CN101208421A - 用于分析单细胞的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于单个分析目的细胞的装置，包含(a)接收目的细胞内含物的通道，其中该通道具有一个输入端和一个输出端，以及(b)接近于该通道输入端的细胞收集部位，其中(i)改变该通道的输入端以便使完整的目的细胞不能进入该通道；和(ii)该通道包含一个或多个用于分析目的细胞内含物的分析组分。在应用中，将一个细胞用于该装置，其中通过细胞收集工具将其截留。该细胞不能完整地进入该通道，但其内含物可以原位释放进入该通道的输入端。然后该内含物沿着该通道到达输出端，然后其遇到固定化试剂，从而容许细胞内含物的分析。
Description
本文所引用的全部文献和在线的信息以整体形式并入作为参考。
技术领域
本发明属于细胞分析领域，并特别地属于单细胞的分析。
背景技术
有很多方法用于细胞和组织的生物化学特征鉴定。使用例如电泳、色谱法、质谱法、微阵列等方法来分析细胞或组织的分子组成。例如，这样的分析的结果可能表明疾病状态。通常在溶解细胞来释放其内含物之后进行分析，并且其通常需要使用大量细胞，因为很难分离单细胞，也因为正常的检测方法对于测定单细胞的内含物不够灵敏。
但是，极少发现包含全部处于相同状态的细胞的生物系统：在实验室中人工同步的细胞培养物可能接近齐性，但即使在天然情况下同种的细胞也将处于不同的状态例如处于细胞周期的不同阶段等。因此一般分析表示所分析细胞的平均水平。
就任何系统的状态的更完整的描述而言，分析单细胞将是有益的。例如在人体中很多疾病状态引起向白血球的转变，并且在霍奇金氏恶性淋巴瘤中已经表明单个淋巴细胞的基因表达模式不是整体上群体所代表的特征[1]。因此细胞混合物的分析掩盖了在混合物中的多相性，并且没有提供对于理解疾病状态来说有可能重要的信息。在细胞之间的微妙但重要的变化淹没于实验噪声之中。
在生物学和医学中有很多例子，其中单细胞的分析比完整群体或收集物的分析更有用。发展生物学的主要目标在于说明伴随有机体生长和分化的分子改变。通过从单细胞开始的定义来进行胚胎学研究。将在活细胞组织成对刺激应答的系统中的方法：为了研究这样的系统及其对照物，必须测定在很多细胞中包插mRNA、蛋白、代谢物等分子的水平。疾病状态经常在细胞和组织的组分中。癌细胞不同于其在基因中的正常对应物，所述基因在mRNA和蛋白水平上表达。可将胎儿血细胞放入母体循环中，并必须单独地从母体细胞中分析。自身免疫和感染性疾病引起向白血球组分的转变。循环白血球本身是多相的，并且包含几种不同的功能性类型，包括嗜中性白细胞、淋巴细胞、单核细胞和血小板。这样的细胞收集物的分子组成的说明将增加生物系统和方法的基本知识，并可以报告疾病的原因和治疗的研究。
参考文献2创造了术语“化学上的血细胞计数”来描述通过利用高灵敏度化学分析方法研究单细胞，而参考文献3评述了单细胞分析的基本特征。参考文献4评述了用于单细胞分析的微技术和毫微技术。参考文献5描述了用于操作单细胞的微流体装置。在参考文献6和7中公开了单细胞分离装置。
本发明的目的在于提供更多而改善的用于分析单细胞，尤其是其基因组、转录组和蛋白质组的装置和方法。
本发明的公开
总的来说，本发明提供了一种在装置中分离单细胞的方便的方法，所述装置容许分别分析其内含物。截留单细胞，释放其内含物，然后沿着包含适当的分析组分(例如固定化核酸探针、固定化抗体等)的通道分析单细胞的内含物。因此单细胞基因组、转录组和蛋白质组等的分析成为可能。此外，通过在相同的装置上安装多通道，可同时并行处理和分析多个细胞，容许快速而方便地比较群体中的单细胞。当多通道均分通用的输入线路时，可以容易地将细胞群分为单细胞，使一个细胞与一个通道相联系。
因此本发明提供了一种用于单个分析目的细胞的装置，包含：
-接收目的细胞内含物的通道，其中该通道具有一个输入端和一个输出端，以及
-接近于该通道输入端的细胞收集部位，
其中：
-改变该通道的输入端以便在使用期间使完整的目的细胞不能进入该通道；
-该通道包含一个或多个用于分析目的细胞内含物的分析组分；
-可以将目的细胞内含物沿着该通道在从输入端向输出端的方向上移动。
在应用中，将一个细胞用于该装置，其中在细胞收集部位将其截留。该细胞不能完整地进入该通道，但其内含物可以原位释放进入该通道的输入端。该内含物然后沿着该通道移动，当其遇到分析组分时，从而容许细胞内含物的分析。
如上所述，在优选的实施方案中该装置具有很多通道，以便可以并行分析多个细胞的内含物。因此本发明提供了一种用于单个分析目的细胞的装置，包含：
-很多通道，其中每个通道接收单个目的细胞的内含物，其中每个通道具有一个输入端和一个输出端，以及
-接近于每个通道输入端的细胞收集部位，
其中：
-改变该通道的输入端以便使完整的目的细胞不能进入该通道；
-每个通道包含一个或多个用于分析目的细胞内含物的分析组分；
-可以将目的细胞内含物沿着该通道在从输入端向输出端的方向上移动。
优选这些通道基本上彼此相同(例如：根据大小、材料、分析组分等)以便在使用期间使在不同的通道中的细胞彼此之间分别受到基本上相同的处理和分析，容许结果的直接比较。这些通道优选彼此平行。但是在替换装置中，通道可由中心点向周围放射(图23)。也可安排由中心点向不同方向延伸的并行通道(图24)。但是，优选通道在相同方向上排列的方案，因为这样的话则便于实现材料的动电学的运动。当通道从输出管向不同方向排列时，则可能需要阀门等以便实现通过不同通道的相等运动。
在不同的细胞中并行地运行相同的个体分析尤其有效，并且易于容许发现表面上相同的细胞的差异。因此本发明提供了一种用于分别分析很多细胞的装置，包含很多通道，每个通道接收单细胞的内含物，其中每个通道沿着该通道包含连续的分析组分，并且其中在一个通道中的分析组分的顺序与在另一个通道中的相同。因此不管其遇到哪个通道，不同的细胞都受到共同的分析，并且来自一个通道的结果可以容易和直接地与另一个通道的结果相比。
本发明提供了一种用于分析单个目的细胞的方法，包含以下步骤：将细胞收集到接近于具有一个输入端和一个输出端的通道的输入端，改变该输入端以便使目的细胞不能进入该通道；释放该细胞的内含物以便其进入该通道的输入端；容许释放的内含物从输入端向输出端运动，以便其在通道内与一种或多种分析组分相互作用，从而容许内含物的分析。
本发明也提供了一种用于分析很多单个目的细胞的方法，包含以下步骤：将单细胞收集到接近于每个具有一个输入端和一个输出端的很多通道的输入端，改变这些输入端以便使目的细胞不能完整地进入该通道；释放这些细胞的内含物以便其分别进入这些通道的输入端；容许释放的内含物从输入端向输出端运动，以便其在通道内与一种或多种分析组分相互作用，从而容许内含物的分析。
本发明也提供了一种用于分析很多单细胞的方法，包含以下步骤：分别释放很多单细胞的内含物；将单个内含物用于单个装置中的单个通道，其中每个通道包含一系列的连续分析组分，并且其中在一个通道中的分析组分的顺序与在另一个通道中的相同。
不同的分析可需要在本发明范围内的不同装置。例如，不同的细胞类型可能需要具有不同大小的装置。相同细胞类型的不同分析可能使用不同的分析组分，例如用于蛋白质组分析对比转录组分析，或用于细胞周期分析对比细胞信号分析。此外，可根据上述的实验数据来设计装置，并可根据上述的实验以不同的方式使用装置。例如，如果在初始实验中装置没有产生有用的数据，则可在进一步的实验中改变变量例如流速、操作温度、分析组分的种类等，并且可使用信号扩增技术，如下更详细地描述。因此如本文所述，不同的实验可以根据所要求的分析来使用不同的部件。
装置
本发明的装置具有几个部件，包括分析通道、细胞收集部位等。这些部件可由组合的散部件形成和/或通过从材料的单个部分形成(例如：通过浇铸、蚀刻等)。因为该装置的大小处于细胞范围内，所以一般使用微装配的方法。优选地，本文所描述的各种部件形成集成装置。
用于该装置的材料的选择受一些设计要素的影响，并且技术人员根据特定装置的要求可以容易地选择适当的材料。例如，材料应该经得起微装配，对用于细胞操作分析的试剂稳定，并且和用于监测细胞和分子的方法相适应。
一般使用对在分析中使用的试剂具有非渗透性的材料。就一些应用而言，需要将试剂共价结合于材料的表面。就一些应用而言，需要使用硬质材料；其它的应用可能需要柔性材料。当将荧光用于检测时，则材料对于激发和发射波长应当是透明的，并且在这些波长下具有低的固有荧光。当使用电渗来在该装置周围移动材料时，则该材料应当在使用时带电，或能携带电荷。例如，技术人员可以选择通过用适当的硅烷化试剂衍生化来将正或负电荷给予硅、玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面。可优选能传送照射逐渐消失的波(通过全内反射)用于某些检测技术。
适当的材料和装配方法是众所周知的。可以使用硬质材料例如硅和玻璃，其对于微装配方法来说已经使用了很多年。“软性平版印刷术(softlithography)”的最新发展已经使在细胞尺度上装配微流体装置的方便方法成为可能(例如：参考文献8公开了一种集成的由多层的软平版印刷术所形成微装配细胞分类器，包含蠕动泵、阻尼器、转换阀、输入孔和输出孔，来以协调和自动的方式进行细胞分类，控制阀的有效容积小至1pl，并且光探测的量是约100fl)，所述的“软性平版印刷术(soft lithography)”利用在聚合体，例如聚二甲硅氧烷(PDMS)中对于模型装置的电势。这样的装置具有与本发明的装置中的通道相似的通道，并且结合用于本发明的一些实施方案的其它部件，例如用于荧光测定的由激光照射的流体单元。
因此可从各种材料中制造本发明的装置，包括而不限于二氧化硅、聚合物、陶瓷、金属等及其混合物。可使用的具体材料包括，但不限于：玻璃；聚乙烯；聚二甲基硅氧烷(PDMS)；聚丙烯和硅。聚二甲基硅氧烷(PDMS)是特别有用的材料，并且可用浇铸、注入成型或UV-模型和固化来方便地制造该装置。
除具有通道和细胞收集部位之外，装置的其它部件可以包括：
-输出管与细胞收集部位相连。细胞可经由导出管引入该装置中，其可从导出管中获取并被细胞收集部位所截留，然后其内含物可从导出管中进入分析通道。未被截留的细胞可在运输管的废料端被冲洗掉。公共的导出管的应用对于具有多通道的装置是特别有利的，因为不同的通道都从相同的来源接收细胞。当这些通道彼此平行时，导出管可能垂直于这些通道(例如：图1)，但是在替换装置中可能分支成与这些通道平行的输出通道(例如：图53和54)。为了使意外的溶解最小化，输出管应该在总尺寸上大于要分析的细胞，例如25-250μm高。
-试剂供应管与细胞收集部位相连，以便将化学试剂(例如：溶解试剂或化学刺激物)施加给细胞，并且特别是截留细胞。试剂供应管可能与输出管相同(例如：图1)，或可能与输出管分离(例如：图53和54)。当这些分析通道彼此平行时，试剂供应管一般垂直于那些通道。
-排气装置与分析通道的输出末端相连。因此离开通道的物质可直接成为废物。排气装置还可以用于控制通过通道的流动。
-一个或多个电极。电极可用于产生跨越装置的电势，并且特别是沿着分析通道例如通过电运动传输细胞，来容许电穿孔等。作为一种选择方案，该装置可以包括与表面电极相连的触点。
-一个压电器件以便溶解细胞。
-一个光源例如激光器。其能被用于各种目的，例如用于细胞溶解，来观察通道中液面的前进，来激发荧光基团等。
-一个图象捕捉元件，例如摄象机。其可捕捉静止的和/或移动的图象。其一般为数字摄象机。
当该装置包括很多通道时，一般将这些通道彼此紧挨着排列在单个平面内。可将通道的平面层叠，以便在三维上排列这些通道，但是易于制造(特别是将试剂施加到分析通道内部)和结果集合(特别是读取在通道内的分析数据)意味着优选基本上平面排列的通道。然而，整个装置可延伸到通道的平面外，例如输出管、排气装置等可能超出通道的平面。
细胞收集部位
本发明的装置包括细胞收集部位，而不是依靠细胞的单向扩散进入通道之内来提供用于分析的物质。将细胞逐一截留，以便当将其内含物释放用于分析时，其可以进入单独的通道。因此细胞收集部位物理上与通道相连并近似位于通道的输入端，以便当释放时，截留细胞的内含物可以经由其输入端进入通道。
可以设置细胞收集部位，以便其能够仅仅收集单细胞。这一般可以通过使用能够仅仅接收单个目的细胞的大小，和/或通过使用一旦已经收集了一个细胞就不能收集更多细胞的细胞收集部位来实现。
如果细胞收集部位能收集一个细胞以便其内含物可被释放进入分析通道中，则其能够采取各种形式。在单个装置中，细胞收集部位可在输入端分析通道的入口。例如，已知在玻璃微量加液器的末端收集细胞。然而，细胞收集部位通常在分析通道的输入端之前采取锥形进口的形式，其具有细胞能够进入的较大直至和细胞不能离开的较小直径(例如：对于人淋巴细胞15μm和3μm的直径；进一步参见如下)。因此如参考文献9所报道，细胞能够进入锥形进口，但其不能继续进入分析通道内。锥形的较小直径能够导致直接进入分析通道内。参见图1和2。锥形可处于一维或处于二维，例如锥形可具有恒定的高度和狭窄的宽度(图15A；以及图35)，或可具有缩短的高度和宽度(图15B)。锥形可为线性的(例如：图2)或非线性的(例如：图70)。其可为平滑的或分段的。锥形细胞收集的进一步的优点是由小量的细胞沿着锥形延伸的能力而产生的，如以下进一步的细节所述(参见图8和70)。通过在其输出管端具有最初(至少部分地)关闭的部位可实现与锥形相同的效果，以便细胞可进入但不能继续下流，然而可随后(例如：在溶解之后)打开(例如：通过利用阀)来容许进一步的下游运动。
在图3中说明了物理上收集细胞的更多方式。在图3A中，使用直径上的逐步减少而不是锥形。在图3B中，将隔板安置于通道中以便在细胞运动时将其捕捉。在图3C、3D和3E中，跨越通道设置柱，而这些柱捕捉细胞。
由于流体在装置内的运动收集部位容许收集单细胞，而不是由使用者操纵进入该部位之内。可任意占有细胞收集部位，但优选例如通过使用动力或吸引力来协助，特别是当使用锥形进口时。例如，可施加电力(例如：电渗透；进一步参见如下)或机械力(例如：吸力，方便地通过分析通道)来促使细胞进入收集部位。该力可通过增加在分析开始时占满全部细胞收集部位的可能性，以及通过加速收集部位被占据的过程来促进有效的分析。在参考文献10中已经描述了通过利用负压来促进单细胞在通道入口处的水动力圈闭作用(图8)。通过利用电势来传送单细胞常见于库尔特计数器。
为了防止将多细胞吸引进相同的收集部位内，则可设置为一旦其被占据则一个部位的吸引力就停止；另外，为了防止细胞逃脱细胞收集部位，则吸引力应该恢复，例如：如果使用吸力的话，则收集的细胞可阻塞并终止吸取有吸引力的更多细胞，但如果细胞离开了则吸力重新开始并可再吸引离开的细胞。
就细胞进入细胞收集部位内的电渗透运动而言，将电势用于该装置，一般用收集部位的阴极上游(例如：在输出管中)和阳极下游(例如：分析通道的下游)。1-2v/cm的电势梯度一般将引起细胞溶解，因此用于移动完整细胞的电势将低于此，例如0.1-0.3v/cm。通过电渗作用移动的细胞将进入锥形收集部位并移动到锥形的窄末端，在其中细胞将被截留。由于锥形被阻塞，则电流不能流动，因此电渗作用将停止。然而如果细胞脱离了锥形的窄末端，电流将恢复并且细胞将再次向阳极移动，并将被再次收集。所以电渗作用容许细胞的高效收集。参见图5。
可通过细胞固位法更方便地占据细胞收集部位。这些不会主动地吸引细胞，但是一旦细胞已经占据了细胞收集部位，将把细胞保持在原位。细胞固位法的例子指包括识别目的细胞上的细胞表面分子的固定化抗体。参见图32。
所以，一般可随着例如通过利用吸力(改善kon)或通过利用固定化抗体(改善koff)收集接近于通道输入端的单细胞来改变细胞收集部位的kon和/或koff。
在参考文献10中公开了一种由聚二甲基硅氧烷(PDMS)形成的微装配装置，其具有可选择性固定单细胞的单侧细胞收集部位。在参考文献11和12中描述了在孔中收集单细胞，并使用微泡来将其释放的MEMS装置。在参考文献13中报道了由硅片形成的用于单个收集的细胞片段堆分析的微装配装置，其注口大小是1μm、3μm和10μm。然而，通过无接触方式例如通过利用抗电动力学和压力-主动力来收集单细胞[26]，而不是使用物理上的收集部位。
参考文献14描述了使用毛细管和静电场收集和操纵单细胞细胞。单细胞根据其电泳迁移率移动入毛细管中阻止电渗作用流动来封闭该毛细管。在毛细管中收集细胞之后，通过施加反向电压将其抽出放入微容器。当将负电压用于微容器时，在其中的细胞由于静电推斥力可相对长期地维持漂浮。
在优选的设置中，装置包括锥形进口，通过利用电运动，并且特别是电渗透作用将细胞(例如来自输出管)移入锥形进口中。在通道入口的锥形的底部收集细胞，将其内含物放入通道，可随后分析其内含物。
释放细胞的内含物
当已经收集了细胞时，可通过例如细胞溶解将其内含物释放。可以各种方式释放内含物。例如，可将溶解液用于该装置(例如：经由输出管)，并且将细胞在细胞收集部位内原位溶解(图6A)。作为替换方案，细胞收集部位可适合于机械破裂收集的细胞(图6B)例如使用在参考文献15中描述的“毫微尺度倒钩法(nanoscale barbs)”。作为进一步的替换方案，可通过电穿孔法除去细胞内含物(图6C)并且依靠用于电穿孔的电场的强度，可简单地打开膜片，容许通向细胞内含物，或可能破裂，导致细胞溶解[16]。优选强到足够引起溶解的电场。
可使用的一般溶解液可包括如下组分：表面活性剂，例如当分析核酸时，离子型去垢剂如SDS，或当分析蛋白质时，非离子型洗涤剂如Triton-X100；消化蛋白质的酶，例如蛋白酶K；消化核酸的酶，例如DNase和/或RNase；钝化酶和溶解的细胞组分的离液剂，例如胍盐如异硫氰酸胍等。这样的试剂通常用于大量细胞溶解的现有技术中。试剂的选择取决于所研究的被分析物的性质，例如如果目标是分析mRNA则在溶解液中可包括蛋白酶和DNase，而不是降解mRNA的试剂。
已经描述了单细胞的机械破裂。参考文献17公开了一种通过产生冲击波来快速溶解单细胞(或其细胞组分)的方法，并且为了将操作损伤减到最少，细胞或由激光钳来放置或作为粘合细胞来培养。还可以将超声波振动用于该装置以便溶解细胞，如可用激光，其以前已经用于溶解单细胞[18，19]。在参考文献20中报道了通过渗透性冲击在微装配装置中的单细胞溶解。参考文献21描述了用光钳将单细胞引导和操纵到微流体网络的不同区域，其中可由电泳和电渗来控制流动性。在两个电极之间收集细胞，其中可通过电脉冲溶解细胞。
已经报道了使用电穿孔法来溶解少量细胞的微流体装置，其使用包含多金属柱和窄的流动通道[22，23]。也已经描述了用于除去内含物的单细胞电穿孔法，例如参见参考文献10和24。虽然参考文献10和24的焦点是促进物质运送入细胞，但是相同的原则适用于除去细胞内含物，因为细胞膜的开放容许双向流动，如图9所示。可使用低的外加电压(＜1伏)将人细胞原位电穿孔来除去其内含物。通过在电穿孔之前收集单细胞以及通过将少量细胞向前延伸，可在低电压下实现局部的电穿孔，因为将电场集中以便跨主要细胞膜存在最大的电位降。因为电阻与表面积成反比，所以细胞小的延伸部分比未延伸部分具有更高的电阻(例如：至少50倍大)。所以最大的电势降存在于细胞膜的延伸部分。低的外加电压足以实现具有跨主要膜的高电场的电穿孔(例如：大于500kV/cm)，对于双分子类脂膜的介电强度来说在参考文献25中报道其在300-1000kV/cm范围内。为了以这种方式实现细胞的最大局部延伸，优选细胞收集工具是锥形，更优选分为两维的锥形。参见图7。
单细胞的电穿孔是用于释放细胞内含物的优选方法。
在将细胞内含物用于装置通道内的分析试剂之前(或在进行分析之后，但在分析完成之前)，可能想要从内含物和/或修饰的某些组分中除去某些组分。经常将生化分析放在用于除去可能干扰的物质的该纯化或修饰步骤之前，或按照被分析物与试剂的相互作用，或取得或说明结果。然而，本发明的一个方面是这些除去步骤可能不需要的。已经发现能可靠收集mRNA被分析物用于可检测的杂交，甚至阻止细胞内含物的本底(例如：参见图60和62)。因此本发明提供了一种用于单个分析一个或多个目的细胞的方法，包含以下步骤：(i)释放细胞的内含物；以及(ii)通过杂化作用从释放的内含物中收集mRNA来固定核酸，其中在步骤(i)和(ii)之间没有mRNA纯化的步骤。因此步骤(ii)可在有释放的细胞内含物、用于步骤(i)的溶解试剂等存在的情况下进行。
然而，当包括除去步骤时，有两个优选部位用于进行该步骤。在第一个实施方案中，装置可包括通道输入端上游(例如：在细胞收集部位和通道输入端之间)或输入端的紧接着下游的扩大室。细胞内含物可进入扩大室，其中可经由例如与细胞内含物进入相同的路线来引入治疗试剂(图10)。通过利用扩大室避免了释放的内含物扩散回到输出管，因为如果将溶解的细胞留在收集位点则可能发生。在第二个实施方案中，可沿着分析通道引入治疗试剂，不需要扩大室。
在进一步的实施方案中，可在该装置中终止细胞而继续流体运动。例如，参考文献26描述了通过利用抗动电学和压力主动力来在微装配的装置中终止细胞。可继续流体运动而细胞保持固定，通过无接触方式收集，因此可将治疗试剂引入流动流体并应用于固定的细胞。不同的细胞可需要不同的操纵电场和外加电压以便以这种方式收集细胞，例如人们发现E.coli细胞需要具有比酵母细胞更大μeof的缓冲液，因为在pH7的Tris缓冲液(μeof＝4×10-4cm2/Vs)中E.coli可抗电渗透流动而酵母随着流动。
适当的治疗试剂包括，但不限于：核酸酶(例如：DNase)、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、阳离子交换剂、阴离子交换剂、去垢剂、离液剂等。可在细胞内含物已经释放之后将这些试剂引入该装置，或其可已经处于适当的位置。在优选的设置中，将治疗试剂固定于装置中，例如固定在装置的内表面上的酶、粉末形式或作为玻璃料的树脂插头等。
优选设置治疗试剂以便处理细胞内含物来除去蛋白质和DNA，留下浓缩的mRNA用于分析。但是，如上所述，这种除去并不总是必需的。
在与分析试剂相互作用之前，还可能在细胞内含物内分离组分。例如，通道可包含mRNA-特异性收集试剂(例如：固定化的poly-T核酸)。其它的细胞组分(例如：蛋白)将继续移动通过mRNA-特异生收集试剂，并能因此与分析组分在通道内相互作用。如果核酸杂交随后受到干扰(例如：温度增加、盐浓度减少等)，mRNA将被释放并可随着蛋白沿通道移动。可类似地使用用于可逆收集细胞组分类型(例如：用于收集DNA、蛋白质、mRNA、糖等)，而使其它通过的其它试剂。
优选在收集和溶解之间的时间较短，例如在收集之后防止细胞分裂。作为一种替换方案，可在低温下(例如：2-8℃)使用该装置来防止细胞分裂及其它细胞代谢过程。
在溶解开始之前，优选细胞运送到通道就应该停止，否则就有这样的危险：第二个细胞可能被已经用过的细胞收集部位所收集，因此导致多于一个细胞的内容进入通道。
通道
本发明的装置包括细胞的内含物可沿其通过用于分析的通道。该通道具有一个输入端和一个输出端。输入端接收细胞的内含物，其由收集的细胞所释放。细胞内含物沿着通道从输入端向输出端移动。在输出端，残余的细胞内含物(在预备和/或分析过程已经沿着该通道进行之后)可脱离该通道。
改变通道的输入端以便完整的目的细胞不能进入该通道。这一般通过使输入端小于目的细胞来实现。因为细胞不是刚性物体，所以细胞的一部分可能延伸到通道内(图7和8)，但是细胞总体上不能完整进入通道。
通道的输入端可能是细胞收集部位的直接下游。在一种替换方案中，细胞收集部位和输入端可能被中间区域分隔开。例如，该中间区域可采取扩大室的形式(参见上面；图10)，可将细胞内含物流入其中来在分析之前用试剂处理。
分析通道的尺寸对于装置的运行具有重要的影响。尺寸是重要的，因为不但防止了细胞的进入，而且缩短了在通道内细胞内含物释放的分子必须扩散来接触分析组分所通过的距离。尺寸的更多细节如下。
通道一般具有基本上恒定的横截面积，和优选基本上恒定的横截面形状。横截面的变化导致通过通道流速的变化，其通常不是想要的。优选矩形的横截面，如以下更多细节所述。
如果将电渗用于沿着通道移动物质，则通道的至少一个壁将在使用期间具有适当带电荷的表面。可根据在任何特定分析中所要求的方向和移动速度来选择电荷的极性和大小。极性可同时取决于用于制造通道的基础材料，任何表面附加材料(例如：固定化核酸)以及任何表面改良。如果将正电荷材料用于通道的一个壁，将DNA和/或RNA固定于对面壁的分离位置上，则局部的ζ电势变化将导致整体流分配的缩小和扩大，依次引起不同的横向物质传输率并由此混合。如在参考文献27和28中所表明的，还可以通过使用在电极之间跨通道的电势脉冲，应用埋入电极来获得类似的效果。在一些试验中可能想要混合作用和湍流，但是在其它试验中可能不需要。熟练的技术人员可根据其需要选择这些条件，并且可根据经验确定适宜的条件。
优选通道是关闭的，除非朝着流动的方向。因此引入通道的液体将能仅仅沿着某一轴向-纵向，而不是上/下或横向流动-虽然沿着该轴的流动方向可能变化(向前/向后)。
在具有用于分析很多细胞的多通道的装置中，优选具有基本上彼此相同的通道(例如：根据尺寸、材料、固定化试剂等)以便在使用期间，细胞受到基本上相同的处理和分析，容许结果的直接比较。优选所有分析通道是基本上相同的。
在本发明的一些实施方案中，通道可分为两个或更多个亚通道(例如：图25)。内容物可进入每个分支。可设置每个分支接收与其它分支基本上相同的物质，或者不同的细胞内含物可直接沿着不同的分支，例如mRNA沿着一个分支而DNA沿着另一个分支，或带正电荷的蛋白沿着一个分支而带负电荷的蛋白沿着另一个分支。分通道可能汇合或可能不再汇合，即分叉通道对于单个输入端可具有多于一个输出端。
分支还可用于另一个方式。可在第一维内分离细胞的内容物，并可改进为“T形连接”分支。如果两个分支具有相反的极性，则一般具有不同电荷的蛋白质和RNA可流入不同的分支，因此容许在一个分支上进行蛋白质组分析而在另一个分支上进行基因组分析(图31)。
除分析通道之外，装置可包括更多的通道，其不是用于分析，而是例如用于试剂运送或移动，或不使用的通道。
在通道内的分析组分
在装置中的通道用于细胞内含物的分析，并且其包括可与细胞内含物相互作用来产生分析结果的分析组分。一般根据对目的细胞的认识来选择在任何给定装置中的分析组分以便产生所研究的分析数据。
可位于通道内的一般分析组分包括，但不限于：色谱分离介质；电泳分离介质；固定化结合试剂等。还可以包括已经用于化学上用的血细胞计数的试剂[2]。优选的分析组分是固定化结合试剂，例如用于杂交的核酸、用于抗原结合的抗体、用于抗体结合的抗原、用于收集糖和/或糖蛋白的植物凝血素等。优选的结合试剂特异于选择的靶子，例如用于与目的靶子特异杂交的核酸序列、用于特异结合目的靶抗原的抗体。可根据单个试验的需要改变特异性的程度，例如在一些实验中可能想要收集相对于固定序列具有核苷酸错配的靶子，但是其它的试验可能需要绝对严格。
优选仅仅沿着通道的单侧来固定分析试剂。在具有矩形横截面的通道中，试剂一般位于四个壁的仅仅一个壁上，并且优选位于长壁的一个壁上。
优选将不同的固定化结合试剂设置成独立单元或膜片，以便于数据分析-如果不同的试剂位于相同的膜片内，则将不清楚哪个试剂产生了信号。但是，如果由一个固定化试剂产生的信号可以不同于不同的固定化试剂产生的信号，则可能将相邻膜片稍微重叠或不具有紧密的分界线。
优选的通道包括在细胞内含物中与特异的核酸杂交的一系列不同的固定化核酸。将根据目的靶子来选择核酸序列。更优选地，分析组分保持特异性的mRNA转录。固定化核酸优选是DNA，优选是单链的，并且优选是寡聚核苷酸(例如：短于200个核苷酸、＜150nt、＜100nt、＜50nt或更短)。通过在分析之前除去DNA，mRNA的保存比DNA更便于实现。
其它优选的通道包括用于收集蛋白的一系列不同的固定化试剂。这些一般是免疫化学试剂，例如抗体，虽然还可以使用其它的特异性结合试剂，例如用于蛋白的受体，反之亦然。通过将试剂固定于固体表面来特异性收集蛋白的技术在本领域中是众所周知的，例如根据酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体谐振、蛋白芯片、抗体芯片等。已经可以得到用于分析血液的抗体芯片(例如：通过细胞活素和胞内信号蛋白的特异性收集和分析)[29](例如：来自Panomics的TranSignalTM细胞活素抗体芯片[30])，并且已经报道了基于固定化收集抗体的电化学酶免疫测定具有10pg/ml的灵敏性[31]。为了在免疫化学试验形式中检测结合，则一般需要使用第二抗体(一种“三明治”试验)。
单个通道可包括用于分析核酸和蛋白质的试剂。
用于将分析试剂固定到表面上的方法是本领域中众所周知的。将核酸以可杂交的形式固定到表面上的方法是微阵列领域已知的，例如经由连接子固定到表面的基质上，固定到表面的凝胶上等。众所周知的方法是Affymetrix用过的用于在玻璃表面上核苷酸探针的原位合成的光刻掩蔽法，但是还已知电化学原位合成法，以及喷墨沉淀法。用于将蛋白(特别是抗体)固定到表面的方法同样是已知的。这些方法已经用于适于单细胞分析的尺度。
可以预合成固定化核酸然后将其固定于表面，或者可以通过将前体递送到增长的核酸链来在表面上原位合成固定化核酸。可根据本发明使用这些方法的任何一个。
如参考文献32、33和34所述，优选使用增长的核酸链的电化学脱保护通过原位合成来形成固定化核酸。
本发明所使用的一个分析方法包括通过与固定化的收集DNA杂交来在通道内收集mRNA，随后使用固定化的和杂交的DNA作为引物来逆转录mRNA。所以，在这个方法中逆转录酶需要存在于通道内，并且可在mRNA固定之后将其与dNTP及其它试剂一起引入通道。逆转录过程延长固定化引物来合成固定化cDNA，并因此导致本发明装置的共价修饰。下面给出了该方法的更多细节。收集的DNA一般具有两个部分：容许mRNA-特异性收集的poly-T部分和用于与选择的靶子序列-特异性杂交的第二个部分。
为了通过逆转录作用促进在装置上DNA的链延长，将DNA经由其5’末端或者经由内在的核苷酸来固定，以便其具有自由的3’末端。
装置优选包含至少10N个不同的分析试剂，其中N选自0、1、2、3、4、5、6、7、8或更大。至少106个不同的寡聚核苷酸固定到单个表面上是微阵列领域中众所周知的。一般将10N个不同的试剂布置在10N个不同的膜片中。
优选固定化试剂的每个膜片具有小于10Xm2的面积，其中X选自-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12等。使用目前的技术可容易地制备具有大小按照10μm×10μm(即10-10m2)的顺序的膜片的微阵列。当物质结合到固定化分析试剂时，将它们限于较小的区域，增加了信噪比。
膜片的中心间距优选小于10Ym，其中Y选自-3、-4、-5等。相邻的膜片可能邻接或可能重叠，但优选相邻的膜片通过间隙分隔开。不优选重叠的膜片。
优选膜片具有矩形或者正方形的形状。就具有宽度W和面积A的通道而言，该膜片的长度因此是A÷W。就相同大小的相邻膜片而言，中心间距将是A÷W，并容许在膜片之间的缺口，则中心间距将更一般地是至少1.5(A÷W)或2(A÷W)。
优选设置膜片以便其沿着运动方向各自连续遇到细胞内含物，如图11中所说明的。因此优选沿着运动方向(纵向)，而不是沿着垂直方向(横向)设置相邻的膜片。
类似地，优选设置膜片以便其占据通道的全宽(图12)。这样使稀少的被分析物通过通道前进而不遇到膜片的可能性降到最低。
在具有用于分析很多细胞的多通道的装置中，优选在使用期间沿着每个通道的固定化试剂的选择、系列和量应该基本上相同以便每个细胞受到基本上相同的处理和分析，容许结果的直接比较。本发明这方面的更多细节如下。
在优选的包含多通道和很多固定化分析试剂的装置中，通道是直的并且基本上彼此平行，并且以与通道基本上相互垂直的直线的方式固定分析试剂(也参见参考文献34)。参见图13。以下进一步论述，该设置保证膜片占据通道的全宽，而且全通道包含相同的系列分析试剂。
因此本发明提供了一种装置，其包含：(a)多通道；以及(b)很多固定化分析试剂，其中：(c)通道基本上彼此平行；以及(d)将固定化分析试剂设置成与通道相互垂直的直线。该通道优选具有一个输入端和一个输出端，并且如上所述，改变输入端以便使完整的目的细胞不能进入该通道。
因为优选通道是关闭的，除非不能容易地沿着其长度到达其内表面，其对用于吸附分析试剂的方法有影响。优选的装置是由基底构件和盖板构件所组合形成的。基底构件包括具有开放的上端通道，容许进入通道的内表面。在试剂已经固定到基底构件上之后，附加上盖板构件来关闭通道的上端(图16)。盖板和基底构件将相互结合来封闭通道，防止物质在通道之间渗漏。在一种替换装置中，将试剂用于盖板而不是用于基底。当盖板覆盖了通道时，其可能是平的。在一种替换装置中，盖板自身可能包括通道的一部分(图17)。优选的基底构件由聚二甲基硅氧烷(PDMS)组成，并且优选盖板由玻璃组成。
分析结果
用于分析结果的检测方法取决于分子靶的性质，并且取决于可能使用的任何标记。其还可能取决于在给定的分析部位上信号的强度，更多的细节如下所述。优选定量的检测方法。
可在装置内原位进行检测，或在分解装置中进行检测。例如，在具有槽式构件和盖板构件(参见上面)的装置中，其中收集的试剂固定在盖板构件上，可以在被分析物已经通过通道之后除去盖板，并且可以例如使用微阵列分析已经使用的试剂、技术、装置和软件来分别分析盖板。
就优选的分析(RNA和蛋白质)而言，可能需要进一步的生物方法以便在靶被分析物与固定化结合试剂相互作用之后引入可检测的标记。优选将荧光标记用于本发明。
使用逐渐消失的波可以激发通道中的荧光。这些波以照明光波长的约1/2延伸出材料的表面，即其将以约150-350nm向外延伸，其超过足以穿越一块固定化寡核苷酸来延伸照明。还可以使用用于激发的其它光源，例如激光器、灯、发光二极管(LED)等。
可以通过开发抗体的几种已知方法之一来检测蛋白质。例如，可以通过将特异于来自第抗体的不同表位的第二标记抗体用于形成“三明治”复合物来检测通过固定化抗体收集的蛋白质。
就RNA被分析物而言，可通过使用酶例如逆转录酶将荧光核苷酸插入互补链中来实现检测。可通过引入核苷酸前体和RT，在细胞溶解的区域之内或者在扩大室内用溶液反应物中的mRNA制备cDNA。替换方案是将mRNA与寡聚核苷酸探针杂交，并使用固定化探针作为引物来原位合成cDNA。逆转录反应优选将标记的核苷酸插入cDNA以便易于杂交的检测[35]。这可通过利用有适当的荧光基团附着的dNTP来实现。不同于顺序反应，对于不同的核苷酸使用不同颜色的荧光基团不是必需的，因为不需要鉴别单个核苷酸。类似地，不必标记每个核苷酸，因此可标记dATP、dCTP、dGTP和dTTP的1个、2个、3个或4个，并且可使用标记的和未标记的dNTP的混合物。很多荧光基团插入cDNA(例如：在至少5％的插入dNTP中，例如≥10％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥75％或更多)指可以通过任何惯用的荧光检测方法容易地在通道内检测到cDNA，因此甚至针对单个杂交事件显示正信号。因此即使低丰度的mRNA也可以被检测到。
还可插入特异性的功能基团，而不是直接插入荧光基团，随后例如在例如逆转录作用、冲洗等步骤之后与荧光基团结合(“后-标记”)。
如上所述，用于分析结果的检测方法可能取决于在给定分析位点上的信号强度。取一个固定化的寡DNA来举例说明，其使用荧光标记的dNTP并使用杂交的mRNA转录本作为模板来延伸，根据在膜片上的信号是强还是弱来应用不同的检测技术：对于强信号，则可使用来自整个膜片的全部信号的综合，其信号的强度与杂种的数目成正比(并因此与原始细胞中转录本的数目成正比)；但是对于弱信号，全部信号的综合可以是不相称的，因此不适合于定量分析，特别是对于低丰度的转录本来说。强弱信号之间的主要区别是信噪比：对于强信号，则噪声具有较小的效果，但噪声可以使弱信号的定量分析模糊不清。
例如，对于稳定到高丰度的人mRNA，则10μm×10μm膜片一般将收集用于满足综合所需的足够信号，并且如果收集了大部分RNA的话则将有足够的荧光信号来容许精密测量。膜片的大小与哺乳动物细胞近似相同，并且众所周知当用荧光cDNA探针时可以通过原位杂交来检测稳定丰度的mRNA；例如：FISH法可用于检测在一个细胞中少到50-60个转录本。但是，就非大量的mRNA而言，由光电倍增管或常规的CCD系统产生的综合信号是不适合的。
例如，通常的转录本大约长300nm(1000个核苷酸；每3nm10个核苷酸)，并且其直径是大约1nm。转录本的“区域”因此是0.3×0.001μm＝3×10-4μm2。因此一个10μm×10μm(100μm2)的膜片可以容纳最大100/3×10-4的转录本，其中每个膜片3.3×105个转录本。因为常规荧光检测的密度范围是大约104，即使暴露RNA转录本的全部区域用于检测(例如：通过如上所述并在图29中说明的流动实施方案)则至少需要30个转录本用于检测。因此通过常规的检测方法不能检测到在每个细胞中存在少于约50个的转录本。
但是，提供了用于检测单个荧光基团的感光技术[36，37]，在目前的技术能力的范围内可以检测包含多个荧光基团的单个cDNA/mRNA杂种。目前能鉴定单个荧光基团的仪器具有约150nm的象素分辨率。例如，参考文献38和39描述了单个分子阅读器(从Upper Austrian Research GmbH作为“CytoScout”市售可得)，其中CCD检测器与样品扫描载物台的移动同步，能够获得连续数据来在11分钟之内以129nm的象素大小收集来自区域5mm×5mm的数据。如以下更详细的描述，来自单个核酸的荧光信号可以延续300nm长，因此可以不同于使用目前技术的背景。可以用总量相当于转录本总量的信号来计算这些信号。
但是，可以通过膜片的高分辨率扫描米计算信号，而不是从总体上分析膜片。例如，激光光点(200-300nm直径)可以照亮沿着膜片的精确控制的通路(图28)并且可以用光点的前进来计算荧光，当如上所述检测膜片的全部荧光时没有受到相同的信噪比。一般而言，单个荧光点要小于照亮的激光光点。为了检测，可将冷却的CCD或光电倍增管或其它的方法用于测定荧光发射的弱光强度。可以对整个膜片区计算光点；作为替换方案，可以继续计算直到具体数目的光点已经定位，并且该区域已经扫描到该点能因此与膜片的总面积相比，并且可以通过外推法估算整个膜片的总数为止。
可以通过如下更详细描述的串联原位逆转录方法来进一步改进该检测方法的敏感性。
但是就大量的转录本而言，在拥挤的区域内不能辨别单个分子。10μm×10μm的一块区域相当于上述单个荧光基团检测器中的约3-4,000个像素。如果超过几百个占据该区域的话，则不可能计算单个信号，因为在信号周围需要有空白区域以便计算(即：在方阵中由8个“开”像素围绕着1个“关”像素)。然而，使用常规的微阵列阅读器或具有适合于扫描整体像素强度的扫描载物台的共聚焦显微镜。因此可以使用已经用于分析微阵列的扫描器。已经将使用流动通道的适当的分析器结合进容易获得的设备(例如：Agilent Bioanalyzer)中。
在中间密度，其有可能在图象中识别空白区域，但该密度导致具有较高几率的像素多重占有，统计方法可用于计算在图象中来自对象密度的分子的最可能的数目。
因此可用各种方法收集数据。对于大量的被分析物，在CCD数据集中的每一个像素具有与荧光基团(并因此被分析物)存在的数目成正比的强度；对于少量的被分析物，将一般通过计算像素的数目来分析数据，所述像素中存在荧光信号，其中每个“开”像素代表单个被分析物。用于测定信号的方法可以结合各种途径，因此获得测定密度范围的物质延伸一有时用标准的积分法，其余用计数法。在低信号强度下，密度范围可以增加100倍，并且出人意料的是，在高信号强度下也可能在密度范围上有10倍的增加。
本发明的装置还可以与质谱仪相连接。例如，通道的输出端可以直接给料入电喷雾电离质谱仪，当细胞内含物从分析通道中出来时用于其质谱仪分析。具有质谱仪的微流体装置的整体是已知的，例如参考文献40描述了一种利用整体的高效液体色谱(HPLC)柱、样品富集柱和纳电喷雾装置用于肽分析的微流体基片，并且该“HPLC-基片/质谱仪技术”得自Agilent。
装置可包括一个激光源和/或一个串联的激光检测器。激光可通过多通道发射，并且可通过通道上方的检测器读取斜向上的光。当激光通过其在通道中的路径或从通道的输出端出来时，其可用于激发分子。
本发明的主要优点是其分析细胞内含物的能力，即使被分析物从每一细胞零到数千拷贝变化。如上所述，本发明提供了在荧光检测上的改进，其中信号强度跨越几个数量级，并且本发明的一个方面是用于实行本方法的完整的荧光检测器。因此本发明提供了一种用于检测在反应基质上荧光的仪器，包含光源、荧光检测器、用于目的基质的容器以及在整体检测方式和计算检测方式之间选择的计算机程序。光源一般是激光器。荧光检测器一般是荧光显微镜。目的基质般是本发明的装置，或其一部分(例如：盖板构件)。可能在整体和计算方式之间进行人工选择，但优选根据一项或多项预选择标准(例如：信号强度等)自动地进行选择。该装置通常能够相对于彼此地移动基质、光源和/或检测器，例如：以适合于基质和探针设置的特定形式。例如，忽略探针排列之间的空白区域将加速读数过程。
检测的荧光优选由两个生物分子(例如：两个核酸、抗体和抗原等)的特异性结合所引起。
当分析单个通道的结果时，可用各种方法来操作该装置。例如，其可以整体方式沿着扫描单个膜片的通道运动，然后回到未到达信号阈的膜片以便以计算的方式分析它们。作为一种替换方案，可选择沿着通道的每个膜片，而不是进行粗略的“首次扫描”并需要对一些膜片进行二次测定。类似地，可以这些方式的任何一个操作该装置，但与通道垂直地进行扫描。进一步的变化是显而易见的。
常见的分析组分
如上所述，本发明的一个主要方面是在不同的细胞上平行进行相同的单个分析，并且本发明提供了一种用于单个分析很多细胞的装置，包括很多通道，其中每个接受单个细胞的内含物，其中每个通道沿着该通道包含一系列连续的分析组分，并且在一个通道中分析组分的序列与另一个通道中相同。
因此不管细胞进入哪个通道，细胞都将遇到常见的一系列(例如：A、B、C、D、E、F、G...)的分析组分。在多通道内分析组分的常见方案指被分析的每个细胞遇到相同的分析试剂，意味着一个细胞的结果可以容易地和直接地与另一个细胞的结果相对比。
优选地，至少10个(例如：10个、50个、100个、250个、500个、1000个或更多个)分析通道，更优选全部分析通道，包含分析组分的常见顺序。
常见的系列分析组分优选在每一通道中具有相同的组分和空间排列(例如：所有膜片的固定化试剂彼此之间具有基本上相同的大小、间隔、位置、试剂浓度等)。因此可以容易地将来自多通道的结果相互结合。例如，如果所有通道是平行直线，并且如果定位所有通道的第一个分析组分(例如：图13)，则垂直于通道的直线将在每一通道内跨越相同的分析组分。因此沿着垂直于并且高于通道的直线的检测器能够依次扫瞄对于单个细胞的相同单个分析试验的结果。因此其能沿着通道的方向移动到达下一个分析细分的位置，并且能够重复直线扫描来获得下一个单个分析试验的结果等。
虽然每个通道可能具有常见的系列分析组分，但这不意味着每个通道的所有内容物必须是相同的。例如，双通道可能在常见系列的第一个构件(例如：可用于识别特定通道的独特组分)的上游具有不同的组分。类似地，可能通过非常见的组分米分离常见的系列组分的单个构件，但是可在每个通道中发现常见的系列，不论任何其它的组分。例如，图26显示了每一通道七个分析组分的方案，其中具有四个常见组分。
尤其优选常见的系列固定化结合试剂。
如果装置包括设计用来接受不同种类物质的分支通道(例如：一个分支用于DNA、一个分支用于mRNA)，则在分支区域内常见的系列通常适于每一通道仅仅一个分支，例如所有的DNA分通道具有常见的系列，但是在mRNA分通道中没有相同的常见系列。平行于通道的直线扫描的优点还表现在分支方案中，但是因为检测器从一个通道移动到下一个通道，则将测定两个分通道。
通过该装置移动细胞内含物
在已经释放细胞内含物之后，细胞内含物进入适于分析的通道。其进入通道的输入端并且沿着通道向输出端移动。在内容物已经进入通道之后在一些位置上可能想要逆转运动方向，但是至少初始运动将是从输入端向输出端的。
可使用各种方法将细胞内含物沿着通道移动，例如基于抽吸、吸取、动电学等。优选的方法以动电学移动细胞内含物(例如：通过电渗或通过电泳)并且需要跨通道应用的电势，其具有指示移动方向的极性。在参考文献41中评述了在微装配装置中的动电学运动。当在本发明的范围内使用电泳时，通常通过装置移动物质，而不是根据其流动性彼此分离分子。
当跨通道应用电势时，电渗是流体流过带电通道的一种方法。如果通道的表面带正电(例如：沿着一个或多个壁)，则当跨通道应用电势时，通道内的流体能够通过电渗向阳极移动。参见图4。大量流体的运动可以产生在流体内物质的运动，例如细胞、悬浮组分、已溶物质等。
电泳是带电粒子在电场内移动的一种方法。细胞通常在中性pH下带负电荷，因此可通过电泳向阳极移动。在装置内的电泳可以在开口管道中进行，或可以在处于通道内的凝胶或粘稠物质中进行。
可以同时进行电渗和电泳。例如，可以通过电泳将带负电荷的mRNA分子向阳极移动。如果通道的壁带正电荷，则在通道内的流体运动也将向阳极，因此通过电渗和电泳也将mRNA向阳极移动。但是如果通道的壁带负电荷，mRNA将受到电渗透作用向阴极流动，其将对抗电泳的流动。抗电渗透和电泳流动对于mRNA运动的净效果取决于如下因素，例如：电场强度、通道壁上的电荷、使用的溶剂(例如：取决于粘稠度)、温度(此外，粘性可以改变)、离子强度、表面活性剂的存在、pH等。在该装置设计期间(例如：原料等的选择)和/或在应用期间(例如：温度、电场等的选择)可以改变这些因素，以便实现特定组分想要的运动。在应用期间pH的改变是控制运动的优选方法。
优选物质通过该装置的电渗透运动。通过具有(a)在输入端相对于输出端的负电势(阴极在输入端，阳极输出端)，以及(b)在通道壁上的正电荷来方便地实现mRNA通过该装置的运动。通过使用带正电荷的材料用于其制造来获得带电壁。
由于核酸是带电荷的分子，则当固定到通道壁上时其可以导致电渗透性质上的改变。如果需要的话，则在这样的位置上，可用不带电荷的核酸类似物代替例如戊糖核酸(PNA)。
可以精确控制动电学运动，并且可如需要通过改变电势来改变运动的速度和方向。还可以停止动电学运动，例如其能被用于容许通过机械法(例如：注射、抽吸等)导入试剂。
在20V/cm的电压梯度下，DNA以125μm/s在微通道内运动[42]。因此在核酸膜片的线性阵列上核酸传递的适当速率是大约2V/cm。
优选地，在低pH下核酸(具有其磷酸二酯骨架)带负电荷，其中大多数蛋白质带正电荷。因此，在低pH下，大多数蛋白质向阴极运动而核酸向阳极运动。因此具有适当极性的电场的应用容许蛋白质和核酸彼此分离，从而便于单个分析而不受其它的干扰。在图31中的通道设置便于该分析(更多的参见如下)。
还可以将双向电泳用于移动被分析物。已经报道了使用该技术的无接触细胞收集[11]，虽然很难优选区域的几何形状。参考文献43使用图象驱动的双向电泳技术来在光导表面上实现极化电场的高分辨率模式用于操作单细胞。
如上所述，在一些位置上在通道内向前或向后方向移动细胞内含物可能是有用的。那么就低丰度分子的灵敏检测而言，收集用于分析的尽可能多的那些分子是有用的。如果单向移动然后朝另一个方向移动，则可以两次通过特定的结合试剂，从而提供了收集免于在第一次通过时收集的任何分子的第二次机会。
在通道内逆转大量流体运动的能力也提供了涉及避免本底噪声和非特异性结合的优点。如图29所示，当逆转流向时则特异性杂交的核酸分子的位置相对于其附着点发生改变，并且高分辨率检测器可以发现该变化。与此相反，非特异性结合信号不受流体运动变化的影响。因此，通过比较由正反向流动得到的信号，可将特异性结合与非特异性结合区别开来。通过在电场中延伸结合的核酸分子可以获得相同的效果；极性反转将改变束缚的核酸的位置，但不会改变非特异性结合噪声。
因此本发明提供了一种用于分析核酸杂交试验的结果的方法，所述试验起于在以下组分之间的相互作用：(i)固定在杂交基质上的核酸，以及(ii)游离核酸，其中固定化核酸和/或游离核酸包括可检测的标记，并且其中该方法包含如下步骤：(i)在液体流过或将电场用于在第一个方向上跨越基质的条件下，获得杂交基质的第一个图象；(ii)在液体流过或将电场用于在第二个方向上跨越基质的条件下，获得杂交基质的第二个图象；以及(iii)比较第一个和第二个图象。以第一个图象中的第一个方向和以第二个图象中的第二个方向排列的可检测标记表示特异性杂交信号；显示非这样排列的可检测标记表示实验噪声或非特异性杂交信号。优选第一个和第二个方向在基本上相同的平面上，在该平面上的两个方向之间的小角(即：如参见由上所述，用于测定目的)通常≥45°，优选≥90°，更优选≥135°，最优选是大约180°(即：逆转流动或电场)。可通过改变通道的电极性容易地实现在流动或电场方向上的改变，以便逆转动电学移动的方向。一般通过电脑来进行第一个和第二个图象的比较。
在本方法的开发中，使用了两个具有可鉴别信号的标记，一个是早期标记，一个是晚期标记。当链延长发生时，初始延长将使用早期标记，后期延长将使用晚期标记。当流动方向改变时，则特异性杂交将显示在早晚期标记的相对位置上的变化。引入标记的一种方式是最初提供四种核苷酸前体的仅仅一种亚型。将继续进行链延长直到“出差错的”核苷酸是所必需的为止。能因此提供出差错的核苷酸，容许进一步的链延长，从而掺入不同的可检测标记。因此举例来说，核酸链可具有红色的5’区和绿色的3’区，并且在特定杂种中杂种红色和绿色区域的相对位置随流动方向而变化。因此沿着直线型的核酸链具有不同的可检测标记有利于反向检测。
取1000nt作为转录本的平均长度，并且每3nm的RNA大约10个核苷酸，通常的转录本大约有300nm长。提供了能识别单个荧光基团分子的装置，并且其具有约150nm的象素分辨率极限[38]。利用荧光dNTP基质进行收集的mRNA分子的逆转录，将多个(例如：＞100个)荧光基团插入cDNA中。通过如上所述的液流(或者通过使用电场)来延长该分子，然后信号将延续至300nm长，并具有相对强烈的荧光信号。强烈的荧光因此将在检测器中占据一个像素以上，容许将其与本底区别开来。
如参考文献44所述，还可以通过分析其杂交动力学来鉴别非特异性结合的核酸阵列。
分析的细胞
本发明适合于分析各种细胞，包括真核细胞和原核细胞。本发明尤其适合于分析很多细胞，其虽然是相同的类型，但是非同步的，即处于细胞周期的不同阶段。
本发明可用于分析原核细胞，例如细菌，包括但不限于：E.coli；B.subtilis；N.meningitidis；N.gonorrhoeae；S.pneumoniae；S.mutans；S.agalactiae；S.pyogenes；P.aeruginosa；H.pylori；M.catarrhalis；H.influenzae；B.pertussis；C.diphtheriae；C.tetani等。
在真核生物中，本发明可用于分析动物细胞、植物细胞、真菌细胞(尤其是酵母)等。优选的目的动物细胞是哺乳动物细胞。优选的哺乳动物是灵长类动物，包括人类。
特定的目的细胞种类，尤其就人类细胞而言，包括但不限于：血细胞，例如淋巴细胞、天然杀伤细胞、白细胞、嗜中性白细胞、单核细胞、血小板等；肿瘤细胞，例如癌、恶性淋巴瘤、白血病细胞；配子，包括卵细胞和精子；心脏细胞；肾细胞；胰腺细胞；肝细胞；脑细胞；皮肤细胞；干细胞，包括成体干细胞和胚胎干细胞等。还可以分析细胞系。本发明尤其适用于研究干细胞。在分离通道中单个分析之前对单个细胞进行不同处理的能力尤其适用于细胞如干细胞，例如：可以在原位(例如：通过经由试剂供给管提供刺激物)或在进入装置之前用不同的刺激物(生长因子等)处理分离的细胞，并且可以分析对于基因和/或蛋白质表达的作用。
根据实践的观点，较易于分离和收集处于游离悬浮液的细胞，例如单细胞机体或来自动物的循环细胞。然而，常常不能以这种方式容易地分离目的细胞。但是在此情况下，制备细胞悬液的方法众所周知地来自于应用于荧光激活细胞分类仪(FACS)的技术。
本发明用于分析细胞内含物。这并不意味着本发明必须用于分析全部的细胞内含物，例如如上所述，可以在分析之前除去不需要的物质。也不是必须将全部的细胞内含物从细胞中除掉，例如：仅需要除去特定的部分，而仅需要取得部分的提取物。但是一般说来，本发明包含细胞溶解来释放全部的细胞内含物，并且至少在来自细胞的mRNA转录本和/或蛋白上进行分析。
在引入本发明的装置之前处理细胞群可能更有优势。例如细胞可被分成几个部分，如根据大小、细胞标志物等。可以通过本领域已知的一些方法实现分离。尤其有利的方法是荧光激活细胞分类术(FACS)。在所谓的“芯片上的实验室(lab-on-a-chip)”装置中已经开发了用于FACS的方法，并且这样的装置可以容易地与本发明结合并且应用。将细胞染色以便识别特定的类型更有好处。例如，可以在引入装置之前或之后，将细胞用表面标志物的荧光抗体染色。如果在细胞进入装置之后使用抗体，则其可以在固定于该装置之前或之后结合到细胞，容许辨别与每个微通道有关的细胞。
就具体应用而言，在将其输送到装置之前预分离细胞是有优势的，以便不同尺寸的通道可用于分析不同大小的细胞。可以在缓冲液流到达漏斗和通道系统之前通过使细胞悬液经由过滤系统根据大小预分离细胞(图22)。在参考文献45中公开了从较大的细胞群中提取单细胞的方法。
存在一些方法将细胞引入本发明的装置中。在大多数情况下，将细胞悬浮在缓冲液中，例如用来保证其保持完整以及特征的大小和形状。可将悬浮液应用于注入输出管的容器中。输出管的尺寸是这样的以便细胞在缓冲液流中或者在电场的影响下自由地移动。载体溶液或电场的流动路径从输出管开始，并经由通道。从此细胞穿过输出管，然后直接进入细胞收集部位漏斗内，所述的漏斗随后引入通道。
细胞可以进入直接来自其它细胞分离装置的装置，例如：来自细胞分类器(例如磁性-活细胞分类(MACS)或荧光激活细胞分类(FACS)装置)、来自细胞分部分离柱(例如通常用于分离红血球和白血球的细胞分部分离柱等)。
细胞的观察
当想要在装置内观察细胞时，通常使用显微镜。因为相对于缓冲液和一般的微装配结构较小的光学衬比，可能想要应用对比度增强，例如使用例如相差显微术、差示干涉差显微镜术、荧光显微术等技术。但是在很多情况下，可使用常规的光学显微镜。
在一个简单的实施方案中，检测运用长焦距显微镜物镜。在一些结构中，特别是当通道较深时，可使用远心的显微镜物镜以便同时避免投影和视差错误。想要应用具有放大作用的管透镜以便在选择视域中具有适应性而不需要改变显微镜物镜。显微镜可具有摄像窗口，其附属于摄像机。当在图象中的差别对比较低时，可想要应用具有增强的位深的摄像机，例如每一像素10位、每一像素12位或更多。
如果在选择的样品几何学中可以使用透射电子显微术，则其为优选的结构。通常通过样品发射白光源，但是在一些结构中，彩色光(滤光或者来自彩色光源例如来自发光二极管(LED))可能是有优势的。
就反射显微术而言，想要用反射面(例如：金属)包被样品的背面，或者通过建立在反射面上的微装配结构例如镜子、硅片等。在一个优选的是实施方案中，入射光与显微镜的光轴同轴，以免产生投影，但在一些结构中环绕光或暗视野照明也可能增强在图象中的差别对比。
用于样品移动例如垂直于光轴的定位阶段的常规方法，以及用于聚焦显微镜的方法能被应用。
根据试验的要求，可人工操作显微镜(聚焦、定位、选择视域等)，或其可以完全自动操作。该图象可用于诊断目的和缺陷检验(wo细胞的随机收集、污染物的收集、在早熟细胞溶解之后具有基因组DNA的结构的阻碍等)，而且可用于记录目的。
沿着条带设置分析试剂
如上所述，优选的装置包括很多通道和很多可流动的分析试剂，其中(a)通道是直的，并且基本上彼此平行，以及(b)分析试剂以与通道基本上垂自的直线来固定。在图13中说明了该装置。
可使用各种技术来以一系列平行的直线固定试剂(例如核酸)。这些技术一般用于在载体表面上制备条带，其将与另一种组分组合来供给本发明的装置，例如如图46所示。
参考文献32至34公开了利用生长链的电化学脱保护来原位合成核酸的方法。该方法尤其对于本发明适用。当该方法使用苯醌时，一个改进是在反应步骤之间包含用双氧水洗涤的步骤。已经发现在酸产生期间，一种中间类型(苯醌衍生物)有时可以在载体电解液中与阳离子类型(四(烷基)铵)形成难溶复合物，而且该复合物优选沉淀到阴极上。该沉淀逐渐引起在反应循环之间电极电阻的增加。双氧水可用于除去该复合物，并且阻止电阻增加，例如使用水中3％H2O2的混合物。人们认为含水溶剂的存在促进离子复合物的分解，而H2O2的存在促进部分减少的苯醌种类的重氧化。
当使用铂或铱电极时，进一步的改进利用了关键层以便增强电极对硅的附着力。关键层是铬或钛的薄层(10-200nm厚)。需要注意关键层受电解液保护，因为铬和钛都是电解活化的，并且(a)在目前/酸产生步骤期间有电化学熔解的倾向，(b)用惰性电极材料形成原电池(图63)。所以在装配期间，使用绝缘的二氧化硅层覆盖电极的边缘。这也将关键层与电解液相屏蔽。
作为电化学方法的替换方案，参考文献46公开了一种用于在表面上形成一个试剂条带的方法，包含如下步骤：(a)在反应基质的反应面之间形成接触，并且在通道基质上形成开放的微流体通道；(b)将试剂引入微流体通道以便该试剂沿着接触条带接触反应面，所述的接触条带由在反应面和开放的微流体通道之间的接触点形成；以及(c)分离反应面和微流体通道，留下在反应面上沿着接触条带固定的试剂。该方法可用于本发明。
本方法可用于引导核苷酸前体沿着接触条带通过原位合成方法来装配核酸。但是作为一种替换方案，其可用于引导活化的预合成的核酸沿着通道来容许其与在基质表面上的活性部位相互作用。通过在微装配通道内包含与反应面接触的活化核酸，则可能导致局部共价连接到由通道限定的区域中。例如，具有活性NHS-酯表面的玻璃基板(例如：Schott Nexterion H的产品)可以与平行微流体通道限定的结构相结合，然后改变氨基的核酸可以沿着通道移动。每个通道可以接收分离的核酸，从而得到具有固定化核酸条带的基片。在图64中说明了该方法，其中两个不同的氨基标记的70多聚物沿着两个平行的封闭通道移动，所述通道具有活性的NHS-酯表面(pH＞7.0)。
可以使用选择性的激活，而不使用物理障碍来分隔条带。例如，可以用光致断裂保护基(例如：NVOC[47])来活化基片的表面。可以通过使用适当的模式屏蔽来脱保护表面上的条带膜片，留下可与预合成的核酸反应的活性基团。在例如参考文献48中描述了利用干涉图案的该类型的方法。通过使用适当的光源和光工作站，可以照亮窄至1μm的条带，产生密集的寡聚核苷酸条带。
还可以使用通过电化学方式的选择性激活来制备条带。参考文献32到34和49公开了在电解液中产生酸的细条带的方法。这些方法可用于与酸易变化的保护基结合来有选择地活化在载体面上的条带用于随后吸附核酸。
沿着条带设置分析试剂，而其对利用垫片有用，尤其是当使用电化学方法时。垫片可以从反应基片中以固定的距离(例如：在10-50μm之间)分离电极(即用来产生和/或限制活性物质)，还可以限制在通过作为流动细胞合成期间使用的试剂。所以在合成期间垫片将不会受到任何化学制剂的腐蚀，并且其应该形成良好的密封是重要的。例如，可由聚四氟乙烯(PTFE)制备垫片，利用冲模从PTFE片上剪下，然后将其放在电极和基片之间。选择性地，可以将其光致蚀刻并永久地固定于电极。还可以使用光致抗蚀剂SU8来制备10-50μm厚的惰性垫片。
尺寸和参数
本发明的装置的各种特征的尺寸和参数是非常重要的，但将根据特定的需要和应用而改变。
改变通道的输入端以便完整的目的细胞不能进入。这一般是通过在输入端具有小于细胞尺寸的孔来实现的。下表中给出了一般的细胞尺寸，用一些举例的细胞器和病毒尺寸来比较：
| 细胞 | 直径 | 量 |
| S.cerevisiae | 5μm | 66μm3 |
| S.pombe | 2×7μm | 22μm3 |
| 哺乳动物细胞 | 10-20μm | 500-4,000μm3 |
| 人T淋巴细胞 | 6-8μm | |
| E.coli | 1×3μm | 2μm3 |
| 哺乳动物线粒体 | 1μm | 0.5μm3 |
| 哺乳动物细胞核 | 5-10μm | 66-500μm3 |
| 植物叶绿体 | 1×4μm | 3μm3 |
| 噬菌体λ | 50nm(仅头部) | 6.6×10-5μm3 |
| 核糖体 | 30nm直径 | 1.4×10-5μm3 |
| 球状单体蛋白 | 5nm直径 | 6.6×10-8μm3 |
所以根据分析的细胞，通道的输入端一般具有在1μm和50μm之间的宽度，优选在2μm和20μm之间。
相同的尺寸范围描述了锥形细胞收集部位的较小直径的特征。锥形的较大直径一般在10μm到500μm的范围之内。
通道的横截面积优选与孔的面积大致相同，即其在孔之后不扩大。
当扩大室存在时，优选将其输入口的宽度增加至少2倍(例如：至少3、4、5倍或更多)。其可比处理的细胞内含物在量上更大，但要小到足够将递送的处理试剂基团很快扩散来与细胞内含物相互作用。也应该将其塑型来容许高效混合，例如：如果用脉冲压力波来回地移动这些内含物，则其表面可能携带突起或隔板来搅拌容器中的内含物。
提供了感光的检测方法(例如：进一步参见如下)，但是只有收集了靶子后才能对其进行检测。本发明的一个目标是收集尽可能多的靶分子(即：在通道中提供了对于分析组分的被分析物)，优选在一个细胞中mRNA靶的至少50％(例如：≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥95％、≥99％以至100％)，并且一般基本上是所有的特定靶转录本。这对于稀少的转录本尤其重要。该目标涉及装置的各种特征及其应用，例如：收集膜片的尺寸、在膜片内核酸的密度、通道的尺寸、通过装置的流速等。
采用经由通道的移动横截面，在任何给定时间内可将靶子定位于横截面中的任何一个x，y位置，例如接近通道的顶端或底部。如果探针仅仅固定于通道的底部，则在探针之上的横截面区域在某一时间在任一特定点是无结果的。所以减低高度或通道以及增加宽度是有用的，这样可以使收集的试剂覆盖尽可能多的横截面积。所以，分析通道的横截面积优选是矩形的。具有矩形而不是正方形，用红色末端作为底部(h＜w，图18)，指分子经由通道很快地移动扩散到固定于通道底部和/或壁的表面的探针。h∶w的比例优选是至少1∶2，例如1∶3、1∶4、1∶5、1∶6等。通道的高度优选≤50μm(例如：≤40μm、≤30μm、≤20μm、≤10μm、≤5μm、≤2μm等)。另外，当与弯曲的底部相比在平底上具有收集的试剂便于信号检测，尤其是就设置垂直于底部的检测器而言。
为了进一步减少横截面的无结果的部分，收集的试剂应该覆盖尽可能多的横截面积。因此核酸以单层固定在通道底部的应用可能比固定于不同长度的接头(例如具有一定范围长度的接头)的核酸的应用更不优选，因此容许在横截面之内在各种高度上的收集。还可以使用扩展到横截面并且靶子可经由其移动的立体接头(例如：聚丙烯酰胺)。立体聚合物衬垫具有比在玻璃上合成的单层探针大100-1000倍的载量，并且该类设置参见例如参考文献50、51等。在参考文献51中，寡聚核苷酸附于20μm厚的每个40μm×40μm的聚丙烯酰胺衬垫上。但是，如果根据是否使用逆流来检测的话(参见上面)，则每一固定化寡聚核苷酸应当只使用单个接头，因为交联可指在序列中的改变不能充分发生。较长的接头容许在两个方向之间的信号的较大改变。
分析通道的高度一般小于任何预收集部位通道(例如：输出管)的高度。
还可以控制物质经由通道的流速。如果流动过急，则靶子将被向前冲走而没有机会获得与收集的探针有用的接触。用足够慢的流速，则将在收集的膜片的前沿收集靶子。因此收集的密度在膜片的近端边缘处最高，并且向着远端边缘按指数规律减低。例如，图30显示了在膜片中收集的探针在三个不同流速上的分布。就一切情况而论收集偏爱于膜片的前沿，并更偏爱较慢的流速。信号的不对称分布提供了一些优点：通过将收集集中于封闭区来增强检测少量靶子的灵敏性；特征性的指数式衰减有助于将真实的杂交信号与噪声区别开；并且跨越膜片的相同的高信号表明探针已经饱和了。
在如图13所述来设置的典型装置中，通道是10μm宽并且具有50μm的中心间距。所以200-通道装置是1cm宽。为了维持正方形装置，通道可以是1cm长(或稍微较短，来容纳输出管、收集部位、废物管等)。可以适用500个不同的寡聚核苷酸条带，每个10μm宽并且具有20μm的中心间距(即：在条带之间的10μm缺口)。因此1cm2装置可以同时在200个单细胞中分析500个不同的mRNA转录本。具有较窄通道的较大装置可以平行分析数百或数千个细胞，并且可以检测与大多数的其它细胞(例如：在循环群体中的有丝分裂细胞)混合以低频率发生的细胞。
每个寡聚核苷酸膜片在通道的表面上具有10μm×10μm的面积。就10μm的通道高度而言，在该10μm×0μm膜片中12.5pl/秒的流速适于收集接近80％的互补RNA靶。
如上所述，10μm×10μm的寡聚核苷酸收集膜片可以按顺序每一膜片容纳105个转录本。甚至多余的转录本很少(如果有过的话)超过每一细胞105个，因此10μm×10μm膜片是适当的。但是如果膜片在面积上减小100倍(例如：1μm×1μm)，则只能收集103个转录本，其对于大多数充足的转录本是不适当的。因此特定靶子的丰度可以决定收集膜片的尺寸。如果已知靶子具有特别高或低的密度，则可以适当地校正收集膜片的尺寸，因此在本发明的装置中的通道之内的膜片不必全部具有相同的尺寸。
按顺序排列的原位逆转录
如上所述，一种用于分析细胞内含物的优选方法，包含通过与固定化的收集DNA杂交来在通道之内收集mRNA，随后利用固定化杂交DNA作为引物原位逆转录该mRNA来提供标记的cDNA。与适当的检测器结合(参见上面)，该技术利于容许即使稀少的转录本也能被检测到。
可以大致将转录本分为：过剩、丰富和稀少。这三类之一的粗略特征如下：
| 过剩 | 丰富 | 稀少 |
| mRNA量 | 15-90％ | 50-75％ | ＜25％* |
| 对于RNA多样性的贡献 | 可以忽略的 | ＜5％ | 95％ |
| 结构型基因转录本的数目 | ＜10 | 200-1000 | 很多 |
| 每细胞每序列的转录 | ＞5000 | 500-2500 | 1-10 |
| 发现的细胞类型 | 高特异性 | 大多数 | 大多数 |
| PAGE可测的蛋白质 | 是 | 是 | 否 |
*每个转录本小于总mRNA量的0.01％。
如上所述的原位逆转录方法可用于检测甚至在单细胞提取物中的这些单个mRNA转录本，即使该提取物可能包含少于10个转录本。就稀少的转录本而言(例如：在每一细胞中以少于100个拷贝存在的转录本，并且尤其是具有＜10拷贝/细胞的转录本)，其中信号强度是非常低的，本发明提供了一种用于提高可检测信号的数值的改进技术。
在该改进技术中，进行逆转录的重复循环。在合成cDNA之后，熔解杂种(例如：通过加热)以便释放mRNA。但是如果熔解条件是适度的，或者如果其迅速逆向(例如：通过冷却到低于polyA/polyT双链体的Tm)，则释放的mRNA可以迅速再退火到接近的非延伸引物(图14A和14B)。此外，如果固定化核酸与mRNA的poly-A尾部的一部分相互补，则杂种的相对不稳定的rA-dT异型双链部分所熔解的温度要低于熔解分子的其余部分所要求的温度，抑制扩散。一旦熔解杂种(完全或部分)，则频繁发生再退火，因为在表面上大量存在非延伸引物。
因此单个mRNA分子可用作模板来合成多重标记的cDNA分子，并且由任何单个mRNA分子产生的cDNA产品是极接近的。所以可以扩增包含低丰度mRNA的单标记杂种来产生更容易检测的斑点的标记(图14C)。在单个膜片中斑点的全部数目不增加，因此不丧失试验的量的性质，但是扩增了每个标记的斑点的尺寸，便于杂种的检测。如果扩增已经充足的话，则常规测定的荧光信号将与扩增程度成比例增加。那么，如上所述，mRNA可按每个寡聚核苷酸膜片中荧光斑点的计数来测定。
为了以这种方式实现逆转录的重复循环，如果将加热用于裂解双链体的话，则可使用耐热的逆转录酶[52，53]。本发明所用的优选逆转录酶优选具有降低的RNase H活性。
可将本发明的这个方面与其它方面分开进行，因此本发明提供了一种用于进行核酸杂交试验的方法，包含如下步骤：(i)提供包含固定化核酸的杂交基质；(ii)在容许游离核酸与固定化核酸形成杂种的条件下将游离核酸施加于杂交基质，其中游离核酸具有在杂种中的单链延伸；(iii)利用单链延伸作为模板来在杂种中延长固定化核酸，其中延长反应将可检测标记插入固定化核酸中；(iv)熔解杂种的至少一部分并容许熔解的部分再退火形成固定化核酸，来形成新的杂种，其中游离的核酸具有单链延伸；以及(v)重复步骤(iii)至少n次，其中n是大于1的整数，假如n＞1则在步骤(iii)的至少第一个n-1重复之后进行步骤(iv)。
用于步骤(i)的杂交基质可以是本文所述的装置，或者可以是本领域已知的标准的核酸芯片。固定化核酸一般是DNA。
用于步骤(ii)的游离核酸可以是DNA或RNA，并且优选是mRNA。当其是mRNA时，则固定化核酸可能包插poly-T序列，例如：至少10个(例如：20个、30个、40个、50个或更多个)连续T核苷酸的延伸。poly-T序列在固定化序列的5’末端处或接近其5’末端。
在步骤(iii)中的延伸可以是酶催化的或非酶催化的，并且可以通过聚合或连接来实现。优选酶催化的聚合，例如：利用DNA聚合酶(包括DNA依赖性DNA聚合酶和RNA依赖性DNA聚合酶，即逆向转录酶)、RNA聚合酶(包括DNA依赖性RNA聚合酶和RNA依赖性RNA聚合酶)等。根据使用的引物(例如：DNA或RNA)和想要的延伸(例如：DNA或RNA)来选择适当的酶。可检测标记优选是荧光标记。
在步骤(iv)中，将核酸杂种熔解(至少部分地)并再退火。在部分熔解之后，在上述杂种附近熔解的链可以与新的引物再退火。可使用存在的双链体的全部熔解物，但是扩散作用干扰再退火，因此优选部分熔解，例如包含收集的mRNA的polyA部分的杂种的部分的熔解。当再退火迅速发生(例如在步骤(iv)中的熔解在10d秒之内，其中d选自0、-1、-2、-3、-4、-5或更小)时，方法是最有利的。类似地，在步骤(iv)中的再退火可在上述的杂种的10e米之内进行(参见上述)，其中e选自-4、-5、-6、-7、-8、-9或更小。
按照在步骤(v)中的说明，步骤(iii)和(iv)可以重复至少一次，优选至少两次、三次等。因此n优选是至少2、3、4、5、10、20、30、40、50或更大。步骤(iii)的每个重复继之以步骤(iv)，除非最后的(即第n次)重复无须继之以步骤(iv)。但是，在很多位置上，即使步骤(iii)的第n次重复也继之以步骤(iv)第n次重复。
本发明也提供了由该方法获得的修饰的杂交基质。
该方法可能包括进一步的步骤：(vi)在修饰的杂交基质上检测标记。
第二条链的cDNA合成
在进行原位逆转录之后，开始存在RNA/DNA杂种，其中DNA一般包括用于检测的标记。在本发明的一些实施方案中，使用例如RNAse H除去在该杂种中的RNA链。该除去步骤留下单链DNA，其通过固定化引物扩增来制备。在除去步骤之后，该单链cDNA可用作模板来合成互补cDNA链，从而产生双链cDNA。
利用与存在的cDNA链相互补的引物来起始该第二条链的合成。在起始逆转录之后，仅仅获得已经延伸到该引物位置的DNA来引导第二条链的合成。也可合成第二条cDNA链来插入标记，并且该标记可以与在第一个条链合成期间所用的标记相同或不同。
在图59中说明了该技术，显示与两条固定化寡DNA链的杂交。在步骤(a)中，mRNA靶与两条链都杂交。逆转录发生在步骤(b)中，但是仅仅完成了两条寡DNA引物的一条。在步骤(c)中除去mRNA模板，然后在步骤(d)中加入第二条链的引物。仅仅一个延伸的固定化DNA可以作为用于第二条链合成的模板。
进一步的特征
除分析细胞内含物之外，可优选分析在真核细胞中的单个细胞器，尤其是细胞核(例如：就转录因子而言)、线粒体和质体(例如：叶绿体)。可以在将细胞器导入本发明的装置之前从细胞中制备细胞器，或者可通过原位溶解从细胞中释放细胞器。因此能用与如上所述适合于整体细胞的方法相同的方法进一步收集和处理细胞器。用于获得该细胞器的方案如图19所示——收集细胞，释放其细胞器，然后收集细胞器同时洗掉其它物质(双锥形收集)。在参考文献22中公开了线粒体的等电点聚焦法。
如图21所示的类似的附加锥形装置用于从复合样品(例如：穿刺活检)中除去大细胞，并且使小细胞到达分析通道，但是该装置容易堵塞。基于大小的用于分离细胞的替换装置如图22所示。
导出管可根据大小将细胞分成不同的部分，然后将不同大小的细胞导入不同大小的细胞收集部位。因此单个装置可以处理各种不同大小的细胞。适当大小的分级分离方案如图20所示。
因为本发明的装置具有极小的尺度，所以其容易被污染物例如灰尘所堵塞。因此优选在分析之前过滤样品。过滤器可以与本发明的装置相整合或分开。
一旦收集了细胞，则可在显微镜下观察细胞的特征，例如大小和形状。就更详细的特征而言，可将其染色，例如在显微镜观察前用荧光抗体染色。该信息对于结合分子特征是有用的，其为本发明的主要目标。
一般性术语
术语“包含”包含“包括”和“由...组成”，例如：一种“包含”X的组合物可只由X组成，也可包括一些另外的东西例如X+Y。
术语“大约”涉及数值×平均值，例如，x±10％。在必要时，术语“大约”可以省略。
术语“基本上”不排除“完全”，例如：一种“基本上”从Y中释放的组分可能是完全从Y中释放的。在必要时，术语“基本上”可从本发明的定义中省略掉。
通过使用与元件有关的术语例如“直径”和“圆周”不一定表示元件是圆的(或者，在三维的范围内，是球状的)。
术语“抗体”包括任何可获得的各种天然的和人造的抗体和抗体衍生蛋白，以及其变体，例如包括无限制的多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人的抗体、单结构域抗体、完整抗体、抗体片段(例如F(ab’)2和F(ab)片段、Fv片段(非共价的杂二聚体))、单链抗体(例如单链Fv分子(scFv))、小抗体、寡抗体、二聚或三聚抗体片段或构造等。术语“抗体”不表示任何特定的来源，并且包括通过非(例如噬菌体展示法)获得的抗体。本发明的抗体可以具有任何同型(例如：IgA、IgG、IgM，即α、γ或μ重链)，并可具有κ或λ轻链。
附图的简要说明
图1是本发明的装置的说明，其具有多通道、用于收集细胞的锥形进口，并且利用吸取来将细胞移入锥形进口内。图2说明在锥形进口中收集的细胞，而图3显示用于物理上收集细胞的替换装置。
图4说明物质通过电渗的运动。
图5说明类似于图1装置的装置，但是使用电渗而不是吸取来将细胞移入锥形进口内。
图6说明在进口处收集溶解细胞的不同方法：(a)溶解液的应用；(b)机械破裂；以及(c)电穿孔。
图7说明通过使用电势引入锥形进口的部分延长的细胞。
图8显示通过使用吸取引入锥形进口的部分延长的细胞。
图9显示通过电穿孔除去并引入通道的细胞荧光标记的内容物。
图10说明用于处理细胞内容物的扩大室的操作。
图11说明沿着通道相邻膜片的优选设置，而图12说明相对于通道宽度的优选膜片宽度。
图13说明本发明的装置，其具有沿水平方向的多通道，以及沿垂直方向的固定化寡聚核苷酸的多条带。也显示了沿着通道之一的横截面(X-X)。
图14说明本发明的串联的逆转录方面。图14A说明早到中期，而图14B显示中到晚期。
图14C说明如何以这种方式扩增标记的小斑点。
图15说明两种类型的锥形进口，其在(a)一维或(b)二维上窄化。
图16说明可以如何装配装置。选择具有通道的基材，然后将DNA探针列垂直地加到通道中。然后将盖板加到该装置上来封闭通道。在图16中盖板是平面，而在图17中其具有一个切掉的部分，所述的切掉的部分成为通道的一部分。
图18说明通道的大小。
图19说明细胞器在收集部位的释放。
图20说明在收集之前细胞的大小分级分离。图21也说明利用一系列的锥形管的基于大小的细胞分离。图22说明进一步的大小分级分离方法。
图23说明其中通道从中心点径向延长的装置，而图24说明具有从中心导出管以相反的方向延长的平行通道的装置。
图25说明分支变成两个亚通道的通道。所示的通道具有圆截面，因此直径以√2减小来保持恒定的截面的面积。具有正方形或矩形截面，则通道的宽度将易于平分。
图26说明五个通道，每个通道具有七个分析膜片。用箭头标出的四个膜片是通用的分析组分。
图27说明与很多转录本杂交的膜片(“强的”)和与少量转录本杂交的膜片(“弱的”)。
图28显示激光光点扫描具有三个杂交信号的斑点。图29显示流向对于杂交的转录本的作用，借此非特异性信号(短的黑色横条带)可以不同于真实的信号。
图29显示流向对于杂交的转录本的作用，借此可将非特异性信号(短的黑色横条带)同真实的信号区别开来。
图30显示以三种不同的流量(pl/秒)在固定化互补DNA的膜片上收集的mRNA靶的分布。左图显示来自侧面的密度，并且下一个条带显示从上方所测定的密度。
图31显示分叉通道，其中蛋白质以一条路线移动而RNA以另一条路线移动。
图32说明在细胞收集期间抗体的应用。在图32A中，通过收集的抗体(例如“Y”形状)来保留收集的细胞。在图32B中，管的一端表面镀有收集的抗体。
图33显示在本发明的装置中微装配通道的平面布置。图34到36显示当装置由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成时，装置放大的详细特征。
图37显示具有输入和输出管的装置，其附于DNA微阵列上。
图38显示在微阵列上的杂交和逆转录。
图39说明用于同时测定与固定的寡聚核苷酸杂交和逆转录的测试系统。
图40和41显示寡dT长度对于杂交效率的作用。
图42显示包含mRNA中polyA尾部对杂交的作用。
图43到45显示寡dT长度对于逆转录的作用。
图46显示单个装置的结构。通道由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造(1)。将寡聚核苷酸探针的平行条带(3)用于滑道(2)。聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道位于滑道的上方，通道平行于条带。在图47中，两个细胞的mRNA内含物分别经由两个通道通过。逆转录随着荧光标记的掺入发生，然后将其显影。不同的细胞显示了不同的荧光图案。
图48显示在微装配装置中分别收集的四个细胞。
图49是具有20个通道的装置的说明，每个通道具有在5×4阵列中设置的圆形的输入和输出孔。仅显示了八个通道。图50A显示经由20个通道的10个部分通过的墨水。在图50B中，利用类似的通道，墨水沿着几个通道完全地通过。
图51显示在装置的7个相邻通道中的杂交信号。
图52显示在8个相邻通道中的杂交信号，将所述相邻通道设置成与寡聚核苷酸探针的14个条带相垂直。
图53到55显示图33的替换装置，仅显示了输入面。
图56显示具有附加的流体连接体的装置。图57和58说明如何将电插头引入该类型的装置中。
图59显示在原位逆转录之后的第二条链cDNA的合成。
图60显示将mRNA与经过各种处理的阵列杂交。
图61显示表面100×100象素面积的图象。X和Y轴显示以μm为尺度的位置。右侧的梯度是在任意线性标度上的荧光强度。
图62显示包含第二条链cDNA合成的试验结果。
图63显示在基础层(铬或钛)和惰性电极材料(铱)之间的原电池的形成。氧化剂可以是O2、I2或H2O2。
图64和66说明预合成的核酸固定到活化表面上。在图64中使用物理方法将核酸固定在表面上，而在图66中利用紫外线选择性地活化表面。图65显示通过图64的方法将核酸附加荧光，而图67和68显示通过图66的方法将核酸附加荧光。
图69和70显示在用台盼蓝对死细胞染色之后在本发明的装置中收集的细胞。在图70中，将活细胞的一部分扩展到通道中。
图71显示流体前端经由图53的装置的移动。前端均匀地进入该通道。
图72显示本发明装置的输出管、试剂供给管和细胞收集部位的六个静止的图象。由框架B到F环绕细胞，显示其从进入到收集的移动。
图73显示在图61所示的载体上三个任意选择的位置上在10秒(X轴)之内荧光强度的时间轨迹。利用100ms的曝光时间收集了100个图象，每个都处于最大激光量。通过横线指示数字水平(即：荧光染料分子的数目)。
本发明的实施方式
微装配装置
用聚二甲基硅氧烷(PDMS)板制备具有如图33所示平面图的微流体网络(1)。细胞沿着输出管(10)进入装置的顶端。在多个并行通道的锥形入口(20)处收集单细胞，并且其内含物沿箭头所示的方向移动。在沿着通道(30)移动之后，将试剂由排气装置(50)留在装置(1)的输出端(40)。在最终的聚二甲基硅氧烷(PDMS)装置(1)中的输出端(40)的放大图如图34所示。在最终的聚二甲基硅氧烷(PDMS)装置(1)中的锥形入口(20)的放大图如图135所示。入口(20)下游区域的零件包含各种用于收集细胞的突出物(60)的排列，如图36所示。通道(30)具有一矩形横截面，为10μm宽，并且根据使用的聚二甲基硅氧烷(PDMS)厚度从2到20μm高。相邻通道按60μm分开。入口(20)锥形从50μm到10μm。突出物(60)或者是通道中的柱(2μm×2μm)或者是从器壁上突出的挡板(2μm×3μm)。
在图53中说明了装置预收集部分的替换装置。细胞的悬浮液经由输出管(110)进入装置，并流过具有分叉通道(115)的流体分离器，目的是在将其输送到一系列细胞收集部位(120)之前使流体和细胞平均地分配。流体可以经由分叉的输出管通道(图71)均匀地通过。这些通道从1mm宽减少到例如25μm。所以，与图33所示的设置相反，细胞沿平行于分析通道的方向流入细胞收集部位，而不是沿垂直于分析通道的方向(图54)。但是，仍然存在垂直的运载条带(105)，并且其可用于使流动试剂通过收集的细胞，例如进行溶解，或将细胞暴露于化学刺激。该运载条带(105)一般是50-500μm宽。当在样品中的细胞的数目较少以致收集效率重要时，该设置就比图33的设置更有用了。与图33的设置相比，其还可以减少剪切力导致的细胞破裂。图55显示相当于图54的显微图象。
该装置由结合到玻璃表面上的聚二甲基硅氧烷(PDMS)构成，其具有相当于入口孔的孔。玻璃表面提供了聚二甲基硅氧烷(PDMS)和固定于入口孔的流体接头的机械载体。利用具有主要图案的硅+SU8模具来将其铸造成聚二甲基硅氧烷(PDMS)来制成微通道。在固化聚二甲基硅氧烷(PDMS)之后除去模具，留下聚二甲基硅氧烷(PDMS)中的图案的印记。通道的深度取决于SU8的厚度。聚二甲基硅氧烷(PDMS)的总厚度取决于在固化过程期间固定于玻璃表面到放置的模具上的聚酰亚胺的条带。
就一个模板而言，将具有900nm的热增大氧化物的100mm<100>n型硅片在平底锅上1100℃烘干脱水15分钟。利用商品化的旋转机在硅片上旋转10毫升的SU8-25，并且通过两级旋转处理得到50μm的厚度(沉淀步骤)。在65℃下烘干硅片3分钟，然后在95℃下15分钟(预烘干步骤)。冷却之后，利用掩模光刻机将硅片经由镀铬的玻璃掩模在10mW/cm2宽波段的紫外线灯下曝光30秒，然后在65℃下再曝光1分钟，随后在95℃下4分钟(再曝光步骤)。随后利用两个槽的1-甲氧基-2-丙醇醋酸盐处理硅片5分钟，随后在用无水氮气吹干之前在2-丙醇中清洗。在150℃下进行再烘干10分钟，然后利用S1818抗光蚀剂的旋转层来保护，在110℃下烘干1分钟。然后利用由S1025金刚石锯片锯开的硅片将硅片切割成小片。人工分离该模具，通过首先在丙酮中然后在2-丙醇中清洗来除去抗光蚀剂保护层，然后用无水的氮气吹干。在分离之后用眼睛检查模具的任何主要的缺陷或较大的损伤。
该方法产生了相同厚度的SU8结构。考虑到更深的进气道(例如：为了便于细胞运输)，可以使用双深度的SU8结构。这些可以通过连续处理(沉淀、预烘干、曝光、后烘干)彼此紧接着的几个SU8层来得到，随后单个处理步骤(作为在单个深度的装配中)。在参考文献54中描述了该双深度的SU8结构的装配。
然后使用软石版印刷术(soft lithography)[55]将模具用于制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)结构。简短地说，通过将基础聚合物和固化剂以10∶1的比例混合来制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)，随后在减小的压力下进行排气步骤30分钟。将少量该预聚合物的混合物浇铸在SU8模具和预处理的显微镜载片上，作为载体。利用固定增强剂进行显微镜载片的预处理。用5毫米厚的聚碳酸酯条带支持模具以便除了易于操作之外改善其耐久性。将铸件的总厚度减到最小以免受溶剂的影响而膨胀，将其与在该模具两侧具有Kapton带的条带支持的模具相对比，产生约180μm的总厚度。由固定于玻璃的带的两个条带的厚度决定聚二甲基硅氧烷(PDMS)部分的总厚度。将显微镜载片和模具相接触，夹入一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)并在原位牢牢固定，而容许加工处理聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在完成时，轻轻地使模具离开铸件并在应用之前除去Kapton带的条带。
在除去SU8模具之后，用聚二甲基硅氧烷(PDMS)充满在支承面上的入口孔，并且需要清洗该入口孔。利用直径稍小于入口孔直径的孔冲床来除去聚二甲基硅氧烷(PDMS)的插头。在除去插头期间需要小心，以免产生尺寸大于通道尺寸的碎片。具有相同孔位置的模板滑道保护该结构免受显微尘粒和在冲床处理期间产生的碎片的侵害，并且有助于引导孔冲床。孔冲床是一种针状轴，其在一端从内侧削尖，以便提供清洁的切面。将该轴完全经由孔拖拉，而不是拉回，以免将碎片拉回并成为结构。19G针(0.9mm)与具有入口孔(1mm)的孔相配。
图72显示一个细胞进入图53的装置并且在锥形收集部位中被收集。该装置是25μm高，并用注射器来提供样品，所述注射器载有50μL缓冲液、10μL台盼蓝、10μL缓冲液、5μL细胞悬液(100个细胞/μL)和10μL缓冲液。在图72所示的序列中流速是1μL/分钟。
如图37所示，将装置(1)置于与DNA微阵列相接触，所述DNA微阵列是在玻璃显微镜载片(2)上制备的。聚二甲基硅氧烷(PDMS)形成了相对于玻璃的封条，从而不需要应用任何压力而阻止了水溶液的渗漏。将引入和引出通道(10)的管(11a和b)插入聚二甲基硅氧烷(PDMS)装置(1)中，也插入排出管(51)。
可以将细胞(例如人类白细胞)的悬浮液经由管(11a)引入输出管(10)。大量流体经由管(11b)排出，但是由于经由排出管(51)的微小吸力，将一些流体吸入通道(30)中。单细胞进入锥形入口(20)，但其太大而不能进入通道(30)，因此在入口(20)处收集这些单细胞。当保持负压时，将溶解的溶液经由管(11a)引入输出管(10)中。在入口(20)处收集的该溶解细胞将其内含物释放流入通道(30)中，其中其可与在滑道(2)上的微阵列探针相互作用。
作为用于流体连接的更牢固的方法，可以使用市售可得的插头。一般的装置由端口和相匹配的插头组成。将端口定位于玻璃载体块的入口孔上方，结合注射器针头和相匹配的聚四氟乙烯(PTFE)槽的碎片的帮助，并且用环氧树脂粘结。过夜处理环氧树脂，随后除去注射器针头和聚四氟乙烯(PTFE)槽的碎片。图56显示具有该附加插头的装置。利用该装置，将Harvard PHD2000双注射器泵附于插头111a、111b和151上，并将其用于以细胞悬浮液装入该装置。利用该泵送装置使两个管孔的活塞平行运动。利用一些阀，样品可以沿任何方向相当容易地运动。
可以利用在参考文献34中公开的电化学方法方便地制备一系列核酸探针的基本上平行的条带(3)。如图46所示，可以设置聚二甲基硅氧烷(PDMS)装置(1)，以便其通道与微阵列上的条带基本上相互垂直。可以在通道的入口处收集单细胞(例如：如图8、48和69所示)，原位溶解，并且其mRNA内含物可以流入分离通道，每个遇到相同系列的核酸探针。在杂交之后逆转录杂交的mRNA，在逆转录中插入荧光基团(图39)。然后可除去通道装置(1)，可通过标准技术阅读阵列(2)上的荧光(图47)。根据条带的尺寸和mRNA的浓度，可利用标准微阵列阅读器或能够检测单分子的高分辨率阅读器来检验该阵列，并可用于灵敏的高分辨率荧光基团的检测，例如：CytoScoutTM阅读器。
原位细胞溶解
就溶解细胞而言，使用两种缓冲液。
第一种溶解缓冲液是锂十二烷基硫酸盐溶解缓冲液，包含：100mMTris(pH7.5)；500mM氯化锂；10mM EDTA；1％锂十二烷基硫酸盐和5mM DTT。LiDS去垢剂容许组蛋白保持结合到基因组DNA上，维持其紧密。RNase抑制剂的加入将阻止mRNA的降解。
第二种缓冲液是胍盐硫氰酸盐溶解缓冲液，包含：3M GuSCN；2mM柠檬酸钠；2％β-巯基乙醇；1％Triton X-100；1M NaCl；10mM Tris(pH7.5)以及1mM EDTA。离液溶解剂GuSCN裂解了所有蛋白的氢键、盐桥和水合。因此，将组蛋白从基因组DNA中剥离，并且展开超螺旋。它也使细胞RNase变性。
将这些缓冲用于已经在固体表面上收集的细胞，并且利用显微镜观察溶解。利用第一种缓冲液，在10秒内完整细胞的浓度降低大约10倍，并且在30秒之后全部细胞溶解。第二种缓冲液更强，因为在10秒之后见不到完整的细胞。溶解缓冲液的选择将决定在溶解完全之前细胞应该在锥形进口中保持多长时间，例如直到30秒为止。
通过封闭的微流体通道的流体运动在封闭的微流体通道之内的杂交
用PDMS的片状颗粒修饰并行通道。PDMS结构具有20个平行的通道。每个通道的两个末端终止于具有垂直于PDMS平面的轴的圆孔。因此在PDMS结构的一端存在20个输入孔，而在另一端具有20个输出孔，其具有以5×4设置的孔。图49说明该设置仅仅显示了20个通道的8个。
将PDMS结构相对于玻璃滑道推进来关闭除输入和输出孔之外的通道。发现由于PDMS的“粘性”，玻璃和PDMS彼此保持紧紧地固定。
为了测试装置流体学的基本运转，特别是为了证实流体可通过通道移动而不经由PDMS/玻璃的分界面溢出也不使通道壁变形，把有色墨水经由输入孔注入到通道中。图形50A显示了该试验的结果，视觉上证实流体能以良好的流体运动沿通道移动而不渗漏入相邻通道中。
利用荧光标记和荧光显微术证实了在相邻通道之间没有渗漏。
为了证实核酸杂交可以在通道内进行，利用常规的化学方法将5’-CTACGC六聚物探针附于玻璃滑道表面的膜片上。简短地说，在10％HCl水溶液中利用10分钟搅拌将Schott环氧滑道开环。利用PPDMS垫片、LongPCouple圈、ABI分块和氧化剂人工合成该六聚物。在50/50无水乙醇/氨基乙醇中600℃下脱保护25分钟，随后用无水乙醇/N2清洗。如前所述，用无水乙醇/N2清洗玻璃滑道和通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)结构，并一起推进。
偶数通道接收100μl与固定化六聚物探针序列互补的Cy5标记的靶子，其定点于聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道结构的一端。奇数通道仅仅接收缓冲液。不使用两个外侧通道(1和20)。用约5分钟加液来保证充满了每个通道(一旦开始后，加液速度约1mm/s)。在30分钟之后，流体渗出通道，并且分离了玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)结构。在全浓度的缓冲液中摇动5分钟来进行清洗，然后在1/2浓度的缓冲液中摇动5分钟，然后离心干燥。使用Agilent扫描仪来检验滑道。
在接收Cy5标记的靶子的通道中杂交是明显的。在相邻通道之间存在极低的渗漏。通过比较奇数和偶数的通道，可以确定渗漏的量。靶子/缓冲液的信噪比通常是50∶1(20,000对400)，最高是160∶1(32,500对200)并且最低是11∶1(9,000对800)。
在类似的试验中，通道按如下顺序接收：空气；缓冲液；靶子；靶子；缓冲液；靶子；靶子等。结果如图51所示。仅在那些接收靶子的通道中可见荧光信号，在相邻通道之间没有交流。
在进步的试验中，用电化学方法[34]人工合成一系列寡聚核苷酸。在平行的条带中设置探针，在相邻条带之间分隔开。在聚二甲基硅氧烷(PDMS)中的通道是160μm宽，并设置与寡聚核苷酸条带相互垂直。镀条带上的通道的效果是沿着通道的长度形成一系列寡聚核苷酸小室。标记的靶子经由通道通过来容许杂交。图52显示以8个相邻通道(90a、90b、…90h)方式的效果。通过比较在小室91和92中的信号，测定在相邻通道之间的渗漏。类似地，通过将相邻细胞之间在小室94中的信号与在缺口94中的信号进行比较，测定杂交的信噪比。
因此杂交可以发生在没有标记渗漏入相邻通道并且没有Cy5标记靶子渗入空通道的通道中。杂交的信噪比良好。结果表明可独立地使用每个通道，容许在相邻通道中的单独分析。
动电学运动
为了改造图56的装置来容许物质在装置内的动电学运动(例如：细胞悬液和/或细胞溶解产物)，需要与微流体装置内部液体建立电接触。因此将装置改造成如图57所示。
将聚二甲基硅氧烷(PDMS)结构(101)固定在玻璃滑道(105)上，并且与微阵列(102)相接触。细胞样品(131)可以经由进入口(111a)进入装置并且经由端口(151)排出。端口(111a、111b、151)通过载体(105)。利用喷镀沉淀，将金属薄膜(145a、145b)沉淀到载体(105)的背面上。优选将用于其它的物理气相淀积技术例如电子束蒸发，因为其容许不仅在固定微流体装置的平面上沉淀，并且在入口孔(111a、111b)的侧壁上沉淀。经由在入口孔(111a、111b)壁上的导电层，可与在装置内的溶液(131)建立电接触。
由于在应用电势和电流通路期间金属薄膜可与流体接触，所以重要的是金属是惰性的。贵金属例如黄金和铂可用于此目的。首先沉淀铬关键层以便改善贵金属的粘合。通过遮罩沉淀薄膜，以便只覆盖端口附近的区域。用金属覆盖的区域充当粘合剂的衬垫。就每个粘合剂的衬垫而言，利用载有银的环氧树脂附于电插座(148)上。
因此通过端口111a、111b和151存在电传导面，并且该表面提供靠近的插座(例如：148)用于连接到电源上。图58说明该方案，显示金属薄膜层(145)与两个插头(148、151)和载体(105)相接触。
从细胞溶解产物中收集mRNA
在将细胞截留在本发明的装置中之后，溶解细胞，然后将其溶解的内含物在通道中分析。就mRNA分析而言，通过杂交分析细胞的mRNA。进行试验来观察溶解试剂和/或释放的非mRNA内含物是否影响杂交。
图60A显示在两种不同的溶解缓冲液中和在有提高浓度的细胞溶解物存在的情况下标记的mRNA与微阵列的杂交。样品从左侧流到右侧。自上而下，11种样品是：(1)对照杂交缓冲液；(2)LiDS缓冲液+2个溶解细胞的内含物；(3)LiDS缓冲液+50个细胞；(4)LiDS+100个细胞；(5)LiDS；(6)GuSCN缓冲液+2个细胞；(7)GuSCN+50个细胞；(8)GuSCN+100个细胞；(9)GuSCN；(10)对照缓冲液；(11)对照缓冲液。
图60B显示在通道中标记的mRNA与结合在玻璃载体上的寡聚核苷酸膜片的杂交。载体夹在微流体装置上，与图53中所示的相似。将在1XPBS中的细胞注入装置，随后使用1XPBS插头(来保持溶解缓冲液和细胞分离)，并且最终加入包含标记的合成小鼠HPRT mRNA的1％Triton X-100溶解缓冲液。将细胞溶解，并且将内含物和存在于溶解缓冲液中的合成mRNA一起注入通道。合成的mRNA与通道露出区域的寡聚核苷酸杂交。该通道是5μm宽，25μm高。
因此在有溶解缓冲液和细胞溶解产物的情况下杂交是可能的。因此当利用本发明时在常规的微阵列杂交试验之前不需要使用纯化步骤，并且有可能在化学溶解单细胞之后在装置的通道中获得并发现杂交，而溶解缓冲液和溶解产物都保持存在。
原位逆转录
常规微阵列技术需要将mRNA在与阵列上的探针杂交之前纯化、逆转录、扩增、标记并再次纯化。在其它技术中，将纯化的mRNA直接与阵列杂交。固定的双探针提供一个游离的3’末端，然后作为引物用于通过逆转录进行原位酶催化的扩增[56]。将荧光标记的dNTP加入反应以便得到的产物是mRNA的共价阵列结合标记的cDNA拷贝。因为将扩增的标记产物通过引物共价附着于阵列，所以可通过简单清洗该阵列来除去任何未掺入的核苷酸，而在产品产量上没有随后的损失。
本方法提供了更多复合物纯化和基于溶液标记的靶子的制备的简单替换方案，并且可以特异性改善向基于阵列的分析中加入酶。用于在模板和引物之间，尤其是在引物的延长端的末端碱基处的正确碱基配对的酶的需要，补充了单独的杂交反应的特异性。
进行该方法的目标是在poly-A尾部和mRNA特异性序列3’末端之间接合。该区域不大可能受在靶子中的二级结构和位阻的影响。
在通过墨喷装配常规合成微阵列之前，进行几个初步试验。利用ABI 394 DNA合成装置在由聚乙二醇200(15个原子)衍生的环氧衍生物载玻片上合成几段DNA寡聚核苷酸探针(20×20mm)，其与一段2.5个核苷酸相等。在“反向”方向上从5’到3’合成DNA探针序列5’-dT25oligo21-3’，容许引物从游离的3’-OH延伸。在初始试验中将人β-球蛋白polyA15IVT(利用T7RNA聚合酶体外转录获得)33P标记的mRNA与阵列杂交，拍照(图38A)，洗涤并且培养逆转录混合物。除去RNA，随后将包含来自mRNA5’末端的20-多聚物序列的Cy5标记的探针成功杂交，表明来自固定的引物延伸的逆转录已经完成(图38B)。
将逆转录步骤加入微阵列试验提供了与常规杂交相比的优点。就进行的引物延伸而言，酶需要在延伸引物的末端接近正确的碱基配对。如上述研究所证实的，这是寡聚核苷酸探针的区域，已知其对于杂交具有相对较小的影响。所以在探针的3’末端具有错配的靶子可以形成相对稳定的杂种导致杂交强度的显著性水平，但是不可能通过逆转录来延伸。此外，在靶子的标记拷贝制备期间，该引物延伸方法很少会在表达水平分析中由于错误插入而产生误差。应用mRNA组与DNA微阵列杂交的研究要求拷贝mRNA(并且有时扩增)并且在与阵列杂交之前进行标记。拷贝和扩增都是具有将不正确的碱基引入mRNA序列的可能性的步骤。例如，利用四种不同的逆转录酶和DNA聚合酶的RT-PCR的研究产生克隆，其中在4个克隆之间，并且20％的克隆包含突变序列。
除了特异性以外，mRNA在阵列上原位的直接拷贝使获得表达分析数据的步骤简单化。将纯化的聚腺苷酸mRNA与阵列直接杂交。当杂交时，完全相配的靶子探针复合物借助于直接插入荧光标记dNTP的逆转录酶来延伸。该延伸的标记产物共价结合于阵列上，以便可以通过有力的冲洗将未插入的核苷酸和任何未延伸的靶子从阵列上除去。在杂交之前不必拷贝、扩增或预标记mRNA。在标记的拷贝纯化期间没有样品损失。
在进一步的试验中，将细胞在覆盖有oligo-dT(30)的玻璃滑道上原位溶解。溶解缓冲液包含320mM蔗糖、5mM MgCl2、10mM Hepes和1％Triton-X100。在室温下在溶解的缓冲液中培养滑道90分钟，冲洗，然后利用Superscript III酶和红色荧光基团在45℃下与逆转录酶混合培养2小时。
结果证实mRNA可以与固定化寡聚核苷酸杂交，甚至是在有溶解缓冲液和细胞溶解产物的情况下，并且更转录可以在该条件下进行。
在最初产生mRNA/cDNA杂种的逆转录之后，有可能除去mRNA并合成cDNA的第二条链(图59)。图62显示完成了第二条链合成的试验结果。
将与小鼠HPRT mRNA的碱基800-859互补的oligo-DNA固定在NHS衍生的玻璃滑道上。将固定形状的容器用于将oligo-DNA固定到滑道表面的特定区域。将Cy3标记的合成的1200个碱基的RNA靶子与滑道杂交。在相同的容器内进行杂交，但是其已经稍有偏移以便确定RNA与滑道的任何非特异性结合。扫描滑道(图62A)。在37℃下进行杂交1小时。然后应用逆转录混合物，在500℃下培养1小时。在逆转录期间将Cy5标记插入DNA。然后冲洗滑道并扫描(图62B)。
然后将该阵列在标准RNAse H条件下处理来除去Cy3RNA，冲洗然后扫描(Cy3通道＝图62C；Cy5通道＝图62D)。RNase处理除去约75％的Cy3信号。
在第二条链的合成步骤中培养膜片的两个面。图62E说明在该阶段膜片是如何分离的-将一个正方形(“+pol”)用必要的试剂培养用于DNA合成，一个正方形没有DNA聚合酶(“-pol”)，并且不处理周围区域。这两个正方形包含60μmdNTP和20μMCy3-dCTP。第二条链的引物与完全延伸的cDNA序列的3’末端互补。因此只有逆转录的全长延伸产物能导致第二条链的合成。
图62F显示在Cy3通道中的“+pol”正方形比“-pol”正方形和周围区域都亮。但是通过Cy5通道，信号没有差异(图62G)。因此在逆转录步骤中存在大量的全长引物延伸(800个碱基)。
polyA/polyT相互作用对于杂交和逆转录的影响
在DNA寡聚核苷酸微阵列上的最佳杂交是在特异性和灵敏性之间的折衷；特异性发生于较短的寡聚核苷酸，而灵敏性随着寡聚核苷酸的长度而增加。为了表达分析，理想的目标是增加灵敏度而不减少特异性。
具有(polyA+)与不具有(polyA-)15个碱基polyA尾部的β球蛋白IVT的信号强度的比较表明poly rA:dT相互作用对于杂交产量具有非常重要的影响。
使用双标记法，其容许同时分析杂交和逆转录反应。通过利用CY3-dCTP直接插入来标记人β-球蛋白IVT。通过直接插入CY5-UTP来标记阵列上的逆转录。基于杂交和逆转录反应的阵列的略图如图39所示。将固定化探针在其5’末端经由连接子(91)结合到载体上，并且其具有poly-dT区域(92)和多至21个核苷酸的靶特异性序列(93)。mRNA靶子在其3’末端具有poly-A尾部(94)，并具有编码序列(95)。在该测试系统中，在转录期间将Cy3标记(96)插入来确定杂交(步骤A)。在步骤B中，在有Cy5标记的dCTP存在的情况下发生逆转录。所以延伸的探针包含Cy5标记(97)。
为了研究可以作为隔离物并且可以与mRNA尾部相互作用来“捕捉”多聚腺苷酸mRNA的poly-dT束，将dT0-25加入到固定化探针的5’末端，以五个增加直到最大值dT25为止。
在1M NaCl/20％甲酰胺缓冲液或者在42℃和50℃下的Superscript II逆转录酶1X反应缓冲液中进行与β-球蛋白IVT靶子的杂交。在室温下建立全部的杂交反应，然后在需要的温度下培养90分钟。
1 X 1M NaCl杂交混合物包含：1 X MES*、1M NaCl、20％甲酰按、20mM EDTA(pH8.0)、0.5mg/ml BSA、1％Triton X-100、140-280单位RNasinTM核糖核酸酶抑制剂(Promega)、8nM CY3标记的IVT靶子和H2O，加至250μl的量。
1 X Superscript II杂交混合物包含：50mM Tris-HCl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、20mM DTT、140-280单位RNasinTM核糖核酸酶抑制剂、0.5mg/ml BSA、8nM CY3标记的IVT靶子和H2O，加至250μl的量。
通过注射器和针头将混合物用于杂交容器的两部分。在42℃和50℃下在旋转的杂交恒温箱中培养该阵列90分钟。在培养之后将滑道从支持物上除去，并冲洗。冲洗(1)是以6 X SSPE、0.005％N-十二烷基-肌氨酸(在室温下50ml五分钟)。冲洗(2)是6 X SSPE、0.18％PEG200(在室温下50ml五分钟)。然后在压缩空气下干燥滑道并且在Agilent G2565BA扫描仪中进行扫描，或者开始逆转录反应。
杂交靶子的逆转录主要在杂交并且冲洗滑道后进行；在一例中在一步反应中一起进行杂交和逆转录。将Superscript II酶(Invitrogen)用于42℃下的反应，而Thermoscript(Invitrogen)用于高温60℃下的反应。利用Superscript II酶在42℃下的逆转录反应如下起始：反应混合物包含50mM Tris-HCl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、20mM DTT、140-280单位RNasinTM核糖核酸酶抑制剂、每种dNTP 100μM、8μM Cy5-dCTP、0.5mg/ml BSA、4000单位Superscript II酶和H2O，加至250μl的量。在室温下将混合物用于双杂交容器中的阵列，然后在42℃转炉中培养两个小时。当在单个反应中完成了杂交和逆转录时，将8nM终浓度的IVT RNA靶子加入到反应混合物中。
用于Thermoscript酶的反应缓冲液包含50mM乙酸Tris(pH 8.4)、75mM乙酸钾、8mM乙酸镁。混合物的所有其它组分是相同的。在60℃下分别培养反应混合物和滑道15分钟，以便在将混合物加入阵列之前都达到温度。在60℃下培养阵列两个小时。在培养之后，用6 X SSPE、0.005％N-十二烷基-肌氨酸(在室温下50ml五分钟)然后用0.06 X SSPE、0.18％PEG200(在室温下50ml五分钟)冲洗来从容器中除去滑道。在扫描之前用压缩空气干燥滑道。
在寡聚核苷酸探针和载体之间加入加长的poly-dT隔离物的效果如图40所示。在1M NaCl/甲酰胺和Superscript缓冲液中，poly-dT束相对于在等长聚合物上的六乙烯基-乙二醇连接子来说，在杂交强度上产生了四到五倍的增加。dT15束与最大的HEG5连接子长度同等。
到目前为止当poly-dT束超过15个碱基poly-A尾部的长度时，观察到对于杂交的最大影响，其是就常规连接子的强度而言的大约100倍。
利用20个碱基的探针长度，由15个碱基组成的poly dT25序列与poly-A尾部和10个碱基的附加“隔离物”杂交，5个HEG单位的更多隔离物的加入产生杂交信号的四倍增加。比较起来，将五单位的HEG加到dT10束上对于杂交产生了微乎其微的增加。该结果显示加入长的poIy-dT隔离物来收集poly-A终止mRNA靶子的好处。与常规连接子相比在强度上存在近似300倍的增加。
为了研究在杂交步骤中poly-A/poly-dT相互作用的意义和作用，将没有poly-A尾部的IVT(42B)的杂交特性与具有poly-A尾部的IVT(42A)的杂交特性相比较。在相同滑道的两个阵列上进行杂交。将Superscript II缓冲液用作杂交缓冲液，并且杂交温度是42℃。阵列的扫描图象如图42所示。很明显在缺少poly-A尾部(即在图42B中)整个杂交明显减少。
在两个靶子之间就poly dT束增加的长度对于杂交产量的影响而进行的比较如图41所示，其中将poly dT束引入其自身的20多聚物探针的5’末端，并与HEG隔离物结合。就polyA-IVT而言，其中dT序列仅仅作为隔离物，观测到在强度上相对小的并且线性的增加，直到最大值dT25为止，并且在大小上类似于加入相等数量的HEG隔离物所观测到的强度。最明显的观测是在polyA+靶子上增加dT长度的效果。在dT15及以下，polyA+靶子的杂交强度小于polyA-的杂交强度，尽管dT束可以与polyA尾部形成双链体。当dT束的长度超过polyA尾部的长度时，观察到杂交强度上的对数增加。具有polyA尾部的靶子的杂交强度是在dT25上没有polyA尾部的靶子的杂交强度的三倍。
测定dT束长度对于逆转录产量的效果，并其与杂种产量的效果相比较。通过将五单位的六乙烯基乙二醇隔离物加到寡聚核苷酸引物上对于产物产量没有影响。相反，通过将poly dT0-25束置于载体和20个碱基寡聚核苷酸引物之间对于cDNA产物产量有明显影响。图43比较了RT和杂种产量。在NaCl/甲酰胺(43A)和Superscript II(43B)缓冲液中延伸的cDNA产物的强度产量与靶子引物异源双链相似。更短的探针也显示了相同的效果。
通过比较有无polyA尾部的β-球蛋白IVT的产品产量来研究polyA/polyT相互作用在逆转录中的作用。在副本中进行试验。一个试验显示明显的延伸(图44)。第二个试验显示21个碱基探针的任何20个没有明显延伸，但是据信由于未知原因，在第二个试验中杂交和逆转录都不能进行。
将加长的poly-dT束加到寡聚核苷酸探针上的结果如图45所述。将1到5个单位的dT5插入寡聚核苷酸引物的5’端。逆转录的结果近似按照杂交所观察到的结果。
总的说来，poly-dT:poly-rA相互作用通过提高杂种的稳定性和/或杂交的比例以降低特异性为代价来提高产量。然而，包含逆转录大大地提高了特异性，并且可以在高温下产生接近完美的差别。
单分子检测
就荧光基团的灵敏检测而言，将扫描仪在大约130nm的象素分辨率和波长580nm(Cy3发射波长)下在300nm(使用Sparrow氏标准)和370nm(使用Raleigh氏标准)之间的衍射限制分辨率下进行操作。因此在Nyquist氏标准内全部的衍射限制分辨率都是可用的。激发波长是532nm。利用冷却的每像素12位的具有商业上干燥的光学显微镜的CCD来获得发射光。
应用线性编码器以100nm的分辨率来控制样品的位置垂直于光轴。在闭环中主动控制和操作微定位阶段。
利用大约1kW/cm2的感光强度，均匀感光产生(如果分析单个像素的话)在最高值中心的单象素中每一荧光染色分子大约大约55个CCD计数。该结果的感光时间是100ms。在相同条件下的噪声是大约每一像素10个计数，对于检测单象素中的单个分子产生约5∶1的信噪比。因为衍射限制的斑点较大(大约9像素)，所以应用特有的分析信噪比可以超过该值。
应用该扫描仪，可以从单个染色分子起计算发射。图61显示以最大激光量应用100ms曝光时间在单个水平样品位置上收集的100×100象素面积(相当于(13μm)2)的图象。最后，可见光致退色的染色分子。在图61中可见小的高强度斑点，其相当于单个cDNA分子。
图73显示漂白不是以平滑的类似变化存在，而是每当漂白或再发射染色分子时是分层的。因此量化是指分子计数不需要依靠单独的空间分辨，因为也可以使用强度鉴别。从此，可以在单个位置上计数一个以上的分子。
形成寡聚核苷酸条带
正如以上的讨论，可使用各种方法将寡聚核苷酸条带固定在载体上。
在图64所说明的本方法的实施方案中，已经将预合成的寡聚核苷酸共价结合到镀NHS的玻璃滑道上。将在5’末端用Cy5标记的3’-NH2-C7改变的16多聚物通过通道到达滑道的表面。在0.1-10μM范围的寡聚核苷酸、pH 9.0/DMSO的0.2M磷酸盐缓冲液中使用各种浓度的寡聚核苷酸。图65显示产生的滑道的荧光图象，证实了该连接方法的效力。
应用光致断裂保护基的方法如图66所示。如图所示衍生了覆盖氨基的表面。将产生的光敏表面暴露于有适当掩蔽的紫外光，除去光不稳定保护基并且暴露活性NHS酯基团的条带。然后将表面暴露于适当的氨基改变的寡聚核苷酸以便共价结合到表面上。在图65中所用的荧光标记的探针也用于该技术，其使用三种不同宽度的紫外线条带来脱保护，并且结果如图67所示。将互补的Cy3标记的寡聚核苷酸用于证实固定化寡聚核苷酸的方向及其用于杂交的有效性。结果如图68所示。
可以利用酸不稳定性保护基来进行类似的方法，其应用参考文献32到34和49的电化学方法来产生酸的条带。
计算机建模
准备计算机模型用于靶子以一定范围的通道高度和流速，流过宽80μm的通道，到达长度和宽度40×80μm的探针膜片处。使用19μm2/s的扩散系数，其相当于250bp的靶长度。将不定的速率常数用于靶子-探针杂交，其具有零点偏移的速率常数，以便到达探针表面的所有靶子立即杂交并且留在那里。
根据该模型，如果mRNA分子以12.5μm/s的流速流过在高1-5μm的通道中长度80μm的膜片，则将吸收超过99％的分子。不论分子是以活塞式流动(电泳)还是通过层流(溶液的大量运输)来移动，在收集的比例都没有差别。
可以通过在大约2V/cm下电泳来达到该流速。在该流速下，将需要大约800秒穿过1cm长的通道，传递约100-200个探针。
利用等速分布(活塞式流动)和19μm2/s的扩散系数，将靶子以一定范围的通道高度和流速，流过宽80μm的通道，到达宽度80μm并且长度10、20和40μm的探针处，该模型表明可以容易地达到≥95％的杂交。
很清楚仅以举例的方式描述了本发明，可以进行细节的改变而不脱离本发明的精神和范围。
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Claims (68)
1.一种用于单个分析目的细胞的装置，包含：
-接收目的细胞内含物的通道，其中该通道具有一个输入端和一个输出端，以及
-接近于该通道输入端的细胞收集部位，
其中：
-改变该通道的输入端以便使完整的目的细胞不能进入该通道；
-该通道包含一个或多个用于分析目的细胞内含物的分析组分；以及
-可以将目的细胞内含物沿着该通道在从输入端向输出端的方向上移动。
2.权利要求1的装置，其中该装置具有：很多所述的通道，每个通道用于接收单个目的细胞的内含物；以及接近于每个通道输入端的细胞收集部位。
3.权利要求2的装置，其中该通道基本上彼此相同以便在使用期间使在不同的通道中的细胞彼此之间分别受到基本上相同的处理和分析。
4.权利要求3的装置，其中每个通道沿着该通道包含一系列分析组分，并且其中在一个通道中的分析组分的顺序与在另一个通道中的相同。
5.权利要求2到4的任何一个的装置，其中通道基本上彼此平行。
6.权利要求5的装置，其中这些通道彼此紧挨着排列在单个平面内。
7.任一以上权利要求的装置，其中该通道具有基本上恒定的横截面积和/或基本上恒定的横截面形状。
8.任一以上权利要求的装置，其中该通道具有矩形的横截面形状。
9.任一以上权利要求的装置，其中该通道具有＜50μm的高度。
10.任一以上权利要求的装置，其中该通道是关闭的，除非朝着从输入端向输出端流动的方向。
11.任一以上权利要求的装置，其中该细胞收集部位在通道的输入端之前采取锥形进口的形式。
12.权利要求11的装置，其中可以通过利用电运动将细胞移入锥形进口中。
13.任一以上权利要求的装置，其中通道包括(i)在其细胞收集部位和其通道输入端之间或(ii)其输入端的紧接着的下游的扩大室。
14.任一以上权利要求的装置，其中通道包含聚二甲硅氧烷壁。
15.任一以上权利要求的装置，其中通道包含玻璃壁。
16.权利要求15的装置，其中通道由在平面玻璃载体上设置的聚二甲硅氧烷组成。
17.任一以上权利要求的装置，其中分析组分是固定化结合试剂。
18.权利要求17的装置，其中分析组分是共价固定的。
19.权利要求17或权利要求18的装置，其中结合试剂包括用于杂交的核酸。
20.权利要求19的装置，其中核酸可以保留mRNA转录本。
21.权利要求19或20的装置，其中核酸是DNA。
22.权利要求19到21的任何一个的装置，其中核酸＜200nt。
23.权利要求17到22的任何一个的装置，其中结合试剂包括固定化蛋白质。
24.权利要求17到23的任何一个的装置，其中结合试剂包括固定化抗体。
25.权利要求17到24的任何一个的装置，其中分析试剂仅仅沿着通道的单侧来固定分析试剂。
26.权利要求17到25的任何一个的装置，每一通道包含至少100种不同的分析试剂。
27.权利要求17到26的任何一个的装置，其中将不同的固定化结合试剂设置在独立膜片内。
28.权利要求27的装置，其中固定化试剂的每个膜片具有小于10-8m2的面积。
29.权利要求27或28的装置，其中相邻膜片的中心间距优选小于10-3m。
30.权利要求27到29的任何一个的装置，其中膜片具有矩形形状。
31.权利要求27到30的任何一个的装置，其中设置膜片沿着通道的长度从输入端向输出端逐一串联。
32.权利要求27到31的任何一个的装置，其中膜片占据通道的全宽。
33.任一以上权利要求的装置，包含多通道和很多固定化分析试剂，其中通道贯穿固定化分析试剂的条带。
34.权利要求33的装置，其中通道是直的，并且基本上彼此平行。
35.权利要求33或权利要求34的装置，其中固定化分析试剂的条带是直的，并且基本上彼此平行。
36.权利要求33到35的任何一个的装置，其中固定化分析试剂的条带与通道基本上相互垂直。
37.任一以上权利要求的装置，包括与细胞收集部位相连的输出管。
38.权利要求37的装置，其中输出管垂直于通道。
39.权利要求37的装置，其中输出管平行于通道。
40.任一以上权利要求的装置，包括与细胞收集部位相连的试剂供给管。
41.权利要求37到40的任何一个的装置，其中输出管和/或试剂供给管高于通道。
42.任一以上权利要求的装置，包括与分析通道的输出端相连的排气装置。
43.任一以上权利要求的装置，包括用于通过通道移动液体的泵。
44.任一以上权利要求的装置，包括一个或多个电极，或用于连接电极的插头。
45.权利要求44的装置，其中电极可用于产生沿着通道的电势。
46.任一以上权利要求的装置，包含光源。
47.任一以上权利要求的装置，包含摄像机。
48.一种用于分析单个目的细胞的方法，包含以下步骤：将细胞收集到接近于具有一个输入端和一个输出端的通道的输入端，改变该输入端以便使目的细胞不能完整进入该通道；释放该细胞的内含物以便其进入该通道的输入端；容许释放的内含物从输入端向输出端运动，以便其在通道内与一种或多种分析组分相互作用，从而容许内含物的分析。
49.权利要求48的方法，利用了权利要求1到47的任何一个的装置。
50.权利要求48或49的方法，其中通过电运动沿着通道移动细胞内含物。
51.权利要求48或49的方法，其中通过抽吸沿着通道移动细胞内含物。
52.权利要求48到51的任何一个的方法，其中分析组分可以通过核酸杂交收集来自细胞的mRNA。
53.权利要求52的方法，其中通过分析组分收集的mRNA是逆转录的。
54.权利要求53的方法，其中分析包含以下步骤：(i)容许mRNA与在通道中的固定化核酸杂交，以便在杂种中mRNA具有单链延伸；(ii)利用单链延伸作为模板在杂种中延长固定化核酸，其中延长反应将可检测标记插入固定化核酸中。
55.权利要求54的方法，其中分析进一步包含以下步骤：(iii)熔解杂种并容许游离的核酸再退火形成固定化核酸，来形成新的杂种，其中游离的核酸具有单链延伸；以及(iv)重复步骤(ii)至少n次，其中n是大于1的整数，假如n＞1则在步骤(ii)的至少第一个n-1重复之后进行步骤(iii)。
56.权利要求52到55的任何一个的方法，其中利用能鉴定单个荧光基团的装置来检测DNA/mRNA杂种。
57.权利要求52到56的任何一个的方法，其中收集细胞内至少80％的mRNA靶用于分析。
58.用于制备权利要求1到47的任何一个的装置的方法，其中通道是聚合材料形成的。
59.权利要求58的方法，其中聚合材料是光可聚合的。
60.权利要求58的方法，其中通道由聚合材料浇铸或注入成型来形成。
61.权利要求58到60的任何一个的方法，其中聚合材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
62.权利要求58到61的任何一个的方法，其中分析组分是用于杂交的固定化核酸。
63.权利要求62的方法，其中利用原位合成法将核酸固定于该装置的表面。
64.权利要求62的方法，其中在将核酸固定于该装置的表面之前合成该核酸。
65.权利要求63或权利要求64的方法，其中通过在微流体通道基片上反应面和开放的微流体通道之间形成接触点来将核酸施加到装置的表面；(b)将试剂引入微流体通道以便该试剂沿着接触条带接触反应面，所述的接触条带由在反应面和开放的微流体通道之间的接触点形成；以及(c)分离反应面和微流体通道，留下在反应面上沿着接触条带固定的试剂。
66.权利要求63或权利要求64的方法，其中通过脱保护在基片表面上的区域来暴露活性基团从而将核酸施加于装置的表面，并且将预合成的核酸施加于基片来容许其结合到有活性的暴露的活性基团上。
67.权利要求66的方法，其中脱保护是光脱保护。
68.权利要求66的方法，其中脱保护是电化学脱保护。
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Application publication date: 20080625 |