殿剤分子の拡散速度９より約１桁は小さいので
結晶化は蛋白質を含むゲル５の内部で起こる。数日の
後、結晶がゲル５中に生成するので、これをゲルより取
り出すか、或いはゲルに包埋したまま分析に供する。

【００１８】本実施例において緩衝液のみを含むゲル層
７の存在は必須ではなく、省略することも可能である。

【００１９】ゲルの調製方法としては緩衝液、沈殿剤、
或いは蛋白質を含む、テトラメチルシラン単量体、或い
はアクリルアミドの単量体溶液を重合させてゲル化する
方法の他、前もってゲルを調製しておき、これを緩衝
液、沈殿剤、或いは蛋白質溶液に浸漬することでこれら
を含むゲルを調製することが出来る。アガロースゲルの
場合には融解したゲルに緩衝液、沈殿剤、或いは蛋白質
を添加する、或いは緩衝液、沈殿剤、ないしは蛋白質溶
液に粉末のゲルを添加した後、加熱融解し、冷却するこ
とで緩衝液、沈殿剤、或いは蛋白質を含むゲルを調製す
る。

【００２０】熱変性し易い蛋白質の場合には低融点アガ
ロースゲルを使用する。緩衝液、及び沈殿剤のみを含む
ゲルのゲル濃度に関しては特に制約は無いが、蛋白質を
含むゲルに関しては結晶に対し、強い応力が働かないよ
うにするためにゲル濃度はなるべく低いこと、即ちアク
リルアミドゲルならば６％以下、アガロースゲルならば
１％以下が望ましい。

【００２１】実施例２本発明の他の実施例を図３により説明する。蓋１０で密
封できる容器１に蛋白質の沈殿剤、例えば３モルの硫酸
アンモニウムを含む８％アクリルアミドゲル６を入れ、
次いで蛋白質混合物試料からゲル電気泳動法にて分離精
製し、ゲル板より切り出したチトクロームｃ１％を含む
ゲル断片５を重層する。さらにこの上部に、沈殿剤を含
むゲル、或いは、沈殿剤溶液１１そのものを乗せ、蓋１
０をする。この容器全体を恒温、例えば、４℃に保ちな
がら、連続的、或いは間歇的に容器の上下方向を変換す
る。蛋白質分子の拡散速度は沈殿剤分子の拡散速度より
約１桁は小さいので結晶化は蛋白質を含むゲル５の内部
で起こる。数日の後、結晶がゲル５中に生成するので、
これをゲルより取り出すか、或いはゲルに包埋したまま
分析に供する。

【００２２】本実施例では混合物からの分離に使用した
ゲルの中から蛋白質を抽出精製すること無しに直接結晶
化に使用できる。ゲルの上部に乗せる沈殿剤がゲル状で
はない場合には、蛋白質を含むゲル５は容器の上下方向
の変換のたびに、沈殿剤溶液１１の中を動き回ることに
なるがゲル内部における結晶化には影響ない。数日の
後、結晶がゲル５中に生成するので、これをゲルより取
り出すか、或いはゲルに包埋したまま分析に供する。

【００２３】実施例３本発明の他の実施例を図４により説明する。本装置は、
実施例１或いは実施例２で示した結晶化容器を装着する
回転台１２、設定温度が可変の恒温槽１３、及び、回転
台の回転速度、恒温槽の温度を制御する装置１４からな
る。実施例１、或いは実施例２と同様に、調製したゲ
ル、或いは溶液を充填した結晶化容器１を回転台１２に
装着する。ここで回転台１２は重力に対し垂直方向に設
けらているので、図２、図３で説明したように、沈殿剤
ゲル６、緩衝液ゲル７、蛋白質ゲル５、緩衝液ゲル６、
沈殿剤ゲル７のサンドイッチ構造は、回転台１２の回転
に応じて上下が反転させられるものとなる。ゲル、或い
は溶液内の物質移動に大きな影響を与えないために回転
装置１２の回転速度あるいは間歇的な回転は制御装置１
４により制御される。また、制御装置１４は装置全体の
温度を一定に保つことも、さらに予め設定したスケジュ
ール通り温度を変化させることも可能である。

【００２４】ゲル、及びゲルに含まれる溶媒、溶質にか
かる向心力を最も低減し、回転に伴う新たな溶媒の流れ
を防止するためには結晶化容器を回転軸上に並べること
が有効である。また本実施例では１つの回転軸上に８つ
の結晶化容器を配置する構成を示したが、本発明は任意
の個数について有効である。さらに本実施例では結晶母
液内の密度分布の不均一性に起因する対流の極小化が可
能なので、実施例１、２で述べた拡散法による結晶化法
の他、濃縮法、温度勾配法、ハンギングドロップ法、透
析法、透析拡散法、蒸気拡散法等のこれまで適用されて
来た結晶化法の内、容器を逆さにした状態で流出する程
度の結晶化母液量を用いる静置バッチ法以外のすべての
結晶化法に適用可能である。

【００２５】

【発明の効果】物質の結晶化において等方的結晶成長に
阻害的に働く結晶母液内の対流は無重力空間では抑えら
れる。一般に微小重力環境を設定するためには、航空
機、ロケット等の弾道飛行、落下塔、宇宙空間利用等の
方法がある。ところが蛋白質等の結晶化に要する時間は
長い（数日〜数週）ので、良質の蛋白質結晶の成長には
宇宙空間利用が最も適当である。しかし、微小重力状態
を持続できる宇宙空間の利用には多大の経費がかかる。
これに対し、本発明によれば、簡便に擬似微小重力環境
が設定できるので、安価な良質の結晶成長が可能とな
る。

【００２６】さらにゲルの篩効果により一旦出来た結晶
が機械的衝撃等で破壊されて生じた微結晶、或いは溶媒
中のチリ等の移動が抑えられる結果、これらを核として
多数の二次的結晶が生成するおそれは小さくなり、少数
の核のより大きな寸法の結晶成長が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】結晶の近傍に生じ、結晶の等方的成長を阻害す
る対流を説明する図。

【図２】ゲル中結晶化容器の構造と物質移動を示す図。

【図３】蛋白質を含有するゲルを内部に保持したゲル中
結晶化容器の構造図。

【図４】ゲル中結晶化容器を回転させる結晶成長装置の
構造図。

【符号の説明】

１：結晶化容器、２：結晶、３：結晶化母液、４：結晶
化母液内に生ずる対流、５：蛋白質を含有するゲル、
６：沈殿剤を含有するゲル、７：緩衝液のみを含むゲ
ル、８：蛋白質の拡散方向を示す矢印、９：沈殿剤の拡
散方向を示す矢印、１０：結晶化容器の蓋、１１：沈殿
剤溶液、１２：結晶化容器回転装置、１３：恒温槽、１
４回転数、温度制御装置。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】結晶化容器内に沈殿剤ゲルと、結晶化すべ
き蛋白質、核酸、或いはこれらを主たる構成要素とする
化合物を含むゲルと沈殿剤ゲルとよりなるサンドイッチ
構造を形成し所定の周期で結晶化容器の上下を反転させ
てゲル中で結晶成長させることを特徴とする結晶化方
法。
【請求項２】ゲル間に緩衝液ゲルがはさまれたことを特
徴とする請求項１記載の結晶化方法。
【請求項３】結晶化容器内に沈殿剤ゲル、蛋白質混合物
試料からゲル電気泳動法にて分離された結晶化すべき蛋
白質を含むゲル断片５および沈殿剤を含むゲル或いは沈
殿剤溶液１１よりなるサンドイッチ構造を形成し所定の
周期で上下を反転させてゲル中で結晶成長させることを
特徴とする結晶化方法。
【請求項４】結晶化すべき蛋白質、核酸、或いはこれら
を主たる構成要素とする化合物をゲル状態で収納した結
晶化容器、前記結晶化容器を装着した重力に対しほぼ垂
直に設けられ回転可能な回転板、前記回転板の回転を制
御する制御装置よりなることを特徴とする結晶化装置。
【請求項５】前記回転板を連続的、或いは間歇的に回転
させることを特徴とする請求項４記載の結晶化装置。