CN102639716A

CN102639716A - 使用二维cDNA文库的基因表达解析方法

Info

Publication number: CN102639716A
Application number: CN2010800547494A
Authority: CN
Inventors: 白井正敬; 神原秀记; 谷口妃代美
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2010-11-29
Publication date: 2012-08-15
Also published as: US20170283796A1; JP5415560B2; JP2014027955A; US11214796B2; JPWO2011068088A1; WO2011068088A1; JP2016052320A; CN106701739A; US20120245053A1; JP5878154B2

Abstract

本发明提供用于取出每1个细胞并解析、同时在保存组织的二维信息的形态下定量监视各种基因的表达量的方法和/或手段。具体而言，本发明提供在保持活体组织内的二维细胞分布信息的形态下，由mRNA制备cDNA文库、以1个细胞水平的位置分辨能力获得任意的或作为对象的所有位置的基因表达量的方法。更具体而言，在保持活体组织内的二维细胞分布信息的形态下，由mRNA制备薄片状的cDNA文库，将其重复，用于基因表达的检测步骤，从而能够高精度地对多个基因计测表达分布。

Description

使用二维cDNA文库的基因表达解析方法

技术领域

本发明涉及基因表达解析方法。具体而言，涉及由样品所含的核酸制备cDNA文库、解析样品中的基因表达谱的方法。

背景技术

在基因表达解析中使用如下方法：由细胞群之中取出mRNA，制备互补链cDNA，利用聚合酶链反应（PCR）等扩增该拷贝数后，使用DNA探针阵列（DNA芯片），在对应的探针位置捕获靶标，检测荧光。但是，使用PCR扩增、DNA芯片的方法定量分析精度低，期待一种精度高的基因表达谱分析方法。随着人类基因组解析的完成，定量研究基因表达的要求越来越强烈，最近则期待由1个细胞提取mRNA并进行定量分析的方法。定量性好的分析方法是定量PCR，其为如下的方法：准备具有与靶标相同的DNA序列的标准试样，在相同条件下进行PCR扩增，通过荧光探针监视扩增的进行情况并进行比较，从而进行定量分析。就靶标而言，在1个细胞的情况下，存在的mRNA数量原本就少，难以进行定量分析。此外，为了进行多个基因表达的定量分析，需要将试样分开，分别独立地进行定量分析。当作为对象的基因数量众多、含有表达量少的基因的情况下，还存在由于分开试样而无法测定的情况。

在这样的状况下，发明人等考虑了如下的方法：制备将全部mRNA转变成cDNA并将其保持在珠子上的cDNA文库（含有全部cDNA的cDNA集合体），并用于定量分析（专利文献1）。在此，通过重复利用cDNA文库，可以去除试样分开所致的微量表达基因的计测误差，能够准确计测1个细胞中所含的多个基因的表达量。但是，对于活体组织而言，现状是只存在由多个细胞取出mRNA并解析的技术。保持活体组织的二维形状的形态下的基因表达解析，是使用荧光探针监视1或2个左右的mRNA来进行的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007－319028号公报

发明内容

发明要解决的问题

对再生医疗、使用基因的诊断、或生命现象的基本理解而言，不仅重视组织的平均的基因表达量，而且重视对构成组织的每1个细胞中的基因的表达进行定量分析。为此，希望取出每1个细胞进行解析同时在保持组织的二维信息的形态下定量监视各种基因的表达量，但现状却是没有较好的方法。在对象基因为1或2个的情况下，能够利用使用了荧光探针的标记观测组织中的基因表达，但不可能观察多个基因的表达量。通常认为，理想的是，在形成二维或三维的结构体的活体组织中，若能在1个细胞水平下在保持细胞的位置信息的形态下计测活动的基因（mRNA），则能够详细地获知包括细胞间的相互作用在内的活体内发生的各种现象，对生命科学领域、尤其是医疗或药物开发领域影响较大。

这样就要求由多个细胞的平均的信息获得1个细胞的信息，掌握生命活动，进而并非仅对1个细胞而是对多个细胞群中每1个细胞进行分析。

解决问题的手段

本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果开发了一种方法，其在保持活体组织内的二维细胞分布信息的形态下，由mRNA制备cDNA文库，以1个细胞水平的位置分辨能力，对任意的或作为对象的所有位置的基因表达量进行分析。即，发现通过制备对应于二维地扩展的组织内的各细胞或细胞的部位的cDNA文库薄片，并将其用于基因表达解析，能够解决上述问题。

具体而言，本发明包含以下的（1）～（27）。

（1）一种基因表达谱的解析方法，其特征在于，包括：

（a）使样品中的待测核酸与二维地分布且固定在支持体上的核酸探针杂交的步骤，

（b）合成具有与待测核酸的序列互补的序列的cDNA，在该支持体上制备二维cDNA文库的步骤，

（c）使用二维cDNA文库，检测样品中的基因表达的步骤。

（2）根据（1）所述的方法，样品含有多个细胞，对每个细胞解析基因表达谱。

（3）根据（1）或（2）所述的方法，样品含有多个细胞，解析每个细胞的基因表达谱，比较细胞间的基因表达谱。

（4）根据（1）～（3）中任意一项所述的方法，样品为活体组织样品，在保存构成活体组织样品的细胞的二维位置信息的状态下，制备二维cDNA文库。

（5）根据（1）～（3）中任意一项所述的方法，样品为活体组织样品，在保存构成活体组织样品的细胞的内部的二维位置信息的状态下，制备二维cDNA文库。

（6）根据（4）或（5）所述的方法，活体组织样品为组织切片样品，通过使该组织切片样品中的待测核酸移动到支持体，使其与核酸探针杂交。

（7）根据（6）所述的方法，待测核酸向支持体的移动是通过电泳进行的。

（8）根据（1）～（7）中任意一项所述的方法，样品为二维地保持有各个细胞的阵列。

（9）根据（1）～（8）中任意一项所述的方法，待测核酸选自由信使RNA（mRNA）、非编码RNA（ncRNA）和DNA、以及它们的片段组成的组。

（10）根据（9）所述的方法，待测核酸为mRNA，核酸探针为含有多聚T序列的DNA探针。

（11）根据（1）～（10）中任意一项所述的方法，支持体为选自薄片、膜、凝胶薄膜、毛细管板和珠子组成的组中的至少1种。

（12）根据（1）～（11）中任意一项所述的方法，支持体具有二维地划分而成的多个微细空间。

（13）根据（12）所述的方法，微细空间的间隔比细胞的尺寸更小。

（14）根据（12）或（13）所述的方法，二维cDNA文库是cDNA被保持在支持体的二维地划分而成的多个微细空间中的文库。

（15）根据（1）～（14）中任意一项所述的方法，还包含如下步骤：使保持在二维cDNA文库中的cDNA移动至第2支持体，并使其与二维地分布且固定在第2支持体上的、具有与该cDNA或其片段互补的序列的核酸探针杂交，从而制备第2二维cDNA文库。

（16）根据（1）～（15）中任意一项所述的方法，还包含如下步骤：生成与保持在二维cDNA文库中的cDNA对应的核酸片段，在保持有二维cDNA文库的二维位置信息的状态下，使该核酸片段移动至第2支持体，从而制备第2二维cDNA文库。

（17）根据（16）所述的方法，与cDNA对应的核酸片段含有cDNA的互补序列。

（18）根据（16）所述的方法，与cDNA对应的核酸片段含有cDNA的互补序列和与cDNA的序列没有关联的已知序列。

（19）根据（1）～（18）中任意一项所述的方法，使对检测对象的基因为特异性的标记核酸探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，基于其标记检测基因表达。

（20）根据（19）所述的方法，标记为荧光标记或化学发光标记。

（21）根据（1）～（18）中任意一项所述的方法，使对检测对象的基因为特异性的核酸探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，进行该核酸探针中所含的核酸序列的扩增反应，基于其扩增产物检测基因表达。

（22）根据（21）所述的方法，扩增反应为聚合酶链反应（PCR）。

（23）根据（1）～（18）中任意一项所述的方法，使对检测对象的基因为特异性的核酸锁式探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，通过连接反应使已杂交的锁式探针形成环状的探针，以该环状探针为模板，进行滚环扩增（RCA）反应，基于其扩增产物检测基因表达。

（24）根据（21）～（23）中任意一项所述的方法，利用荧光或化学发光检测扩增产物。

（25）根据（1）～（24）中任意一项所述的方法，重复使用二维cDNA文库，进行基因表达的检测步骤。

（26）根据（1）～（25）中任意一项所述的方法，还包含如下步骤：比较二维cDNA文库的基因表达的检测结果和样品的二维位置信息，获得样品中的特定的位置和基因表达的相关数据。

（27）一种分子谱的解析方法，其特征在于，其为样品中所含的分子谱的解析方法，包括：

（a）使样品中的待测分子与二维地分布且固定在支持体上的抗体或适体结合的步骤，

（b）利用邻位连接法，形成对待测分子和抗体的结合或者待测分子和适体的结合为特异性的环探针的步骤，

（c）使用上述环探针或以环探针为模板而生成的核酸片段，制备二维cDNA文库的步骤，

（d）使用二维cDNA文库，检测样品中的分子的存在的步骤。

（28）根据（27）所述的方法，分子为蛋白质。

发明效果

本发明提供一种基因表达谱的解析方法。本发明的方法可以将样品中的基因的表达与其二维位置信息一起进行解析。此外，就本发明的方法而言，可以将样品中表达的基因全部转变成cDNA而制成cDNA文库，因此能够简单且高效地进行基因表达的检测。因此，本发明在细胞功能解析、活体组织的解析、疾病诊断、药物开发等领域中是有用的。尤其是，通过将本发明用于累积至今的病理切片等，可以进行各种疾病的阐明、诊断方法的建立、或药物开发等。

附图说明

图1是在细孔阵列薄片中制备二维cDNA文库的方法的概略图。

图2是cDNA文库的制备中使用的反应槽的一个例子。

图3是滚环扩增（RCA）反应的概略。

图4表示靶标序列（序列号1）的一个例子。

图5表示锁式探针的序列（序列号2）的一个例子。

图6表示共通DNA探针I的序列（序列号3）的一个例子。

图7表示共通DNA探针II的序列（序列号4）的一个例子。

图8是用于进行化学发光测定的反应槽的一个例子。

图9是用于进行化学发光测定的光学系统的一个例子。

图10是用于进行化学发光测定的共聚焦光学系统的一个例子。

图11是由组织切片样品制备cDNA文库的方法的一个例子。

图12是用于进行荧光测定的光学系统的一个例子。

图13是用于进行荧光测定的光学系统的其它例子。

图14是用于进行荧光测定的反应槽和光学系统的一个例子。

图15表示在使环探针移动至其它检测用凝胶膜进行RCA反应时的、细孔阵列薄片和凝胶膜的剖面。

图16是进行荧光测定时的滚环扩增（RCA）反应的概略。

图17是用于进行荧光测定的基于瞬逝激发的光学系统的一个例子。

图18是在膜中制备cDNA文库的方法的一个例子。

图19是在珠子上制备cDNA文库的方法的一个例子。

图20是在珠子上制备cDNA文库的方法其它例子。

图21是为检测cDNA文库中的靶标cDNA而使用的探针设计的一个例子。

图22是用于通过电位计测来测定基因表达的方法的一个例子。

图23是用于利用邻位连接法将检测对象的分子固定在cDNA文库中进行定量的方法的一个例子。

图24是对基因表达进行荧光检测时的流程图。

图25是对基因表达进行化学发光检测时的流程图。

图26表示进行荧光测定时的荧光像的例子和获得的数据例子。

膜膜膜具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。本申请要求2009年12月4日提出的日本专利申请第2009-276883号的优先权，包括上述专利申请的说明书和/或附图所记载的内容。

本发明涉及的基因表达谱的解析方法包括以下步骤：

（b）合成具有与待测核酸的序列互补的序列的cDNA、在该支持体上制备二维cDNA文库的步骤，

（c）使用二维cDNA文库，检测样品中的基因表达的步骤。

本发明中，“基因表达谱的解析”是指对样品（细胞、组织切片等）中的基因的表达进行定量分析、对样品中的基因的表达分布进行分析、获得样品中的特定的位置和基因表达量的相关数据。

就样品而言，只要是来自于欲解析基因表达谱的活体的样品即可，没有特别限定，可以使用细胞样品、组织样品、液体样品等任意样品。具体而言，可以列举出由1个细胞构成的样品、含有多个细胞的样品、组织切片样品、二维地保持有多个的各个细胞的阵列形态的样品等。

此外，作为样品来源的活体也没有特别限定，可以使用来自于脊椎动物（例如哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类、两栖类等）、无脊椎动物（例如昆虫、线虫、甲壳类等）、原生生物、植物、真菌、细菌、病毒等任意活体的样品。

就本发明的方法而言，可以是例如样品含有多个细胞，对每个细胞解析基因表达谱。此外，可以是例如样品含有多个细胞，解析每个细胞的基因表达谱，比较细胞间的基因表达谱。

就本发明的方法而言，优选的是，例如样品为活体组织样品，在保存构成活体组织样品的细胞的二维位置信息的状态下，制备二维cDNA文库。或者优选样品为活体组织样品，在保存构成活体组织样品的细胞的内部的二维位置信息的状态下，制备二维cDNA文库。作为活体组织样品，可以使用组织切片样品，通过使该组织切片样品中的待测核酸移动到支持体，使其与核酸探针杂交。该待测核酸向支持体的移动可以通过例如电泳来进行。

在本发明的方法中，作为待测核酸，可以使用信使RNA（mRNA）、非编码RNA（ncRNA）和DNA、以及它们的片段。例如、可以通过本技术领域中公知的方法提取样品中所含的核酸而制备待测核酸。例如，使用蛋白酶K之类的蛋白水解酶、硫氰酸胍·盐酸胍这些离液序列高的（CHAOTROPIC）盐、Tween和SDS这些表面活性剂、或市售的细胞溶解用试剂溶解细胞，使其中所含的核酸即DNA和RNA溶出。使用mRNA作为待测核酸时，可以在上述通过细胞溶解而溶出的核酸中，通过DNA分解酶（DNase）分解DNA，获得仅含RNA作为核酸的试样。

此外，使用的核酸探针只要是能够与这些待测核酸杂交并捕捉这些待测核酸的探针即可，没有特别限定，对本领域技术人员而言是公知的。例如，当待测核酸为mRNA时，优选使用含有多聚T序列的DNA探针作为核酸探针。含有多聚T序列的DNA探针、即寡聚（dT）可以通过常规方法合成，寡聚(dT)的聚合度只要是能够与mRNA的聚A序列杂交、能够将mRNA捕捉到固定有寡聚(dT)的支持体的聚合度即可。

支持体只要是在cDNA文库的制备中以本技术领域中通常使用的材料制备而成的即可，没有特别限定，例如为薄片、膜、凝胶薄膜、毛细管板、珠子、薄膜等。作为其材料，可以列举出例如金、银、铜、铝、钨、钼、铬、铂、钛、镍等金属；不锈钢、耐蚀耐热镍基合金（Hastelloy）、镍铬铁耐热耐蚀合金（inconel）、蒙乃尔合金、硬铝（duralumin）等合金；硅；玻璃、石英玻璃、熔融石英、合成石英、氧化铝、蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石和感光性玻璃等玻璃材料；聚酯树脂、聚苯乙烯、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、ABS树脂（丙烯腈-苯乙烯-丁二烯树脂）、尼龙、丙烯酸树脂、氟树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、甲基戊烯树脂、酚树脂、密胺树脂、环氧树脂和氯乙烯树脂等塑料；琼脂糖、葡聚糖、纤维素、聚乙烯醇、硝基纤维素、几丁质、壳聚糖。例如使用薄片作为支持体时，可以由例如氧化铝、玻璃等制备薄片。此外，使用凝胶薄膜作为支持体时，例如可以使用丙烯酰胺凝胶、明胶、修饰聚乙二醇、修饰聚乙烯吡咯烷酮、水凝胶等制备凝胶薄膜。使用膜作为支持体时，例如可以使用醋酸纤维素、硝基纤维素或这些的混合膜、尼龙膜等。使用珠子作为支持体时，可以由树脂材料（聚苯乙烯等）、氧化物（玻璃等）、金属（铁等）、琼脂糖凝胶、和这些的组合等制备珠子。

在此，为了能够在保持二维位置信息的状态下在二维cDNA文库中保持cDNA，优选支持体具有二维地划分而成的多个微细空间。例如，通过在薄片、凝胶薄膜、毛细管板上设置细孔或在如槽等划分而成的空间中铺设珠子，从而能够设定这样的多个微细空间。这样的支持体中的微细空间的间隔优选比细胞的尺寸更小。

核酸探针向支持体的固定可以通过本技术领域中公知的任意方法进行。例如，可以利用共价键、离子键、物理吸附、生物学结合（例如生物素与亲和素或链霉亲和素的结合、抗原和抗体的结合等），将核酸探针固定在支持体的表面、细孔内部、膜的纤维等上。此外还可以介由间隔序列将核酸探针固定在支持体上。

介由共价键进行的核酸探针向支持体的固定，例如可以通过向核酸探针导入官能团且在支持体表面导入与该官能团具有反应性的官能团、使两者反应而实施。例如，可以在核酸探针中导入氨基，在支持体中导入活性酯基、环氧基、醛基、碳二亚胺基、异硫氰酸酯基或异氰酸酯基，从而形成共价键。此外，还可以在核酸探针中导入巯基，在支持体中导入活性酯基、马来酰亚胺基或二硫基。作为在支持体的表面导入官能团的方法之一，可以列举出通过具有期望官能团的硅烷偶联剂处理支持体的方法。作为偶联剂的例子，可以使用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、N-β-(氨基乙基)-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-β-(氨基乙基)-β-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷等。作为在支持体中导入成为结合部位的官能团的其它方法，可以列举出等离子体处理。此外，作为通过物理吸附将核酸探针固定在支持体上的方法，可以列举出利用核酸探针的电荷使其静电结合到用聚阳离子（聚赖氨酸、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺等）进行了表面处理的支持体上的方法等。

另外，为了避免其它物质（核酸、蛋白质等）吸附到支持体上，优选对支持体进行表面涂布。

为了使使样品中的待测核酸与固定在支持体上的核酸探针杂交，如上所述地提取样品中的待测核酸，使其与支持体接触。此时，例如还可以使用如下方法：利用核酸的负电性，对含有待测核酸的样品和支持体施加电场，通过电泳使待测核酸移动到固定在支持体上的核酸探针附近。

杂交反应可以通过在样品中孵育固定有核酸探针的支持体和含有待测核酸的样品而实施。优选该用于杂交的孵育在温度70℃下在平稳的搅拌下进行5分钟左右，然后以0.1℃/秒左右缓慢地将温度降低至室温。此外，优选在杂交反应后由支持体洗涤并除去非结合成分。

使待测核酸和核酸探针杂交后，合成具有与待测核酸或其部分序列互补的序列的cDNA。该互补链合成可以通过本技术领域公知的方法进行。例如，在待测核酸为mRNA或ncRNA时，例如可以使用逆转录酶通过逆转录反应合成cDNA。此外，在待测核酸为DNA时，例如可以使用聚合酶通过复制反应合成cDNA。合成反应之后，使用例如RNase分解除去待测核酸。其结果是，在支持体上构建了由与待测核酸对应的cDNA构成的二维cDNA文库。就制备的二维cDNA文库而言，优选的是cDNA保持在支持体的二维地划分而成的多个微细空间中。

cDNA合成之后，通过对二维cDNA文库（支持体）实施洗涤、除去的操作，可以除去残留试剂、例如细胞溶解试剂和DNA分解酶，可以不妨碍此后基因表达的检测步骤的实施。

此外，任选地，通过使上述那样制备的二维cDNA文库中含有的cDNA移动、或通过生成与二维cDNA文库中含有的cDNA对应的核酸片段，可以将原二维cDNA文库中含有的cDNA的信息转移至其它二维cDNA文库。

例如，作为使保持在二维cDNA文库中的cDNA移动至第2支持体的方法，可以使具有与该cDNA或其片段互补的序列的核酸探针二维地分布、固定到第2支持体上，使固定在该第2支持体的核酸探针和保持在原二维cDNA文库中的cDNA杂交，从而制备第2二维cDNA文库。

此外，例如在生成与二维cDNA文库中所含的cDNA对应的核酸片段的情况下，可以：生成含有该cDNA的互补序列的核酸片段；或与对该cDNA为特异性的核酸探针杂交并将该核酸探针用作核酸片段；或生成含有cDNA的互补序列和与cDNA的序列没有关联的已知序列的核酸片段。在保持二维cDNA文库的二维位置信息的状态下，使如此生成的核酸片段移动至第2支持体，制备第2二维cDNA文库。

如上述那样制备的二维cDNA文库（也包括第2二维cDNA文库）可以在各操作后进行洗涤从而重复使用，可以使用相同的二维cDNA文库进行多次后述的基因表达的检测步骤。

接着，使用如上述那样制备的二维cDNA文库（也包括第2二维cDNA文库）检测样品中的基因表达。在本发明中，“检测”包含有无基因表达的检测、和其表达量的定量检测这两方面。

作为用于检测基因表达的1个方法，存在如下方法：使对检测对象的基因为特异性的标记核酸探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，基于其标记检测基因表达。就这样的检测中使用的核酸探针而言，本领域技术人员可以适当设计。此外，使用的标记也可以使用本技术领域公知的任意的标记，可以列举例如荧光标记（Cy3、异硫氰酸荧光素（FITC）、异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）等）、化学发光标记（荧光素等）、酶标记（过氧化酶、β－半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等）、放射性标记（氚、碘¹²⁵等）。

此外，作为其它的方法，存在如下方法：使对检测对象的基因为特异性的核酸探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，对该核酸探针中所含的核酸序列进行扩增反应，基于其扩增产物检测基因表达。作为这样的扩增反应，可以使用本技术领域公知的任意方法，可以列举例如聚合酶链反应（PCR）、滚环扩增（RCA）反应、依赖核酸序列的扩增（Nucleic Acid Sequence-BasedAmplification，NASBA）法和环介导等温扩增法（Loop-Mediated IsothermalAmplification，LAMP）法。此外，本领域技术人员可以根据采用的扩增反应适当设计所使用的核酸探针。例如，进行滚环扩增（RCA）反应作为作为扩增反应时，可以使对检测对象的基因为特异性的核酸锁式探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，通过连接反应使已杂交的锁式探针形成环状的探针，以该环状探针为模板，进行RCA反应，基于其扩增产物检测基因表达。此外，上述扩增反应还可以包含在cDNA末端导入重复序列的程序。

这样的扩增产物可以通过本技术领域公知的任意方法来检测。例如，可以给扩增反应中使用的底物（碱基）添加标记，基于其标记检测扩增产物。或者，通过使用能够与获得的扩增产物特异性结合的标记核酸探针，基于结合了的核酸探针的标记检测扩增产物。使用的标记与上述相同。

基于标记的检测可以使用本技术领域公知的方法和仪器来进行。例如，荧光标记和化学发光标记可以使用适当的光激发器进行激发，使用对放出的荧光进行计数的光学系统、荧光显微镜、酶标仪等进行检测和定量。此外，使用酶标记时，加入由于酶作用而分解、显色的底物，通过光学方式对底物的分解量进行测定，从而检测和定量。使用放射性标记时，通过闪烁计数器等测定放射性标记发出的放射线量。在本发明的方法中，可以利用荧光或化学发光，对获得的光信号的发出位置进行计数，从而对基因的表达进行定量分析。此外，作为具体例子，可以基于来自于1个待测核酸的cDNA，如上所述地进行扩增反应，将获得的扩增产物导入或固定于1μ以下的微细的反应槽中，对荧光或化学发光的发光点进行计数，从而对基因的表达进行定量分析。

此外，作为其它的基因表达检测方法，还可以使用如下方法：使对检测对象的基因为特异性的核酸探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，接着仅使该核酸探针与固定在电极上的、对该核酸探针为特异性的第2核酸探针杂交，计测基于该杂交的电极的电位变化。

在本发明中，通过比较如上述那样获得的二维cDNA文库中的基因表达的检测结果和样品的二维位置信息，还能够获得样品中的特定的位置和基因表达的相关数据。这样的样品的二维位置信息为例如细胞样品或组织切片样品的显微镜像、通过其它标记法获得的荧光像或化学发光像等。

此外，本发明的样品中所含的分子谱的解析方法，包括以下步骤：

（d）使用二维cDNA文库，检测样品中的分子的存在的步骤。

代替上述的使样品中的待测核酸与核酸探针杂交，该方法使样品中的待测分子与能够和该待测分子特异性结合的配体（抗体或适体等）结合，通过邻位连接法形成环探针，从而制备二维cDNA文库。在本发明中，作为检测对象的分子可以列举出蛋白质、肽核酸、高分子（聚合物）、低分子等任意的分子。由于是利用特异性结合捕捉到支持体上，因此优选存在着特异性结合的配体的待测分子。例如，可以选择蛋白质作为待测分子，选择抗体或适体作为特异性结合的配体。

使用邻位连接法制备二维cDNA文库的细节将在实施例8中说明。

上述的本发明的方法，可以对活体组织内全部细胞，将表达的基因或分子转变成cDNA，在保持细胞位于组织内的位置信息的状态下，二维地制备cDNA文库。因此，可以获知关注的任意位置中的基因表达或所有位置中的基因表达，能够使组织之中基因信息如何扩展等迄今无法获得的各种信息可视化。进而，将组织切片而制成切片样品，对各切片制备二维cDNA文库，研究基因表达，从而还能够获得基因表达的三维分布信息。这些均与此前的针对少量基因的荧光检测法不同，能够简便且高效地获得非常众多的基因的信息。此外，还能够期待基于利用本发明获得的基因表达谱的解析结果，获得基因信息流向、刺激对组织的影响等众多的新信息。

实施例

以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。但以下实施例并不限定本发明。

［实施例1]

本实施例是如下的例子：在细孔阵列薄片中，由薄片状的细胞群，在保持其中所含的mRNA的位置信息的形态下，构建二维cDNA文库薄片并使用。以下将二维状地形成了多个细孔的薄片称为细孔阵列薄片，将在其上形成了cDNA文库的薄片称为cDNA文库薄片。该方法的一个例子的概念图如图1所示。

该方法由下述程序构成：在保存细胞位置信息的状态下的mRNA的提取和捕获至薄片内部的DNA探针的程序（图1的(a)）；在薄片内部利用逆转录制备cDNA文库的程序（图1的(b)）；然后作为随着该程序的基因表达的计测方法的一个例子，使两端杂交到靶标cDNA的形状的DNA探针（锁式探针）杂交到靶标cDNA，使用连接反应制备环状的DNA探针（称为环探针），从而识别靶标cDNA的存在的程序（图1的(c)）；与环探针杂交，通过互补链合成而扩增与环探针互补的序列，制备特定的序列串联地连接的DNA的DNA扩增程序（称为RCA（Rolling Circle Amplification））（图1的(d)）；使具有与串联地连接的DNA互补的部分序列的荧光探针进行杂交，计测荧光的程序，尤其是通过计测发光的斑点进行基因的计数定量的程序（图1的(e)）。

首先，作为用于制备cDNA文库的细孔阵列薄片，使用对氧化铝进行阳极氧化而得的细孔阵列薄片。这里，对使用了孔径为200nm、厚度为60μm、直径为25mm的薄片1的例子进行说明，但细孔阵列的薄片的形状并非限定于此。就这样的薄片而言，可以通过阳极氧化而自己制作，也可以获得孔径为20nm～200nm的薄片的市售品。此外，作为细孔阵列薄片，还可以使用由多孔玻璃构成的整个薄片（monolith sheet）、将毛细管捆扎切断而得的毛细管板、尼龙膜、或凝胶薄膜等。形成于薄片1中的细孔2贯通了薄片1的厚度方向，细孔彼此完全独立。其表面为亲水性，蛋白质对表面的吸附极少，可以高效进行酶反应。首先，对细孔阵列薄片的表面进行硅烷偶联处理，将DNA探针7固定在细孔表面。被固定的探针以平均30～100nm²中为一个的比例固定在表面，因此在1个孔中固定有4～10×10⁶个DNA探针。接着，为了防止表面吸附，用表面涂布剂涂布表面。该表面涂布可以与探针固定同时进行。作为探针，使用的是含有25mer以上的多聚T序列的DNA探针。该探针密度为能够100％捕获通过该空间的mRNA的DNA探针密度。

接着，由细胞群提取mRNA，在细孔阵列薄片中制备cDNA文库。如图1的(a)所示那样，将含有用于破坏细胞膜的裂解液（例如表面活性剂）的凝胶设置在细孔阵列薄片的上部。这里，3为样品的细胞群（细胞薄片），4为含有裂解液的凝胶。接着，使细胞薄片的上部与含有电解质的溶液接触。当然也可以是细胞直接接触电解质，但也可以通过凝胶等使其接触。另一方面，细胞薄片的下部也通过细孔而与含有电解质的溶液接触，使得能够对细胞薄片的上下方向外加电场。带负电的mRNA5通过细孔6并向下部电泳，在细孔6中被DNA探针7捕获。如图1的(a)的8所示那样在细孔6中捕获mRNA后，除掉样品（细胞薄片）3和凝胶薄片4，较好的方式是，使用由于温度而发生相变的凝胶即低融点琼脂糖凝胶作为凝胶材料，通过升高温度将其洗去，来进行该操作。

接着，以被细孔中的DNA探针7捕获的mRNA8为模板合成cDNA9。该操作通过用含有逆转录酶和合成底物的溶液填满细孔部6并缓慢升温至50℃进行50分钟左右互补链合成反应而实施。反应完成后，使RNase通过细孔6而流入，将mRNA8分解除去。接着，使含有碱变性剂的液体和洗涤液通过细孔6流入，除去残存物和分解物。通过至此为止的程序，在细孔6内构建了反映了组织样品中的细胞位置的、如图1的(b)所示的cDNA文库。

予以说明，每1个细胞的mRNA数量为约10⁶个，将细胞的尺寸模拟为直径10μm的圆形时，每1个细胞所使用的细孔数量为2500左右。即，当1个细胞中表达的mRNA数量为1000拷贝以下时，平均1个细孔内能够为1拷贝的cDNA。多于上述时，对于同一mRNA种类而言，在1个细孔中将生成多个拷贝的cDNA。当减小细孔的尺寸时，还能够使每1个细孔中各种mRNA为1拷贝以下。（此外，处理每1个细胞，当增大每1个细胞的cDNA文库制备区域时，还能够使每1个细胞为1拷贝以下）。各细孔中平均生成400个各种cDNA。当然，通过分解并计测1个细胞所对应的平均2500个细孔中哪个细孔中固定有mRNA、逆转录成cDNA，从而还能够计测细胞内的mRNA分布。

接着，计测生成的cDNA9。例如，可以利用滚环扩增（RCA），对作为靶标的cDNA的每个种类制作探针10，将其依次导入细孔6中，通过荧光检测或化学发光检测进行计测。在本实施例中，公开了使用滚环扩增（RCA）和化学发光检测的例子。作为其它方法，还可以使用聚合酶链反应（PCR）、依赖核酸序列的扩增法（NASBA）和环介导等温扩增法（LAMP）等扩增方法。将使用RCA的情形制成流程图示于图24和图25中。图24为荧光检测的情形，图25为化学发光检测的情形。

如图24所示，在进行荧光检测时，包括如下方法：使环探针从cDNA文库薄片移入其它检测薄片，然后进行RCA扩增，进行检测、定量的方法；不进行RCA扩增而检测荧光的方法；以及使用cDNA文库薄片直接检测、定量的方法。此时，包括进行RCA扩增的方法和不进行RCA扩增的方法。

另一方面，在检测化学发光时，如图25所示，包括如下方法：使环探针从cDNA文库薄片移入到检测薄片，进行RCA扩增反应，通过化学发光检测此时生成的焦磷酸的方法；在cDNA文库薄片内部进行RCA扩增反应并计测发光的方法，该方法包括锁式探针通过特异性的连接而获得环探针、然后进行RCA扩增反应的方法，以及使环探针直接与cDNA特异性杂交进行RCA扩增反应的方法。

准备两端杂交到各cDNA（靶标）而形成环的DNA探针。在本说明书中，将该DNA探针称为锁式探针，形成环后称为环探针。在本实施例中，该探针设计成全长为110个碱基，杂交到每个欲测定基因（靶标）的部分的序列不同，但内部具有20个碱基左右的2个共通序列（共通序列I和II）。首先，将与1号靶标基因对应的DNA探针10装入细孔6中，使其与靶标cDNA杂交。溶液中含有连接酶（ligase），杂交后的探针为环状（称为环探针）（参照图1的(c)））。升温使连接酶失活，同时使环探针由靶标cDNA9游离。使游离了的环探针10通过电泳或送液移动至在细孔内固定了与共通序列I的部分杂交的共通探针I的其它细孔阵列薄片（也称为“检测用细孔阵列薄片”），通过使其与固定在检测用细孔阵列薄片内的共通DNA探针I杂交而捕捉环探针10。

本实施例中，制备cDNA文库后，使用了对欲测定的基因（靶标）为特异性的DNA探针（锁式探针），但当在cDNA文库薄片中进行RCA扩增时，也可以不使用锁式探针，而是从最初开始使用环状的探针，省略连接的过程，进行RCA扩增。

此外，本实施例中，为了个别地对捕获至细孔中的DNA产生的信号计测化学发光，作为检测用的细孔阵列薄片，使用的是对Si进行阳极氧化而得的吸收可见光的材料制成的细孔阵列薄片。

接着，将含有具有与共通序列II相同的序列的共通DNA探针II、链取代型的DNA聚合酶、DNA合成反应底物和含有使将焦磷酸变换成ATP的试剂、ATP和荧光素反应得到化学发光的试剂的反应液，在4℃下流入细孔。接着，洗掉存在于细孔内部以外的酶，用在15℃以下为溶液、在25℃以上无流动性的凝胶即Mebiol凝胶（Mebiol Inc.）包覆薄片的两面。由此，在抑制来自薄片以外的部分的背景发光的同时，防止注入的酶流至细孔外部。当设定为最适合DNA互补链合成的温度37℃时，与靶标cDNA杂交了的DNA探针I开始DNA互补链伸长。即使绕环一周，也由于链取代活性而不断生成重复序列。图3的(a)中示意出2个共通序列I和II与cDNA杂交的部分被重复扩增的情形。这里，图3中的3′末端的箭头所示的部分为与环探针杂交的部分。这是RCA的第1步骤。最初，探针II不存在应杂交的DNA链，不发生DNA互补链伸长反应，当探针I的DNA链伸长进行的情况下，互补的序列被该互补链制作出来，因此与其杂交，开始互补链伸长。如图3的(b)所示，探针II在最初伸长的DNA互补链的多个位置开始伸长，在相对地为5′末端侧杂交的探针所延伸的伸长链，被在更靠近3′末端侧杂交并开始伸长的互补链逐渐剥离。完全剥离为单链的互补链被固定在附近的探针I捕获，通过互补链伸长生成双链。其结果是形成如图3的(c)所示的状态。实际上这样的过程平行地重复发生。这是RCA的第2步骤。予以说明，在本实施例中从互补链合成的最初就加入了探针II，但也可以首先使用探针I进行RCA，制备长DNA合成链后加入上述试剂，使用探针II进行互补链合成，接着进行化学发光反应。

反应约45分钟时，由约110碱基构成的靶标序列增加至约1000倍。另一方面，以探针I为起点生成的DNA链上杂交约1000个探针II，进行互补链合成，这些反应所形成的DNA拷贝数为约500000拷贝左右。该状态的薄片的剖面图如图1的(d)所示。该反应中生成的焦磷酸分子的数量为10⁸个以上。当底物充分时，使用了这些焦磷酸的ATP生成反应和发光反应能够获得每秒10⁸个发光。即使考虑受光效率和检测的量子效率等，也是能够用致冷型CCD相机等充分检测的量。

另一方面，为了进行荧光计测，使用固定在细孔内的探针I进行RCA互补链伸长后，将带有荧光标记的探针II（荧光探针）导入细孔内，与RCA产物杂交，进行荧光计测。带有荧光探针的状态如图1的(e)所示。

此外，这里，作为进行RCA的检测用细孔阵列薄片和在细孔内制备cDNA的cDNA文库薄片，使用了不同的薄片，使用cDNA文库薄片制备的环探针转移至检测用的细孔阵列薄片（检测用细孔阵列薄片）后进行RCA，这是为了在重复使用cDNA文库薄片时使前次测定中使用的试剂、探针类不妨碍计测。当然，也可以在形成了cDNA文库的薄片的细孔内部进行所有的反应和计测。

接着，对向cDNA文库薄片的细孔内部固定DNA探针的方法进行详细说明。薄片内部的细孔的表面必须是高密度固定有聚T DNA探针且同时不吸附mRNA、环探针等核酸以及连接酶和聚合酶等蛋白质的表面。本实施例中，将用于固定DNA的硅烷偶联剂和防止吸附的硅烷化MPC聚合物（2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱聚合物），以适当比例同时通过共价键固定在细孔表面，实现DNA的高密度固定以及稳定抑制核酸、蛋白质的吸附。实际中，首先将氧化铝制的多孔性薄片1在乙醇溶液中浸渍3分钟后，进行5分钟UVO3处理，用超纯水洗涤3次。接着，在含有3mg/ml的平均分子量为9700（聚合度40）的硅烷化MPC聚合物MPC_0.8-MPTMSi_0.2（MPC:2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱（2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine）/MPTMSi:3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（3-Methacryloxypropyl trimethoxysilane））（参考文献1：Biomaterials（《生物材料》）2009,30,4930-4938，参考文献2：Lab Chip 2007,7,199-206）和0.3mg/ml的硅烷偶联剂GTMSi（GTMSi：3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane）、信越化学）、和作为酸催化剂的0.02％醋酸的80％乙醇溶液中浸渍2小时。用乙醇洗涤后，在氮气氛围中干燥，在烘箱中于120℃加热处理30分钟。接着，为了固定DNA，在薄片上滴加500μL含有1μM的聚T DNA探针（Oligo(dT)₃₀VN）、7.5％甘油和0.15M NaCl的0.05M硼酸缓冲液（pH8.5），在加湿室内于25℃反应2小时。最后，封闭未反应的缩水甘油基，为了除去过量的DNA探针，用足够量的含有10mM Lys、0.01％SDS和0.15M NaCl的硼酸缓冲液（pH 8.5）洗涤5分钟，除去该洗涤液后，用含有0.01％SDS和0.3M NaCl的30mM柠檬酸钠缓冲液（2xSSC,pH7.0）在60℃下洗涤，除去过量的DNA。由此，完成了DNA探针的固定和表面处理。

以下以细胞阵列为例进行说明，使用组织切片样品时也是同样的。以实际测定时的看家基因GAPDH（GenBank登录号NM_002046）为例进行说明。将100万个左右以下的细胞样品装入管中，加入500μL的1×PBS，不损伤细胞地吸取·吐出溶液进行洗涤，然后尽量不残留PBS地弃去溶液，加入50μL冷却至4℃的1×PBS。将该样品在薄片1上排列成阵列状。具体而言，在具有0.1μm细孔的60μm厚的薄片上，通过表面处理以30微米间隔设置带正电的20μm直径的区域。由于细胞表面带负电，因此当使细胞流至该表面时，以25μm间隔被捕获至表面。捕获中利用的薄片面积是直径为25mm的圆形，因此能够捕获约100万个细胞。实际使细胞流入进行捕获时，60％左右的位置能够捕获各一个细胞。

图2是用于捕获细胞的反应槽的一个例子。通过使用反应槽，能够将细胞3一个一个地固定在直径25mm的薄片1上，用溶液填满细孔6的内部。为了使薄片周围填满溶液，在薄片1的周边部分设置聚丙烯制的保护环212，在其上下设置厚度为1mm的间隔物209，用在上下的内侧由溅射形成了电极的上盖201和下盖202夹住这些，形成用于填满反应溶液的上部反应区域203和下部反应区域204。使用固定夹具210和螺钉211，用以固定间隔物209和上下的盖201和202。从入口205注入缓冲液，由上部排出口206和下部排出口207排出，用溶液填满内部。接着，从细胞流路（入口205），边振荡反应槽边使细胞群流入反应槽内。细胞被带正电的部分捕获，当然也可以使用进入1个细胞那样的容器来捕获细胞。接着，使用在由于温度而在凝胶状态和液体状态间发生相变的低融点琼脂糖凝胶（SeaPrep Agarose；2％时，凝胶化温度为19℃，融点为45℃）中混合有裂解液试剂的溶液，在固定了薄片上的细胞位置的状态下破坏细胞膜和细胞组织，提取mRNA。

将250μL的4％低融点琼脂糖凝胶SeaPrep Agarose（Cambrex Bio ScienceRockland,Inc.制造）溶液、495μL的溶菌液（TaqMan MicroRNA Cell-to-CT Kit;Applied Biosystems Inc.）和5μL的DNase I在40℃下充分混合。接着，将薄片1的温度设定为4℃，除去反应区域203和204的溶液后，从入口205注入上述裂解液溶液。确认薄片上的溶液发生凝胶化，将薄片温度升至20℃，反应8分钟后，在凝胶上添加50μL终止液（使DNase失活的溶液），反应5分钟，冷却至4℃。接着，加入0.5mL含有分子量为60万、0.03％的PEO（聚氧乙烯）和分子量100万、0.03％的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、0.1％Tween 20的10mM的Tris缓冲液（pH 8.0）。此时，将上部电极201和下部电极202间的距离设为2mm，薄片上部和下部的空隙（反应区域203,204）被前述Tris缓冲液完全填满。在维持薄片和溶液温度为4℃的状态下，将上部电极201作为阴极（GND）、下部电极202作为阳极，施加＋0.8V共2分钟，使带负电荷的mRNA由细胞内部向204的方向电泳。

该过程中，大分部mRNA被固定在薄片中的细孔内的寡dT DNA探针捕捉。但是，一部分mRNA由于2次结构而未被捕捉，移动至薄片下部的缓冲液中（204）中。为了使mRNA完全被寡dT DNA探针捕捉，将薄片1和溶液的温度提高至70℃，保持5分钟后，边每1分钟反转一次施加于下部电极202的电压的极性边以－0.1℃/sec冷却至4℃（最初施加－0.8V共1分钟，然后按照＋0.8V→－0.8V的方式每分钟重复施加10次）。接着，从入口205导入上述tris缓冲液，从排出口206排出，由此边交换薄片1上部的区域203中的溶液，边将溶液和薄片1的温度升高到35℃，溶解琼脂糖凝胶，洗涤并除去非必要的细胞组织和琼脂糖。进而，将585μL的含有0.1％Tween20的10mM的Tris缓冲液（pH=8.0）、40μL的10mM dNTP、225μL的5xRT缓冲液（SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA合成系统（SUPERSCRIPT III Cell DirectcDNA Synthesis System））、40μL的0.1M DTT、40μL的RNaseOUT（SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA合成系统）和40μL的Superscript III（逆转录酶：SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA合成系统）混和，由排出口206和207排出填满薄片1的溶液，立即由入口205注入含有逆转录酶的上述溶液。然后，将溶液和薄片1升温至50℃保持50分钟，从而完成逆转录反应。然后，在85℃保持1.5分钟，使逆转录酶失活，冷却至4℃后，由入口205注入10mL的含有RNase的含0.1％Tween20的10mM Tris缓冲液（pH=8.0），从排出口206和207排出，由此分解RNA，同样流入等量的碱变性剂，除去并洗涤细孔内的残存物和分解物，构建了cDNA文库。

这里，每1个细胞使用约1万个细孔来制备cDNA文库。细孔相对于每1个细胞的总表面积为约0.7mm²。每100nm²固定了1个以上DNA探针，因此探针总数为约7×10⁹个，对捕获每1个细胞中的mRNA（总数10⁶左右）而言为足够的量。由于核酸容易吸附在细孔内的表面，如上所述使用MCP聚合物作为表面涂布剂包覆细孔表面，以防吸附。

由以上操作，获得来自于1个细胞的cDNA被固定在多个细孔的表面的cDNA文库。这可以说是应称为1个细胞cDNA文库薄片的文库，与迄今为止的由多个细胞获得的平均化的cDNA文库截然不同。

由这样获得的cDNA文库薄片，对各种基因，定量计测各个基因的表达量。由于每1个细胞存在1万个细孔，因此每1个细孔的cDNA个数平均为100个。对于1种cDNA，当每1个细胞的cDNA拷贝数为1万个以下时，每1个细孔平均为1个以下。为了检测该基因，使用与每种cDNA特异性杂交的探针。

检测方法包括利用化学发光或荧光的方法，这里对利用化学发光的方法进行说明。作为扩增靶标cDNA的目标序列部分的方法，包括例如聚合酶链反应（PCR）或滚环扩增（RCA）反应。这里，使用扩增率稳定的滚环扩增。靶标序列的1例如图4（序列号1）所示。与该靶标部分杂交的DNA探针（锁式探针）如图5（序列号2）所示。该锁式探针由与靶标杂交的特异序列部分和由约22个碱基构成的2个共通序列部分构成。本实施例中，全长为110个碱基。DNA探针制成如下形状：两端与靶标杂交，通过修复酶连接酶，末端彼此结合而生成环状的DNA（环探针）。使DNA探针流入细孔，使DNA探针（锁式探针）与靶标杂交，通过连接获得环状的DNA（环探针）。

具体而言，将10μL的2μM锁式探针、100μL的10x Ampligase缓冲液（Ampligase DNA Ligase试剂盒（Ampligase DNA Ligase Kits）;EPICENTREBiotechnologies公司）、100μL的Ampligase（Ampligase DNA Ligase试剂盒;EPICENTRE Biotechnologies公司）、250μL的BSA（10mg/mL）和540μL纯水（DW）混和，由入口注入该溶液，保持50℃反应12小时。然后升温至80℃，保持20分钟，从而使连接酶失活。

接着，将环探针转移至检测用细孔阵列薄片进行计测，在该细孔内预先固定有与环探针中的共通部分I的序列杂交的共通DNA探针I（图6；序列号3），将环探针捕捉至细孔内。接着，将具有与环探针中的另一个共通部分II相同的22个碱基的序列的共通DNA探针II（图7；序列号4）和具有链取代活性的聚合酶导入细孔内，在37℃进行45分钟RCA反应。

为了利用RCA和化学发光进行计测，在对不透明的Si进行阳极氧化而得的薄片内部固定聚T探针，与前述同样利用MPC聚合物进行涂布。与氧化铝薄片同样，设细孔的直径为0.1μm，直径为25mm，厚度为100μm。接着，如图8所示，在形成有环探针的薄片1的下方重叠配置固定了探针I的薄片801，组装反应槽。在对下盖202的内侧的电极施加＋0.4V的状态下，于95℃加热1分钟，然后以1℃/sec的速率冷却至65℃，维持10分钟。切断电压，将温度冷却至室温，除去氧化铝制的cDNA文库薄片，仅剩在探针I上杂交了环探针的薄片801，再次组装反应槽。

将100μL的

发光试剂缓冲液（0.5M Tricine,0.1M MgAc,0.1M(NH₄)₂SO₄,4mM DTT,4mM D-荧光素,0.02mM APS）、10μL的游离DNA探针II（0.1μM）、50μL的10mM dNTP、25μL的10mg/mL BSA和50μL的10U/μL

聚合酶（New England BioLabs公司），将100μL的耐热性荧光素酶（4258.1GLU/mL;Kikkoman公司）和50μL的ATP硫酰酶（30U/mL;NewEngland BioLabs公司）混合到625μL纯水(D.W.)中，由入口205注入。注入后立即边不使薄片的上下产生压力差边由排出口206和207除掉多余的试剂。接着，将冷却至4℃的

发光试剂缓冲液和Mebiol凝胶的1：9混合溶液同样地由排出口220、221以不产生压力差的方式静静地注入。反应槽保持在37℃，因此Mebiol凝胶立即发生凝胶化。然后进行20分钟RCA反应。

接着，利用如图9所示的光学系统连续进行化学发光的计测。这里，使用NA为0.8、工作距离为3.3mm的物镜901、成像镜902和致冷型CCD相机903（1000×1000像素（pixel）、像素尺寸13×13μm,量子效率0.9）。光学系统的倍率设为50倍，使焦点对准薄片下侧（接近下盖202的薄片801的）表面而获得发光像。这里，还可以使用CMOS图像传感器等其它摄像元件。此时分辨能力为0.5μm，获得几乎临界的分辨能力。1帧大小为0.26mm见方，曝光时间设为3秒，将直径25mm的计测区域分成7500个区域进行计测。由获得的7500张化学发光图像提取化学发光斑点，在上面对计测区域作图。预先由明视野像获得细胞在薄片上的位置，通过使其与化学发光斑点对合位置，可以确认每一个细胞中表达了多少分子的GAPDH。这里，制备的薄片能够重复利用，制备对需要获知表达量的基因（靶标）为特异性的锁式探针，与上述同样地进行连接反应以后的程序，从而对该靶标基因在各个细胞的基因的表达量进行计数，由此能够高精度地对其进行确认。即使RCA反应的扩增效率改变或者计测的时机变为从RCA反应开始，也由于化学发光斑点的有无是在同一画面上确定的，因此都不成为问题。化学发光斑点与mRNA的分子数直接对应，其定量误差几乎能够抑制至遵守泊松分布的测定误差。

本实施例中，使用与GAPDH（GenBank登录号NM_002046）特异性杂交的锁式探针（序列号2）进行序列特异性RCA扩增反应后，通过化学发光斑点的计数进行定量，由于cDNA保持着原来的状态，因此进行GAPDH的定量评价后，通过导入其它基因的特异性的探针并同样处理，能够测定基因表达分布、解析基因表达谱。即，通过重复利用cDNA文库，能够对所有必需种类的基因进行高精度的表达分布测定。

本实施例中，为了抑制来自薄片内以外的区域的背景发光，使用Mebiol凝胶排除薄片内部以外的部分的区域的酶，从而进行控制，在细胞数量少，计测区域狭窄的情况下，还可以不使用Mebiol凝胶，而是使用如图10所示的共聚焦光学系统来抑制背景的影响。在图10中，1001为狭缝，能够将z方向的景深控制至0.01μm以下。1002可以使用雪崩光电二极管（APD）或光电倍增管(PMT)中任意一种。

此外，光学系统还可以与图8同样地在薄片表面固定化学发光所必需的酶（荧光素酶和ATP硫酰酶），而不使用Mebiol凝胶。固定酶的方法存在多种，这里，在固定探针I的方法中，与探针I同时混合链霉亲和素进行反应。通过链霉亲和素表面的氨基和硅烷偶联剂反应而固定链霉亲和素。在该状态下，混合生物素化荧光素酶和生物素化ATP硫酰酶并在室温下反应30分钟，则完成荧光素酶和ATP硫酰酶向表面的固定。之后，若省略Mebiol凝胶的注入工序而进行RCA反应和化学发光计测，则可以与前述同样进行化学发光计测。可以使用荧光进行计测，其细节如实施例2所述。

此外，可以使用将毛细管捆扎拉伸切断而成的毛细管板来代替通过铝、硅的阳极氧化而得的薄片，而应用完全相同的方法。但是，市售的毛细管板的细孔的直径最小为1μm。因此分辨能力为1/10，在对mRNA分子计数时，每一个细胞能够计测的最大分子数为100个。这样的情况下，通过阶段性改变化学发光量的强度可以扩大定量分析范围。使用毛细管板时最佳的计测方法如下所示。就使用的毛细管板而言，使用了细孔径为6μm、形成有细孔的区域的直径为20mm、外径为25mm、厚度为1.0mm的浜松光子学公司制产品。细孔的内壁与前述同样地在硅烷偶联处理的同时进行防止吸附的表面处理，在细孔的内壁固定含有polyT序列的寡聚DNA，与膜的情况同样地制备cDNA文库薄片。此时，由于形成于毛细管板的细孔的直径大，因此缓和了分辨能力的降低，因此还可以在毛细管板的内部，在直径1μm的涂布链霉亲和素的磁珠上固定含有polyT序列的寡聚DNA，将该珠子塞进毛细管板上的细孔内部，捕捉cDNA，同样地制备cDNA文库。

［实施例2］

本实施例的概要如图11所示。这是由组织切片样品1101在细孔阵列薄片中构建二维cDNA文库薄片来使用的例子。将冻结的组织切片按照5～20μm左右的厚度利用切片机制成膜状的样品，如图11所示那样在氧化铝制的细孔阵列薄片1上放置组织切片样品1101，立即用含有裂解液的低融点琼脂糖包覆组织切片样品。琼脂糖溶液在35℃保持溶液的状态，将薄片1冷却至4℃则立即凝胶化，然后设置在如图2所示的反应槽内，与实施例1同样地提取mRNA。

使用在低融点琼脂糖凝胶（SeaPrep Agarose；2％时的凝胶化温度为19℃、融点为45℃）中混合了裂解液试剂的溶液，在薄片状的细胞切片样品中的细胞的位置固定的状态下，破坏细胞膜和细胞组织提取mRNA。这种情况下也能够进行化学发光计测，本实施例中则对荧光计测进行详细说明。

将mRNA固定在薄片内后，制备与实施例1同样地能够重复利用的cDNA文库薄片。然后，既可以用对基因（靶标）为特异性的荧光探针标记该薄片中的cDNA，洗涤后直接进行荧光计测；也可以使荧光探针与使用RCA、PCR等化学扩增法获得的扩增产物杂交后进行荧光计测。此外，既可以如实施例1所示那样移动（转移）到其它薄片后进行荧光计测，也可以进行化学扩增后测定。这里详细记载了由cDNA文库导入对基因为特异性的锁式探针、将环探针移动到其它薄片中后进行RCA扩增并计测荧光的例子。

即，在cDNA文库薄片内部进行基因特异性连接，由锁式探针制备环探针。接着，通过电泳使该环探针移动至其它薄片。这里，用于计测荧光的第2细孔阵列薄片使用的是氧化铝制的透明薄片。荧光计测通常灵敏度高，因此在RCA反应时不使用探针II，在进行RCA后将与荧光标记的探针II同样的序列导入细孔内，从而导入荧光探针，通过如图12所示的光学系统得到荧光像。使用该像对荧光斑点进行计数，从而进行mRNA分子数的计数。这里，1201为激发器，荧光体设为Cy3，因此激发器的激发波长设为532nm、输出水平设为20mW。

此外，使用与双链DNA结合发出荧光的嵌入剂(SYTOX Green、POPO 3）来代替使用带有荧光体的探针II，也能够同样地进行mRNA分子计数。

激发器输出是光束直径为1mm的准直光，利用激光扩束器1202将其放大至5倍。1203为NA是0.8、工作距离是3.6mm、焦距是3.6mm的物镜，使焦点对准薄片最下面，在倍率50倍下利用致冷型CCD相机1206得到荧光像。这里，1204是分色镜，1205是成像镜，1207是用于阻断激发光的带通滤光片。1帧的图像尺寸为0.26mm见方，曝光时间为10msec、用70秒扫描了薄片最下面整体。接着，沿着z方向仅移动1μm，按照焦点对准薄片内部的方式同样进行扫描，获得薄片整体的图像需要80分钟。面内的分辨能力为0.5μm，因此直径10μm的每1个细胞能够计数的mRNA的最大数量为约20000。此外，在分辨能力0.5μm下还能够获得细胞内的mRNA分布。

氧化铝制的折射率较大，为1.76，多晶性导致光散射较大。因此RCA反应不会以足够的效率充分发生，当对RCA产物的每1分子的荧光体数量少的分子计测荧光时，有时无法视为荧光斑点进行计测。因此，也可以不沿着z方向移动物镜的焦点位置，而是将带荧光体的RCA产物移动至薄片下面然后使焦点对准薄片最下面来拍摄，仅在xy方向扫描载物台而能够获得薄片整体的荧光像。为了移动RCA产物，可以将温度升高至80℃左右并对下盖侧的电极施加＋0.4V左右的电压，但这里，对该电极施加－0.4V，使得由上至下产生每秒10μm的压力流，从而RCA产物移动至薄片最下面附近，利用这种方式得到荧光像。

图26中示出此时得到的荧光像例子和得到的数据例子。2601表示由一次摄像CCD相机获得的图像。其中的白点2602对应于来自荧光探针与RCA反应后的DNA结合而成的分子的荧光斑点。一个一个的该点对应于细胞中的一分子mRNA，通过对该荧光斑点计数，可以对对应于特定基因的mRNA的分子数进行计数。沿着XYZ方向（2604）扫描取得这样的多个图像（2603)。该XYZ方向与图12的1210所示的XYZ方向一致。被计测的荧光斑点分别对应于XYZ坐标，Z方向为由于电泳而移动的方向，因此与cDNA文库薄片上的细胞位置对应，所以不考虑Z坐标，而是通过与事先取得的为哪个细胞中的mRNA的显微镜像对应而确定。利用这样的数据的相关，可以获得如表2605这样的数据组。

接着，在需要提高荧光斑点的分辨能力、计测细胞内的表达分布的情况下，可以使用如图13所示的光学系统。由激发器发射的光被激光扩束器1202由1mm放大至5mm，利用NA为20.9、工作距离为1mm、焦距为3.6mm的物镜1203，将激光斑点在薄片内部汇聚至1μm左右。利用同一物镜1203对位于薄片的细孔内部的荧光体（Cy3）发出的荧光进行聚光，通过分色镜1204，阻断激发光后，利用成像镜1205成像，在成像面通过直径50μm的针孔1301，构成共聚焦光学系统。光检测器1302使用了光电倍增管，也可以利用APD。这种情况下，得到了方向的光学系统的分辨能力5nm，但由于利用了10nm间距的z方向驱动机构，因此计测整体的分辨能力为10nm。XY方向的光学系统的分辨能力为0.4μm，因此使用60μm厚度时，假设细胞中最大表达量为10000，则几乎可以以光学系统的分辨能力对基因表达量进行定量。这种情况下还能够获得细胞内的核内外的mRNA分布。

在前面的记载中，由细孔阵列薄片中制备的cDNA文库，在同一薄片中进行RCA扩增，在薄片内部与荧光探针杂交并进行荧光计测，或者使环探针通过电泳移动至检测薄片后进行RCA扩增，与荧光探针杂交并进行荧光计测。还可以使环探针移动至凝胶膜来代替移动至检测薄片，而进行荧光计测。接着，对这种情况进行说明。

在细孔阵列薄片中制备cDNA文库，完成cDNA文库薄片后，制备如图14所示的、在下盖202之上形成膜状的凝胶1401并在其上密合带有细孔的cDNA文库薄片1而成的反应槽。接着，在cDNA文库薄片内，序列特异性地由锁式探针形成环探针，使环探针通过电泳移动至凝胶膜。移动了的环探针被共通探针I捕捉，注入具有与环探针杂交的序列的荧光探针后，通过电泳被诱导至凝胶膜，从而完成荧光计测准备，也可以在RCA反应后同样地添加荧光探针。下面详细记载这种情况。这里，就使用的凝胶而言，可以使用任意的凝胶材料，既可以使用例如丙烯酰胺凝胶、明胶、修饰聚乙二醇、修饰聚乙烯吡咯烷酮、修饰聚乙二醇，也可以使用其它水凝胶。但是，凝胶的材料必需是在从cDNA分离环探针而进行电泳的条件下保持凝胶状态的材料。例如，在实施例1的条件下，在95℃必需保持凝胶状态。

这里，将0.5mL的含有2％AWP（东洋合成）和10mg/mL的链霉亲和素的50mM Tricine缓冲液（pH7.5）滴加到下盖202上，以1500rpm旋转涂布后，照射含有波长302nm的紫外光（2mW/cm²）2分钟使其凝胶化。由此，形成厚度为10μm左右的含有链霉亲和素固定化位点的凝胶膜1401。再将500μL的5′末端经生物素修饰的探针I的1μM溶液按照包覆膜的方式滴加到凝胶膜1401上，边防止干燥边在室温下反应2小时，然后用足够量的缓冲液洗涤凝胶膜，从而完成与环探针杂交的探针向凝胶膜1401的固定。

将带有凝胶膜1401的下盖202安装到反应槽中，在其上密合cDNA文库薄片1，安装上盖201，然后由入口205将1mL的50mM Tricine缓冲液（pH7.5）注入反应槽内，脱气。

接着，为了在该薄片内与前述同样制备环探针，由入口205注入含有锁式探针和连接酶的试剂，在实施例1所述的条件下反应。为了使环探针通过电泳移动至凝胶膜中，在对下盖202的内侧的电极施加＋0.4V的状态下于95℃加热1分钟，然后以1℃/sec的速率冷却到65℃，维持10分钟。结果获得的凝胶膜和薄片剖面的状态模式的示于图15。1501为用于通过生物素亲和素结合来固定探针I（1502）的链霉亲和素，其与AWP聚合物通过紫外线照射引起的链霉亲和素上的伯胺和AWP聚合物上的叠氮基的反应而共价结合。因电泳而移动过来的环探针1503因与高密度固定的探针I（1502）杂交而被固定。这里，取下cDNA文库薄片，将100μL的

发光试剂缓冲液（0.5MTricine,0.1M MgAc,0.1M(NH₄)₂SO₄,4mM DTT）、10μL的5′末端磷酸化的游离DNA探针II（0.1μM）、50μL的10mM dNTP、25μL的10mg/mL BSA和50μL的10U/μL

聚合酶（New England BioLabs）混合到775μL的10mM DTT的D.W.中，由入口205注入。然后将反应槽保持在37℃，进行60分钟RCA反应。此时，RCA反应与实施例1的情况相同，但在磷酸化的探针II起始的互补链合成反应时，由于

聚合酶的链取代活性，多个互补链从由探针I伸长的DNA分离，但该链在本来环探针与探针I杂交的位置的极近处再次被探针I捕捉，起始互补链合成反应。因此，凝胶中形成由多条如下的链构成的荧光斑点：来自1分子的环探针的一条链中具有多个用于荧光探针杂交的杂交位点。RCA反应越长、探针II的浓度越高，此外探针I的浓度越低，则该荧光斑点尺寸越大。上述反应条件下，斑点直径为0.1～0.3μm。此外，由于相当比例的DNA链为双链，因此即使此后导入与探针II序列相同且固定了Cy3荧光体的荧光探针，杂交的位置（位点）也变少。为了防止由此导致的荧光强度降低，可以利用λ核酸外切酶选择性消化经磷酸化的链，将双链变成单链。即，如图16的(a)所示，由于5′末端导入了磷酸基，该被磷酸化的链被λ核酸外切酶消化而单链化，由此如图16的(b)所示，几乎所有位点均能够结合荧光探针。

接着，为了附加荧光探针，在反应槽中注入1μM与探针II序列相同且5′末端结合了荧光体（Cy3）的探针，对下盖202施加＋0.4V 5分钟后，每分钟重复三次－0.4V和＋0.4V的施加。然后将溶液交换成不含探针的50mMTricine缓冲液，对下盖施加－0.4V 10分钟，同时以1mL/min的流速使缓冲液从入口205持续流至排出口207。

荧光计测是使用图14所示的共聚焦光学系统进行的。光学系统的构成与图13相同。沿着z和xy方向扫描凝胶中而获得，与细孔阵列薄片相比，使用凝胶时折射率分布小，荧光计测时不易受到散射光的影响。

此外，荧光计测还可以使用图17所示的瞬逝激发。为了实现瞬逝激发，在厚度为2mm的用石英板制成的下盖202的中心附近形成2处直角三楞柱形的凹陷1703。波长532nm的激发光经激光扩束器1202放大至3倍后，能够经聚光镜1702聚光至凝胶膜1401和下盖202的上面的边界附近。此时，通过凹陷1703折射，激光以小于上述界面的临界角的角度入射从而进行全反射。通过全反射，仅在上述界面附近数百nm进行激发，仅位于该界面附近的荧光体被计测。

物镜1203与前述同样地使用NA为0.8、工作距离为3.3mm的物镜，通过除去激发光的散射光的带通滤光片1207和成像镜1205，使用作为拍摄元件的致冷型CCD相机1206得到荧光像。

此前的例子中通过对荧光像中的荧光斑点进行计数而进行mRNA的定量，当然也可以使荧光强度和分子数对应而进行定量。但是，利用对斑点进行计数的定量不仅是不需要标准曲线的绝对定量，而且仅设定判定分子有无的1个阈值，因此是能进行最高精度的定量。但另一方面，该方法牺牲了空间分辨能力。即使牺牲定量性也必需保证空间分辨能力的情况下，也可以利用强度和分子数的对应关系进行定量。予以说明，选择这样的利用计数进行定量或者部分使用强度计测均与实施例1的化学发光的情况相同。

此外，为了利用瞬逝激发获得荧光像，还可以使用全内角反射荧光（TotalInternal Reflection Fluorescence）专用的物镜（例如APON 60×OTIRFM（奥林巴斯））。

在本实施例的情况下，当然也能够重复利用cDNA文库薄片。此外，所有实施例中均能够同样的是，将通过本法获得的荧光像或化学发光像和由其得到的基因表达谱（基因表达分布）与事先取得的细胞的显微镜像重合，由此能够获得关于细胞的形状和基因表达之间的相关的数据。进而通过将利用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization;FISH）法得到的图像和利用本法得到的像重合，在测定了相同基因时，还可以有效利用本法的高精度定量而评价FISH法的定量性。

当然，用于进行重合的像也可以是通过其它标记法得到的荧光、化学发光像。

此外，还可以使用固定了碱性磷酸酶、过氧化酶等化学发光酶的DNA探针来代替荧光标记，然后加入化学发光底物，从而进行发光计测。

［实施例3］

本实施例并非是如实施例1或2那样利用带细孔的薄片作为cDNA文库薄片，而是利用其它膜作为支持体制备cDNA文库的例子。

作为膜，可以利用吸附蛋白质少的醋酸纤维素膜、硝基纤维素膜或它们的混合膜以及尼龙膜等。这里示出使用厚度为115μm、孔隙尺寸为0.2μm、直径为25mm的醋酸纤维素制膜（Whatman公司）的例子。

如图18所示，在膜1801内部的膜纤维1802的表面，与实施例1同样对聚T探针1803进行硅烷偶联处理而将其固定。此外，同时MPC处理也同样进行。接着，将膜设置在与实施例1或2同样的反应槽中，放置组织切片样品1101，进行与前述同样的处理，则能够在膜内保存细胞位置信息的状态下将mRNA捕获至膜内的聚T探针上。然后，同样进行逆转录反应，由此能够制备cDNA文库膜。

既可以导入基因特异性荧光探针，用如图13或图14那样的能够进行单分子计测的光学系统对其进行计数，由此测定基因表达分布，也可以在RCA、PCR等化学扩增后与前述同样进行荧光计测。

此外，也可以与实施例1和2同样地，由cDNA文库薄片移动至检测薄片（其既可以使用带细孔的薄片，也可以使用膜、凝胶膜），然后不进行RCA、PCR等化学扩增，就进行荧光计测、化学发光计测。此外，也可以在扩增后同样进行计测。

此外，不使用膜，而是使用薄片状的凝胶膜、其它多孔材料也能够进行同样的操作。

［实施例4］

本实施例是利用珠子作为支持体制备cDNA文库的例子。

该例子中，预先在面上铺设比细胞更小的珠子，在珠子表面固定聚T探针，在其上放置组织切片，与前述实施例同样进行处理。此时的cDNA文库薄片的剖面图如图19所示。石英制的板1903和其上面形成透明电极1902，在其上铺设固定了聚T探针的直径1μm的Dynabeads（商标）磁珠1901。为了使Dynabeads（商标）磁珠1901不移动，按照一定间隔设置挡块1904。在其上放置组织切片样品1101，与前述同样地破碎细胞和同时通过电泳将mRNA捕捉到珠子表面，进行逆转录得到cDNA文库薄片。就测定而言，石英板1903和透明电极1902对应于下盖202，因此能够通过石英板计测荧光。此外，还能够换成尼龙网等多孔质制材料来代替石英板，将mRNA的位置信息转移至其它薄片、膜。此外，在该例子中，珠子为1层，但也可以铺设多层珠子。此外，珠子材料既可以是聚苯乙烯等树脂材料、玻璃等（金属）氧化物、金属、琼脂糖凝胶（Sepharose）等有机物，也可以是这些的混合物。例如，这里使用了组合聚苯乙烯和铁的磁珠。

接着，也可以在如图20所示那样的收纳细胞的槽的底面铺设多个珠子并进行同样的处理。该例子中，2001为反应槽，在其底面使用了固定有聚T探针的直径为1μm的磁珠1901。1903为石英板，1902为透明电极。这些的作用与前述相同。

［实施例5］

实施例1～4中，使基因特异性的锁式探针与cDNA杂交，将基因特异性地形成的环探针转移至其它薄片、膜、凝胶中。将基因的表达分布转移至其它膜的方法并非仅有该方法。

例如还可以在通过使用逆转录酶M-MLV逆转录酶（例如SUPERSCRIPTII），由mRNA合成cDNA时，在cDNA的所有末端添加CCC序列，接着在薄片内部与识别该序列的探针杂交，将伸长反应后的适当长度的互补链转移至其它薄片，从而将全cDNA的分布信息转移至其它薄片。

通过对全部基因表达的信息进行序列解析，还能够获得分布。此时利用焦磷酸测序法还能够转变成除去了同聚物的序列。

此外，与不形成环的基因特异性的探针杂交，如图21所示在5′末端侧添加与基因信息对应的序列，从而能够在非靶标序列的序列中保持信息。图21的2101表示薄片的细孔内壁、膜的纤维。其表面预先固定有cDNA文库，2102表示单链cDNA。DNA探针2103部分序列特异性地进行杂交，序列特异性是基于2104的序列与cDNA的一部分序列互补。通过将与该序列对应的已知序列配置在例如2105，能够识别非原cDNA序列的序列并计测荧光、化学发光。此外，通过在这样的探针中导入共通序列部分，能够使引物杂交到该共通序列部分而进行扩增，因此能够降低扩增偏嗜，这与以前的实施例是同样的。进而，通过在2104的序列识别部分使用通用碱基，还能够以一个序列来代表某一组序列，使一个探针与该组基因群反应。

［实施例6］

上述实施例中使用了荧光、化学发光计测，还可以通过计测当DNA接近电极表面时产生的、电极的电位变化来对mRNA分布进行定量。尤其是通过利用FET的栅电极电位变化，能够对由cDNA文库薄片转录获得的DNA探针进行定量。通过使栅电极容量减小至fF左右，还能够对1个元电荷的栅电极附近的移动进行计测，因此能够计测1分子DNA在栅电极上的杂交。

图22示出利用了电位计测的计测机器的构成例子。1为细孔阵列薄片，设为已经形成cDNA文库。在该薄片的正下方配置有以几乎密合的形态配置有多个FET的半导体芯片2201。FET芯片2201和薄片1之间以及薄片1内部预先充满电解质溶液，此外，该溶液的电位设为受参照电极控制。芯片上形成多个FET槽2202，在槽内部形成各个源极2203、漏极2204和栅极2205。槽尺寸设为1μm。槽间形成有字元线（word line）和引线，能够通过开关用FET依次计测特定的槽的源极漏极间的电流。栅电极由宽度为50nm的多晶硅配线形成，栅极－漏极和栅极－密封层（grand）容量被设计为足够小。在栅电极上预先通过硅烷偶联剂固定了与环状探针2207特异性杂交的探针2206，栅电极电位由于杂交产生的负离子而降低，能够有效地改变源极漏极间的电流。

［实施例7］

上述实施例中详述了对mRNA的分布进行定量的方法，对于mRNA以外的非编码RNA（ncRNA）、基因组DNA也能够应用同样的方法。不同点在于，在薄片的细孔内壁、膜的纤维上固定能够将作为解析对象的序列（ncRNA、DNA等）固定的通用探针，而不是固定聚T探针。

［实施例8］

本实施例中，对核酸以外的分子（例如蛋白质或其它低分子物质）在细胞中的存在进行解析。通过在细孔内固定与细胞内的欲定量的分子特异性结合的抗体、适体，形成对欲定量的分子为特异性的环探针，与上述实施例同样地能够对细胞内的存在分布进行定量。该方法称为邻位连接法（Proximity LigationMethod）（参考文献：Malin Jarvius等人，Molecular & Cellular Proteomics（《分子细胞蛋白质组学》）6(9)p.1500,2007）。

图23中示出薄片的细孔内部的模式图。2101表示细孔的内壁或膜的纤维，对于与细胞内的欲定量的分子2301结合的抗体2302，通过将把该抗体识别为抗原的二抗2303固定在细孔壁面2101上，来进行固定，其结果是，将欲定量的分子2301固定。此外，与欲定量的分子2301形成三明治结合的另一抗体2304也与识别抗体的二抗2305结合。二抗上分别预先固定有DNA（2306和2307），欲定量的分子2301结合到抗体2302和2304上，从而使这两根单链DNA靠近。此时，在细孔内注入两条DNA探针2308和2309，使其与2306和2307杂交，通过连接反应形成环探针。形成环探针后的计测法与上述实施例相同。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请的全文，均作为参考引入本说明书中。

产业利用性

本发明提供基因表达谱的解析方法。本发明的方法能够将样品中的基因的表达与其二维位置信息一起检测出来。此外，就本发明的方法而言，能够将样品中表达的基因全部转变成cDNA制成cDNA文库，因此能够简便且高效地进行基因表达的检测。因此，本发明在细胞机能解析、活体组织的解析、疾病诊断、药物开发等领域中是有用的。

附图标记说明

1 薄片

2 细孔

3 细胞

4 含有裂解液的凝胶

5 mRNA

6 细孔

7 DNA探针

8 被捕获到细孔中的mRNA

9 cDMA

10 探针

201 上盖、上部电极

202 下盖、下部电极

203 上部反应区域

204 下部反应区域

205 入口

206 上部排出口

207 下部排出口

209 间隔物

210 固定夹具

211 螺钉

212 保护环

220 上部排出口

221 下部排出口

801 薄片

901 物镜

902 成像镜

903 致冷型CCD相机

1001 狭缝

1002 雪崩光电二极管（APD）或光电倍增管(PMT)

1101 组织切片样品

1201 激发器

1202 激光扩束器

1203 物镜

1204 分色镜

1205 成像镜

1206 致冷型CCD相机

1207 带通滤光片

1210 xyz方向

1301 针孔

1302 光检测器

1401 凝胶膜

1501 链霉亲和素

1502 探针I

1503 环探针

1701 镜

1702 聚光镜

1703 凹陷

1801 膜

1802 膜纤维

1803 探针

1901 Dynabeads磁珠

1902 透明电极

1903 板

1904 挡块

2001 反应槽

2101 薄片的细孔内壁或膜的纤维

2102 cDNA

2103 DNA探针

2104 与cDNA的部分序列互补的序列

2105 与cDNA的序列不同的已知序列

2201 半导体芯片

2202 FET槽

2203 源极

2204 漏极

2205 栅极

2206 探针

2207 环探针

2301 计测对象的分子

2302 抗体

2303 二抗

2304 抗体

2305 二抗

2306 DNA

2307 DNA

2308 DNA探针

2309 DNA探针

2601 由一次拍摄CCD相机获得的图像

2602 荧光斑点

2603 多个图像

2604 xyz方向

2605 数据组

序列表自由文字

序列号1～4：人工序列（合成DNA）

Claims

1.一种基因表达谱的解析方法，其特征在于，包括：

（c）使用二维cDNA文库，检测样品中的基因表达的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，样品含有多个细胞，对每个细胞解析基因表达谱。

3.根据权利要求1或2所述的方法，样品含有多个细胞，解析每个细胞的基因表达谱，比较细胞间的基因表达谱。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，样品为活体组织样品，在保存有构成活体组织样品的细胞的二维位置信息的状态下，制备二维cDNA文库。

5.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，样品为活体组织样品，在保存有构成活体组织样品的细胞的内部的二维位置信息的状态下，制备二维cDNA文库。

6.根据权利要求4或5所述的方法，活体组织样品为组织切片样品，通过使该组织切片样品中的待测核酸移动到支持体，使其与核酸探针杂交。

7.根据权利要求6所述的方法，待测核酸向支持体的移动是通过电泳进行的。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的方法，样品为二维地保持有各个细胞的阵列。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的方法，待测核酸选自由信使RNA（mRNA）、非编码RNA（ncRNA）和DNA、以及它们的片段组成的组。

10.根据权利要求9所述的方法，待测核酸为mRNA，核酸探针为含有多聚T序列的DNA探针。

11.根据权利要求1～10中任意一项所述的方法，支持体为选自薄片、膜、凝胶薄膜、毛细管板和珠子组成的组中的至少1种。

12.根据权利要求1～11中任意一项所述的方法，支持体具有二维地划分而成的多个微细空间。

13.根据权利要求12所述的方法，微细空间的间隔比细胞的尺寸小。

14.根据权利要求12或13所述的方法，二维cDNA文库是cDNA被保持在支持体的二维地划分而成的多个微细空间中的文库。

15.根据权利要求1～14中任意一项所述的方法，还包含如下步骤：使保持在二维cDNA文库中的cDNA或其互补链拷贝移动至第2支持体，并使其与二维地分布且固定在第2支持体上的、具有与该cDNA或其互补链拷贝片段互补的序列的核酸探针杂交，从而制备第2二维cDNA文库。

16.根据权利要求1～15中任意一项所述的方法，还包含如下步骤：生成与保持在二维cDNA文库中的cDNA对应的核酸片段，在保持有二维cDNA文库的二维位置信息的状态下，使该核酸片段移动至第2支持体，从而制备第2二维cDNA文库。

17.根据权利要求16所述的方法，与cDNA对应的核酸片段含有cDNA的互补序列。

18.根据权利要求16所述的方法，与cDNA对应的核酸片段含有cDNA的互补序列和与cDNA的序列没有关联的已知序列。

19.根据权利要求1～18中任意一项所述的方法，使对检测对象的基因为特异性的标记核酸探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，基于其标记检测基因表达。

20.根据权利要求19所述的方法，标记为荧光标记或化学发光标记。

21.根据权利要求1～18中任意一项所述的方法，使对检测对象的基因为特异性的核酸探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，进行该核酸探针中所含的核酸序列的扩增反应，基于其扩增产物检测基因表达。

22.根据权利要求21所述的方法，扩增反应为聚合酶链反应（PCR）。

23.根据权利要求1～18中任意一项所述的方法，使对检测对象的基因为特异性的核酸锁式探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，通过连接反应使已杂交的锁式探针形成环状的探针，以该环状探针为模板，进行滚环扩增（RCA）反应，基于其扩增产物检测基因表达。

24.根据权利要求21～23中任意一项所述的方法，利用荧光或化学发光检测扩增产物。

25.根据权利要求1～24中任意一项所述的方法，重复使用二维cDNA文库，进行基因表达的检测步骤。

26.根据权利要求1～25中任意一项所述的方法，还包含如下步骤：比较二维cDNA文库的基因表达的检测结果和样品的二维位置信息，获得样品中的特定的位置和基因表达的相关数据。

27.一种分子谱的解析方法，其特征在于，其为样品中所含的分子谱的解析方法，包括：

（d）使用二维cDNA文库，检测样品中的分子的存在的步骤。

28.根据权利要求27所述的方法，分子为蛋白质。