JP2017518752A - 捕捉用重合体膜を用いた単細胞捕捉 - Google Patents
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Abstract
本発明は、捕捉用重合体膜を用いて単細胞を捕捉する方法、システム、アセンブリ、及び物品を提供する。ある特定の実施形態において、捕捉用重合体膜は、頂部及び底部開口を有する複数の個別流路を含み、流路は、単細胞が:i)底部開口に負圧が提供された場合に、流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に流路を閉塞させるような;またはii)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、流路には入らないような寸法である。いくつかの実施形態において、捕捉用重合体膜の流路は、マルチウェルチップのウェルと一直線に並んでいて、細胞、または単細胞の内容物を、対応するウェルに移送することができるようになっている。【選択図】図1A
Description
本出願は、2014年6月12日出願の米国仮出願番号第62/011,267号、及び、2014年12月1日出願の米国仮出願番号第62/086,044号の優先権を主張し、これらは両方共、そのまま全体が本明細書中に参照として援用される。
本発明は、捕捉用重合体膜を用いて単細胞を捕捉する方法、システム、アセンブリ、及び物品を提供する。ある特定の実施形態において、捕捉用重合体膜は、頂部開口及び底部開口を有する複数の個別流路を備え、流路は、単細胞が:i)底部開口に負圧が提供された場合に、流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に流路を閉塞させるような;またはii)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、流路には入らないような寸法である。いくつかの実施形態において、捕捉用重合体膜の流路は、マルチウェルチップのウェルと一直線に並んでいて、細胞、または単細胞の内容物を、対応するウェルに移送することができるようになっている。
遺伝学者は、癌、自己免疫障害、及び神経障害のような複雑な疾患を特性決定すべく努力しているが、こうした疾患を駆動する発症機序はとらえどころがないと感じている。体細胞突然変異、すなわち生涯にわたって細胞に蓄積する自然変異は、疾患の発症及び再発を駆動する主要因である。細胞は、新たな突然変異を蓄積すると、正常細胞と共存するポリクローナル細胞集団を形成する。細胞集団総体での配列決定は、根底にあるこれら独特で珍しい細胞型の異種性を遮蔽する恐れがあり、これらと正常生殖細胞系列突然変異とを区別することを困難にする。こうした差異を明らかにしてクローン構築物を視覚化する最良の方法は、集団中の細胞を個別に配列決定することである。単細胞配列決定は、複雑な疾患の機序を明らかにする助けとなる可能性があるものの、従来のアプローチは高価で、多大な労力を必要とし、しかも大量の試料入力を必要とする。必要とされているのは、単細胞、例えば、マルチウェルデバイスで使用するのに適した単細胞を単離する方法である。
本発明は、捕捉用重合体膜を用いて単細胞を捕捉する方法、システム、アセンブリ、及び物品を提供する。ある特定の実施形態において、捕捉用重合体膜は、頂部開口及び底部開口を有する複数の個別流路を備え、流路は、単細胞が:i)底部開口に負圧が提供された場合に、流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に流路を閉塞させるような;またはii)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、流路には入らないような寸法である。いくつかの実施形態において、捕捉用重合体膜の流路は、マルチウェルチップのウェルと一直線に並んでいて、細胞、または単細胞の内容物を、対応するウェルに移送することができるようになっている。
ある特定の実施形態において、本発明は、重合体膜上で個別流路またはスポットにより単細胞を捕捉する方法、システム、アセンブリ、及び物品を提供する。ある特定の実施形態において、重合体膜は、特定の寸法及び負圧を利用して単細胞を捕捉することができる複数の個別流路を(例えば、マルチウェルと一致するパターンで)有する。他の実施形態において、重合体膜は、単細胞を捕捉することができる複数の個別親水性スポットを(例えば、マルチウェルと一致するパターンで)有する。ある特定の実施形態において、そのような重合体膜は、マルチウェルと一致するパターンで単細胞を捕捉した状態で、一致するウェル開口パターンを持つマルチウェルプレートまたはマルチウェルチップと嵌合させられて、捕捉された細胞がマルチウェルプレートまたはマルチウェルチップに吐出できるようになっており、各ウェルが単細胞を受け取ることができる(例えば、それから単細胞を溶解して核酸配列決定することができる)。ある特定の実施形態において、サイズ排除重合体膜、例えば、マルチウェルデバイスに貼付され(例えば、PCR適合性両面接着剤により)このデバイスと整列したサイズ排除重合体膜が採用される。いくつかの実施形態において、マルチウェル貫通デバイスは、細胞寸法の頂部開口及びそれより大きい底部開口(例えば、反応成分を受け取るように構成されている)を備えている。他の実施形態において、マルチウェルデバイスは、マルチウェル貫通穴チップの底部にPCR適合性膜を貼付することにより作製される。さらなる実施形態において、本明細書中に提供されるのは、細胞寸法の陥凹またはウェル(例えば、それぞれが単細胞を収容する)を持つ捕捉チップであり、このチップは、単細胞を剥離させる及び/または溶解する試薬を含有する複数のウェルを持つマルチウェルデバイスと嵌合させることができる。捕捉チップ及びマルチウェルデバイスは、チップの陥凹とデバイスのウェルが整列するように嵌合させることができ、次いで試薬が、マルチウェルデバイスのウェルから細胞寸法の陥凹に入っている細胞へと流れるように処理することができ、次いで処理された細胞がマルチウェルデバイスのウェルへ流入できるように再度処理することができるようになっている。
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるのは、重合体膜を含む製品であり、重合体膜は、上面、底面、及び重合体膜を貫通して延びる複数の個別流路(例えば、マルチウェルデバイスパターンで配列している)を備え、個別流路はそれぞれ:a)重合体膜の上面に頂部開口を有し、b)重合体膜の底面に底部開口を有し、かつc)細胞懸濁液から1個の細胞が、その1個の細胞のみで、i)底部開口に負圧が提供された場合に、個別流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に個別流路を閉塞させるような;またはii)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、個別流路には入らないような寸法である。特定の実施形態において、複数の個別流路の頂部開口は、マルチウェルデバイス(例えば、マルチウェルプレートまたはマルチウェルチップ)のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ。
特定の実施形態において、本明細書中に提供されるのは、以下を備えるシステムまたはアセンブリである:a)重合体膜、重合体膜は、上面、底面、及び重合体膜を貫通して延びる複数の個別流路を備え、個別流路はそれぞれ:i)重合体膜の上面に頂部開口を有し、ii)重合体膜の底面に底部開口を有し、かつiii)細胞懸濁液から1個の細胞が、その1個の細胞のみで、A)底部開口に負圧が提供された場合に、個別流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に個別流路を閉塞させるような;またはB)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、個別流路には入らないような寸法である;ならびにb)液体は通過させるが細胞は通過させない多孔質材料を含む多孔質層、多孔質層は、複数の個別流路の各底部開口が多孔質材料で覆われるように、重合体膜の底面と接触させられる寸法である。
さらなる実施形態において、本明細書中提供されるのは、単細胞を単離する方法であって、該方法は以下を含む:a)細胞懸濁液を細胞単離システムと接触させること、細胞単離システムは以下を備える:i)重合体膜、重合体膜は、上面、底面、及び重合体膜を貫通して延びる複数の個別流路を備え、個別流路はそれぞれ:A)重合体膜の上面に頂部開口を有し、B)重合体膜の底面に底部開口を有し、かつC)細胞懸濁液から1個の細胞が、その1個の細胞のみで:1)底部開口に負圧が提供された場合に、個別流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に個別流路を閉塞させるような;または2)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、個別流路には入らないような寸法である;ii)負圧を提供する空気圧デバイス、空気圧デバイスは接触面を備える、ならびにiii)液体は通過させるが細胞は通過させない多孔質材料を含む多孔質層、多孔質層は、A)複数の個別流路の各底部開口が多孔質材料で覆われるように、重合体膜の底面と;及びB)空気圧デバイスの接触面と接触している;b)細胞懸濁液を細胞単離システムとともにインキュベートすること、このとき空気圧デバイスは、各個別流路が1個の捕捉細胞を有するように重合体膜の個別流路がそれぞれ、1個の細胞を、その1個の細胞のみで、細胞懸濁液から捕捉するように負圧を提供する;ならびにc)重合体膜を洗浄して、細胞懸濁液から捕捉されなかった細胞を除去し、細胞を捕捉した重合体膜を作製すること。
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、細胞を捕捉した重合体膜とマルチウェルデバイス(例えば、マルチウェルプレートまたはマルチウェルチップ)を一緒にしてアセンブリを作製することを含み、このマルチウェルデバイスは、複数のウェル開口を有し、細胞を捕捉した重合体膜の複数の個別流路の頂部開口は、マルチウェルデバイスの複数のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ。特定の実施形態において、本方法はさらに、個別流路のそれぞれについて1個の捕捉細胞が、または個別流路のそれぞれについて1個の捕捉細胞の一部内容物が、マルチウェルデバイス(例えば、マルチウェルプレートまたはマルチウェルチップ)の対応するウェル開口へと移送されるように、アセンブリを処理する工程を含む。ある特定の実施形態において、アセンブリは、重合体からマルチウェルデバイスへ細胞を放出するように、あるいは負圧が止められ、及び/または正圧が用いられて細胞が放出されるように構成されている。
ある特定の実施形態において、捕捉細胞は、マルチウェルデバイスと接触する前に、重合体上にある状態のままで、溶解させられる。他の実施形態において、本方法はさらに、1個の捕捉細胞または1個の捕捉細胞の内容物が修飾されるように、マルチウェルデバイスのウェル開口のそれぞれに試薬を添加する工程を含む。さらなる実施形態において、試薬は、以下からなる群より選択される:緩衝液、溶解用緩衝液、ポリメラーゼ、配列決定試薬、プロテイナーゼ、及びヌクレオチド。特定の実施形態において、単細胞がマルチウェルデバイスの複数ウェルのそれぞれに入ったら、使用者または自動システム(例えば、WAFERGEN製)が、ニッカーゼ及びポリメラーゼ(例えば、Pyrophage3137ポリメラーゼ)のカクテルならびに溶解用緩衝液を分配する。次いで、ウェルを約37℃、次いで95℃で処理してニッカーゼを不活化し、ポリメラーゼを使用して等温増幅を行う。ある特定の実施形態において、代替方法として細胞を熱溶解する。次いで、プロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼK)をウェルに分配して、55℃でインキュベートし(pyrophage3137などのポリメラーゼを消化するため)、95℃でインキュベーションを行うことによりプロテイナーゼを不活化する。次いで、遺伝子特異的反応を各ウェルで行う。
さらなる実施形態において、複数の個別流路の頂部開口は、マルチウェルデバイスのウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ。さらなる実施形態において、複数の個別流路は、少なくとも50、少なくとも500、少なくとも5000、または少なくとも50,000の個別流路(例えば、少なくとも50・・・100・・・687・・・1000・・・5000・・・7500・・・13,000・・・33,000・・・または50,000の個別流路)を含む。ある特定の実施形態において、マルチウェルデバイスのウェル開口は、それぞれが、約50μm〜900μm(例えば、50・・・100・・・300・・・500・・・700・・・900um)の直径を有する。
いくつかの実施形態において、マルチウェルデバイスの複数のウェルは、少なくとも50、少なくとも500、少なくとも5000、または少なくとも50,000の個別ウェル(例えば、少なくとも50・・・100・・・687・・・1000・・・5000・・・7500・・・13,000・・・33,000・・・または50,000の個別ウェル)を含む。
いくつかの実施形態において、マルチウェルデバイスの複数のウェルは、少なくとも50、少なくとも500、少なくとも5000、または少なくとも50,000の個別ウェル(例えば、少なくとも50・・・100・・・687・・・1000・・・5000・・・7500・・・13,000・・・33,000・・・または50,000の個別ウェル)を含む。
さらなる実施形態において、重合体膜は、疎水性重合体で構成される。ある特定の実施形態において、疎水性重合体は、ポリイミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、TEFLON(登録商標)、及び/またはPTFEを含む(例えば、約20〜30μm厚さで、3〜5μmの穴を有するものである)。他の実施形態において、重合体膜の上面は、疎水性コーティングを備える。特定の実施形態において、疎水性コーティングは、以下からなる群より選択される材料を含む:ポリアクリル酸化合物(例えば、ポリ(アクリル酸ブチル)、及びポリ(アクリル酸メチル)、アクリロニトリル重合体及び共重合体(例えば、ポリアクリロニトリル)、マレイン酸無水物共重合体(例えば、ポリ(スチレン−co−マレイン酸無水物))、メタクリル酸重合体(例えば、ポリ(メタクリル酸ベンジル)及びポリ(メタクリル酸ブチル))、アミド及びイミド(例えば、ナイロン)、カーボナート(例えば、ポリ(ビスフェノールAカーボナート))、ジエン(例えば、ポリブタジエン)、エステル(例えば、ポリ(1,4−ブチレンサクシネート))、エーテル(例えば、ポリ(プロピレングリコール))、フルオロカーボン(例えば、ポリ(テトラフルオロエチレン))、フルオロシラン、オレフィン(例えば、ポリエチレン)、スチレン(例えば、ポリスチレン)、ビニルアセタール(例えば、ポリ(ビニルブチラール−co−ビニルアルコール−co−酢酸ビニル))、ビニル及びビニリデンの塩化物(例えば、ポリ(塩化ビニル))、ビニルエステル(例えば、ポリ(酢酸ビニル))、ビニルエーテル及びケトン(例えば、ポリ(エチルビニルエーテル))、ビニルピリジン及びビニルピロリドン重合体(例えば、ポリ(4−ビニルピリジン))、Lotus Leaf製HYDROFOEコーティング、ならびにACULON疎水性コーティング。
ある特定の実施形態において、多孔質材料は、以下からなる群より選択される:硬質多孔性発泡体、超高分子量ポリエチレン(UHMWPE)、高密度ポリエチレン(HDPE)、低密度ポリエチレン(LDPE)、超低密度ポリエチレン(VLDPE)、ポリプロピレン(PP)、エチレン酢酸ビニル(EVA)、ポリスチレン(PS)、エポキシガラス、及びフェノールガラス。他の実施形態において、多孔質材料は、GENPORE(Morgantown、RD)、POREX(Fairburn、GA)、またはPERMAPLAS Corp.(Fayetteville、GA)製材料である。
さらなる実施形態において、個別流路の各頂部開口は、直径が約5μm〜約80μm(例えば、5・・・15・・・25・・・45・・・・65・・・または約80um)である。ある特定の実施形態において、個別流路は、レーザーで形成された流路である(例えば、UVレーザードリルまたはCO2もしくはエキシマーレーザードリルを使用して)。他の実施形態において、フォトリソグラフィーまたはプラズマエッチングを用いて、重合体膜に流路を作製する。ある特定の実施形態において、重合体膜は、約1平方センチメートル〜約16平方センチメートル(例えば、1・・・5・・・10・・・13・・・または16平方センチメートル)である。
ある特定の実施形態において、本システムはさらに、マルチウェルデバイス(例えば、マルチウェルプレートまたはマルチウェルチップ)を備え、複数の個別流路の頂部開口は、マルチウェルデバイスのウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ。他の実施形態において、重合体膜は、厚さが25μm〜2mm(例えば、25μm・・・75μm・・・500μm・・・1mm・・・2mm)である。他の実施形態において、複数の個別流路は、それぞれが、ほぼ円筒状をしている。
いくつかの実施形態において、個別流路のそれぞれについて1個の細胞は、以下からなる群より選択される:血小板(約2μm径)、赤血球(約3〜8μm径)、好中球(約8〜10μm径)、リンパ球(約6〜12μm径)、外分泌細胞(約10μm径)、線維芽細胞(約10〜15μm径)、骨細胞(約10〜20μm径)、軟骨細胞または肝細胞(約20μm径)、杯細胞または線毛細胞(約50μm長及び5〜10μm幅)、マクロファージ(約20〜80μm径)、造血幹細胞(約30〜40μm径)、貯蔵脂質で満たされた脂肪細胞(約70〜120μm径)、及びニューロン(約4〜120μm径)。ある特定の実施形態において、細胞は、原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞)である。
いくつかの実施形態において、本システムはさらに、c)負圧を提供する空気圧デバイスを備え、この空気圧デバイスは接触面を備え、かつ多孔質層は空気圧デバイスの接触面と接触する寸法である。他の実施形態において、空気圧デバイスは、個別流路が全てまたは実質的に全て、部分的にまたは実質的に細胞で閉塞しているかどうかを判定することを可能にする高精度ゲージを備える。他の実施形態において、多孔質層は、重合体膜の底面及び空気圧デバイスの接触面と接触している。特定の実施形態において、空気圧デバイスはさらに、個別流路のそれぞれから1個の細胞を押し出すのに十分な正圧を提供するように構成されている。他の実施形態において、細胞懸濁液は、100〜1×1013個(例えば、100・・・1000・・・1×106・・・1×109・・・1×1012及び1×1013)の細胞を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供されるのは、重合体膜を含む製品であり、重合体膜は、上面を備え、上面は、マルチウェルパターンで配列された複数の個別親水性スポットを除いては、ほぼまたは完全に疎水性であり、個別親水性スポットはそれぞれ、1個の細胞が、その1個の細胞のみで、細胞懸濁液から個別親水性スポットそれぞれにより捕捉されるような大きさであり、マルチウェルパターンは、マルチウェルデバイス(例えば、マルチウェルプレートまたはマルチウェルチップ)の複数のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ。特定の実施形態において、親水性スポットは、ポリドーパミンまたは同様な材料で構成される(Kang and Choi, Bull. Korean, Soc., 2013, 34(8):2525−2527を参照、本明細書中参照として援用される)。他の実施形態において、個別親水性スポットは、直径が5〜30μm(例えば、約5・・・15・・・25・・・または約30μm)である。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供されるのは、以下を備えるシステムである:a)マルチウェルデバイス(例えば、マルチウェルプレートまたはマルチウェルチップ)、マルチウェルデバイスは、複数のウェル開口を備える、及びb)上面を備える重合体膜、上面は、マルチウェルパターンで配列された複数の個別親水性スポットを除いては、疎水性であり、個別親水性スポットはそれぞれ、1個の細胞が、その1個の細胞のみで、細胞懸濁液から個別親水性スポットそれぞれにより捕捉されるような大きさであり、マルチウェルパターンは、マルチウェルデバイスの複数のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ。
特定の実施形態において、本明細書中提供されるのは、以下を含む方法である:
a)細胞懸濁液を細胞単離用重合体膜と接触させること、細胞単離用重合体膜は、上面を備え、上面は、マルチウェルパターンで配列された複数の個別親水性スポットを除いては、疎水性であり、個別親水性スポットはそれぞれ、1個の細胞が、その1個の細胞のみで、細胞懸濁液から個別親水性スポットそれぞれにより捕捉されるような大きさであり、マルチウェルパターンは、マルチウェルデバイス(例えば、マルチウェルプレートまたはマルチウェルチップ)の複数のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ;b)個別親水性スポットがそれぞれ1個の捕捉細胞を有するように、個別親水性スポットが1個の細胞を、その1個の細胞のみで、細胞懸濁液から捕捉するように細胞懸濁液を細胞単離用重合体膜とともにインキュベートすること;ならびにc)細胞単離用重合体膜を洗浄して、細胞懸濁液から捕捉されなかった細胞を除去し、細胞を捕捉した重合体膜を作製すること。
a)細胞懸濁液を細胞単離用重合体膜と接触させること、細胞単離用重合体膜は、上面を備え、上面は、マルチウェルパターンで配列された複数の個別親水性スポットを除いては、疎水性であり、個別親水性スポットはそれぞれ、1個の細胞が、その1個の細胞のみで、細胞懸濁液から個別親水性スポットそれぞれにより捕捉されるような大きさであり、マルチウェルパターンは、マルチウェルデバイス(例えば、マルチウェルプレートまたはマルチウェルチップ)の複数のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ;b)個別親水性スポットがそれぞれ1個の捕捉細胞を有するように、個別親水性スポットが1個の細胞を、その1個の細胞のみで、細胞懸濁液から捕捉するように細胞懸濁液を細胞単離用重合体膜とともにインキュベートすること;ならびにc)細胞単離用重合体膜を洗浄して、細胞懸濁液から捕捉されなかった細胞を除去し、細胞を捕捉した重合体膜を作製すること。
さらなる実施形態において、本方法はさらに、細胞を捕捉した重合体膜とマルチウェルデバイス(例えば、マルチウェルプレートまたはマルチウェルチップ)を一緒にしてアセンブリを作製することを含み、この場合、マルチウェルデバイスは複数のウェル開口を有し、細胞を捕捉した重合体膜の複数の個別親水性スポット(それぞれが捕捉した細胞を持つ)は、マルチウェルデバイスの複数のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ。他の実施形態において、本方法はさらに、個別親水性スポットのそれぞれについて1個の捕捉細胞が、または個別親水性スポットのそれぞれについて1個の捕捉細胞の一部内容物が、マルチウェルデバイス(例えば、プレートまたはマルチウェルチップ)の対応するウェル開口へと移送されるように、アセンブリを処理する工程を含む。例えば、ある特定の実施形態において、アセンブリは、遠心されて細胞を移送する、または緩衝液条件を変化させることで親水性スポットから細胞を放出することができる。特定の実施形態において、細胞は、マルチウェルデバイスと接触する前に、重合体膜上で、溶解させられる。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、1個の捕捉細胞または1個の捕捉細胞の内容物が修飾されるように、マルチウェルデバイスのウェル開口のそれぞれに試薬を添加する工程を含む。他の実施形態において、試薬は、以下からなる群より選択される:緩衝液、溶解用緩衝液、ポリメラーゼ、配列決定試薬、プロテイナーゼ、及びヌクレオチド。
いくつかの実施形態において、本明細書中提供されるのは、以下を備えるシステムである:a)上面及び底面を持つマルチウェル貫通孔チップ、ならびにb)このマルチウェル貫通孔チップの底面に貼付されたまたは貼付可能であり、貼付することで複数のウェルを持つマルチウェルデバイスが作製される、PCR適合性膜、このPCR適合性膜は、この複数のウェルのそれぞれの底部を形成する。特定の実施形態において、本システムはさらに、サイズ排除重合体膜を含み、このサイズ排除重合体膜は、このマルチウェル貫通孔チップのこの上面に貼付される。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供されるのは、以下を備えるシステムである:a)複数のウェル開口を備えるマルチウェルデバイス;b)上面を備える重合体膜;この上面は、マルチウェルパターンで配列された複数の個別親水性スポットを除いては、疎水性であり、個別親水性スポットはそれぞれ、1個の細胞が、その1個の細胞のみで、細胞懸濁液から個別親水性スポットそれぞれにより捕捉されるような大きさであり、マルチウェルパターンは、マルチウェルデバイスの複数のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ;及びc)PCR適合性両面接着剤、PCR適合性両面接着剤は、この重合体膜とこのマルチウェルデバイスを接着する。
特定の実施形態において、マルチウェルデバイスは、マルチウェル貫通孔チップにPCR適合性膜を組み合わせて形成されており、このPCR適合性膜は、このマルチウェル貫通孔チップの底部に貼付されていて、それにより複数のウェルを持つマルチウェルデバイスが作製されており、このPCR適合性膜は、この複数のウェルのそれぞれの底部を形成する。
ある特定の実施形態において、本明細書中に提供されるのは、以下を備えるマルチウェル貫通チップである:複数の貫通孔を持つ基板、各貫通孔は、頂部開口及び底部開口を有し、この頂部開口は、単細胞1個のみを受け取る寸法の直径を有し、この底部開口は、この頂部開口より大きい直径を有する。
いくつかの実施形態において、底部開口の直径は、この頂部開口より少なくとも10%大きい(例えば、10%・・・25%・・・75%・・・100%・・・300%・・・1000%、またはそれ以上)。さらなる実施形態において、基板は、ケイ素、石英、ガラス、またはそれらの任意の組み合わせを含む。さらなる実施形態において、頂部開口の直径は、2〜50um(例えば、2・・・24・・・40um、または2〜10um、2〜20um、4〜10;10〜25;及び25〜50um)である。他の実施形態において、この底部開口の直径は、100〜800um(例えば、100・・・450・・・600・・・または800um)である。ある特定の実施形態において、基板は、0.5mm〜3.0mm(例えば、0.5・・・1.0・・・2.0・・・2.6・・・3.0mm)の厚さを有する。さらなる実施形態において、基板は、ガラスウエハと接着したケイ素ウエハを含む。いくつかの実施形態において、頂部開口は、このケイ素ウエハにあり、底部開口は、このガラスウエハにある。さらなる実施形態において、単細胞は、以下からなる群より選択される:骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、上皮細胞、筋細胞、分泌細胞、脂肪細胞、赤血球、白血球、血小板、及び血小板。
いくつかの実施形態において、本明細書中提供されるのは、以下を含む方法である:a)単細胞が複数の貫通孔の少なくともあるものの頂部開口に入るように、本明細書中記載されるマルチウェル貫通チップを、細胞含有溶液と接触させること;b)複数の貫通孔の上記少なくともあるものの頂部開口にカバーを付けて、複数のウェルを持ち、ウェルがそれぞれ単細胞を含有するマルチウェルデバイスを作製すること、カバーは、この複数のウェルの底部を形成する。さらなる実施形態において、本方法はさらに以下を含む:複数のウェルの少なくともあるものに試薬を添加すること、試薬は、生化学反応を行うのに有用なものである。他の実施形態において、試薬は、以下から選択される作用剤を含む:溶解用緩衝液、PCRプライマー、ポリメラーゼ、及びそれらの組み合わせ。さらなる実施形態において、カバーはPCR適合性膜を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供されるのは、以下を備えるシステムである:a)それぞれが細胞混合物から単細胞を捕捉することが可能な複数の細胞寸法の陥凹またはウェルを備える基板を備える捕捉チップ;及びb)複数のウェルを備えるマルチウェルチップデバイス、この複数の細胞寸法の陥凹またはウェルは、このマルチウェルチップのこの複数のウェルと1対1で一致し、一直線に並ぶ。
特定の実施形態において、上記細胞寸法の陥凹またはウェルのあるものまたは全ては、それぞれ、単細胞を含有する。いくつかの実施形態において、このマルチウェルチップのこの複数のウェルのあるものまたは全ては、細胞を剥離させる及び/または溶解する試薬を含有する。さらなる実施形態において、上記細胞寸法の陥凹またはウェルのあるものまたは全ては、それぞれ、単細胞を含有する。さらなる実施形態において、細胞寸法の陥凹またはウェルは、フォトリソグラフィーによりエッチングされている。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供されるのは、以下を含む方法である:a)以下を用意すること:i)それぞれが細胞混合物から単細胞を捕捉することが可能な複数の細胞寸法の陥凹またはウェルを備える基板を備える捕捉チップ、この複数の細胞寸法の陥凹またはウェルのそれぞれは、単細胞を含有する;ならびにii)複数のウェルを備えるマルチウェルチップデバイス、この複数の細胞寸法の陥凹またはウェルは、このマルチウェルチップのこの複数のウェルと1対1で一致し、一直線に並び、この複数のウェルのそれぞれは、細胞を剥離させる及び/または溶解する試薬を含有する;b)この捕捉チップのこの細胞寸法の陥凹またはウェルがこのマルチウェルデバイスのこのウェルと一直線に並ぶように、この捕捉チップとこのマルチウェルチップを一緒にして嵌合デバイスを形成させること;c)このマルチウェルデバイスのこのウェル中のこの試薬がこの細胞寸法の陥凹またはウェルへと移動し、この単細胞と接触して処理細胞を生成するように、この嵌合デバイスを攪拌すること;ならびにd)この細胞寸法の陥凹またはウェルのそれぞれ中の処理細胞が、このマルチウェルデバイスの対応するウェルへと移動するように、この嵌合デバイスを攪拌すること。いくつかの実施形態において、攪拌は、遠心力を加えることを含む。
特定の実施形態において、マルチウェルデバイス中の複数のウェルの少なくともあるものは、容積が0.1ナノリットル〜500ナノリットル(例えば、約0.1nl・・・0.9nl・・・1.5nl・・・5.0nl・・・10nl・・・20nl・・・35nl・・・50nl・・・75nl・・・100nl・・・150nl・・・300nl・・・450nl・・・500nl)である。特定の実施形態において、複数のウェルの少なくともあるものは、容積が1.0ナノリットル〜250ナノリットル(例えば、1〜250nl、10〜200nl、25〜150nl、40〜100nl、または50〜100nl)である。いくつかの実施形態において、複数のウェルは、少なくとも3つのオープンウェル(例えば、3・・・10・・・100・・・350・・・500・・・750・・・1000・・・1500・・・3000・・・5000・・・7500・・・10,000・・・15,000・・・20,000・・・30,000・・・45,000、またはそれ以上のオープンウェル)を含む。
さらなる実施形態において、マルチウェルデバイス(例えば、チップ)は、長さが10mm〜200mm(例えば、10mm・・・50mm・・・100mm・・・150mm・・・または200mm)、幅が10mm〜200mm(例えば、10mm・・・50mm・・・100mm・・・150mm・・・または200mm)、及び厚さが0.1mm〜10センチメートル(例えば、0.1mm・・・1.0mm・・・10mm・・・10cm)である。他の実施形態において、マルチウェルデバイスに使用される基板は、以下からなる群より選択される材料を含む:ガラス、セラミックス、半金属、ケイ素、ケイ酸化合物、窒化ケイ素、二酸化ケイ素、石英、ガリウムヒ素、プラスチック、及び有機ポリマー材料。さらなる実施形態において、マルチウェルデバイス(例えば、チップ)はさらに、個別制御される加熱要素を備え、それらはそれぞれ、ウェルと操作可能にカップリングしている。
いくつかの実施形態において、本開示は、以下を含む製品を提供する:捕捉用重合体膜、捕捉用重合体膜は、上面、底面、及び捕捉用重合体膜を貫通して延びる複数の個別流路を備え、個別流路はそれぞれ:a)捕捉用重合体膜の上面に頂部開口を有し、b)捕捉用重合体膜の底面に底部開口を有し、かつc)細胞懸濁液から1個の細胞(例えば、その1個の細胞だけ)が:i)底部開口に負圧が提供された場合に、個別流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に個別流路を閉塞させるような;またはii)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、個別流路には入らないような寸法である。
ある特定の実施形態において、捕捉用重合体膜は、不活性及び/または疎水性重合体(例えば、ポリイミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、TEFLON(登録商標)、及び/またはPTFE)を含む。さらなる実施形態において、製品はさらに、捕捉用重合体膜に取り付けられた、または捕捉用重合体膜と一体化した少なくとも1つの膜ガイド構成要素(例えば、膜中の孔を誘導するフラップまたは他の突出)を備え、膜ガイド構成要素は、捕捉用重合体膜の複数の個別流路マルチウェルデバイスのウェル及び/または重合体膜支持プレートの孔と1対1で整列させることができるように構成されている。他の実施形態において、複数の個別流路の頂部開口は、マルチウェルデバイス(例えば、Wafergen Biosystems製のSMARTCHIP)のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ。さらなる実施形態において、複数の個別流路は、少なくとも10・・・250・・・500・・・1000・・・5000・・・または30,000の個別流路を含む。さらなる実施形態において、個別流路のそれぞれは、細胞懸濁液から1個の細胞(例えば、その1個の細胞だけ)が、底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、個別流路には入らないような寸法である。他の実施形態において、重合体膜は、厚さが10μm〜50μm(例えば、10・・・20・・・40・・・または50μm)であり、上面は、面積が1cm2〜30cm2(例えば、1・・・20・・25・・・または30cm2)である。さらなる実施形態において、個別流路はそれぞれ、直径が約2〜10μm(例えば、2・・・4・・・6・・・8・・・10μm)である。
ある特定の実施形態において、本開示は、以下を備えるシステムを提供する:a)捕捉用重合体膜、この捕捉用重合体膜は、上面、底面、及び捕捉用重合体膜を貫通して延びる複数の個別流路を備え、個別流路はそれぞれ:i)捕捉用重合体膜の上面に頂部開口を有し、ii)捕捉用重合体膜の底面に底部開口を有し、かつiii)細胞懸濁液から1個の細胞(例えば、その1個の細胞だけ)が:A)底部開口に負圧が提供された場合に、個別流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に個別流路を閉塞させるような;またはB)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、個別流路には入らないような寸法である;ならびにb)以下からなる群より選択される第一構成要素:i)液体は通過させるが細胞は通過させない多孔質材料を含む多孔質層、多孔質層は、複数の個別流路の各底部開口が多孔質材料で覆われるように、捕捉用重合体膜の底面と接触させられる寸法である;ii)複数の個別貫通孔(例えば、それらは、直径が捕捉用重合体膜の流路よりも大きい)を持つ基板(例えば、金属、セラミックス、ケイ素、アルミニウム、など)を備える膜支持構成要素、複数の個別貫通孔は、捕捉用重合体膜の複数の個別流路と1対1で一直線に並び、膜支持構成要素は、捕捉用重合体膜の底面と接触しこれを支持する寸法である;iii)複数の個別ウェル(例えば、マイクロウェルまたはナノウェル)を備えるマルチウェルチップ、マルチウェルチップは、複数の個別ウェルが捕捉用重合体膜の複数の個別流路と1対1で一直線に並ぶように捕捉用重合体膜の上面と接触する寸法である;ならびにiv)細胞(例えば、生細胞)、この細胞は:A)個別流路の1つの内側に捕捉される、またはB)個別流路の1つの頂部開口に捕捉される。
ある特定の実施形態において、システムはさらに、収容基地を備え、収容基地は、捕捉用重合体膜を収容する(例えば、底部支持を提供し、一般には周囲を取り囲む)ように構成されており、かつ以下からなる群より選択される少なくとも1つの基地機構を備える:真空接続口(例えば、収容基地の底部に)、捕捉用重合体膜と膜支持構成要素を整列させるための少なくとも2つのガイドピン、膜支持プレート用陥凹、液体貯蔵部、ガスケット、及び収容頂部を接続するための少なくとも1つの接続ロッド。
特定の実施形態において、本システムはさらに、収容頂部を備え、収容頂部は、収容基地と接続して、捕捉用重合体膜を包囲するように構成されており、かつ以下からなる群より選択される少なくとも1つの頂部機構を備える:注入口(試料送達構成要素と接続して、細胞懸濁液及び洗浄液を送達するためのもの)、排出口(例えば、ダイアフラムポンプと接続するためのもの)、スロットアレイ(例えば、液体を捕捉用重合体膜の流路に誘導する複数のスロットを持つ)、ガイドピン受け、及び接続ロッド受け。
ある特定の実施形態において、捕捉用重合体膜は、不活性及び/または疎水性重合体(例えば、ポリイミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、TEFLON(登録商標)、PTFE、またはそのような重合体の任意の2種、任意の3種、任意の4種、任意の5種、または任意の6種の組み合わせ)を含む。特定の実施形態において、捕捉用重合体膜は、厚さ約20〜30μmで、3〜5μmの孔を有する。さらなる実施形態において、捕捉用重合体膜はさらに、捕捉用重合体膜に取り付けられた、または捕捉用重合体膜と一体化した少なくとも1つの膜ガイド構成要素を備え、膜ガイド構成要素は、捕捉用重合体膜の複数の個別流路を、マルチウェルデバイスのウェル及び/または重合体膜支持プレートの孔と1対1で一直線に並べることができるように構成されている。他の実施形態において、複数の個別流路の頂部開口は、マルチウェルデバイスのウェル開口及び/または重合体膜支持プレートの孔と1対1で一致し、一直線に並ぶ。さらなる実施形態において、捕捉用重合体膜は、以下からなる群より選択される特性のうち少なくとも1つを有する:i)複数の個別流路は、少なくとも5・・・100・・・500・・・30,000の個別流路を含む、ii)個別流路のそれぞれは、細胞懸濁液から1個の細胞が、その1個の細胞のみで、底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、個別流路には入らないような寸法である、iii)厚さが10μm〜50μmである、iv)上面は、面積が1cm2〜30cm2である;及びiv)個別流路はそれぞれ、直径が約2〜120μmである。
いくつかの実施形態において、細胞は、以下からなる群より選択される:血小板(約2μm径)、赤血球(約3〜8μm径)、好中球(約8〜10μm径)、リンパ球(約6〜12μm径)、外分泌細胞(約10μm径)、線維芽細胞(約10〜15μm径)、骨細胞(約10〜20μm径)、軟骨細胞または肝細胞(約20μm径)、杯細胞または線毛細胞(約50μm長及び5〜10μm幅)、マクロファージ(約20〜80μm径)、造血幹細胞(約30〜40μm径)、貯蔵脂質で満たされた脂肪細胞(約70〜120μm径)、及びニューロン(約4〜120μm径)。他の実施形態において、本システムはさらに、以下からなる群より選択される第二の構成要素を備える:負圧を提供する真空ポンプ、収容基地を回転させるように構成された遠心モーター、ダイヤフラムポンプ、チップ整列構成要素、スイングアーム支持ロッドに取り付けられたスイングアーム、試料送達構成要素、ユーザーインターフェース画面、及び少なくとも1つの廃棄物容器。
いくつかの実施形態において、本開示は、単細胞を単離する方法を提供し、本方法は以下を含む:a)細胞懸濁液を細胞単離システムと接触させること、細胞単離システムは、以下を備える:i)捕捉用重合体膜、この捕捉用重合体膜は、上面、底面、及び捕捉用重合体膜を貫通して延びる複数の個別流路を備え、個別流路はそれぞれ:A)捕捉用重合体膜の上面に頂部開口を有し、B)捕捉用重合体膜の底面に底部開口を有し、かつC)細胞懸濁液から1個の細胞が、その1個の細胞のみで:1)底部開口に負圧が提供された場合に、個別流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に個別流路を閉塞させるような;または2)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、個別流路には入らないような寸法である;及びii)負圧を提供する空気圧デバイス、及びb)細胞懸濁液を細胞単離システムとともにインキュベートすること、このとき捕捉用重合体膜の複数の個別流路の少なくともあるものが1個の捕捉細胞を有するように、個別流路の少なくともあるものが細胞懸濁液から1個の細胞を捕捉するように、空気圧デバイスが負圧を提供する;ならびにc)捕捉用重合体膜を洗浄して、細胞懸濁液から捕捉されなかった細胞を除去し、細胞を捕捉した重合体膜を作製すること。
他の実施形態において、本方法はさらに、細胞を捕捉した重合体膜とマルチウェルデバイスを一緒にしてアセンブリを作製することを含み、このマルチウェルデバイスは複数のウェル開口を有し、細胞を捕捉した重合体膜の複数の個別流路の頂部開口は、マルチウェルデバイスの複数のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ。ある特定の実施形態において、細胞単離システムはさらに、以下を備える:i)液体は通過させるが細胞は通過させない多孔質材料を含む多孔質層、多孔質層は、複数の個別流路の各底部開口が多孔質材料で覆われるように、捕捉用重合体膜の底面と接触させられる寸法である;またはii)複数の個別貫通孔を持つ基板を備える膜支持構成要素、複数の個別貫通孔は、捕捉用重合体膜の複数の個別流路と1対1で一直線に並び、膜支持構成要素は、捕捉用重合体膜の底面と接触しこれを支持する寸法である。
本発明は、捕捉用重合体膜で単細胞を捕捉するための方法、システム、アセンブリ、及び物品を提供する。ある特定の実施形態において、捕捉用重合体膜は、頂部及び底部開口を有する複数の個別流路を備え、流路は、単細胞が:i)底部開口に負圧が提供された場合に、流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に流路を閉塞させるような;またはii)底部開口に負圧が提供された場合に、頂部開口で捕捉されるが、流路には入らないような寸法である。いくつかの実施形態において、捕捉用重合体膜の流路は、マルチウェルチップのウェルと一直線に並んで、細胞、または単細胞の内容物を、対応するウェルに移送することができるようになっている。
ある特定の実施形態において、本発明は、重合体膜上で個別流路またはスポットにより単細胞を捕捉する方法、システム、アセンブリ、及び物品を提供する。ある特定の実施形態において、重合体膜は、特定の寸法及び負圧を利用して単細胞を捕捉することができる複数の個別流路を(例えば、マルチウェルと一致するパターンで)有する。他の実施形態において、重合体膜は、単細胞を捕捉することができる複数の個別親水性スポットを(例えば、マルチウェルと一致するパターンで)有する。ある特定の実施形態において、そのような重合体膜は、マルチウェルと一致するパターンで単細胞を捕捉した状態で、一致するウェル開口パターンを持つマルチウェルデバイスと嵌合させられて、捕捉された細胞がデバイスに吐出できるようになっており、それにより各ウェルが単細胞を受け取ることを可能にする(例えば、それから単細胞を溶解して核酸配列決定することができる)。ある特定の実施形態において、サイズ排除重合体膜、例えば、マルチウェルデバイスに貼付され(例えば、PCR適合性両面接着剤により)このデバイスと整列したサイズ排除重合体膜が採用される。いくつかの実施形態において、マルチウェル貫通デバイスは、細胞寸法の頂部開口及びそれより大きい底部開口(例えば、反応成分を受け取るように構成されている)を備えている。他の実施形態において、マルチウェルデバイスは、マルチウェル貫通穴チップの底部にPCR適合性膜を貼付することにより作製される。さらなる実施形態において、本明細書中に提供されるのは、細胞寸法の陥凹またはウェル(例えば、それぞれが単細胞を収容する)を持つ捕捉チップであり、このチップは、単細胞を剥離させる及び/または溶解する試薬を含有する複数のウェルを持つマルチウェルデバイスと嵌合させることができる。捕捉チップ及びマルチウェルデバイスは、チップの陥凹とデバイスのウェルが整列するように嵌合させることができ、次いで試薬が、マルチウェルデバイスのウェルから細胞寸法の陥凹に入っている細胞へと流れるように処理することができ、次いで処理された細胞がマルチウェルデバイスのウェルへ流入できるように再度処理することができるようになっている。
本開示で採用するマルチウェルデバイス(例えば、以下でさらに詳細に説明するもの)は、いくつかの実施形態において、マルチウェル貫通孔チップ及びPCR適合性膜から構築されてもよい。マルチウェル貫通孔チップは、例えば、本明細書中に記載されるマルチウェルデバイスと同じであり当該分野で既知である(例えば、数百または数千のウェルを持つナノまたはマイクロウェル)が、ただし、「ウェル」用の開口が基板を貫通して延びており、ウェルの代わりに孔を形成する。マルチウェルデバイスは、マルチウェル貫通孔チップの片側から、孔の少なくとも一部または全てをPCR適合性膜(例えば、TempPlate(登録商標)PCRシーリング膜;VWR PCRシーリング膜;LABNET熱シーリング膜;BRANDTECH SCIENTIFICシーリング膜;AXYGEN SCIENTIFIC PCR−SPシーリング膜;など)で覆うことにより、マルチウェル貫通孔チップから形成してもよい。
特定の実施形態において、本明細書中提供されるマルチウェルデバイス(例えば、上記のPCR適合性膜製のものを含む)は、本明細書中記載されるサイズ排除重合体膜に貼付されて、サイズ排除性質及びマルチウェルデバイス性質を持つデバイスを形成する。ある特定の実施形態において、サイズ排除重合体膜は、PCR適合性両面接着剤(例えば、3M 9965接着テープ)でマルチウェルデバイスの頂部に貼付される。ある特定の実施形態において、いったん単細胞が膜により捕捉されてマルチウェルデバイスのウェルに移送されると、ウェルに溶解用緩衝液が添加される(例えば、全ゲノム増幅または全トランスクリプトーム増幅アッセイプロトコルを開始するため)。
ある特定の実施形態において、複数の貫通孔を有するマルチウェル貫通孔チップが提供され、貫通孔はそれぞれ、チップの片側において細胞寸法の開口(例えば、直径2〜10μmまたはそれより大きい開口、捕捉しようとする細胞の寸法による)を、反対側においてそれより大きい寸法の開口(例えば、直径100〜800μm、または直径400〜500μm)を有する。いくつかの実施形態において、チップは、厚さが少なくとも0.5mm(例えば、少なくとも0.5・・・1.0・・・1.5・・・2.0mm、またはそれ以上)である。特定の実施形態において、チップは、ケイ素、石英、ガラス、またはそのような材料の組み合わせから(例えば、ほとんどまたは完全に)構成される。特定の実施形態において、2つの材料(例えば、ガラスとケイ素)を1つに接着させて、貫通孔を持つチップを形成する。例示の実施形態において、ガラスウエハ(例えば、厚さ500um)(例えば、FORTRANガラスウエハ)をケイ素ウエハ(例えば、厚さ25um)と接着させて、結合チップを形成する(例えば、厚さ約525umである)。次いで、ケイ素側でマスクを整列させてパターンを形成し、細胞寸法の孔(例えば、4um)を、ケイ素からその下のガラス層までエッチングする。次いで、第二のマスクをガラス側に整列させ、より大きな反応寸法の孔をガラスにエッチングして、マルチウェル貫通孔チップを作製するが、孔は各側で大きさが異なる。
本明細書中に記載されるマルチウェル貫通孔チップは、各側に異なる寸法の開口を持つが、このチップは最初に細胞寸法の開口で単細胞を捕捉するのに使用する。チップにPCR適合性膜を貼付して細胞寸法の開口を密閉し、こうしてマルチウェルデバイスを作製するが、単細胞は、形成されたウェルの底部で捕捉されている。次いでマルチウェルデバイスを本明細書中記載されるとおりに、例えば、反応寸法の孔を通じて溶解及び増幅試薬を添加することにより、使用する。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供されるのは、細胞寸法のスポットまたは陥凹(例えば、ミニウェル)を複数備え、スポットまたは陥凹はそれぞれが、単細胞を細胞混合物から捕捉することを可能にする、捕捉チップである。いくつかの実施形態において、細胞寸法の陥凹は、基板(例えば、ガラス、ケイ素、石英、またはそれらの組み合わせで構成される)にエッチングされる。特定の実施形態において、プラズマエッチングが採用される。例示プロトコルは以下の通りである。基板マスクを、フォトレジスト(例えば、Shipley 1818)でコーティングされた基板に設置し、露光させて、陥凹を作製する。フォトマスクは、Heidelberg Instrumentsなどの直接型レーザーライターにより製造する。基板にスポット/陥凹をエッチングしたら、エッチングしたチップ全体に細胞懸濁液を流し(例えば、フローセル中で)、単細胞をスポット/陥凹中に捕捉する。次いで、過剰な細胞を洗い落とし、捕捉チップを、捕捉チップの陥凹がマルチウェルデバイスのウェルと一直線に並ぶように、本明細書中に記載されるとおりのマルチウェルデバイスと整列させる。マルチウェルデバイスのウェルは、溶解及び/または増幅試薬などの試薬で予め満たしておいてもよい。次いで、マルチウェルデバイスの試薬が陥凹の細胞に向かって移動して細胞と接触する(例えば、細胞を溶解するまたはいずれにしろ陥凹とのどのような付着からも細胞を放出させる)ように、嵌合させたデバイスを遠心する(またはいずれにしろ攪拌する)。次いで、細胞(または溶解した細胞内容物)が反対にマルチウェルデバイスのウェルに向かって移動するように、嵌合させたデバイスを遠心する。次いで、捕捉チップを取り出し、各ウェルが単細胞(または単細胞内容物)を含有した状態のマルチウェルデバイスを、生物学的反応(例えば、PCRまたは同様な反応)で処理する。
本発明のシステム及び方法の別の例示実施形態は、以下の通りである。本発明のシステムは、オープンフレームにまたがって広げられ、レーザーまたは同様なデバイスでドリルされた疎水性または超疎水性(例えば、フルオロシランコーティングした)重合体膜で構成されてもよい。作製される流路の直径及び膜の厚さは、1つの単細胞が各流路に含有されていることを可能にするように選択される。流路の間隔すなわちパターンは、単細胞アッセイを行うのに使用することができるマルチウェルデバイス(WAFERGENの5184 SmartChipなど)の孔のパターンと一致するだろう。この重合体膜は、硬質多孔性発泡体で裏打ちされており、この発泡体は、親水性であっても疎水性であってもよいが、細胞懸濁液緩衝液のみ通過を許容し、細胞は遮断する孔を有するように選択される。このサンドイッチ体から、使用者が発泡体の背後から負圧源を使用しつつ、細胞懸濁液を導入することができるアセンブリを組み立てる。この全アセンブリを、撹拌器または旋回器に配置し、重合体膜の各流路内部の負圧により単細胞を捕捉することができるように細胞懸濁液を重合体膜の頂部で動かしてもよい。単細胞は、発泡体を通過することができず、懸濁液のみが通過するだろう。負圧は、高精度ゲージで監視してもよく、高精度ゲージは重合体膜の流路が全て細胞により閉塞してしまった時点を示す。重合体膜は、疎水性であるか、またはフルオロシランなどの超疎水性コーティングでコーティングされているため、懸濁細胞は、一般に、それ自身単独でまたは塊になって、表面に付着することはないだろう。いったん細胞が捕捉されたとみなされたら、ある程度の負圧をかけて捕捉された細胞が流出しないように維持しながら、過剰な細胞懸濁液を、PBSなどの無細胞緩衝液で洗い落として、過剰な細胞を除去してもよい。過剰な細胞及び細胞懸濁緩衝液を除去した後、膜上には捕捉された単細胞が存在しているだろう。次いで、マルチウェルデバイス(例えば、SmartChip)を、表面を膜に向かって下向きに設置してもよく、アセンブリを遠心固定具に設置して単細胞を個別にマルチウェルデバイスのウェルに移送してもよい。マルチデバイスウェルは、細胞を生きたまま維持するように細胞緩衝液が予め添加されていてもよいし、細胞溶解用緩衝液が予め添加されていることもあり得る。マルチウェルデバイスは、遺伝子発現または配列決定のため、この段階で、マルチ試料ナノ分配器により様々なアッセイ試薬で満たされてもよい。
本発明のシステム及び方法の別の例示実施形態は、以下の通りである。詳細には、細胞の単離及び捕捉の別の方法を、マルチウェルデバイス(例えば、Smartchip)のとおりのピッチで、ただし単細胞は捕捉されるものの通過することができない寸法で、掘られた流路を有する重合体表面で達成してもよい。細胞の捕捉は、負圧により達成されてもよく、負圧は、多孔質発泡体の背後からかけられる。この方法は、細胞が重合体膜の流路の内側ではなく表面で捕捉されることから、(上記と)同じ厚さの重合体膜を必要としないだろう。表面捕捉のこの方法はまた、捕捉細胞を負圧により流路頂部であるべき場所に保持しながら、過剰な細胞を効率的に洗い落とすことを可能にするだろう。
捕捉細胞を移送する別の方法は、負圧を正圧に反転させることにより捕捉細胞を重合体表面または膜の流路から押し出し、細胞懸濁緩衝液を用いて細胞を表面または流路からマルチウェルデバイス(例えば、SmartChip)のウェルへと洗い入れることにより、達成されてもよい。
別の代替例示実施形態は、以下の通り記載される。単離の代替方法は、細胞が接着することを防ぐ超疎水性表面(例えば、フルオロシラン)を使用して構築してもよい。この超疎水性の表面は、ポリドーパミンまたは他の親水性材料からなる小さな島を有してもよく、細胞はこの島に接着することができる。すなわち、標的細胞ぐらいの寸法の島を持つ超疎水性表面は、フローセルの一部となり得るもので、懸濁緩衝液中に懸濁している目的の細胞はこの表面を流れ通るときにポリドーパミンまたは他の親水性材料からなる「島」に捕捉されるだろう。島(または「スポット」)のパターン及び寸法は、過剰な細胞をSmartchipなどのマルチウェルデバイスから洗い落とした後、単純なピン整列スキームを使用して、捕捉された単細胞の島がそれぞれマルチウェルデバイス(例えば、SMARTCHIP)のウェルの1つの中心に入るように、正面を下向きに設置することができるようなものであり得る。次いで、遠心を利用して、捕捉した単細胞それぞれを、マルチウェルデバイス(例えば、SMARTCHIP)のウェルへと移送することができる。
単離することが望まれる単細胞の寸法が、採用される重合体上の流路または親水性スポットの寸法を決定づける。重合体の流路は、流路中で細胞を捕捉する目的で、所望の細胞よりも少なくともわずかに大きいことが必要である。重合体の表面において、流路で細胞を捕捉することが望まれる場合、流路の直径は、標的細胞よりも少なくともわずかに小さくなければならない。親水性スポットに関しては、これらのスポットは、標的細胞ぐらいの寸法でなければならない。ヒト細胞の寸法は、大部分が、2〜120ミクロンの寸法範囲内に収まる。血小板は約2ミクロンであり、赤血球は約3ミクロン×約8ミクロンであり、好中球は約8〜10ミクロンであり、リンパ球は寸法が約6〜12ミクロンであり、外分泌細胞は約10ミクロンであり、線維芽細胞は約10〜15ミクロンであり、骨細胞は突起を含めて約10〜20ミクロンであり、軟骨細胞及び肝細胞は約20ミクロンであり、杯細胞及び線毛細胞は約50ミクロン長及び5〜10ミクロン幅であり、マクロファージは約20〜80ミクロンであり、造血幹細胞は約30〜40ミクロンであり、貯蔵脂質で満たされた脂肪細胞は典型的には直径が70から120ミクロンである(もっとも、非常に太った人々では最大5倍まで大きくなる場合がある)。ニューロンは、寸法及び形状が非常に巨大であり、その本体は、直径が4〜120ミクロンの範囲であり、直径が約0.1〜20ミクロンで変化し長さが数ミクロンから最長約1メートルの範囲に渡る軸索突起を持つ;筋細胞(全組織細胞の約30%)もまた、直径が10〜100ミクロンで変化し、長さが最長約50cmに届く場合がある。 本発明は、採用するマルチウェルデバイス(例えば、プレートまたはチップ)または重合体上の流路及びスポットが嵌合するように設計される対象の種類により制限されない。一般に、そのようなデバイスは、複数のウェルを有し、ウェルは、液体(例えば、ウェルに捕捉される液体であるが、重力だけではその液体はウェルから流出できないような液体)を含有する、または含有する寸法のものである。例示チップの1つは、WAFERGENの5184ウェルSMARTCHIPである。他の例示チップは、米国特許第8,252,581号;同第7,833,709号;及び同第7,547,556号に提示されており、これら特許文献は全て、例えば、文献中で使用されるチップ、ウェル、熱サイクル条件、及び関連試薬の教示も含めて、その全体が本明細書中に参照として援用される。他の例示チップとして、QUANTSTUDIOリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で使用されるOPENARRAYプレートが挙げられる。別の例示マルチウェルデバイスは、96ウェルまたは384ウェルプレートである。
マルチウェルデバイスの全体的な寸法は、様々であってよく、例えば、厚さが数ミクロン〜数センチメートルの範囲に渡り、幅または長さが数ミリメートルから50センチメートルの範囲に渡ることが可能である。典型的には、全デバイス寸法は、幅及び/または長さが約10mm〜約200mmの範囲に渡り、厚さが約1mm〜約10mmの範囲に渡る。いくつかの実施形態において、チップは幅約40mm×長さ40mm×厚さ3mmである。
マルチウェルデバイス上のウェル(例えば、ナノウェル)の総数は、対象チップが採用される予定の特定用途に応じて、様々であってよい。チップ表面のウェル密度は、特定用途に応じて、様々であってよい。ウェル密度、ならびにウェルの寸法及び容積は、所望の用途ならびに要因、例えば、本発明の方法を採用する予定の生物検体などに応じて、様々であってよい。
本発明は、マルチウェルデバイスのウェルの個数により制限されない。多数のウェルをデバイスに組み込んでもよい。様々な実施形態において、デバイス上のウェルの総数は、約100約〜200,000、または約5000〜約10,000である。他の実施形態において、デバイスは、もっと小さいチップを含み、チップはそれぞれ、約5,000〜約20,000のウェルを備える。例えば、正方形のチップが、直径0.1mmのナノウェルを125×125個含んでもよい。
マルチウェルデバイスのウェル(例えば、ナノウェル)は、任意の都合の良い寸法、形状、または容積で製造されてよい。ウェルは、長さが約100μm〜約1mm、幅が約100μm〜約1mm、深さが約100μm〜約1mmであってもよい。様々な実施形態において、各ナノウェルは、約1〜約4の縦横比(深さ対幅の比)を有する。1つの実施形態において、各ナノウェルは、約2の縦横比を有する。横断面は、円形、楕円形、卵形、円錐形、長方形、三角形、多角形、または他のどのような形状でもよい。ウェルの任意の所定の深さでの横断面は、寸法及び形状が変化してもよい。
ある特定の実施形態において、ウェルは、約0.1nl〜約1μlの容積を有する。ナノウェルは、典型的には、1μl未満、好ましくは500nl未満の容積を有する。容積は、200nl未満であっても、100nl未満であってもよい。ある実施形態において、ナノウェルの容積は約100nlである。所望であれば、ナノウェルは、表面積対容積比が大きくなるように製造することができ、それによりユニットを通じた熱伝導を促進することができ、そうすると熱サイクルのランプタイムを削減することができる。各ウェル(例えば、ナノウェル)の空洞は、様々な形状を取ってよい。例えば、ウェル内の空洞は、直線または曲線状の壁により分割されて別々のただし隣り合う区画を形成してもよいし、円形の壁により分断されて内側及び外側の環状区画を形成してもよい。
内部表面対容積比が大きいウェルは、ウェルに入った反応体がウェルの内部表面と相互作用する可能性を低下させることが望ましい場合には、低下させるための材料でコーティングされてもよい。コーティングは、試薬が望ましくないことに内部表面と相互作用しやすいまたは内部表面に接着しやすい場合に、特に有用である。反応体の性質に応じて、疎水性または親水性コーティングを選択してよい。様々な適切なコーティング材料が当該分野で利用可能である。材料のあるものは、表面と共有結合する場合があり、他のものは非共有結合相互作用で表面と結合する場合がある。コーティング材料の制限ではなく例として、ジメチルクロロシラン、ジメチルジクロロシラン、ヘキサメチルジシラザン、またはトリメチルクロロシランなどのシラン処理試薬、ポリマレイミド、ならびに酸化ケイ素、AQUASIL、及びSURFASILなどのシリコン処理試薬が挙げられる。さらなる適切なコーティング材料は、アミノ酸などのブロック化剤、または重合体などであり、重合体としてポリビニルピロリドン、ポリアデニル酸、及びポリマレイミドが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定のコーティング材料は、加熱、照射を介して、または化学反応により、表面と架橋することができる。当業者なら、マルチウェルデバイスのナノウェルをコーティングする他の適切な手段を知っているだろう、または不要な実験を行うことなく、それを確認することができるだろう。
例示のマルチウェルデバイス(例えば、チップ)は、厚さが約0.625mmであり、そのウェルは寸法が、長さ及び幅約0.25mm(250um)である。ナノウェルの深さは、約0.525mm(525um)が可能であり、所定のウェルの真下のチップは約0.1mmの余地がある。ナノウェル開口として、任意の形状、例えば、円形、正方形、長方形、または他の所望の幾何学形状をあげることができる。例として、ナノウェルは、約100μm〜約1mmの直径または幅、約150μm〜約1mmのピッチまたは長さ、及び約10μm〜約1mmの深さを備えることができる。各ウェルの空洞は、様々な形状を取ってよい。例えば、ナノウェル内の空洞は、直線または曲線状の壁により分割されて別々のただし隣り合う区画を形成してもよい。
マルチウェルデバイスのウェル(例えば、ナノウェル)は、例えば、一般的に知られるフォトリソグラフィー技法を用いて形成されてもよい。ナノウェルは、例えば、湿式KOHエッチング技法、乾式異方性エッチング技法、機械掘削、射出成形、及びまたは熱形成(例えば、熱エンボス加工)を用いて形成されてもよい。
マルチウェルデバイスに入った液体に含有される試薬は、各ウェルに沈殿した単細胞で行う予定の反応に依存する。ある実施形態において、ウェルは、核酸増幅反応を行う試薬を含有する。試薬は、免疫アッセイ、核酸検出アッセイ用試薬が可能であり、アッセイは、核酸増幅を含むが、これに限定されない。試薬は、チップの単位で、乾燥状態にあることも液状であることも可能である。ある実施形態において、ウェルは、以下の試薬のうち少なくとも1種を含有する:プローブ、ポリメラーゼ、及びdNTP。別の実施形態において、ウェルは、プローブ、プライマー、及びポリメラーゼを含む溶液を含有する。様々な実施形態において、各ウェルは、(1)この標準ゲノム内のポリヌクレオチド標的用のプライマー、及び(2)このプライマーに関連したプローブ、プローブは、プライマーがこの標的と結合したら、濃度に依存したシグナルを発する、を含む。様々な実施形態において、各ウェルは、ゲノム内のポリヌクレオチド標的用のプライマー、及びプライマーに関連したプローブ、プローブは、プライマーが標的と結合したら、濃度に依存したシグナルを発する、を含む。別の実施形態において、チップの少なくとも1つのウェルは、順方向PCRプライマー、逆方向PCRプライマー、及び少なくとも1つのFAM標識化MGB消滅型PCRプローブ(FAM labeled MGB quenched PRC probe)を含む溶液を含有する。ある実施形態において、プライマー対がウェルに分配されて、凍結などにより乾燥させられる。次いで、使用者は、試料、プローブ、及び/またはポリメラーゼを選択的に分配、例えばナノ分配することができる。
本発明の他の実施形態において、ウェルは、上記溶液のいずれかを乾燥させた形状で含有してもよい。この実施形態において、この乾燥形態は、ウェルをコーティングしていてもよいし、ウェルの底部に集中していてもよい。使用者は、各ウェルに水及び捕捉された細胞の混合物を加えてから分析することができる。この実施形態において、乾燥させた反応混合物を含むチップは、ライナーで密閉され、別の場所で貯蔵または別の場所へ移送されてもよい。
マルチウェルデバイスは、各ウェルに単細胞を持つ状態で、遺伝子型判定、遺伝子発現、またはPCRにより行われる他のDNAアッセイに使用されてもよい。プレートで行われるアッセイは、TAQMAN、TAQMAN Gold、SYBR gold、及びSYBR greenなどのDNAアッセイに限定されず、受容体結合、酵素、及び他の高処理スクリーニングアッセイなど他のアッセイも含む。いくつかの実施形態において、ROX標識化プローブを、内部標準として使用する。
本開示の別の例示実施形態を、以下の段落に提示するが、これは、捕捉用重合体膜を使用して単細胞を捕捉する収容アセンブリの最初の構築及び使用、ならびに捕捉された単細胞それぞれを処理するための(例えば、捕捉された単細胞それぞれのmRNAを配列決定するための)マルチウェルチップのアセンブリを記載する。この説明は、概して、図2〜図9に関連し、図は実施形態の例示を提供するにすぎない。
マルチウェルチップは、貫通孔チップと接着シーリング膜を合わせてマルチウェルチップのウェルの底部を形成することにより、作製することができる。貫通孔チップは、平面状の、比較的硬質で比較的薄い材料、例えば金属(例えば、アルミニウム)、ケイ素、セラミック、及び関連材料などに複数の孔を掘削することにより作製してもよい。材料の厚さは、各ウェルの所望の深さに依存し、いくつかの実施形態において、1.0〜9.0mm(例えば、1.0・・・2.7・・・3.4・・・5.0・・・7mm)であってもよい。孔は、任意の数の適切な技法を用いてこの材料を貫通させて掘削してもよく、そのような技法として、プログラミング式高速精密掘削機械での機械掘削が挙げられる(例えば、Kern Precision、Inc.製のKern HSPC 25掘削機械)。例えば、金属基板(例えば、アルミニウム)を、プログラミング式高速精密掘削機械で機械掘削してもよい。典型的には、STEP AP214などの3D CAD設計ファイルを適切な機械コマンドに変換し、次いで適正な直径のドリルを使用して、コマンドを実行してドリルパターン及び深さにする。掘削された孔の直径は、最終的なウェルの所望の直径に応じて様々であってよい。いくつかの実施形態において、材料に掘削された各孔の直径は、0.20〜2.5mm(例えば、0.2・・・0.45・・・1.5・・・2.5mm)である。孔の数は、所望のウェルの数に依存する。ある特定の実施形態において、掘削された孔の数は、2〜30,000(例えば、2・・・15・・・50・・・96・・・386・・・1000・・・3000・・・5184・・・15,000・・・30,000の孔)である。特定の実施形態において、72×72の格子を掘削機械にプログラミングして、5184の孔を持つ貫通孔チップを作製する。ある特定の実施形態において、次いで、各流路(これがウェルになる)が疎水性コーティング(例えば、そのようなコーティングの例は、パリレンコンフォーマルコーティングである)でコーティングされるように貫通孔を処理して、最終的なウェルを生体適合性にする。最後に、貫通孔チップの片面にシーリング膜(例えば、低粘着シーリング膜を用いて)を付加して各ウェルの底部を形成する。
捕捉用重合体膜及び単細胞を単離するための(マルチウェルチップとともに使用するための)関連構成要素を収容する収容アセンブリは、以下に記載する例示実施形態により作製することができる。
収容アセンブリ(例えば、図2に示す収容アセンブリ)内の構成要素の3つは、マルチウェルチップのウェルと一直線に並ぶ孔とともに作製される。これら3つの構成要素は、両面接着剤、捕捉用重合体膜、及び膜支持プレート(図1に示すとおりの多孔質層の代わりに膜支持プレートを使用する場合)を含む。両面接着剤(例えば、3M9965粘着性接着剤)は、2つの剥離層及びその真ん中にキャリア(例えば、全てポリエステル製)を有していてもよく、この両面接着剤を、貫通孔チップと同じピッチで掘削する(例えば、レーザー掘削する)。掘削された孔は、一般に、対応する貫通孔チップに掘削された孔よりも小さい(例えば、5〜50%小さい)。ある特定の実施形態において、掘削された孔は、0.10mm〜4.0mm(例えば、0.1・・・0.350・・・2.0・・・及び4.0mm)である。両面接着剤の掘削は、プログラミング可能なXY表を有するエキシマーレーザー(例えば、Potomac Photonics製)を使用することにより達成されてもよい。上記の精密ドリルと同様に、3D CADファイルをロードして、貫通孔チップと同じピッチで孔を掘削する。
捕捉用重合体膜の孔は、両面接着剤についてと同様にして、例えばレーザードリルを使用して、貫通孔のピッチと同様なピッチを用いて、作ってもよい。孔の直径は、単細胞が、孔(流路)の頂部付近、または内側で捕捉されるように作製される。そのような孔は、単離されている細胞の型に依存する(例えば、流路1つにつき単細胞)。例示の寸法範囲は、2〜35ミクロン(例えば、2・・・4・・・25・・・または35ミクロン)である。膜は、任意の種類の適切な材料のものでよく、そのような材料として、不活性かつ疎水性である重合体(例えば、DuPont製のKAPTON膜などのポリイミド膜、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、TEFLON(登録商標)、及び/またはPTFE;Vladkova, T.G.(2010) ‘ ‘Surface engineered polymeric biomaterials with improved biocontact properties.’’ Int. J. Polym. Sci., 2010, 1−22も、特にその中で記載される重合体について参照、本明細書中その全体がそのまま参照として援用される)が挙げられる。膜の厚さは、ある特定の実施形態において、10um〜50um(例えば、10・・・25・・・35・・・及び50um)である。特定の実施形態において、縦横比(孔径対重合体厚)は、約5:1、6:1、または7:1である。
膜支持構成要素の孔は、ある特定の実施形態において、貫通孔チップと同じ種類の方法、材料、及びデバイスを使用して(上記参照)、貫通孔チップについてと同じピッチを用いて、。ある特定の実施形態において、膜支持構成要素の孔の直径は、貫通孔チップのものと同じまたは同様である(上記参照)。例えば、膜支持構成要素は、直径が0.20〜2.5mm(例えば、0.2・・・0.45・・・1.5・・・2.5mm)の孔を有してもよい。膜支持構成要素は、貫通孔チップのものと同様な厚さを有してもよいし、それより薄くてもよい(例えば、約0.9〜1.1mm厚さのアルミニウムまたは他の金属または材料)。
スロットアレイ構成要素(例えば、図2、図5A、及び図5Bの部分180)は、捕捉用重合体膜の孔と同じピッチを用いて、複数のスロット(例えば、捕捉用重合体膜の流路/孔の並びと同数)で製造されてもよい。スロットアレイ構成要素は、ある特定の実施形態において、スロットが、細胞含有液を重合体膜の孔/流路の頂部に送達することができるように、捕捉用重合体膜の寸法に基づいて寸法が決まる。例示の寸法は、幅400um×深さ200umである。スロットアレイ構成要素は、射出成形により製造し蒸気研磨することができる。ある特定の実施形態において、スロットアレイは、熱可塑性重合体(例えば、ポリカーボネート)または他の種類のプラスチック製である。
例示収容アセンブリは、図2に示す構成要素のあるものまたは全てを用いて組み立ててもよく、捕捉用重合体膜上で単細胞を捕捉するのに使用されてもよい。図2は、例示の試料送達構成要素(190)が取り付けられた例示収容アセンブリ(45)を示す。収容アセンブリについて、図2に示す円形及び図3に示す正方形の他に、他の形状も採用してよい。収容アセンブリは、プラスチックをはじめとする任意の適切な材料で構成されていてよい。試料送達構成要素(190)は、図2ではシリンジとして示されているが、注入口(150)と嵌合させることができる他のデバイス、例えばピペットまたは同様なデバイスであってもよい。収容アセンブリ(45)は、収容基地(60)を有し、収容基地(60)は、内部上面(120)を有し、内部上面(120)は、その面上に2つのガイドピン(100)を有する。収容基地(60)はまた、液体貯蔵部(80)、膜支持陥凹(70)及び対応するガスケット(85)、ならびに貯蔵部(80)の底部に真空接続口(90)を有する。収容基地(60)はまた、収容基地(60)と収容頂部(140)を接続する1対の接続ロッド(110)も有する。収容頂部(140)は、注入口(150)及び排出口(160)を有する。注入口(150)は、この図ではシリンジとして示されている試料送達構成要素(190)と接続する。収容頂部(140)は、スロットアレイ(180)、及び接続ロッド(110)と接続するための1対の接続ロッド受け(170)を有する。収容頂部(140)はまた、2つのガイドピン受け(105)を有する。例示収容アセンブリ(45)はまた、膜支持構成要素(50)上に設置された捕捉用重合体膜(10)を有する。捕捉用重合体膜(10)は、1対の膜ガイド構成要素(130)を有し、膜ガイド構成要素はそれぞれ、ガイドピン(100)を受けるための膜ガイドピン受け(135)を有する。そのような膜ガイド構成要素は、孔または他の取り付け構成要素を有する捕捉用重合体膜から出るフラップまたは他の突起であってもよい。膜支持構成要素(50)は、ガイドピン(100)が膜ガイドピン受け(135)に挿入され、それにより重合体膜の複数の個別細胞捕捉流路が膜支持構成要素(50)の複数の孔と一直線に並ぶように整列するように、膜支持陥凹(70)に設置されるように構成されている。捕捉用重合体膜は、捕捉用重合体膜の孔(例えば、4um)が膜支持構成要素の400umの孔と中心で整列するように、膜支持構成要素の頂部の上に置かれる。他の実施形態において、膜支持構成要素の代わりに多孔質層(図1の部分20)が使用される。
図3Aは、2つのガイドピン(100)、捕捉用重合体膜(10)、及び膜ガイド構成要素(130)を持つ例示収容基地(60)を示す。ある特定の実施形態において、ガイドピン(100)は、ロッドであるか、コーンであるか、または他の有用な形状である。図3Bは、収容基地(60)及び収容頂部(140)を持つ例示収容アセンブリ(45)を示す。収容頂部(140)には、注入口(150)及び排出口(160)を合わせて示す。注入口(150)は、選択した試料送達構成要素(190)に適合する形状及び寸法になっている。
図4は、収容アセンブリ(45)及びスイングアーム(210)を持つ例示細胞捕捉装置(200)を示し、スイングアーム(210)は、排出口(160)と係合するように設計された流出口(220)を有する。細胞捕捉装置はまた、ユーザーインターフェース画面(240)も有する。一般に、使用者は、収容アセンブリを細胞捕捉装置内に設置し、装置のソフトウェアプログラム(例えば、様々な構成要素のタイミング及び機能を制御する細胞捕捉装置のプロセッサ及び様々な構成要素と操作可能に連結したソフトウェアプログラム)を開始する。
図5Aは、スイングアーム(210)を持つ例示細胞捕捉装置(200)を示し、スイングアーム(210)は、スイングアーム試料送達スロット及び流出口(220)を有する。例示細胞捕捉装置(200)はまた、真空ポンプ(280)(真空接続口90と操作可能に連結している)、第一廃棄物収集容器(270)(例えば、接続口90から液体を受け取るためのもの)、ダイヤフラムポンプ(260)(例えば、収容アセンブリ内で細胞含有液をあちこち移動させるためのもの)、及び第二廃棄物収集容器(290)(例えば、液体用真空トラップとして機能する)も有する。図5Bは、複数のスロットを持つスロットアレイ(180)を示し、スロットの末端は1対のスロットアレイヘッダー(185)に入っている。図5Cは、末端がスロットアレイヘッダー(185)に入っている複数のヘッダー(この図では72のスロットが示される)を持つスロットアレイ(180)の拡大斜視図を示す。スロットアレイヘッダーは、注入口(150)と操作可能に接続している(例えば、ルアー接続)。ある特定の実施形態において、スロットアレイの各スロットは、捕捉用重合体膜の孔の並びのすぐ上にあるように設計される。ある特定の実施形態において、各スロットは、両末端がヘッダー内にあり、ヘッダーはスロットへの供給またはスロットからの排出に使用される。一般に、スロットの目的は、細胞懸濁液を、捕捉用重合体膜にある孔の各列に直接流すためであり、そうすることにより、細胞が概してランダムに流通しないことを確実にする助けとなる。したがって、ある特定の実施形態において、この種の流通制御のため、注入口と排出口の間の圧を変化させることにより、細胞懸濁液を、往復移動させることができる(例えば、捕捉効率を高めるため)。
図5Aに戻って、レギュレーターを備えたダイヤフラム真空ポンプ(260)が、液体トラップを介して排出口(160)と接続している。プログラムを開始させると、スイングアームが収容アセンブリの上に移動して、収容アセンブリを固定する。緩衝液(例えば、3mlの1倍PBS)の入った10mlプラスチックシリンジを注入口に接続する。真空ポンプ(280)を稼働させて、収容アセンブリの底部に負圧(例えば、12’’Hg負圧)を提供し、シリンジから下に向かって液体を移動させ、捕捉用重合体膜の捕捉孔を前湿潤させる。次いで、吸引を止め、細胞懸濁液(例えば、2×105の細胞)が充填された別の10mlシリンジを注入口に接続する。細胞懸濁液を注入口(150)にゆっくりと注入しながら、排出口(160)と接続されたダイヤフラムポンプ(260)を稼働させる。排出口側でダイヤフラムポンプを使用することにより(例えば、4’’Hgに設定した減圧を使用して)、細胞は、吸引されて収容アセンブリを通過する(スロットアレイ(180)により誘導されて)。捕捉用重合体膜による細胞捕捉のために真空ポンプ(280)は減圧(例えば、4’’hgで)を維持したまま、ダイヤフラムポンプを止める。この時点で、捕捉用重合体膜の個別流路/孔の少なくともあるものは、流路/孔内に、または流路/孔の頂部に捕捉された単細胞を有する(例えば、図1を参照)。約3〜10分(例えば、約5分)後、シリンジを取り外し、次いで緩衝液(例えば、10mlの1倍PBS)の入ったシリンジを注入口に導入して、最初のすすぎのために吸引しアセンブリを通過させる。
図6Aは、収容頂部(140)を取り出して捕捉用重合体膜(10)を明示した状態の例示細胞捕捉装置(200)を示す。図6Bは、膜支持構成要素(50)上に捕捉用重合体膜(10)を有する収容基地(60)の下にある遠心モーター(250)を示す。次に、捕捉サイクルが完了したら、捕捉用重合体膜の減圧を引き続きかけたまま(例えば、4’’hgで)、スイングアームを上げて向こう側に移動させ収容アセンブリに到達できるようにする。次いで、収容頂部(140)を取り外す。
この時点で、収容基地(捕捉用重合体膜と合わせて)を、図6に示される遠心モーター(250)を用いて遠心して、あらゆる過剰な洗浄用緩衝液を除去する。緩衝液を膜に噴射して過剰な細胞を完全にすすいでもよい。遠心はまた、捕捉用重合体膜の乾燥表面の形成も可能にし、乾燥表面を有することで、マルチウェルチップを捕捉用重合体膜に接着することができる。
この時点で、収容基地(捕捉用重合体膜と合わせて)を、図6に示される遠心モーター(250)を用いて遠心して、あらゆる過剰な洗浄用緩衝液を除去する。緩衝液を膜に噴射して過剰な細胞を完全にすすいでもよい。遠心はまた、捕捉用重合体膜の乾燥表面の形成も可能にし、乾燥表面を有することで、マルチウェルチップを捕捉用重合体膜に接着することができる。
次に、図7A及び図7Bに示すとおり、チップ整列構成要素上のチップ整列ガイドピン受け(330)を使用して、チップ整列構成要素(310)を捕捉用重合体膜の頂部に設置する。マルチウェルチップ(320)に、両面接着膜(350)(孔が膜に形成されている)を取り付けたものを、チップ整列構成要素(310)の内側、捕捉用重合体膜(10)の頂部に設置する。両面接着剤は、マルチウェルチップと捕捉用重合体膜を接着し、各ウェルをその近隣から遮断する。図8は、図7の配置の側面図を示す。詳細には、マルチウェルチップは、貫通孔チップ(370)及び第一シーリング膜(340)から構成されて示されおり、第一シーリング膜(340)は、底部を形成してマルチウェルチップにウェル(360)を作製する。マルチウェルチップの上面には、両面接着膜(350)が合わせて示されており、両面接着膜(350)は、捕捉された単細胞(40)がマルチウェルチップのウェル(360)と一直線に並ぶように、マルチウェルチップが捕捉用重合体膜(10)に貼付されることを可能にする。捕捉用重合体膜(10)は、捕捉された細胞(40)と合わせて示されているが、収容基地(60)の内側で膜支持構成要素(50)上に設置されており、収容基地(60)は真空接続口(90)を有する。
次に、図9Aに示すとおり、スイングアーム(210)を、向こう側から移動させて下に下ろして、マルチウェルチップに圧を加え、捕捉用重合体膜でマルチウェルチップを密閉する。次いで、スイングアームを上げて向こう側へ移動させて、マルチウェルチップ/捕捉用重合体膜アセンブリを取り出せるようにする。次いで、このアセンブリを上下反転させて設置し、捕捉用重合体膜の底部を拭き取って乾燥させ、第二シーリング膜(380)(例えば、PCRシーリング膜)で密閉する。ある特定の実施形態において、この密閉したアセンブリに、低張性緩衝液を加え、アセンブリを−80℃で30分間または一晩凍結させる。このアセンブリは、室温で解凍させて、任意の種類の単細胞分析に使用することができる。凍結融解手順(例えば、低張性溶液中での)は、細胞を破壊して開放し細胞溶解物をマルチウェルチップのウェルの溶液にする。次いで、上面(例えば、臨時シーリング膜)上の重合体膜を、剥離させて、チップを任意の種類の生物学分析に使用することができる。他の実施形態において、捕捉された単細胞は、グアニジン及び尿素などの変性剤で、または酵素組成物で、重合体膜から放出及び/または溶解させられる。
処理の結果として、マルチウェルチップのウェルの一部、大部分、または全てが、この段階で、単細胞からの細胞溶解物を溶液として有する。任意の適切な種類のアッセイ用試薬を、マルチウェルチップのウェルに加えてもよい(例えば、WAFERGEN BIOSYSTEMS製のものなどマルチウェルディスペンサーを使用して)。ある特定の実施形態において、タンパク質検出アッセイ成分(例えば、抗体を利用したアッセイ)がウェルに添加される。他の実施形態において、SNP検出アッセイ成分がウェルに添加される。他の実施形態において、核酸配列決定アッセイ成分がウェルに添加される。ある特定の実施形態において、個別mRNA分子を標識するための、及び/または細胞/ウェル源を標識するための(例えば、ウェルが配列決定分析の前にプールされる場合)、及び/または特定のマルチウェルチップを標識するための(例えば、2つ以上のマルチウェルチップのウェルが配列決定前にプールされる場合)バーコード法を採用する核酸配列アッセイ成分が採用される。そのようなバーコード方法及び試薬の例は、Pat.Pub.US2007/0020640、Pat.Pub.2012/0010091、U.S.Pat.8,835,358、U.S.Pat.8,481,292、Qiuら (Plant. Physiol., 133, 475−481, 2003)、Parameswaranら (Nucleic Acids Res. 2007 Oct; 35(19): e130)、Craigら reference (Nat. Methods, 2008, October, 5(10):887−893), Bontouxら (Lab Chip, 2008, 8:443−450)、Esumiら (Neuro. Res., 2008, 60:439−451)、Hugら, J. Theor., Biol., 2003, 221:615−624), Sutcliffeら (PNAS, 97(5):1976−1981; 2000), Hollas and Schuler (Lecture Notes in Computer Science Volume 2812, 2003, pp 55−62)、及びWO201420127;で見つかり、これらは全て、核酸のバーコード法及び配列決定に関連する反応条件及び試薬についての記載も含めて、そのまま全体が本明細書中に参照として援用される。
ある特定の実施形態において、WO2014201272のバーコードタグ付方法及び配列決定方法(「SCRB−seq」法)が採用される。SCRB−seq法に必要な試薬(例えば、少量であるために必要な修飾がなされたもの)をマルチチップウェルに添加する。ウェルはそれぞれ溶解した単細胞を含有する。簡単に述べると、SCRB−seq法は、単細胞由来の初期mRNA試料をマルチウェルプレート(上記のとおりのもの)中で増幅させ、マルチウェルプレートは各ウェルが単細胞を有している。最初のcDNA合成は、以下を持つ第一プライマーを使用する:i)細胞/ウェル同定用N6、ii)特定分子同定用N10、iii)mRNAと結合するためのポリT区間、及びiv)第二テンプレートスイッチングプライマーがハイブリダイズする領域を作製する領域。第二プライマーは、ポリG3’末端及びイソ塩基を有する5’末端を持つテンプレートスイッチングプライマーである。cDNA増幅後、タグ付cDNA単細胞/ウェル試料をプールする。次いで、2種の異なるプライマーとともに全長cDNA合成を行ない、全長cDNAを精製する。次に、i7プライマー(12のi7タグのうち1つを加えて特定のマルチウェルプレートを同定する)及びNEXTERA配列決定用のp5タグを加えるP5NEXTPT5(NEXTERA用にP7タグが別の末端に加えられる)を用いて、NEXTERA配列決定ライブラリーを作製する。ライブラリーをゲルで精製し、次いでNEXTERA配列決定を行う。制限ではなく例として、12のi7プレートタグ及び384細胞/ウェル特異的バーコードを用いると、この方法は、合計で4,608の単細胞トランスクリプトームを一度に行うことができる。この方法は、単細胞中のmRNA転写物の定量を可能にし、また使用者が転写物分子/細胞の絶対数を計数して規格化からあらゆる変数を除去することを可能にする。
本明細書中で言及される文献及び特許は全て、本明細書中に参照として援用される。本発明の記載される方法及び組成物の様々な修飾及び改変が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなるだろう。本発明は、具体的な好適な実施形態に関連して記載されてきたものの、当然のことながら、特許請求されるとおりの本発明は、そのような具体的な実施形態に過度に制限されるはずはない。実際、関連分野の当業者に明白である、本発明を実行するために記載された様式の様々な修飾は、以下の請求項の範囲内にあるものとする。
Claims (20)
- 捕捉用重合体膜を含む製品であって、該捕捉用重合体膜は、上面、底面、及び該捕捉用重合体膜を貫通して延びる複数の個別流路を備え、該個別流路はそれぞれ:
a)該捕捉用重合体膜の該上面に頂部開口を有し、
b)該捕捉用重合体膜の該底面に底部開口を有し、かつ
c)1個の細胞が、該1個の細胞のみで、細胞懸濁液から:
i)該底部開口に負圧が提供された場合に、該個別流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に該個別流路を閉塞させるような;または
ii)該底部開口に負圧が提供された場合に、該頂部開口で捕捉されるが、該個別流路には入らないような寸法である、
前記製品。 - 前記捕捉用重合体膜は、不活性及び/または疎水性重合体を含む、請求項1に記載の製品。
- 前記捕捉用重合体膜に取り付けられた、または前記捕捉用重合体膜と一体化した、少なくとも1つの膜ガイド構成要素をさらに備え、該膜ガイド構成要素は、前記捕捉用重合体膜の前記複数の個別流路を、マルチウェルデバイスのウェル及び/または重合体膜支持プレートの孔と1対1で一直線に並べることができるように構成されている、請求項1に記載の製品。
- 前記複数の個別流路の前記頂部開口は、マルチウェルデバイスのウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ、請求項1に記載の製品。
- 前記複数の個別流路は、少なくとも500の個別流路を含む、請求項1に記載の製品。
- 前記個別流路はそれぞれ、1個の細胞が、該1個の細胞のみで、細胞懸濁液から、前記底部開口に負圧が提供された場合に、前記頂部開口で捕捉されるが、前記個別流路には入らないような寸法である、請求項1に記載の製品。
- 前記重合体膜は、10μm〜50μmの厚さを有し、かつ前記上面は、1cm2〜30cm2の面積を有する、請求項1に記載の製品。
- 前記個別流路はそれぞれ、約2〜6μmの直径を有する、請求項1に記載の製品。
- 以下:
a)捕捉用重合体膜、該捕捉用重合体膜は、上面、底面、及び該捕捉用重合体膜を貫通して延びる複数の個別流路を含み、該個別流路はそれぞれ:
i)該捕捉用重合体膜の該上面に頂部開口を有し、
ii)該捕捉用重合体膜の該底面に底部開口を有し、かつ
iii)1個の細胞が、該1個の細胞のみで、細胞懸濁液から:
A)該底部開口に負圧が提供された場合に、該個別流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に該個別流路を閉塞させるような;または
B)該底部開口に負圧が提供された場合に、該頂部開口で捕捉されるが、該個別流路には入らないような寸法である;ならびに
b) 以下からなる群より選択される、第一構成要素:
i)液体は通過させるが細胞は通過させない多孔質材料を含む多孔質層、該多孔質層は、該複数の個別流路の該底部開口のそれぞれが該多孔質材料で覆われるように、該捕捉用重合体膜の該底面と接触させられる寸法である;
ii)複数の個別貫通孔を持つ基板を備える膜支持構成要素、該複数の個別貫通孔は、該捕捉用重合体膜の該複数の個別流路と1対1で一直線に並び、該膜支持構成要素は、該捕捉用重合体膜の底面と接触しこれを支持するようになっている寸法である;
iii)複数の個別ウェルを備えるマルチウェルチップ、該マルチウェルチップは、該複数の個別ウェルが該捕捉用重合体膜の該複数の個別流路と1対1で一直線に並ぶように該捕捉用重合体膜該の上面と接触させられる寸法である;及び
iv)細胞、該細胞は:A)該個別流路の1つの内側に捕捉される、またはB)該個別流路の1つの該頂部開口に捕捉される
を備える、システム。 - 収容基地をさらに備え、該収容基地は、前記捕捉用重合体膜を収容するように構成されており、かつ以下からなる群:真空接続口、前記捕捉用重合体膜と前記膜支持構成要素を整列させるための少なくとも2つのガイドピン、膜支持プレート用陥凹、液体貯蔵部、ガスケット、及び収容頂部を接続するための少なくとも1つの接続ロッド、より選択される少なくとも1つの基地機構を備える、
請求項9に記載のシステム。 - 収容頂部をさらに備え、該収容頂部は、収容基地と接続して、前記捕捉用重合体膜を包囲するように構成されており、かつ以下からなる群:注入口、排出口、スロットアレイ、ガイドピン受け、及び接続ロッド受け、より選択される少なくとも1つの頂部機構を備える、
請求項9に記載のシステム。 - 前記捕捉用重合体膜は、不活性及び/または疎水性重合体を含む、請求項9に記載のシステム。
- 前記捕捉用重合体膜は、前記捕捉用重合体膜に取り付けられた、または前記捕捉用重合体膜と一体化した、少なくとも1つの膜ガイド構成要素をさらに備え、該膜ガイド構成要素は、前記捕捉用重合体膜の前記複数の個別流路を、前記マルチウェルデバイスの前記ウェル及び/または前記重合体膜支持プレートの前記孔と1対1で一直線に並べることができるように構成されている、請求項に記載のシステム。
- 前記複数の個別流路の前記頂部開口は、前記マルチウェルデバイスの前記ウェル開口及び/または前記重合体膜支持プレートの前記孔と、1対1で一致し、一直線に並ぶ、請求項9に記載のシステム。
- 前記捕捉用重合体膜は、以下からなる群:i)前記複数の個別流路は、少なくとも500の個別流路を含む、ii)前記個別流路はそれぞれ、1個の細胞が、該1個の細胞のみで、細胞懸濁液から、前記底部開口に負圧が提供された場合に、前記頂部開口で捕捉されるが、前記個別流路には入らないような寸法である、iii)10μm〜50μmの厚さを有する、iv)前記上面は、1cm2〜30cm2の面積を有する;及びiv)前記個別流路はそれぞれ、約2〜6μmの直径を有する、より選択される少なくとも1つの性質を有する、請求項9に記載のシステム。
- 前記細胞は、以下からなる群:血小板、赤血球、好中球、リンパ球、外分泌細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞または肝細胞、杯細胞または線毛細胞、マクロファージ、造血幹細胞、貯蔵脂質で満たされた脂肪細胞、及びニューロン、より選択される、請求項9に記載のシステム。
- 以下からなる群:前記負圧を提供する真空ポンプ、収容基地を回転させるように構成された遠心モーター、ダイヤフラムポンプ、チップ整列構成要素、スイングアーム支持ロッドに取り付けられたスイングアーム、試料送達構成要素、ユーザーインターフェース画面、及び少なくとも1つの廃棄物容器、より選択される、第二構成要素をさらに含む、請求項1に記載のシステム。
- 単細胞の単離方法であって、以下:
a)細胞懸濁液を細胞単離システムと接触させること、該細胞単離システムは、以下を備える:
i)捕捉用重合体膜、該捕捉用重合体膜は、上面、底面、及び該捕捉用重合体膜を貫通して延びる複数の個別流路を含み、該個別流路はそれぞれ:
A)該捕捉用重合体膜の該上面に頂部開口を有し、
B)該捕捉用重合体膜の該底面に底部開口を有し、かつ
C)1個の細胞が、該1個の細胞のみで、該細胞懸濁液から:
1)該底部開口に負圧が提供された場合に、該個別流路内に捕捉され、部分的にまたは実質的に該個別流路を閉塞させるような;または
2)該底部開口に負圧が提供された場合に、該頂部開口で捕捉されるが、該個別流路には入らないような寸法である;ならびに
ii)該負圧を提供する空気圧デバイス
b)該細胞懸濁液を該細胞単離システムとともにインキュベートすること、該空気圧デバイスは、該捕捉用重合体膜の該個別流路の少なくとも1部が1個の捕捉細胞を有するように、該個別流路の少なくとも1部が細胞懸濁液から1個の細胞を捕捉するように、負圧を提供する;ならびに
c)該捕捉用重合体膜を洗浄して捕捉されなかった細胞を除去し、細胞を捕捉した重合体膜を作製すること、
を含む、前記方法。 - 前記細胞を捕捉した重合体膜とマルチウェルデバイスを一緒にしてアセンブリを作製することをさら含み、該マルチウェルデバイスは複数のウェル開口を有し、かつ前記細胞を捕捉した重合体膜の前記複数の個別流路の前記頂部開口は、該マルチウェルデバイスの該複数のウェル開口と1対1で一致し、一直線に並ぶ、請求項18に記載の方法。
- 前記細胞単離システムはさらに、以下:i)液体は通過させるが細胞は通過させない多孔質材料を含む多孔質層、該多孔質層は、前記複数の個別流路のそれぞれの前記底部開口が該多孔質材料で覆われるように、前記捕捉用重合体膜の前記底面と接触させられる寸法である;またはii)複数の個別貫通孔を持つ基板を備える膜支持構成要素、該複数の個別貫通孔は、前記捕捉用重合体膜の前記複数の個別流路と1対1で一直線に並び、該膜支持構成要素は、前記捕捉用重合体膜の前記底面と接触しこれを支持するようになっている寸法である、を備える、請求項18に記載の方法。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20200050022A (ko) * | 2018-10-31 | 2020-05-11 | 한국생산기술연구원 | 진공 세포 배양장치 |
WO2021065765A1 (ja) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | 東京応化工業株式会社 | 細胞スクリーニングデバイスおよび細胞スクリーニングキット |
JP2021528632A (ja) * | 2018-06-28 | 2021-10-21 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 方法 |
TWI840618B (zh) * | 2019-09-30 | 2024-05-01 | 日商東京應化工業股份有限公司 | 細胞篩選裝置及細胞篩選套組 |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8260824B2 (en) | 2009-05-05 | 2012-09-04 | Rocket Software, Inc. | Object-relational based data access for nested relational and hierarchical databases |
US9404864B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-08-02 | Denovo Sciences, Inc. | System for imaging captured cells |
US10466160B2 (en) | 2011-08-01 | 2019-11-05 | Celsee Diagnostics, Inc. | System and method for retrieving and analyzing particles |
EP2739587B1 (en) | 2011-08-01 | 2020-05-27 | Denovo Sciences | Cell capture system |
US10564147B2 (en) | 2012-05-25 | 2020-02-18 | The Regents Of The University Of California | Microfluidic systems for particle trapping and separation using cavity acoustic transducers |
US9606102B2 (en) | 2013-01-26 | 2017-03-28 | Denovo Sciences, Inc. | System and method for capturing and analyzing cells |
US9707562B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-07-18 | Denovo Sciences, Inc. | System for capturing and analyzing cells |
US9856535B2 (en) | 2013-05-31 | 2018-01-02 | Denovo Sciences, Inc. | System for isolating cells |
US10391490B2 (en) | 2013-05-31 | 2019-08-27 | Celsee Diagnostics, Inc. | System and method for isolating and analyzing cells |
US9757707B2 (en) | 2014-06-12 | 2017-09-12 | Takara Bio Usa, Inc. | Single cell capture with capture chips |
JP2017518752A (ja) | 2014-06-12 | 2017-07-13 | ウエハージェン インコーポレイテッド | 捕捉用重合体膜を用いた単細胞捕捉 |
US9795963B2 (en) * | 2014-09-26 | 2017-10-24 | Picosys Incorporated | Method and apparatus for taped interlayer flow cell with masking and conductive traces |
US20180252646A1 (en) * | 2015-08-18 | 2018-09-06 | Agency For Scien, Technology And Research | Optical structure and optical light detection system |
US9862941B2 (en) | 2015-10-14 | 2018-01-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Single cell microfluidic device |
CN105420086A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-03-23 | 苏州浚惠生物科技有限公司 | 单细胞定位微孔膜及应用和单细胞自动化获取装置 |
WO2017205687A1 (en) * | 2016-05-27 | 2017-11-30 | Takara Bio Usa, Inc. | Contact dispensing of cells into multi-well devices |
EP3525933B1 (en) * | 2016-10-11 | 2024-07-03 | The Regents of the University of California | Systems and methods to encapsulate and preserve organic matter for analysis |
CN108117970A (zh) * | 2016-11-28 | 2018-06-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于微结构的细胞捕获芯片及制备方法和应用 |
KR101916818B1 (ko) * | 2017-04-03 | 2018-11-08 | 이화여자대학교 산학협력단 | 대면적 전사방법을 이용한 전자장치 제조방법 |
WO2018227210A1 (en) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | The Regents Of The University Of California | High-efficiency encapsulation in droplets based on hydrodynamic vortices control |
US11517901B2 (en) | 2017-06-09 | 2022-12-06 | The Regents Of The University Of California | High-efficiency particle encapsulation in droplets with particle spacing and downstream droplet sorting |
US10391493B2 (en) | 2017-08-29 | 2019-08-27 | Celsee Diagnostics, Inc. | System and method for isolating and analyzing cells |
WO2019075409A1 (en) | 2017-10-12 | 2019-04-18 | The Regents Of The University Of California | ISOLATION AND IDENTIFICATION WITHOUT MICROFLUIDIC LABEL OF CELLS USING FLUORESCENCE LIFE IMAGING (FLIM) |
WO2019079787A1 (en) | 2017-10-20 | 2019-04-25 | The Regents Of The University Of California | MICROFLUIDIC SYSTEMS AND METHODS FOR CELL TRANSFECTION VIA LIPOFLEX |
US11499127B2 (en) | 2017-10-20 | 2022-11-15 | The Regents Of The University Of California | Multi-layered microfluidic systems for in vitro large-scale perfused capillary networks |
CN107674861B (zh) * | 2017-11-02 | 2020-10-02 | 苏州浚惠生物科技有限公司 | 稀有细胞单细胞水平的分离及检测方法 |
CN108956567B (zh) * | 2018-07-12 | 2021-02-19 | 广东工业大学 | 一种细胞分析芯片及其细胞荧光检测系统和检测方法 |
JP2020027068A (ja) * | 2018-08-15 | 2020-02-20 | ソニー株式会社 | 粒子取得方法、粒子捕捉用チャンバ、及び粒子分析システム |
KR102051435B1 (ko) * | 2018-12-07 | 2019-12-03 | 주식회사 엘지화학 | 알러지 진단용 칩 제조 장치 |
GB201820617D0 (en) * | 2018-12-18 | 2019-01-30 | Greindx As | System for capturing cells |
CN109847818B (zh) * | 2019-03-08 | 2020-08-28 | 北京理工大学 | 一种高通量微阵列检测芯片及其制备方法、应用方法 |
US10633693B1 (en) | 2019-04-16 | 2020-04-28 | Celsee Diagnostics, Inc. | System and method for leakage control in a particle capture system |
AU2020263374B2 (en) * | 2019-04-23 | 2023-05-11 | Mekonos Inc. | Dielectrophoretic immobilization of a particle in proximity to a cavity for interfacing |
US11273439B2 (en) | 2019-05-07 | 2022-03-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System and method for target material retrieval from microwells |
CN114072490A (zh) | 2019-05-07 | 2022-02-18 | 伯乐实验室有限公司 | 用于自动化的单细胞加工的系统和方法 |
CA3143241A1 (en) | 2019-06-14 | 2020-12-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System and method for automated single cell processing and analyses |
EP4028165A1 (en) * | 2019-09-10 | 2022-07-20 | Orca Biosystems, Inc. | Mesh for cell layer preparation |
US11504719B2 (en) | 2020-03-12 | 2022-11-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System and method for receiving and delivering a fluid for sample processing |
CN114540190A (zh) * | 2022-02-15 | 2022-05-27 | 华威特(江苏)生物制药有限公司 | 一种毒种悬浮培养箱 |
TWI827173B (zh) * | 2022-07-29 | 2023-12-21 | 臺北醫學大學 | 檢體分離裝置 |
Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5262128A (en) | 1989-10-23 | 1993-11-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Array-type multiple cell injector |
WO1998022819A1 (de) | 1996-11-16 | 1998-05-28 | Nmi Naturwissenschaftliches Und Medizinisches Institut An Der Universität Tübingen In Reutlingen Stiftung Bürgerlichen Rechts | Mikroelementenanordnung, verfahren zum kontaktieren von in einer flüssigen umgebung befindlichen zellen und verfahren zum herstellen einer mikroelementenanordnung |
US6893877B2 (en) | 1998-01-12 | 2005-05-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for screening substances in a microwell array |
US6169394B1 (en) | 1998-09-18 | 2001-01-02 | University Of The Utah Research Foundation | Electrical detector for micro-analysis systems |
US6572830B1 (en) * | 1998-10-09 | 2003-06-03 | Motorola, Inc. | Integrated multilayered microfludic devices and methods for making the same |
US6322683B1 (en) * | 1999-04-14 | 2001-11-27 | Caliper Technologies Corp. | Alignment of multicomponent microfabricated structures |
DE19948473A1 (de) * | 1999-10-08 | 2001-04-12 | Nmi Univ Tuebingen | Verfahren und Vorrichtung zum Messen an in einer flüssigen Umgebung befindlichen Zellen |
EP1257816A1 (en) * | 2000-02-11 | 2002-11-20 | Yale University | Planar patch clamp electrodes |
US20050118073A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-06-02 | Fluidigm Corporation | Devices and methods for holding microfluidic devices |
US6932893B2 (en) * | 2000-10-02 | 2005-08-23 | Sophion Bioscience A/S | System for electrophysiological measurements |
US20020132360A1 (en) | 2000-11-17 | 2002-09-19 | Flir Systems Boston, Inc. | Apparatus and methods for infrared calorimetric measurements |
CA2485099C (en) * | 2002-05-04 | 2017-09-26 | Aviva Biosciences Corporation | Apparatus including ion transport detecting structures and methods of use |
WO2004012585A2 (en) | 2002-08-05 | 2004-02-12 | Janssen Pharmaceutica Nv | Electrophysiology assay methods |
US7684844B2 (en) * | 2002-11-06 | 2010-03-23 | Ramot At Tel Aviv University Ltd. | System for and method of positioning cells and determining cellular activity thereof |
WO2005069001A1 (ja) * | 2003-09-25 | 2005-07-28 | Toyama Prefecture | マイクロウェルアレイチップ及びその製造方法 |
EP1692258A4 (en) | 2003-11-12 | 2007-03-21 | Xiao Xu | REAL-TIME ELECTRONIC CELL DETECTION SYSTEMS FOR CELL-BASED TESTS |
WO2005080606A1 (en) * | 2004-02-18 | 2005-09-01 | Xiaochuan Zhou | Fluidic devices and methods for multiplex chemical and biochemical reactions |
US7622296B2 (en) | 2004-05-28 | 2009-11-24 | Wafergen, Inc. | Apparatus and method for multiplex analysis |
EP1802752B1 (en) * | 2004-09-10 | 2012-06-13 | Molecular Devices, LLC | Parallel patch clamp system |
JP2006197880A (ja) * | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Fujitsu Ltd | 細胞捕捉装置および細胞捕捉方法 |
WO2006088427A1 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Agency For Science, Technology And Research | Microfluidics package and method of fabricating the same |
GB0508983D0 (en) * | 2005-05-03 | 2005-06-08 | Oxford Gene Tech Ip Ltd | Cell analyser |
US7655421B2 (en) * | 2005-06-17 | 2010-02-02 | Ciencia, Inc. | Cytometer on a chip |
US20070020640A1 (en) | 2005-07-21 | 2007-01-25 | Mccloskey Megan L | Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis |
EP1830186A1 (en) * | 2006-03-01 | 2007-09-05 | ETH Zürich | High-throughput cell-based screening system |
US8293524B2 (en) * | 2006-03-31 | 2012-10-23 | Fluxion Biosciences Inc. | Methods and apparatus for the manipulation of particle suspensions and testing thereof |
CA2677833C (en) | 2007-01-22 | 2016-05-03 | Wafergen, Inc. | Apparatus for high throughput chemical reactions |
US20090061513A1 (en) | 2007-05-15 | 2009-03-05 | Picovitro Ab | Cell sorting and cell cultivation methods |
EP2185929A4 (en) * | 2007-08-09 | 2015-04-29 | Univ Arizona | DETECTION AND IDENTIFICATION OF BIOLOGICAL SAMPLES USING MICROFLUIDIC DEVICES |
WO2010040831A1 (en) * | 2008-10-10 | 2010-04-15 | Picovitro Ab | Genetic analysis in microwells |
WO2010117620A2 (en) | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Illumina, Inc. | Gene expression analysis in single cells |
US20130337500A1 (en) | 2009-04-24 | 2013-12-19 | National University Of Singapore | System and method for isolation of cells |
US8835358B2 (en) | 2009-12-15 | 2014-09-16 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels |
US8329009B2 (en) * | 2010-04-09 | 2012-12-11 | Molecular Devices, Llc | High throughput screening of ion channels |
US20130122539A1 (en) * | 2010-05-04 | 2013-05-16 | Mo-Huang Li | Microsieve for cells and particles filtration |
EP2623613B8 (en) | 2010-09-21 | 2016-09-07 | Population Genetics Technologies Ltd. | Increasing confidence of allele calls with molecular counting |
US8986986B2 (en) * | 2010-10-29 | 2015-03-24 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Cell lysis device and methods of lysing cells or viruses |
US9844779B2 (en) * | 2011-01-14 | 2017-12-19 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Membrane-integrated microfluidic device for imaging cells |
CA2829331C (en) * | 2011-02-15 | 2019-01-22 | Daniel Brassard | 3d microfluidic devices based on open-through thermoplastic elastomer membranes |
US9304065B2 (en) * | 2012-02-29 | 2016-04-05 | Fluidigm Corporation | Methods, systems and devices for multiple single-cell capturing and processing using microfluidics |
EP3725409A1 (en) * | 2012-06-01 | 2020-10-21 | Vycap B.V. | A microsieve diagnostic device in the isolation and analysis of single cells |
US9757707B2 (en) | 2014-06-12 | 2017-09-12 | Takara Bio Usa, Inc. | Single cell capture with capture chips |
JP2017518752A (ja) | 2014-06-12 | 2017-07-13 | ウエハージェン インコーポレイテッド | 捕捉用重合体膜を用いた単細胞捕捉 |
-
2015
- 2015-06-10 JP JP2016572490A patent/JP2017518752A/ja active Pending
- 2015-06-10 US US14/735,514 patent/US20150360226A1/en not_active Abandoned
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- 2015-06-10 EP EP15805883.4A patent/EP3155396A4/en not_active Withdrawn
- 2015-10-06 US US14/876,365 patent/US9995662B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021528632A (ja) * | 2018-06-28 | 2021-10-21 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 方法 |
JP7354154B2 (ja) | 2018-06-28 | 2023-10-02 | ユニリーバー・アイピー・ホールディングス・ベスローテン・ヴェンノーツハップ | 方法 |
KR20200050022A (ko) * | 2018-10-31 | 2020-05-11 | 한국생산기술연구원 | 진공 세포 배양장치 |
KR102134166B1 (ko) * | 2018-10-31 | 2020-07-16 | 한국생산기술연구원 | 진공 세포 배양장치 |
WO2021065765A1 (ja) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | 東京応化工業株式会社 | 細胞スクリーニングデバイスおよび細胞スクリーニングキット |
CN114466919A (zh) * | 2019-09-30 | 2022-05-10 | 东京应化工业株式会社 | 细胞筛选器件及细胞筛选试剂盒 |
TWI840618B (zh) * | 2019-09-30 | 2024-05-01 | 日商東京應化工業股份有限公司 | 細胞篩選裝置及細胞篩選套組 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9995662B2 (en) | 2018-06-12 |
EP3155396A1 (en) | 2017-04-19 |
CN106796166A (zh) | 2017-05-31 |
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US20160033378A1 (en) | 2016-02-04 |
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