CN107674861B - 稀有细胞单细胞水平的分离及检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种对体液样本中的稀有细胞进行单细胞水平的分离的方法，包含：将体液样本以细胞悬液的形式均匀添加至复合滤膜上，细胞悬液包括作为多数细胞的白细胞和作为稀有细胞的病变细胞，其中复合滤膜包括阵列的1000片以上独立的、可寻址的子滤膜，每片子滤膜中含有孔径在3微米至10微米的微孔进行加压过滤以使得50％以上的子滤膜各自截留的白细胞的数目不超过10个；对有核细胞用荧光标记的病变细胞标志物进行标记处理；对截留的有核细胞进行荧光成像从而确定截留了具有特定荧光特征的病变细胞的子滤膜在复合滤膜上的位置。本方法可以快速、简便和高回收率地以单细胞水平分离稀有细胞。
Description
技术领域
本发明属于稀有细胞分离和检测领域，具体涉及一种从人体体液中分离和检测稀有细胞的方法。
背景技术
人外周血中的循环肿瘤细胞(CTC)是指由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。CTC反映了肿瘤病灶的分子特征，并且是肿瘤血行转移的直接来源，因此CTC检测越来越引起重视。CTC在外周血中含量极少，每10ml血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞，因此从外周血中快速、高效的分离循环肿瘤细胞是后续对循环肿瘤细胞计数、以及分子、功能分析的前提。同时，由于肿瘤细胞具有异质性，因此对于CTC的单细胞分析也极为重要。
目前CTC的检测主要分两步，第一步是CTC的富集分离，第二步是对富集后的CTC进行进一步的鉴定。
CTC的富集分离方法主要依赖于肿瘤细胞与血液细胞在物理、化学或生物学性质的不同，可分为两类。一类是基于CTC与血液细胞物理性质上的差异，如细胞大小，肿瘤细胞一般来说比血液细胞更大、更不容易变形。针对这一物理性质的差异，典型的富集分离方法就是采用滤膜的方法富集CTC并进一步通过病理学染色或免疫染色来鉴定CTC。由于一定比例的白细胞同样尺寸较大，这一方法往往会在富集后仍有较多的白细胞。更重要的是，由于CTC卡在滤膜上的微孔内，这一方法无法将富集到的CTC取出做进一步的分子分析，更无法进行单细胞的分离。另一类CTC富集分离方法主要基于CTC表面与血液细胞不同的独特抗原，通过针对CTC表面独特抗原的抗体或核酸适配体实现CTC的捕获并与血液中其他细胞分离。但目前缺乏肿瘤细胞特异性抗原，因此在捕获后还需进一步的免疫染色以鉴定CTC。可用于捕获CTC的抗原包括上皮细胞抗原EpCAM，器官特异性标志物(如PSA、CEA和HER-2)，EMT标志物等。针对这些抗原的抗体常被修饰于磁球或微流控复合滤膜表面以捕获血液中的CTC。通过微流控复合滤膜捕获的CTC同样存在难以释放CTC以进行分子检测的问题。通过磁球捕获的CTC(如目前唯一获得美国FDA批准的CellSearch系统)虽处于游离状态，但即使在捕获后仍然存在较多血液细胞的干扰，难以获得纯的CTC进行分子检测，更难以将CTC分离成单细胞进行检测。
对富集后的CTC进行进一步的鉴定。传统的标记物(上皮细胞标记物等)鉴定血液中的CTC，在可靠性和获得细胞的活性上被学者们质疑。基于“瓦博格效应”，与PET-CT原理类似，即由于肿瘤细胞内葡萄糖转运蛋白的过度表达以及增强的己糖激酶、磷酸果糖激酶及丙酮酸脱氢酶活性，使肿瘤细胞的葡萄糖无氧代谢活动增强。所以可以通过检测细胞摄取葡萄糖的水平来区别肿瘤细胞和正常体细胞。
由于CTC的分子检测，尤其是单细胞分子检测极为重要，因此目前CTC领域面临的重大技术挑战是无法获得纯的CTC群体进行分子分析，以及获得单个CTC进行单细胞分子分析。解决这一问题的一个可行的思路是通过显微操作设备将鉴定到的CTC一一取出，或置于不同的PCR管或384孔板内进行单细胞分子分析，或置于同一个PCR管内合并起来进行后续分子分析。但显微操作设备的不足之处在于非自动化操作以及容易在操作、转移单细胞过程中丢失细胞，其原因是分离细胞常采用毛细管，而毛细管容易黏住细胞无法成功转移，或虽能转移但无法准确转移至PCR管底部导致后续分子反应难以进行。
因此，针对目前稀有细胞富集过程复杂、单细胞回收困难等情况，需要更高自动化的简便、高效的稀有细胞单细胞水平的分离方法。
发明内容
本发明提供了从血液等样本中快速、简便和高回收率地分离稀有细胞的方法。
本发明方法不以绝对单个细胞形式分离、回收稀有细胞为目的。本发明允许在不影响分离后病变细胞的确认(例如荧光分析确认)和后续分子水平检测验证的情况下，过滤分离的病变细胞可以与少量其它细胞共存。以期实现高通量的分离，并可省去稀有细胞相对于白细胞的富集步骤。
首先提供一种非诊断目的的对人体体液样本中的稀有细胞进行单细胞水平的分离的方法，包含如下步骤：A：将体液样本以细胞悬液的形式均匀添加至复合滤膜上，细胞悬液中的有核细胞包括作为多数细胞的白细胞和作为稀有细胞的病变细胞，其中复合滤膜包括阵列的1000片以上独立的、可寻址的子滤膜，每片子滤膜中含有孔径在3微米至10微米的一个或多个微孔，每片子滤膜中截留的有核细胞能独立于其他子滤膜上的有核被单独回收，进行加压过滤以使得子滤膜总数目的50％以上的子滤膜各自截留的白细胞的数目不超过10个；B：在步骤A的过滤前，或者在过滤后的复合滤膜上，对有核细胞用荧光标记的病变细胞标志物进行标记处理；及C：对复合滤膜上截留的有核细胞进行荧光成像，从而确定截留了具有特定荧光特征的病变细胞的子滤膜在复合滤膜上的位置。
在本发明分离的方法的具体实施方式中：步骤A中，所述体液样本为外周血、胸水或脑脊液，所述病变细胞是其中的肿瘤细胞；步骤A中，添加至复合滤膜上的细胞悬液的白细胞总数目为子滤膜总数目的50倍以上，优选为100倍以上；步骤B中，还包括对有核细胞用荧光标记的白细胞标志物进行标记处理；且，还进一步包括步骤D：将确定截留了病变细胞和0-10个白细胞的子滤膜刺破，而将子滤膜与其截留的细胞一起进行回收。
在本发明分离的方法的具体实施方式中：所述复合滤膜具有4000片以上的子滤膜，且每片子滤膜上有1个所述微孔；步骤A中添加至复合滤膜上的细胞悬液基本上不含红细胞，且白细胞浓度为不超过200万个/ml；添加至一复合滤膜上的细胞悬液的白细胞总数目为50万个以上；且过滤压力设定为10-30mba，使得每次过滤后，复合滤膜的50％以上片数的子滤膜各自截留的白细胞数不超过10个。
在本发明分离的方法的具体实施方式中：所述复合滤膜的每片子滤膜上有2-10个所述微孔；步骤A中添加至复合滤膜上的所述细胞悬液是选自外周血、胸水和脑脊液的体液样本，任选地，是经稀释和/或经去除红细胞处理的；添加至一复合滤膜的所述白细胞总数目为50万个以上；且过滤压力为5-30mba，使得每次过滤后，复合滤膜的50％以上片数的子滤膜各自截留的白细胞数不超过10个。
在本发明分离的方法的具体实施方式中：步骤A中，当体液样本为外周血、胸水和脑脊液时，所述荧光标记的病变细胞标志物是葡萄糖类似物。
在本发明分离的方法的具体实施方式中：所述复合滤膜包括：1000孔以上且10万孔以下，优选4000孔且以上4万孔以下的阵列小孔板；和位于阵列小孔板各小孔的底部的各所述子滤膜。并且小孔与子滤膜的直径为50-150微米，优选50-100微米。
在本发明分离的方法的具体实施方式中：基于所述体液样本，细胞悬液中作为稀有细胞的从病变组织脱落的病变细胞相对于作为多数细胞的白细胞未经富集处理；且白细胞总数目与复合滤膜中子滤膜总数目的倍数的上限选择为不导致过滤时复合滤膜的堵塞，优选地，白细胞总数目与复合滤膜中所述微孔的总数目的1000倍以下，优选800倍以下，更优选500倍以下。
在本发明的另一方面，为了对本发明的上述分离方法的结果进行验证，还提供一种非诊断目的的对体液样本中的稀有细胞进行单细胞水平的检测的方法，包括：前述本发明的分离方法的步骤A-步骤C，确定截留了具有特定荧光特征的病变细胞的子滤膜在复合滤膜上的位置；将确定截留了病变细胞和0-10个白细胞的子滤膜刺破，而将子滤膜与其截留的细胞一起回收；以及在一起回收的病变细胞与白细胞共存的情况下，进行病变细胞的特征基因检测，以验证所述荧光成像确定的具有特定荧光特征的细胞为病变细胞。
根据本发明方法，可以对有核细胞总数目远高于复合滤膜中子滤膜总数目(阵列小孔数目)的细胞悬液进行过滤，使大部分细胞通过滤膜后，可独立回收的子滤膜中的大多数截留白血细胞不超过10个，即与截留的病变细胞数共存的白细胞数不超过10个，从而实现单细胞水平的分离。单细胞水平分离后可以正常荧光分析确认和分子水平的鉴定。其优点是可以省去富集步骤，大幅度节省时间和成本，并且避免了富集过程中夹带等原因导致的稀有细胞损失率，使回收率高达90％。对于多微孔复合滤膜的条件下，甚至可以实现未经去除红细胞、未经富集，甚至未经稀释，而对外周血、胸水、脑脊液等体液进行直接过滤分离肿瘤细胞，而进一步提高效率降低成本。
附图说明
图1是用于本发明的双层结构的复合滤膜示意图，各子薄膜(子滤膜)上具有微孔。
图2是显微镜下双层结构的复合滤膜的图像。其中：图2的A为每个子滤膜具有5um单微孔的复合滤膜；B为每个子滤膜具有4个5um微孔的合滤膜；C为为每个子滤膜具有8个5um微孔的合滤膜；D是每个子滤膜具有7um单微孔的复合滤膜。
图3是过滤细胞后，在显微镜下复合滤膜的多个子滤膜上细胞分布的明场下的实时图。
图4是过滤细胞后，在复合滤膜的子滤膜上截留细胞数的分布统计图，图中横坐标是每子滤膜上的细胞数目范围，纵坐标是截留了各细胞数目范围的子滤膜占子滤膜总数的百分比。
图5是表示复合滤膜截留循环肿瘤细胞和白细胞，刺破子滤膜并用多孔板回收循环肿瘤细胞单细胞的示意图，例如用于(二)非小细胞肺癌细胞H1975的单细胞回收试验。
图6是显微镜下截留了荧光染色的肿瘤细胞及白细胞的复合滤膜在破膜前后的图像。
图7是在复合滤膜上细胞2-NBDG摄取值的分布图，纵坐标为细胞数目，横坐标为2-NBDG摄取值，左上角的小峰是白细胞的摄取分布。
图8是根据本发明一实施例的从外周血样本中分离、回收、鉴定肿瘤细胞的流程示意图。
图9是根据本发明一实施例的在复合滤膜上阳性细胞图，其示出过滤大量细胞后，不同荧光通道下观察到的细胞在复合滤膜中的分布。
图10是图9中阳性细胞获得后，进行分子检测后的结果。
具体实施方式
体液样本，如外周血、胸水和脑脊液等体液中的稀有细胞如肿瘤细胞相对于多数细胞如白细胞通常以百万分之一至十万分之一的数量级存在，外周血中甚至仅以千万分之一的数量级存在，也就是说白细胞以稀有细胞几万倍甚至高达百万倍的数量存在。本发明主要涉及对人体体液中从病变组织脱落的病变细胞尤其是肿瘤细胞进行单细胞水平的分离的方法。
本发明的对体液样本中的稀有细胞进行单细胞水平的分离的方法，包含如下步骤：
A：将体液样本以细胞悬液的形式均匀添加至复合滤膜上，细胞悬液中的有核细胞包括作为多数细胞的白细胞和作为稀有细胞的从病变组织脱落的病变细胞，其中复合滤膜包括阵列的1000片以上独立的、可寻址的子滤膜，每片子滤膜中含有孔径在3微米至10微米的一个或多个微孔，每片子滤膜中截留的有核细胞能独立于其他子滤膜上的有核被单独回收，
其中添加至复合滤膜上的细胞悬液中的白细胞总数目为复合滤膜中子滤膜总数目的50倍以上，且进行加压过滤以使得子滤膜总数目的50％以上的子滤膜各自截留的白细胞的数目不超过10个；
B：在步骤A的过滤前，或者在过滤后的复合滤膜上，对有核细胞用荧光标记的病变细胞标志物进行标记处理；及
C：对复合滤膜上截留的有核细胞进行荧光成像，从而确定截留了具有特定荧光特征的病变细胞的子滤膜在复合滤膜上的位置。
病变细胞(例如外周血中的循环肿瘤细胞、胸水和脑脊液中的肿瘤细胞)，将体液样本中的有核细胞(包括白细胞和稀有的病变细胞)以细胞悬液形式添加至复合滤膜上进行过滤。
本发明具体实施例中所用复合滤膜可包括：1000孔以上的阵列小孔板、和位于阵列小孔板各小孔的底部的所述子滤膜。如实施例中所用，各小孔直径优选为50-100um，更具体第为70um。子滤膜为可为脆性薄膜，以利于针刺破裂。从分离通量角度看，子滤膜或或者说阵列小孔的数量没有上限，但从设备制造成本考虑，可以将其限于每个复合滤膜的子滤膜在10万片以下，更具体地4万片以下，更好地1万片以下。这主要从成本考虑，而不应成为对本发明的限制。在本发明实例中，使用4000-10000片子滤膜，具体为6400片子滤膜的复合滤膜，可以实现本发明的目的。
基于所述体液样本中稀有细胞的存在比例，本发明方法的实施例中使用的细胞悬液中作为稀有细胞的病变细胞相对于作为多数细胞的白细胞未经富集处理。基于所述体液样本中作为多数细胞的白细胞的存在浓度，本发明方法中使用的细胞悬液中白细胞可以是未经稀释的，甚至高于原样本中的浓度，只要其中的白细胞浓度不会导致滤膜的堵塞而无法实现本发明要求的单细胞水平的分离。
从分离到更多的目标细胞考虑，过滤步骤中添加至复合滤膜上的白细胞总数目或者说有核细胞总数目与复合滤膜中子滤膜总数目的倍数越高越有利，只要不导致过滤时复合滤膜的堵塞而无法实现本发明要求的单细胞水平的分离。根据本发明的实施例，白细胞总数目与复合滤膜中所述微孔的总数目的的倍数上限可以选择为1000倍，具体800倍，更具体地500倍，以不影响顺利过滤为准。另一方面，为了提高过滤效率，且为了在有限微孔数的复合滤膜中尽可能地捕获到目的稀有细胞，通常需要一定量的有核细胞处理总数目或其与微孔数目的比例，例如过滤添加的白细胞总数目不小于10万个，例如20万个以上，且其与微孔总数的比例大于10倍，例如大于20倍。具体的下限值可根据不同体液样本中稀有细胞比例的数量级来确定。例如，患者外周血中肿瘤细胞可能以百万分之几的量级存在，过滤需要添加的有核细胞总数目可设为50万个以上、最好100万个以上；为了提高滤膜效率，总数目比例可以设为50倍以上。但对于白细胞含量低而肿瘤细胞比例相对高的患者脑脊液，其添加白细胞总数目为10万个或20万个以上时就会容易捕获到肿瘤细胞，白细胞总数目滤膜与微孔总数目比例的也不必50倍以上，例如可以为20倍或30倍以上。
为了实现高效快速的分离稀有细胞，本发明不要求复合滤膜中的各子滤膜以严格单细胞的形式截留病变细胞，只要与截留分离的目标细胞共存的其它细胞的数量不足以影响病变细胞类型的确定或后续的分子水平鉴定验证。与现有稀有细胞方法不同，本发明方法能够实现不必相对于多数细胞(有核细胞，例如白细胞)富集稀有细胞。
H1975：一种非小细胞肺癌的细胞系
THP1：一种人外周血的单核细胞系，来源于急性单核细胞性白血病患者
2-NBDG：2-(N-(7-硝基苯基-2-噁-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose)
L858R：是人第7号染色体上E21外显子肺癌细胞的一个驱动基因突变
T790M：是人第7号染色体上E20外显子肺癌细胞的一个驱动基因突变。
(一)单微孔复合滤膜过滤参数优化试验
目的是通过多次试验调整各种工艺参数，以获得较好的参数范围。
所用复合滤膜为图1所示复合滤膜，该滤膜具有在阵列孔板中的6400个小孔，各小孔具有独立的子薄膜作为子滤膜，各子滤膜中具有直径为5um的一个微孔(故称为单微孔)。复合滤膜的孔板可以为Si材，子滤膜可以为氮化硅材。阵列小孔直径为70um，深度为360um；各子滤膜的厚度可为1um。
试验例1
(1)过滤前的预处理(去除红细胞)
1)裂解红细胞，将3ml人血300G离心，5min，移除上清液到1.5ml的管中，保存。
2)将剩余的样本转移到50ml离心管，加入血液体积10倍的裂红液。用移液枪吹打混匀，室温避光静置15min，之后4℃，200g，离心5min。小心去除上清。
3)细胞沉淀中加入5ml PBS，吹打混匀，4℃，300g，离心5min，小心去除上清。
4)若此时管内细胞沉淀中，仍有明显的红细胞存在，进行步骤(5)，若无，进行后续步骤(2)染色。
5)细胞沉淀中加入10ml裂红液，吹打混匀，室温避光静置10min，4℃，200g，离心5min，小心去除上清。
6)细胞沉淀中加入5ml PBS，吹打混匀，4℃，300g，离心5min，小心去除上清，重悬浮在1ml的HBSS中，细胞计数。
(2)染色
1)根据细胞数量加入细胞染色试剂(500万白细胞10ul CD45和10ul EpCAM，细胞数大于500万按比例增加抗体量，细胞数小于500万按500细胞的量加抗体)。避光旋转染色1h。
2)将装有细胞悬液的离心管4℃，300g，离心5min，小心去除上清。
3)细胞沉淀中加入HBSS，1ml，小心吹打混匀，4℃，300g，离心5min，小心去除上清。
4)加入1ml HBSS轻轻吹打混匀，重悬细胞，4℃，300g，离心5min，小心去除上清。再重悬细胞与1ml的HBSS中。
(3)过滤
1)将插入了前述复合滤膜的内置的过滤套管放置在细胞过滤采集器中。
2)1mlHBSS加入套管，打开泵，压力调至10mbar，清洗2遍
3)用HBSS将(2)所得细胞悬液稀释至250万细胞/ml的细胞悬液浓度，并取2ml稀释后细胞悬液(即复合滤膜上加入的细胞总量为500万白细胞)加至复合滤膜上，在压力5mbar下过滤。
4)细胞过滤结束后。用1mlPBS溶液清洗复合滤膜，拔出复合滤膜后用1mlHBSS溶液清洗复合滤膜底部。
5)将复合滤膜移至仪器上，荧光观察。
以上过滤过程重复3次以上，以了解过滤是否顺利，及子滤膜上截留细胞数目分布状况。
试验例2-12
与试验例1的过程相同，不同之处在于过滤时加样的细胞悬液的浓度、过滤压力和复合滤膜上加入的白细胞总量。具体参数见表1。
试验例13
与试验例9的过程相同，不同之处仅在于染色步骤在过滤后在复合滤膜上加入染色剂而进行。其染色过程包括：配制染料：在试管中加入196ul PBS+2ul EpCAM-PE+2ulCD45-APC；将染料加入到复合滤膜上，避光染色1.5小时；及用1ml PBS清洗复合滤膜。
表1：单微孔5um复合滤膜实验参数总结
对以上数据分析可以知：(1)单微孔复合滤膜过滤压力在10-30mbar都可行，最适合压力为15-25mbar。(2)待过滤细胞浓度在200万/ml以下为合适，尤其在50-100万/ml范围内为合适。(3)对本试验使用的复合滤膜而言，单次过滤操作加样总细胞数目可高达500万。(4)过滤前染色，过滤后染色都可行。
图3是试验例9中过滤细胞后，在显微镜下复合滤膜的多个子滤膜上细胞分布的明场下的实时图的截图。
图4是试验例9中过滤细胞后，在复合滤膜的子滤膜上截留细胞数的分布统计图。
从表1记录，正常过滤后6400孔复合滤膜(即6400片子滤膜)上截留细胞数基本为2-5万个，部分为1-3万个。从图3示出的过滤后复合滤膜图像的部件截图可以看出，各个子滤膜上截留的细胞数基本上在1-10个之间。从图4示出的截留细胞分布统计数据可以看出，截留细胞数超过10个的子滤膜小于5％，95％以上的子滤膜上截留白细胞数不超过10个。其中近20％的子滤膜截留细胞数为6-10个，约65％的子滤膜截留细胞数为1-5个，还有近10％的子滤膜未截留细胞。
可以得知，当这一方法用于从患者外周血等体液中分离稀有的稀有细胞(例如，外周血中通常数百万白细胞中夹杂数个至数十个循环肿瘤细胞)时，与被截留在单个子滤膜上的稀有肿瘤细胞共存的白细胞数量基本上在0-10个范围内，大多数在0-5个的范围内。发明人推测并经本文后面描述的分离、回收和测序试验证明，这样的共存白细胞数量在与稀有的肿瘤细胞一起回收(例如回收至PCR管孔)后不会干扰后续的对肿瘤细胞的测序鉴定。也就是说能以基本上单细胞形式或以单细胞水平分离到样本中的稀有目标细胞，如循环肿瘤细胞。
为了以较高回收率达到本发明的稀有细胞单细胞水平的分离，通常要求过滤后复合滤膜的50％片数的子滤膜上截留的有核细胞数不超过10个，优选70％以上，更优选90％以上片数的子滤膜各自截留的有核细胞数不超过10个，优选为不超过5个。
(二)非小细胞肺癌细胞H1975的单细胞回收试验
目的：
1.利用实验(一)中得出优化过滤参数后，考察肿瘤细胞的回收率。
2.在分子层面验证本发明未经富集通过过滤一步分离肿瘤细胞方法的可行性。
3.比较本发明过滤方法与现有商用方法(磁球富集+过滤)。
实施例1
(1)样本准备:
将100个非小细胞肺癌细胞H1975用3ul染料VybrantDiI(Life Tehnologies)染色1小时。经此染色标记的肿瘤细胞，过滤后可以在复合滤膜上通过荧光识别。染色后细胞掺入到2ml的血液中。
(2)过滤前的预处理(去除红细胞)
参考试验例1中的方法进行裂解红细胞处理，并且类似地，细胞H1975与白细胞的混合物悬于1ml HBSS中，细胞计数。
(3)过滤
参照试验例9的过滤方法，即：过滤压力20mba，加样细胞液浓度为50万个细胞/ml，总加样量为400万个细胞。
过滤结束后对复合滤膜进行荧光扫描，记录扫描到的阳性细胞(目标细胞H1975)的个数。以上(1)-(3)步骤重复5次，以统计目标细胞回收率。从表2可知，过滤回收率可达90％或以上。
(4)非小细胞肺癌细胞H1975位置的确定及回收
1)对过滤结束后复合滤膜进行荧光扫描，确认目标细胞H1975的位置，并记录个数。
2)按图5所示的过程，通过微针冲击H1975细胞所在复合滤膜的小孔中的子滤膜(小孔底部的机械脆性的氮化硅膜)，使整个氮化硅薄膜碎裂连同目标细胞和共截留的白细胞掉入位于其正下方用于细胞回收的384孔板(或者96孔板或者PCR单管)的孔中，其中PCR单管(或者96孔板或者384孔板)中事先添加了适量体积的缓冲液，一共获取10个H1975细胞分别在10个PCR反应单管。
(5)对回收后单个非小细胞肺癌细胞H1975的鉴定
从各子滤膜回收的有核细胞进行细胞裂解，并采用
Single Cell DNAQuick-Amp Kit(亿康基因)或者REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen)或者Ampli1TMWTA Kit(silicon biosystems)对单细胞全基因组进行放大。
放大后的产物通过Sanger测序，qPCR(Arms-PCR)，NGS检测到H1975细胞所具有L858R和T790M突变，从而验证了荧光扫描计数和确定位置后回收到的细胞确实均有H1975细胞。
对照例1-(磁球富集后再过滤分离)
(1)样本准备:
同实施例1的步骤(1)。
(2)过滤前的预处理(去除红细胞)
同实施例1的步骤(2)
(3)磁球富集(使用试剂盒：EasySepTMHuman CD45Depletion Kit，stemcell)
将除去红细胞后细胞转移至试管1中，再加入5ul的抗体(用枪头混匀)，静止15min；再加入10ul的磁球(用枪头混匀)，静止10min，再加入1ml的PBS；试管1放入磁极，静止10min；取出液体，加入新的试管2，将试管2放入磁极，静止10min。将上清加入套管。最后得到富集后细胞悬液1ml，总细胞量2万个细胞。
(4)过滤
将上述富集后总细胞量2万个的细胞悬液1ml，按实施例1的方法过滤。
以上(1)-(4)步骤重复6次，以统计目标细胞回收率。
实施例1中过滤时间约35min；
对照例1中富集时间约60min，过滤时间约15min，两者时间之和75min。
过滤结束后对复合滤膜进行荧光扫描，记录扫描到的阳性细胞(目标细胞H1975)的个数。以上(1)-(3)步骤重复6次，以统计目标细胞回收率。从表2可知，富集+过滤导致的回收率仅为39％，不足本发明方法的一半。
(5)对回收后单个非小细胞肺癌细胞H1975的鉴定
然后将细胞裂解，并采用
Single Cell DNA Quick-Amp Kit(亿康基因)或者REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen)或者Ampli1TMWTA Kit(silicon biosystems)对单细胞全基因组进行放大。
放大后的产物通过Sanger测序，qPCR(Arms-PCR)，NGS检测到H1975细胞所具有L858R和T790M突变。
表2
可见本发明未经富集直接过滤的方法大大提高了目标细胞的回收率。还大幅减少了操作的时间，节约了设备和试剂。
(三)肿瘤细胞葡萄糖高摄取检测
目的是了解利用肿瘤细胞葡萄糖高摄取来荧光检测肿瘤细胞的可行性
1.THP1(白血病病人白细胞细胞系)用CD45-APC染色1小时。
2.300G离心，取出上清，加入PBS，清洗。重复步骤2次。
3.取500个A549(肺癌细胞系)细胞掺入5000个染色后的THP1细胞中
4.取40ul葡萄糖类似物(2-NBDG，4mM/ml)染色试剂加入至960ul DMEM无糖培养基，再加入至离心管将细胞沉淀吹打重悬。避光旋转染色15min。
5.4℃，300g，离心五分钟，小心去除上清。
6.加入1ml HBSS轻轻吹打混匀，重悬细胞，4℃，300g，离心5min，小心去除上清。再重悬细胞与1ml的HBSS中。
7.复合滤膜过滤，复合滤膜为在前(一)单微孔复合滤膜过滤参数优化试验中的类似。
8.扫描复合滤膜，计算荧光值。当扫描到一个2-NBDG高摄取的细胞，如果CD45-APC不亮，则为A549细胞。
9.实验结果显示，所回收的A549细胞中，葡萄糖都是高摄取的，THP1都是低摄取的，从而证明了利用肿瘤细胞葡萄糖高摄取荧光检测肿瘤细胞的可行性。
图6是本试验中，显微镜下截留了荧光染色的肿瘤细胞及白细胞的复合滤膜在破膜前后的图像。
图7是在复合滤膜上细胞2-NBDG摄取值的分布图，纵坐标为细胞数目，横坐标为2-NBDG摄取值，左上角的小峰是白细胞的摄取分布。
(四)病人血液中循环肿瘤细胞的捕获和分子检测
实施例2
目的：证明本发明方法在肺腺癌细胞分离中的可行性。
按图8所述流程从病人外周血分离和鉴定循环肿瘤细胞，具体步骤为：
1.取已知原位灶有L858R突变肺腺癌血样3ml，裂解红细胞(与试验(一)中裂解红细胞步骤相同)
2.向离心管内细胞沉淀加入缓冲液1ml，吹打混匀后转移到1.5ml离心管中。
3.细胞计数，计算细胞悬液中细胞总量(大约400万个)。
4.根据细胞数量加入细胞染色试剂(500万白细胞加10ul CD45和10ulEpCAM，细胞数大于500万按比例增加抗体量，细胞数小于500万按500细胞的量加抗体)。避光旋转染色1h。
5.将装有细胞悬液的离心管4℃，300g，离心5min，小心去除上清。
6.细胞沉淀中加入HBSS，1ml，小心吹打混匀，4℃，300g，离心5min，小心去除上清。
7.取40ul葡萄糖类似物(2-NBDG，4mM/ml)染色试剂加入至960ul DMEM无糖培养基，再加入至离心管将细胞沉淀吹打重悬。避光旋转染色15min。
8.4℃，300g，离心五分钟，小心去除上清。
9.加入1ml HBSS轻轻吹打混匀，重悬细胞，4℃，300g，离心5min，小心去除上清。再重悬细胞于1ml的HBSS中。
10.过滤：过程与试验(一)中试验例9中相同。
11.对复合滤膜进行荧光扫描，确认目标细胞的位置。(一共有6400片子滤膜数目，血液中的肿瘤细胞小远远少于这个数，所以一片子滤膜中只有1个或者0个肿瘤细胞)通过细针冲击目标细胞所在微孔底部的机械脆性的氮化硅膜，使整个氮化硅薄膜碎裂连同细胞掉入位于其正下方用于细胞回收的事先添加了适量体积的缓冲液PCR单管中。
12.然后将细胞裂解，并采用
Single Cell DNA Quick-Amp Kit(亿康基因)或者REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen)或者Ampli1TMWTA Kit(siliconbiosystems)对单细胞全基因组进行放大。
13.放大后的产物，使用sanger技术，Arms-PCR(qPCR),ddPCR,NGS测序检测基因突变(例如：EGFR,c-MET,Kras等)。荧光检测确认的目标细胞回收后都能检测到有L858R突变。
上面步骤11中的荧光扫描共确认到10个目标细胞(荧光响应为2-NBDG+或者EpCAM+且CD45-)。图9示出了其中部分截留了目标细胞的子滤膜在明场和不同荧光通道下的显微照片。从照片中可以看出子滤膜上与目标细胞共存的白细胞数为3-7个。图10是图9中阳性细胞获得后，进行分子检测后的结果。
实施例3
目的：证明本发明方法在胃癌中的可行性。
除血样取自胃癌病人，步骤1-12与实施例2中的相同。扩增放大后使用sanger检测基因突变。(例如：EGFR,KRAS,TP53等)，检测到有A750T突变。
实施例4
目的：证明本发明方法在乳腺癌中的可行性。
使用已知原位灶有PIK3CA突变的乳腺癌血样，步骤1-12与实施例2中的相同。扩增放大后使用Arms-PCR(qPCR)检测基因突变。(例如：PIK3CA等)，检测到有PIK3CA突变。
实施例5
目的：证明本发明方法在鳞癌中的可行性。
取已知原位灶有T790M突变的鳞癌血样，步骤1-12与实施例2中的相同，扩增放大后使用NGS检测。
结论：在各种癌种患者外周血液样本中找到2-NBDG+或者EpCAM+且CD45-的目标细胞，并在这些细胞中有检测到肿瘤的常见突变，证明了使用本发明方法分离和荧光检测找到的目标细胞为肿瘤细胞。
(五)脑脊液中肿瘤细胞的单细胞分离与检测
实施例6
目的是证明本发明方法在脑脊液中分离稀有肿瘤细胞的可行性。
1.将脑脊液样本2ml，300G离心5min。
2.去除上清，使样本重悬浮与1ml的HBSS中。
3.加入10ul CD45和10ulEpCAM，避光旋转染色1h。
4.染色结束后，将装有细胞悬液的离心管4℃，300g，离心5min，小心去除上清。
5.细胞沉淀中加入HBSS，1ml，小心吹打混匀，4℃，300g，离心5min，小心去除上清。
6.取1管葡萄糖类似物(2-NBDG，40ul)染色试剂加入960ul DMEM无糖培养基(4mM/ml，2-NBDG)混入适量的培养基后，加入离心管将细胞沉淀吹打重悬。避光旋转染色15min。
7.4℃，300g，离心五分钟，小心去除上清。
8.加入1ml HBSS轻轻吹打混匀，重悬细胞，4℃，300g，离心5min，小心去除上清。再重悬细胞与1ml的HBSS中(大约20万个细胞)。
9.过滤：过程与试验(一)中试验例9中相同。
10.对复合滤膜进行荧光扫描，确认目标细胞的位置。通过细针冲击目标细胞所在微孔底部的机械脆性的氮化硅膜，使整个氮化硅薄膜碎裂连同细胞掉入位于其正下方用于细胞回收的PCR单管、96孔板或者384孔板的孔中，其中PCR单管、96孔板或者384孔板中事先添加了适量体积的缓冲液。
在这个脑脊液样本中，共扫描到8个目的细胞。
注：目标细胞为2-NBDG+或者EpCAM+且CD45-。
11.然后将细胞裂解，并采用
Single Cell DNA Quick-Amp Kit(亿康基因)或者REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen)对单细胞全基因组进行放大。
12.放大后的产物，使用sanger检测基因突变，检测到肿瘤驱动基因19Del缺失突变。(也可以通过qRCR,ddPCR，NGS等检测方法检测)
扫描定位后回收的8个目标细胞中均检测到有肿瘤的驱动基因突变。
(六)胸水中肿瘤细胞的单细胞分离与检测
实施例7
取原位灶有19Del缺失突变的样本3ml，使用150目的纱布过滤，除去粘液等；按实施例2中的方法去除红细胞后，制成细胞悬液并计数(大约500万个细胞)。
按实施例2中的方法进行白细胞染色和肿瘤细胞染色。
按实施例2的方法进行过滤(不同之处在于复合滤膜中子滤膜中的微孔直径为7um，如图2的D中所示)，并过滤后在复合滤膜上荧光扫描到33个目标细胞。
目标细胞的回收及分子检测：1)对复合滤膜进行荧光扫描确认目标细胞的位置后，通过细针冲击目标细胞所在微孔底部的机械脆性的氮化硅膜，使整个氮化硅薄膜碎裂连同细胞掉入位于其正下方用于细胞回收的384孔板的孔中。2)然后将细胞裂解，并采用
Single Cell DNA Quick-Amp Kit(亿康基因)或者REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen)或者Ampli1TMWTA Kit(silicon biosystems)对单细胞全基因组进行放大。3)放大后的产物，使用sanger技术，Arms-PCR(qPCR),ddPCR,NGS测序检测基因突变(例如：EGFR,c-MET,Kras等)。
荧光扫描后回收的目标细胞中都能检测到19Dle缺失突变。
(七)4微孔复合滤膜和8微孔复合滤膜试验
本试验所用4微孔滤膜和8微孔复合滤膜与试验(一)中所用的单微孔滤膜相比，区别在于各子滤膜上分别具有4个和8个5um微孔，其微孔的布局如图2的B和C所示。
试验例101
(1)过滤前的预处理
1)裂解红细胞：将10ml人血300G离心，5min，移除上清液到1.5ml的管中，保存。
2)将剩余的样本转移到50ml离心管，加入血液体积10倍的裂红液。用移液枪吹打混匀，室温避光静置15min，之后4℃，200g，离心5min。小心去除上清。
3)细胞沉淀中加入5ml PBS，吹打混匀，4℃，300g，离心5min，小心去除上清。
4)若此时管内细胞沉淀中，仍有明显的红细胞存在，进行步骤(4)，若无，进行染色。
5)细胞沉淀中加入10ml裂红液，吹打混匀，室温避光静置10min，4℃，200g，离心5min，小心去除上清。
6)细胞沉淀中加入5ml PBS，吹打混匀，4℃，300g，离心5min，小心去除上清，重悬浮在1ml的HBSS中。
(2)染色
按试验例1的方法进行染色。
(3)过滤
1)将插入了4微孔复合滤膜的过滤套管放置在细胞过滤采集器中。
2)用1mlHBSS加入套管，打开泵，压力调至10mbar清洗2遍。
3)按照每1mlHBSS溶液加入100万细胞的比例(即100万/ml的细胞悬液白细胞浓度)，一共1500万细胞，加入复合滤膜，压力10mbar下过滤细胞。
4)细胞过滤完成后。用1mlPBS溶液清洗复合滤膜，拔出复合滤膜后用1mlHBSS溶液清洗复合滤膜底部。
5)将复合滤膜移至仪器上，观察。
(试验重复3次或以上，以了解过滤是否顺利，及子滤膜上截留细胞数目分布状况)
试验例102-133
与试验例101的过程相同，不同之处在于使用的芯片孔的个数、是否去除血红细胞、过滤时加样的细胞悬液的浓度、及过滤压力和复合滤膜上加入的白细胞总量。其中试验例131-133使用试验(一)中的单微孔滤膜。其中试验例107-112和119-132中外周血样本未经去除红细胞处理。
表3.具有4微孔和8微孔的复合滤膜试验
多微孔复合滤膜大大提高了过滤的总细胞数，同时与单孔比较，过滤时间大大缩短了。而且采用比试验(一)中更小的压力也能顺利快速地过滤。
更重要的是，采用一片子滤膜上有多微孔的滤膜后，可以直接过滤未经红细胞去除的血样样本。尤其是未经红细胞去除的血液样本在过滤时的加样细胞浓度(指有核细胞)达200万个/ml，也能短时间内非常顺利完成过滤，推测300万个/ml的浓度也能顺利过滤。这样的白细胞浓度已经接近正常外周血中白细胞浓度，达到或超过胸水、脑脊液中或癌症病人外周血中白细胞浓度。这意味着，对于多微孔(例如2-10微孔，尤其是3-10微孔及试验例中的4-8微孔)复合滤膜，可以直接过滤未经红细胞除去、低倍数稀释甚至未经稀释的外周血、胸水和脑脊液等体液样本，并以单细胞水平分离其中的稀有肿瘤细胞。如表中所列，试验例101-124中，在加样有核细胞总数500万的情况下，每次过滤截留的有核细胞总数不超过5万个/6400片子滤膜；在加样总有核细胞数1000万和2500万个的情况下，每次过滤截留的有核细胞数通常分别不超过8万个/6400片子滤膜和10万个/6400片子滤膜。显然，500万个以上水平的有核细胞过滤总量已经可以较容易地分离到其中夹杂的稀有的肿瘤细胞。而从截留有核细胞的复合滤膜的显微图像看，各个试验例均可以实现50％以上子滤膜截留的有核细胞数不超过10个。对于500-1000万有核细胞加样量的情况，通常70％以上，甚至90％以上子滤膜截留的有核细胞数不超过10个，甚至不超过5个。从而可以实现稀有细胞单细胞水平的分离。
Claims (13)
1.一种对人体体液样本中的稀有细胞进行单细胞水平的分离的方法，包含如下步骤：
A：将体液样本以细胞悬液的形式均匀添加至复合滤膜上，细胞悬液中的有核细胞包括作为多数细胞的白细胞和作为稀有细胞的从病变组织脱落的病变细胞，其中复合滤膜包括阵列的1000片以上独立的、可寻址的子滤膜，每片子滤膜中含有孔径在3微米至5微米的一个或多个微孔，每片子滤膜中截留的有核细胞能独立于其他子滤膜上的有核细胞被单独回收，
进行加压过滤使大部分白细胞通过复合滤膜，以使得子滤膜总数目的50%以上的子滤膜各自截留的白细胞的数目不超过10个，其中当每片子滤膜中含一个微孔时进行10-25mbar的加压过滤，当每片子滤膜中含有多个微孔时进行5-25mbar的加压过滤；
B：在步骤A的过滤前，或者在过滤后的复合滤膜上，对有核细胞用荧光标记的病变细胞标志物进行标记处理；及
C：对复合滤膜上截留的有核细胞进行荧光成像，从而确定截留了具有特定荧光特征的病变细胞的子滤膜在复合滤膜上的位置。
2.如权利要求1所述的分离的方法，其中：
步骤A中，所述体液样本为外周血、胸水或脑脊液，所述病变细胞是其中的肿瘤细胞，
步骤A中，添加至复合滤膜上的细胞悬液的白细胞总数目为子滤膜总数目的50倍以上，
步骤B中，还包括对有核细胞用荧光标记的白细胞标志物进行标记处理，且
进一步包括步骤D：将确定截留了肿瘤细胞和0-10个白细胞的子滤膜刺破，而将子滤膜与其截留的细胞一起进行回收。
3.如权利要求2所述的分离的方法，其中：
所述复合滤膜具有4000片以上的子滤膜，且每片子滤膜上有1个所述微孔；
步骤A中添加至复合滤膜上的细胞悬液基本上不含红细胞，且白细胞浓度为不超过200万个/ml；且
添加至一复合滤膜上的细胞悬液的白细胞总数目为50万个以上。
4.如权利要求3所述的分离的方法，其中：
所述微孔的直径为4-5微米；
所述细胞悬液中白细胞的浓度为不超过100万个/ml；
添加至一复合滤膜的所述细胞悬液的白细胞总量为100万个以上；且
过滤压力为15-25mbar，并使得每次过滤后，复合滤膜的70%以上片数的子滤膜各自截留的白细胞数不超过10个。
5.如权利要求2所述的分离的方法，其中：
所述复合滤膜的每片子滤膜上有2-10个所述微孔；
步骤A中添加至复合滤膜上的所述细胞悬液是外周血、胸水或脑脊液，任选地，是经稀释和/或经去除红细胞处理的；且
添加至一复合滤膜的所述白细胞总数目为50万个以上。
6.如权利要求5所述的分离的方法，其中：
每片子滤膜上有3-10个微孔，所述微孔的直径为4-5微米；并且/或者
步骤A中添加至复合滤膜上的所述细胞悬液是外周血、胸水或脑脊液，白细胞的浓度为不超过300万个/ml；并且/或者
添加至一复合滤膜的所述白细胞总数目为100万个以上；且过滤压力为10-20mbar，使得每次过滤后，复合滤膜的70%以上片数的子滤膜各自截留的有核细胞数不超过10个。
7.如权利要求2-6任一项所述的分离的方法，其中，所述荧光标记的病变细胞标志物是葡萄糖类似物。
8.权利要求1-6任一项所述的分离的方法，其中所述复合滤膜包括：
1000孔以上且10万孔以下的阵列小孔板；和
位于阵列小孔板各小孔的底部的各所述子滤膜，
小孔与子滤膜的直径为50-150微米。
9.如权利要求1-6任一项所述的分离的方法，其中，
基于所述体液样本，细胞悬液中作为稀有细胞的病变细胞相对于作为多数细胞的白细胞未经富集处理；且
白细胞总数目与复合滤膜中子滤膜总数目的倍数的上限选择为不导致过滤时复合滤膜的堵塞。
10.如权利要求4所述的分离的方法，其中：
所述微孔的直径为5微米；
所述细胞悬液中白细胞的浓度为不超过50万个/ml；
添加至一复合滤膜的所述细胞悬液的白细胞总量为400万个以上；且
每次过滤后，复合滤膜的90%以上片数的子滤膜各自截留的白细胞数不超过10个。
11.如权利要求6所述的分离的方法，其中：
每片子滤膜上有4-8个微孔，所述微孔的直径为5微米；并且/或者
步骤A中添加至复合滤膜上的所述细胞悬液是外周血、胸水或脑脊液，白细胞的浓度为不超过200万个/ml；并且/或者
添加至一复合滤膜的所述白细胞总数目为1000万个以上；且
每次过滤后，复合滤膜的90%以上片数的子滤膜各自截留的有核细胞数不超过10个。
12.如权利要求8所述的分离的方法，其中所述复合滤膜包括4000孔以上且4万孔以下的所述阵列小孔板，且所述小孔与子滤膜的直径为50-100微米。
13.如权利要求9所述的分离的方法，其中，白细胞总数目为复合滤膜中所述微孔的总数目的1000倍以下。
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