CN113252428B - 过滤装置和液体样本处理系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药与先进制造技术领域，提供了一种柔性微孔膜及其应用于过滤清除自体血中包括肿瘤细胞在内的有核细胞的过滤装置，包含所述过滤装置的检测系统、液体样本处理系统和自体血回输系统，所述过滤装置包括含有ParyleneC膜的过滤结构，所述ParyleneC膜含有均匀的孔，所述孔允许的通过直径范围为4‑8μm。

Description

过滤装置和液体样本处理系统

技术领域

本发明属于生物医疗领域，具体涉及一种过滤装置和包含该过滤装置的液体样本处理系统。

背景技术

外科手术中常常因为出血量大而需要输血，如果单纯使用异体血，常因“血荒”不能满足术中需求导致相当一部分手术无法如期进行，并且异体血输入容易因抑制机体免疫反应进而导致肿瘤患者预后不佳，因此术中自体血回输是一种减少甚至避免输注异体血的方法。但术中肿瘤破裂会引起回收血中肿瘤细胞增多，如果自体血清洗过程不能完全清除肿瘤细胞，就会增加肿瘤复发与转移的概率。加入白细胞滤器(受限于材料，孔径最小在20-40μm)仍不能保证充分去除肿瘤细胞，且白细胞滤器容易刺激激肽类物质释放导致患者低血压；同时由于肿瘤细胞含量很少，如何检测自体血中肿瘤细胞数量和活性仍是需要解决的问题。

现有检测自体血中肿瘤细胞方法包括，流式细胞仪、PCR技术、免疫磁珠与荧光原位杂交、离心后获取细胞块制作切片并染色等方法。最常用的是采用流式细胞仪方法，但其所能检测的细胞几何级数一般为10⁵以上，通常仅用来检测某特定细胞系的数量；用此方法检测数量非常稀少的自体血中肿瘤细胞则很难实现。

另外，还可以通过PCR与细胞块病理学方法等进行判定，但是这些方法都需要对自体血样本进行处理，处理过程包括离心、裂红、清洗、再离心等，然而离心方法所能回收的细胞数量非常有限，回收率不到10％，1ml中存在细胞数量为100个以内，当低于，低于100个/ml时，离心的方法基本无法找到目标细胞,而且会因为处理过程复杂，鉴定时间长，需要破坏细胞结构，难以保留生物活性，无法用于后续鉴定肿瘤细胞的活性。

因此，目前自体血回输面临以下问题：一是如何快速确定肿瘤患者自体血中是否含有肿瘤细胞，其难点是肿瘤患者自体血中所含肿瘤细胞数量少，现有技术存在着检测下限太高，灵敏度太低的问题，另外检测和过滤消耗时间过长，无法满足实际需求；二是提高肿瘤细胞过滤的比例，例如完全过滤肿瘤细胞或者。缺乏能够解决以上问题的方法和装置，大大限制了自体血回输技术的应用。

为解决或部分解决以上问题，本发明提出了一种过滤装置和包含该过滤装置的液体样本处理系统。

发明内容

本发明的第一个方面提供了一种过滤装置，其包括含有Parylene C(聚对二氯甲苯)膜的过滤结构，所述Parylene C膜含有均匀的孔，所述孔允许的通过直径范围为4-8μm。孔的结构可以是各种各样的，例如圆形，正多边等，优选地，选择孔为正六边形结构；膜可以有一层或者更多层。

Parylene C膜的孔的大小根据待过滤目的进行选择，例如过滤细菌可以使用小的孔径，过滤血液样本肿瘤细胞，选择孔允许的通过直径大于红细胞通过的直径，小于肿瘤细胞通过的直径，例如对于肾透明细胞癌，肿瘤细胞拦截的直径大小为8μm。

可选地，过滤结构包含多个过滤单元，每个单元包括支撑结构和Parylene C膜。

本发明的第二方面提供了一种快速检测系统，其包括光学显微镜和至少一个第一方面描述的过滤装置。

该快速检测系统可以用于检测样品中是否包含肿瘤细胞及有核细胞，样品包括但不限于患者外周血、经自体血回输装置、或自体血回输装置与白细胞滤器处理后的术中回收的自体血等。

快速检测系统还可以包括增压装置，增压装置结合过滤装置使用，在一个实施例中，增压装置的具体结构为类针筒结构，其一端与过滤装置连接，另一端为可移动的拉杆活塞；使用时将其一端与过滤装置连接，向类针筒结构的空腔中加入适量样品，然后将拉杆活塞放置到针筒中，通过推动拉杆活塞，给样品过滤增加额外的压力，可以加快过滤速度，提高检测效率。

快速检测系统还可以选择不同的增压方式，例如使用过滤装置连接容器，增压装置还包含压力传感器和自动增压装置，在使用状态下，通过增压装置给容器内部增加压力，从而加快样品通过过滤装置的速度，并使用压力传感器反馈增压结果，保证压力的均匀。

快速检测系统的使用方法如下：使一定量的样品通过过滤装置，然后将过滤装置放置在显微镜下进行观察，即可以快速的确认过滤装置上是否留置有肿瘤细胞，从而确定样品是否符合标准。

本发明的第三发明提供了一种液体样本处理系统，其包括液体样本储存结构、流速控制结构和至少一个的过滤装置。

可选地，本发明的液体样本处理系统还包括白细胞滤器。

可选地，本发明的液体样本处理系统中，所述过滤装置具有立体过滤结构，即所述过滤装置有超过一个面是Parylene C膜，能够增加过滤的总面积，加快过滤速度。

可选地，本发明的液体样本处理系统还包括负压装置，所述过滤装置位于所述负压装置之中，负压装置能够使得其中呈现压力降低的状态，增加过滤装置与负压装置之间的压力差，增加样品的通过速度。

可选地，本发明的液体样本处理系统中，为了提高过滤速度，还并行设置的两个或者更多个过滤装置。

可选地，本发明的液体样本处理系统中，可以串行设置至少两个过滤装置。

本发明的液体样本处理系统还包括光学显微镜和快检装置，通过所述光学显微镜能够快速确定所述快检装置上是否存在目标细胞。快检装置可以有一个或更多个，根据需要进行位置设置。

在一个实施例中，液体样本储存结构连接流速控制装置，流速控制装置连接过滤装置，过滤装置设置在负压装置中，过滤装置具有立体过滤结构，负压装置连接快检装置，快检装置连接样品出口。

本发明的第四方面，提供了含有Parylene C膜的过滤结构在制备用于自体血液肿瘤过滤装置中的用途。

本发明的第五方面，提供了一种自体血回输系统，其特征在于包含本发明的过滤装置和限速结构；限速结构可以使用输液领域的限速结构，可选地，该自体血回输系统可以包含现有滤器或者与现有滤器结合使用。

由上述可知本发明的过滤装置含有Parylene C膜，Parylene C膜上有均匀的孔，所述孔允许的通过直径范围为3-16μm，优选为4-8μm。

本发明的实施例的创新点包括：

1、过滤装置可以根据不同的目标，例如各种肿瘤细胞，微生物等使用不同的孔径，能够适应多种需求；

2、过滤装置能够过滤并回收稀有的目标细胞，大大提高了检测或者分离的精确度；

3、过滤装置能够与增压装置结合，加快检测速度，并通过显微镜观察，快速判断样本是否含有目标细胞；

4、液体样本处理系统中，过滤装置能够与负压装置结合，结合立体过滤面，加快过滤速度，大大压缩过滤处理时间；

5、孔径大小仅允许红细胞变形通过，可以排除红细胞之外的所有细胞成分，得到完全安全的经过滤样本；

6、过滤装置拦截的目标细胞具有较高的活性，可以将过滤装置和目标细胞一同放置在培养环境中培养增值，用于后续鉴定。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1不同孔径的Parylene C膜的过滤效果；

图2本发明的过滤装置的一个实例的示意图，

图3为图2所示的过滤装置的分解图，

图4为图2和图3所示过滤装置的Parylene C过滤膜的具体结构，图4A示出了支撑结构，图4B示出了6μm滤膜的超微结构，

图5为本发明的快速检测系统的一个实例的截面示意图，

图6为本发明的快速检测系统的另一个实例的截面示意图，

图7为通过本发明的方法过滤获得的肿瘤细胞与Parylene C过滤膜共同培养的显微镜观察结果，

图8为本发明的液体样本处理系统的一个实例的示意图，

图9为图8所示的液体样本处理系统的过滤装置的另一个截面示意图，

图10为本发明的自体血回输系统的一个实例的示意图；

附图标记，01为过滤装置，011为Parylene C膜，02为类针筒结构，03为活塞；01a为过滤装置，011a为Parylene C膜，02a为容器，021a为压力传感器，03a为增压装置，10为样本容器，20为负压装置，201为负压装置腔体，202为负压产生器，30为限速结构，40为第一过滤装置，50为第二过滤装置；501样品引入导管，502限速结构，503过滤装置，504经过滤样品引出导管。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

选取经培养的肺癌A549细胞(National Infrastructure of Cell LineResource,Beijing,China)，经细胞计数后，将不同数量的A549细胞作为靶细胞加入1ml健康人全血中，分别形成1个/ml全血、10个/ml全血、100个/ml全血、1000个/ml全血的样品，使用离心法和含有Parylene C膜的过滤结构两种方法进行比较，每种方法进行三次重复，取平均值实验结果如下。

肿瘤细胞浓度/ml血液	1	10	100	1000	过滤方法
						回收比率	0	0	15±4.17％	23±5.22％	离心法
回收比率	86±5.29％	83.2±6.23％	81.2±3.23％	79.6±4.67％	本发明的过滤装置

实验结果可知，含有Parylene C膜的过滤结构实验组中，回收率普遍高于80％，远远超越了离心的方法。

实施例2

使用不同孔径的Parylene C膜的过滤结构验证寻找最佳的允许通过直径。

Parylene C膜的过滤孔根据细胞大小进行的订制。孔径过大，肿瘤细胞容易漏出而不易捕捉；而孔径过小，阻碍血液通过，效率低下且容易堵孔造成研究失败。设定一系列与靶细胞大小相近的孔径，使用样品逐一通过不同孔径滤膜，记录靶细胞回收率和背景细胞拦截率，选择最优化比例的高靶细胞回收率和低背景细胞回收率的适宜孔径大小。例如，在细菌相关的研究中发现，对于直径在1微米左右，长度数十微米的细菌，需要选择孔径为4μm孔径，因为红细胞具有变性能力，可以通过改变自身形状穿过4μm孔径，而细菌则被拦截；对于肾细胞癌而言，使用不同孔径大小的过滤装置进行试验，试验结果参见图1，根据肾细胞癌(靶细胞)回收率和背景细胞清除率，确定最佳的孔径为8μm(图1)。

实施例3

参照图2，示出了本发明的过滤装置的一个实例的示意图，其中箭头示出了液体样本的流向；图3是图2的分解图，其示出了其中的过滤膜，过滤膜可以多于一层，图4示出了过滤膜的一个实例，其还包含支持结构，形成了若干过滤单元，每个单元包括支撑结构和过滤膜。

实施例4

参照图5，其示出了本发明的快速检测系统的一个实例的截面示意图，其中，显微镜未示出，01为过滤装置，011为Parylene C膜，02为类针筒结构，03为活塞，使用状态下，过滤装置01与类针筒结构02连接，液体样本位于类针筒结构02之内，02和03构成了增压装置，推动03运动，即可增加液体样本通过Parylene C膜011的速度；然后可以将过滤装置01与类针筒结构02分离，通过显微镜观察Parylene C膜011上是否具有目标细胞。

实施例5

参照图5，其示出了本发明的快速检测系统的另一个实例的截面示意图，其中，显微镜未示出，01a为过滤装置，011a为Parylene C膜，02a为容器，021a为压力传感器，03a为增压装置，例如气体增压泵，容器02a中的深色部分为液体样本，例如自体血液等，使用过程中，增压装置03a增加容器02a中的气体压力，并通过压力传感器021a监控气体压力的大小，防止过大或者过小，从而增加液体样本通过过滤装置01a的速度。

实施例6

使用实施例4所述的快速检测系统过滤4.5ml肿瘤患者全血，将所获得的肿瘤细胞，连同Parylene C过滤膜一起放入培养液中进行培养，培养9天后仍可以看到存活的癌细胞团(图7)，省略了常规方法中将肿瘤细胞从过滤结构分离的步骤，大大提高了癌细胞团的存活概率和比例。

实施例7

本发明提供了一种鉴定肿瘤患者自体血是否可用于回输的方法，选择含有8μm孔径的Parylene C膜的过滤装置，将肾癌患者的5ml自体血样品加入含有Parylene C膜的过滤结构，通过光学显微观察结果，判定自体血中含有大量肿瘤细胞，不能直接用于自体回输。如果没有观察到肿瘤细胞，表明自体血可以用于回输。这些步骤可以在10分钟内完成，大大缩短了通常的鉴定时间。

而带有肿瘤细胞的Parylene C膜可用于一系列的下游鉴定，尤其，由于其所拦截的肿瘤细胞未被破坏，仍有活性，因此可进行分型、药敏等研究；例如，肾细胞癌包括透明细胞型肾癌、颗粒细胞型肾癌、混合细胞型肾癌、未分化细胞型肾癌，根据具体肿瘤分型寻找更敏感的治疗方法。

对于目标肿瘤细胞种类的鉴定，例如肾透明癌细胞，一抗anticytokeratin7、anti-CD45和G250；含Alexa Fluor荧光染料的二抗孵育，免疫荧光染色后，癌细胞判定标准为CK+/CD45-/G250+；非肿瘤细胞的白细胞判定标准为CK-/CD45+/G250-。对于肾癌来源的骨转移肿瘤，一抗为anticytokeratin7、anti-CD45和CD133，癌细胞判定标准为CK+/CD45-/CD133+。

而对于肿瘤细胞活性的判别中，将含有Parylene C膜的过滤结构放置在培养基中，可以选择使用DAPI免疫荧光染色，判定细胞是否存活。

实施例8

参见图8，示出了本发明的液体样本处理系统的一个实例的示意图，其中，10为样本容器，20为负压装置，201为负压装置腔体，202为负压产生器，30为限速结构，40为第一过滤装置，50为第二过滤装置，显微镜和细胞培养装置未示出，使用过程中，将样品添加至样本容器，通过限速结构30控制样品的流速，负压产生器202为负压装置腔体201提供负压，第一过滤装置40位于负压装置腔体201之中，通过负压加快过滤，第一过滤装置的一个实例是长方体，可以具有多个过滤面，例如在底面和侧面均具有Parylene C膜，其另一个具体实例可以具有更大的面积比，参见图9，示出了另一个第一过滤装置的横截面；经过第一过滤装置40过滤的样品再次通过第二过滤装置50，并使用显微镜观察第二过滤装置50上是否仍有肿瘤细胞。液体样本处理系统还可以与现有白细胞滤器结合使用，例如在过滤装置之前添加白细胞滤器。

实施例9

参见图10，示出了本发明的自体血回输系统的一个实例，其包括501样品引入导管，502限速结构，503过滤装置，504经过滤样品引出导管。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种自体血回输系统，其特征在于，包括白细胞滤器、液体样本储存结构、流速控制装置、第一过滤装置、和第二过滤装置，所述液体样本储存结构连接所述流速控制装置，所述流速控制装置连接所述白细胞滤器，所述白细胞滤器连接所述第一过滤装置，所述第一过滤装置和所述第二过滤装置连接，所述过滤装置包括含有至少两层Parylene C膜的过滤结构，所述过滤结构包含多个过滤单元，每个单元包括支撑结构和Parylene C膜，所述Parylene C膜含有均匀的孔，所述孔允许的通过直径范围为4-6μm。

2.根据权利要求1所述的自体血回输系统，其特征在于，所述过滤单元具有立体过滤结构。

3.根据权利要求1所述的自体血回输系统，其特征在于，还包括负压装置，所述第一过滤装置设置在所述负压装置之中。

4.根据权利要求3所述的自体血回输系统，其特征在于，还包括光学显微镜和快检装置，所述负压装置连接所述快检装置，所述快检装置连接样品出口，通过所述光学显微镜能够快速确定所述快检装置上是否存在目标细胞。

5.根据权利要求1所述的自体血回输系统，其特征在于，包括两个并联设置的所述第一过滤装置和两个并联设置的所述第二过滤装置。