JP6619271B2 - 稀少細胞を分離又は検出する方法 - Google Patents

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Description

本開示は、血液検体中の稀少細胞を分離又は検出する方法、血中循環腫瘍細胞の分析方法、及びそれらに用いられるフィルターならびに稀少細胞捕捉装置に関する。
血液の細胞成分は、主に赤血球、白血球、血小板であるが、血液中には稀少ではあるがこれら以外の細胞が存在することがある。このような稀少細胞の一例として、血中循環腫瘍細胞／ＣＴＣ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ）が挙げられる。ＣＴＣは、原発腫瘍組織又は転移腫瘍組織から遊離し、血液に浸潤した細胞である。がんの転移はがん細胞が血管やリンパ管を通って体内の他の部位に運ばれて増殖することにより起こると考えられていることから、血液中のＣＴＣ数と、がんの転移の可能性及び予後に関係があることが報告されている。このため、がん（特に乳がんなどの転移性のがん）の診断、予後診断、また治療効果の予測又は判定の指標とするための研究で、血液中のＣＴＣ数の計数、ＣＴＣの核酸を測定することが知られている。このため、血液中のＣＴＣの分離・濃縮について様々な手法が提案・研究されている（特許文献１〜５、非特許文献１〜６など）。
特開２０１３−１７４２９号公報 特表２０１０−５３０２３４号公報 特許第５１４１９１９号 特開２０１３−４２６８９号公報 特開２０１１−１６３８３０号公報 Vona G, Sabile A, Louha M, Sitruk V, Romana S, Schutze K, Capron F, Franco D, Pazzagli M, Vekemans M, Lacour B, Brechot C, Paterlini-BrechotP. Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells:A New Method for the Immunomorphological and Molecular Characterization of Circulating Tumor Cells, Am J Pathol.2000 Jan;156(1):57-63. Coumans FA, van Dalum G, Beck M, Terstappen LW. （2013） Filter Characteristics Influencing Circulating Tumor Cell Enrichment from Whole Blood, April | Volume 8 | Issue 4 | e61770 Park S, Ang RR, Duffy SP, Bazov J, Chi KN, Black PC, Ma H （2014） Morphological differences between circulating tumor cells from prostate cancer patients and cultured prostate cancer cells, PLOSONE January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e85264 Xu W, Mezencev R, Kim B, Wang L, McDonald J, Sulchek T. (2012) October 2012 | Volume 7 | Issue 10 | e46609 Cell Stiffness Is a Biomarker of the Metastatic Potential of Ovarian Cancer Cells Zhang W, Kai K, Choi DS, Iwamoto T, Nguyen YH, Wong H, Landis MD, Ueno NT, Chang J, Qin L.（2012） Microfluidics separation reveals the stem-cell-like deformability of tumor-initiating cells. R. Negishi et al. Developmentoftheautomatedcirculatingtumorcellrecoverysystem with microcavityarray, Biosensors and Bioelectronics (2014)
１０ｍｌの血液中には、通常、赤血球が数百億個、白血球は数千万個が含まれているが、ＣＴＣ等の稀少細胞は０〜数個程度、多い場合に数千個程度である。また、これらの稀少細胞の中には、上述のがんの転移との関係性が考えられる細胞や免疫細胞等といった医学的に重要な細胞が含まれているため、血液中の稀少細胞の分析は、今後さらに盛んに行われることが予想され、より簡便でロスの少ない方法が求められている。ＣＴＣをそのまま解析するには技術的課題が多く、例えば、分離濃縮などの処理が必要となる。そのため、血液の中から、より効率的にＣＴＣを分離濃縮する技術の開発が期待されている。
ＣＴＣを分離濃縮する技術はいくつか方法があり、その中には抗体を使った分離濃縮の技術や、フィルターを利用した分離濃縮の技術が報告されている（非特許文献１）。非特許文献１には、φ８μｍの孔をもつフィルターを用いて、大多数の血球はフィルターを通過させ、ＣＴＣをフィルター上に残す分離濃縮技術が開示されている。非特許文献１に開示された方法のようにフィルターを利用した分離濃縮方法は、抗体を使った分離濃縮方法とは異なり、ＣＴＣの表面抗原に依存しない方法として期待されている。
ＣＴＣは、医療の発展に非常に有望な細胞であるが、前述のとおり血液１０ｍｌ中で数個しかいないといわれている。１０ｍｌ中にＣＴＣが２個しかいない場合、ポワソン分布によると、１ｍｌの血液の処理で、１００％漏れなく捕捉できたしても最高２０％の検出率しか期待できないが、血液を多く処理できた場合、８ｍｌでは１個以上のＣＴＣが存在する確率は約９０％近くになる。血液処理量を増えてフィルターの枚数が増えれば煩雑になるため、１度により多くの血液を適切に処理できるフィルターが望まれる。
特許文献２には、ＣＴＣは血球よりもサイズが大きく、血球よりも変形能が低いことが開示されている。一方、ＣＴＣの中には、φ８μｍの孔よりもサイズが小さいがん細胞（例えば、非特許文献１、２）や、変形能の高いがん細胞が存在し、これらの細胞は転移性の高い可能性があると報告されている（例えば、非特許文献４、５）。ＣＴＣを用いて高い精度でがんの診断及び解析等を行うには、これらの細胞についても分離することが求められる。
そこで、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液検体中に稀少細胞が含まれている場合に、小型の稀少細胞と変形能の高い稀少細胞の双方を効率よく簡便に捕捉できるフィルター及び血液検体の処理方法を提供する。
本開示は、一又は複数の実施形態において、短軸径が５μｍ以上８μｍ以下であり、長軸径が４０μｍ以上である孔を、孔密度が４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下で、かつ、長軸径ｗ（μｍ）と短軸径側の孔間の余白ｚ（μｍ）との比（ｗ／ｚ）が７．０以上１３０以下で含むフィルターを用いて、血液検体をフィルター処理して血液検体中の稀少細胞を分離又は検出することを含む、稀少細胞の分離又は検出方法に関する。
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、短軸径が５μｍ以上８μｍ以下であり、長軸径が４０μｍ以上である孔を、孔密度が４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下で、かつ長軸径ｗ（μｍ）と短軸径側の孔間の余白ｚ（μｍ）との比（ｗ／ｚ）が７．０以上１３０以下で含むフィルターに関する。
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、供給口と、排出口と、前記供給口と前記排出口を連通する流路と、分離部とを有し、前記分離部は、前記流路の一部に相当する位置に配置され、かつ上記のフィルターとフィルター保持部とを含む、検体中に含まれる稀少細胞を捕捉するための稀少細胞捕捉装置に関する。
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、血液検体中に稀少細胞が含まれている場合に、小型の稀少細胞と変形能の高い稀少細胞の双方効率よく簡便に捕捉できる。
図１Ａ及びＢはフィルターの写真を示し、図１Ａは本開示のフィルター（孔形状がスリット形状）の一例であり、図１Ｂは比較例のフィルター（孔形状が楕円）の一例である。 図２は、本開示の稀少細胞捕捉装置の一例を示す。 図３は、実施例１の結果を示すグラフであり、図３は短軸径における小型の細胞のＳＷ６２０の捕捉率の結果である。 図４は、実施例２の結果を示すグラフである。 図５は、実施例３の結果を示すグラフである。 図６は、実施例４の結果を示すグラフである。 図７Ａ及びＢは、実施例５の結果を示すグラフであり、図７Ａは系全体のろ過圧（ΔＰ１）が０．４ｋＰａの結果であり、図７Ｂは系全体のろ過圧（ΔＰ１）が１．３ｋＰａの結果である。 図８は、実施例８の結果を示すグラフである。 図９は、実施例９の結果を示すグラフである。 図１０は、実施例１０の結果を示すグラフである。 図１１は、実施例１１の結果を示すグラフである。 図１２は、実施例１２の結果を示すグラフである。
本発明者は、特許文献１〜４及び非特許文献１〜５の方法において、以下の問題を見出している。
非特許文献１に開示されているフィルターは、孔密度が不均一で、孔が連結し、細胞よりも大きな穴になっているものもあるため、細胞が抜けやすく高い捕捉率が得られないという問題がある。
特許文献１及び非特許文献２では、小型の細胞を捕捉する為に孔径を小さくすることで捕捉の向上を試みられているが、φ５μｍ以下になると目詰まりが起きやすくなり、高い圧力による細胞へのダメージ、血球を減らすための溶血操作、フィルターのろ過サイズが大きくするなど煩雑になるという問題がある。
特許文献２は、細胞の粘弾性の違いを利用して稀少細胞を分離することを開示する。しかし、特許文献２に記載された条件では、分離時の濾過膜の両側生じる差圧が２０ｋＰａ〜１９０ｋＰａと高く、分離時に稀少細胞にダメージを与えることが懸念されるとともに、変形能の高い稀少細胞の捕捉が困難になるという問題がある。
特許文献３は、テーパー部、狭窄部及び逆テーパー部を備えるスリットフィルターを用いてＣＴＣを捕捉することを開示する。
特許文献４及び非特許文献５には、スリット状の孔をもつフィルターでの稀少細胞の分離濃縮を記載している。しかしながら特許文献４及び非特許文献５に記載のフィルターでは、多くの血液を処理させつつ、変形能の大きい細胞と小型のがん細胞の捕捉の両立は困難であるという問題がある。特に特許文献４の実施例に記載されたフィルターでは、血液８〜１０ｍｌを処理する場合に、小型のがん細胞や変形能の大きいがん細胞の捕捉率は低下し、多くの血液量を処理できない課題がある。
本開示は、フィルターの孔径を小さくすると変形能の高い細胞の捕捉が難しく、また、変形能の高い細胞の捕捉率に合わせて孔径を大きくすると小型の細胞が抜けやすくなり、さらに、真円孔のフィルターでは小型と変形能の高いがん細胞の両立は困難である、との知見に基づく。本開示は、一又は複数の実施形態において、短軸径が５μｍ以上８μｍ以下であり、長軸径が４０μｍ以上である孔を、孔密度が４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下で、かつ、長軸径ｗ（μｍ）と短軸径側の孔間の余白ｚ（μｍ）との比（ｗ／ｚ）が７．０以上１３０以下で含むフィルターを用いて血液検体のフィルター処理を行うことにより、血液検体中に含まれうる小型の稀少細胞と変形能の高い稀少細胞との双方を効率よく簡便に捕捉することができる、との知見に基づく。本開示は、一又は複数の実施形態において、上記のフィルターを用いて血液検体のフィルター処理を行うことにより、フィルター処理時における濾過圧力条件（系全体における濾過圧力又はフィルター処理する際のフィルター上面と下面との圧力差）を低くすることができ、その結果、変形能の高い稀少細胞の捕捉率をさらに向上でき、好ましくは細胞捕捉時に細胞に与えるダメージを低減でき、生きたままの状態で稀少細胞の回収が可能になりうる、との知見に基づく。本開示は、一又は複数の実施形態において、上記のフィルターを用いて血液検体のフィルター処理を行うことにより、例えば、特にフィルターの孔１個当たりに対するフィルター処理容量が多い場合に、楕円孔や真円孔のフィルターと比較して、検体間差による稀少細胞の捕捉率のばらつきを低減でき、好ましくはヘマトクリットや白血球の濃度が高濃度の検体であっても高い捕捉率で稀少細胞を捕捉できる、との知見に基づく。本開示は、一又は複数の実施形態において、８〜１０ｍｌ程度の多量の血液を処理する場合に、稀少細胞の捕捉率が低下することがあるが、上記の本開示のフィルターを用い、かつ、フィルターの孔１個当たりに対するフィルター処理容量が、フィルターの孔面積当たりの処理容量に換算して０．１ｎｌ／μｍ2以上３ｎｌ／μｍ2以下となるように血液検体をフィルター処理することにより、変形能の高い稀少細胞の捕捉率をさらに向上できる、との知見に基づく。ここで「孔１個当たりに対するフィルター処理容量」は、１個の孔によって処理可能な血液検体の量をいう。
本開示の方法は、フィルターを用いた方法であるため、一又は複数の実施形態において、フィルターに捕捉された血球成分及びＣＴＣ等といった細胞を判別するために、例えば、細胞の染色及び洗浄等を容易に行うことができ、またフィルターに捕捉された細胞を容易に観察することができる。フィルター上で細胞の染色及び洗浄や、細胞の観察を行う場合、ろ過面積が大きくなると、試薬量及び洗浄量並びに観察範囲が増大して煩雑となることから、ろ過面積を抑えたフィルター又は容積を抑えたフィルターハウジングが望まれる。本開示の方法によれば、一又は複数の実施形態において、血液処理量に対しフィルターのろ過面積を抑えることができうるという効果を奏しうる。
［稀少細胞］
本開示において、血液中又は血液検体中に含まれうる「稀少細胞」とは、ヒト又はヒト以外の動物の血液中に含まれ得る細胞成分（赤血球、白血球、及び血小板）以外の細胞をいう。稀少細胞としては、一又は複数の実施形態において、腫瘍細胞及び／又はがん細胞が挙げられる。一般に血液中に循環する腫瘍細胞やがん細胞をＣＴＣという。血液中の稀少細胞数としては、検体にもよるが血液１０ｍｌ中に数個〜数十個、多くて数百〜千個含まれている場合がある。「稀少細胞」は、一又は複数の実施形態において、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、幹細胞及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である。
［小型の稀少細胞］
本開示において「小型の稀少細胞」とは、稀少細胞の中でも径の小さい細胞をいい、一又は複数の実施形態において、直径約１０μｍの真円孔では抜けてしまう大きさの稀少細胞が挙げられる。
［変形能の高い稀少細胞］
本開示において「変形能の高い稀少細胞」とは、細胞サイズが１０μｍ以上であって、かつ、直径が５μｍ以上６．５μｍ以下の円形の孔を通り抜けることが可能な細胞をいう。変形能の高い稀少細胞としては、一又は複数の実施形態において、孔あたり血液検体処理量が１４ｎｌ以上で、かつ孔あたり５ｎｌ／ｍｉｎ以上２０ｎｌ／ｍｉｎ以下で、直径が５μｍ以上６．５μｍ以下の真円孔を備えるフィルターに、全血を送液した場合に、同程度のサイズの稀少細胞と比較して孔を抜けやすい（孔を通過する細胞の割合が多い）稀少細胞があげられる。変形能の高いがん細胞としては、一又は複数の実施形態において、ＳＮＵ−１等があげられる。
［血液検体］
本開示において「血液検体」とは、本開示の処理方法に適用されうる、血液を構成する成分を含有する試料を意味し、血液、赤血球成分を含む血液由来物、血液又は血液由来物が混在する体液や尿、及び、これらから調製された試料等が挙げられる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、前記生体としては、ヒト又はヒト以外の動物（例えば、哺乳類）が挙げられる。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって赤血球成分を含むもの又はそれらの希釈／濃縮物が挙げられ、例えば、血漿が除かれた血球画分や、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理し、赤血球の成分を除去した試料又は溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球、特定の画分などを含む。これらの中でも、限定されない一又は複数の実施形態においては、簡便かつ迅速な処理の観点及び血液中の稀少細胞に対するダメージ抑制の観点から、前記血液を含む試料としては血液又は血球成分を含む血液由来の血球が好ましい。
本開示において、フィルターの孔１個あたりに通過させる血液検体の容量は、人体から採血された血液、すなわち、１μｌあたり、１０００〜２００００個の白血球細胞を含む血液を基準とする。よって、希釈した血液検体を使用する場合、当該希釈血液検体を白血球数に基づき希釈前の血液検体容量に換算できる。すなわち、例えば、１０倍希釈の血液検体を処理する場合、「Ｘ」μｌ／孔の容量の前記希釈血液検体を処理することは、「Ｘ／１０」μｌ／孔の容量の前記希釈前の血液検体を処理することに相当する。
［血液検体の処理方法］
本開示は、一態様において、血液検体をフィルター処理することを含む方法（以下、「本開示にかかる処理方法」ともいう）に関する。
＜フィルター＞
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理に使用するフィルターは、一又は複数の実施形態において、複数の貫通孔を有するスリット状のフィルターであって、各孔の短軸径が５μｍ以上８μｍ以下であり、かつ長軸径が４０μｍ以上である。フィルターに形成された複数の貫通孔は、一又は複数の実施形態において、その大きさが実質的に均一であることが好ましく、より好ましくは短軸径及び長軸径が実質的に同じである。短軸径が実質的に同じであるとしては、一又は複数の実施形態において、フィルターに含まれる貫通孔の短軸径が、下記の方法により得られた短軸径の平均値±１μｍ以内、±０．５μｍ以内、±０．４μｍ以内、±０．３μｍ以内又は±０．２μｍ以内に含まれていることが挙げられる。また、長軸径が実質的に同じであるとしては、一又は複数の実施形態において、前記同様に得られた長軸径の平均値±３μｍ以内、±２μｍ以内、±１μｍ以内、±０．５μｍ以内、±０．３μｍ以内又は±０．２μｍ以内に含まれていることが挙げられる。
短軸径は、小型の稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、一又は複数の実施形態において、５μｍ以上、５μｍより大きい、５．５μｍ以上、６μｍ以上又は６．５μｍ以上であり、同様の観点から、８μｍ以下、８μｍ未満、７．５μｍ以下、７μｍ以下又は６．５μｍ以下である。短軸径が５μｍ以上であるため、変形能の高い稀少細胞の捕捉率を向上でき、また目詰まりを低減でき、その結果、高い捕捉率で稀少細胞を回収できる。本開示において「短軸径」とは、孔に外接する長方形の短辺（図１Ａ参照）をいう。短軸径は、例えば、金属顕微鏡、レーザー顕微鏡などの市販の光学顕微鏡又は電子顕微鏡を用い、前記顕微鏡に付属するソフト、又は市販は画像解析ソフトにより公知の方法で測定し（５０個以上）、その平均を求めることにより得ることできる。具体的には、実施例に記載の方法により求めることができる。
長軸径は、変形能の高い稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、一又は複数の実施形態において、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、又は８０μｍ以上であり、フィルターのたわみやよれ等の発生を抑制し、稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、５０００μｍ以下、４０００μｍ以下、３０００μｍ以下、２０００μｍ以下、１０００μｍ以下、９７０μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１２０μｍ以下、１００μｍ以下、９０μｍ以下又は８０μｍ以下である。本開示において「長軸径」とは、孔に外接する長方形の長辺をいう（図１Ａ参照）。長軸径は、例えば、金属顕微鏡、レーザー顕微鏡などの市販の光学顕微鏡又は電子顕微鏡を用い、前記顕微鏡に付属するソフト、又は市販は画像解析ソフトにより公知の方法で測定し（５０個以上）、その平均を求めることにより得ることができる。具体的には、実施例に記載の方法により求めることができる。
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理に使用するフィルターは、上記の短軸径及び長軸径を有する孔を、４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下の孔密度で含む。孔密度（１ｍｍ2あたりの孔数）は、変形能の高い稀少細胞の捕捉率をさらに向上する観点、及び濾過面積抑制の観点から、４５個／ｍｍ2以上、６０個／ｍｍ2以上、７０個／ｍｍ2以上、９０個／ｍｍ2以上、２００個／ｍｍ2以上、３００個／ｍｍ2以上、４００個／ｍｍ2以上、５００個／ｍｍ2以上、６００個／ｍｍ2以上又は７００個／ｍｍ2以上であり、同様の観点から、１５００個／ｍｍ2以下、１０００個／ｍｍ2以下、９００個／ｍｍ2以下又は８００個／ｍｍ2以下である。孔密度は、公知の方法で測定できる。例えば市販の光学顕微鏡で対物レンズ１０倍〜１００倍を用いて撮影した画像を前記顕微鏡に付属するソフト、または市販は画像解析ソフトを用い画像から算出できる。
フィルターのろ過面に含まれる孔の総数は、ろ過面積を孔の中心間のピッチで除算することにより求めることができる。また、その他には、孔密度にろ過面積を乗算することにより求めることができる。具体的には、実施例に記載の方法により求めることができる。
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理に使用するフィルターにおいて、上記の短軸径及び長軸径を有する孔は、長軸径ｗ（μｍ）と短軸径側の孔間の余白ｚ（μｍ）との比（ｗ／ｚ）が７．０以上１３０以下となるように形成されている。ｗ／ｚは、小型の稀少細胞と変形能の高い稀少細胞との双方の捕捉率を向上する観点、及び検体間差のばらつきを低減できる観点から、７．３以上、７．３を超え、７．５以上、８．０以上、８．５以上、９．０以上又は１０以上であり、フィルターのたわみやよれ等の発生を抑制し、稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、１３０以下、１２９以下、１２０以下、１００以下、９０以下、８０以下又は７０以下である。
本開示において「短軸径側の孔間の余白（ｚ）」とは、短軸径方向に隣接する孔それぞれに外接する長方形同士を結ぶ直線の中で最も短いものをいう。短軸径側の孔間の余白（ｚ）は小型の稀少細胞と変形能の高い稀少細胞との双方の捕捉率を向上する観点、及び検体間差のばらつきを低減できる観点から、６０μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１０μｍ以下であり、フィルターのたわみやよれ等の発生を抑制し、稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、４μｍ以上、５μｍ以上、６μｍ以上、７μｍ以上、７．５μｍ以上、８μｍ以上、９μｍ以上、１０μｍ以上である。
短軸径側の孔間の余白（ｚ）は、例えば、市販の金属顕微鏡、レーザー顕微鏡などの光学顕微鏡や電子顕微鏡などに付属する、または市販の画像解析ソフトにより公知の方法で画像を解析、測定し（５０個以上）、その平均を求めることにより得ることできる。具体的には、実施例に記載の方法により求めることができる。
フィルター処理に使用するフィルターにおける孔１個の面積は、変形能の高い稀少細胞
の捕捉率をさらに向上する観点、及びろ過面積抑制の観点から、一又は複数の実施形態において、２００μｍ2以上７０００μｍ2以下である。孔１個の面積は、同様の観点から、２５０μｍ2以上、２６０μｍ2以上、３００μｍ2以上、３５０μｍ2以上、３９０μｍ2以上、４００μｍ2以上、５００μｍ2以上、又は５５０μｍ2以上であり、同様の観点から、６８００μｍ2以下、６５００μｍ2以下、６３００μｍ2以下又は６０００μｍ2以下である。
フィルターの開口率は、変形能の高い稀少細胞の捕捉率をさらに向上する観点及びろ過面積抑制の観点から、一又は複数の実施形態において、１０％以上６０％以下である。ここで「開口率」は、フィルター表面積に対する孔が形成された表面積の割合をいう。フィルターの開口率は同様の観点から、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３１％以上、３５％以上又は４０％以上であり、同様の観点から、５５％以下又は４５％以下である。開口率は、公知の方法で測定できる。例えば市販の光学顕微鏡で対物レンズ１０倍〜１００倍を用いて撮影した画像を、前記顕微鏡に付属するソフト、または市販は画像解析ソフトを用い画像から求めることができる。
フィルターの厚みは、小型の稀少細胞と変形能の高い稀少細胞との双方の捕捉率を向上する観点から、一又は複数の実施形態において、１μｍ以上１００μｍ以下である。フィルターの厚みは、フィルターの目詰まりを低減しつつ、稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、６０μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１５μｍ以下又は１０μｍ以下であり、同様の観点から２μｍ以上、３μｍ以上、４μｍ以上、５μｍ以上である。
フィルターの材質としては、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、主成分がポリカーボネート（ＰＣ）、パリレンメンブレンフィルター、ヤング率１ＧＰａ以上のプラスチック素材、ニッケル（Ｎｉ）、ＳＵＳ、金、銀、胴、アルミニウム、タングステン、クロム等の金属、又はガラス素材が挙げられる。またフィルター上での細胞を観察する際は、観察する際に使用する色素や蛍光染色などに応じてプラスチック、金属、ガラス素材を選択することが望ましく、これらの組合せから成るものであってもよい。
本開示にかかる処理方法に使用するフィルターは、フィルターを作製するための従来公知の方法、例えば、エッチング、電鋳加工、レーザー加工、スパッタリング加工等を用いて作製できる。フィルターは、孔が全面又は部分的にパターニングされたシートから、目的に応じて適切にサイズを切り出すことで作製してもよい。１枚のフィルターを鋳造で製造してもよい。
＜フィルター処理条件＞
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理は、一又は複数の実施形態において、上述したフィルターを流路内に組み込み、流路に血液検体を導入することによりＣＴＣ等の稀少細胞を捕捉することができる。
本開示にかかる処理方法は、変形能の高い稀少細胞の捕捉率をさらに向上させる観点から、フィルターの孔１個当たりに対するフィルター処理容量が、フィルターの孔の単位面積あたりの処理容量に換算して０．１ｎｌ／μｍ2以上３．０ｎｌ／μｍ2以下となるように血液検体をフィルター処理することを含む。フィルターの孔の単位面積あたりに対するフィルター処理容量は、濾過面積を抑える観点から、０．１ｎｌ／μｍ2以上又は０．２ｎｌ／μｍ2以上であり、変形能の高いがん細胞を捕捉する観点から、２．５ｎｌ／μｍ2以下、２ｎｌ／μｍ2以下、１．５ｎｌ／μｍ2以下又は１ｎｌ／μｍ2以下である。
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理の濾過圧力（ΔＰ1）は、変形能の高い稀少細胞の捕捉率をさらに向上させる観点、及びフィルター処理時に捕捉する細胞に与えるダメージを低減する観点から、０．１ｋＰａ以上２．６ｋＰａ以下である。濾過圧力は、同様の観点から、０．１ｋＰａ以上又は０．２ｋＰａ以上であり、同様の観点から、２．０ｋＰａ以下、１．５ｋＰａ以下、１．３ｋＰａ以下、１．０ｋＰａ又は０．５ｋＰａ以下である。本開示における「フィルター処理の濾過圧力」とは、系の入口から出口までの系全体の圧力差をいい、例えば、血液検体を配置したタンクから廃液タンクまでを含む流路を含めた系の圧力差をいう。このため流路構造によっては記載以上の圧力であってもよい。フィルター処理の濾過圧力（系の圧力差）は、公知の方法で市販の圧力計を用いて測定でき、又は流量と流路構造の関係から算出される。
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理する際のフィルター上面と下面との圧力差（ΔＰ2）は、変形能の高い稀少細胞の捕捉率をさらに向上させる観点、及びフィルター処理時に捕捉する細胞に与えるダメージを低減する観点から、一又は複数の実施形態において、１００Ｐａ以下である。ΔＰ2は、同様の観点から、一又は複数の実施形態において、０．１Ｐａ以上又は１Ｐａ以上であり、同様の観点から、７０Ｐａ以下、５０Ｐａ以下、３０Ｐａ以下、１５Ｐａ以下又は１０Ｐａ以下である。本開示における「フィルター上面と下面との圧力差（ΔＰ2）」とは、フィルターを境に上下で生じる圧力差をいう（図２参照）。圧力差は、周知の計算式から算出できる。スリットフィルターの圧力差の算出方法としては、Ｑ：全孔合算平均流量、ｈ：短軸径、ｗ：長軸径、Ｌ：孔の流路長、η：送液する液体の粘性、Ｎ0：孔数として、ΔＰ2＝Ｑ／Ｎ0ｘ１２ηＬ／〔（１−０．６３）（ｈ／ｗ）〕ｘ（１／ｈ3ｗ）で求められる。血液は非ニュートン性液体であり、また系が同じ圧力差であっても、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）の違いによる粘性によって平均流速が変わる。このため平均流速は一定の範囲をもつ。全血を使用する際の圧力差のΔＰ2設定においては、便宜上η＝４．５ｍＰａ・Ｓを用いて、計算上前記ΔＰ2に入るように送液や圧力の設定をすればよい。希釈等で血液検体のヘマトクリット値（Ｈｃｔ）が２０未満の場合、η＝１〜２ｍＰａ・Ｓの値を用いて計算上前記ΔＰ2に入るようにすれば設定すればよい。もしくは血漿やＨｃｔによる粘性影響が小さくなくなるまで希釈する場合（たとえば全血を４〜１０倍希釈する場合）は、その希釈液の粘性に合わせて計算し送液してもよい。シリンジポンプ等を用いて定流量送液をする場合は、前記ΔＰ２に入るように送液すればよい。このような送液条件は、当業者に周知の一定の圧で送液可能な機構や、一定流量で送液可能な機構を用いて実現できる。
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理におけるろ過面積は、特に限定されるものではない。ろ過面積は、一又は複数の実施形態において、孔数（孔面積）と血液の処理量によって設定できる。ろ過面積を抑制しフィルター処理後の染色操作・標識操作の試薬使用量を低減できる観点、観察操作の点及び稀少細胞を効率よく捕捉する観点から、一又は複数の実施形態において、５ｍｍ2以上２００ｍｍ2以下である。ろ過面積は、同様の観点から、１０ｍｍ2以上であり、同様の観点から、１５０ｍｍ2以下、１００ｍｍ2以下又は８０ｍｍ2以下である。また、血液処理量に対しフィルターのろ過面積を抑える観点から、ろ過面積は、１００ｍｍ2以下、８０ｍｍ2以下、５０ｍｍ2以下、４０ｍｍ2以下、３０ｍｍ2以下又は２５ｍｍ2以下である。
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理において流路への血液検体の送液は、特に規定はないが送液可能な駆動力があればよい。流路への血液検体の導入としては、一又は複数の実施形態において、流路の入り口方向からの加圧を用いる方法、流路の出口方向からの減圧を用いる方法、シリンジポンプやぺリスタルティックポンプを使用する方法等が例示できる。流路への血液検体の導入のため、例えば、フィルターの孔（１個）あたり、１ｍｍ／ｍｉｎ以上６００ｍｍ／ｍｉｎ以下の平均流速で血液検体を送液することで、従来例と比較して適切に稀少細胞を捕捉することが可能である。血液検体の送液条件は、一又は複数の実施形態において、２ｍｍ／ｍｉｎ以上３００ｍｍ／ｍｉｎ以下の流速、３ｍｍ／ｍｉｎ以上１００ｍｍ／ｍｉｎ以下の流速、４ｍｍ／ｍｉｎ以上８０ｍｍ／ｍｉｎ以下の流速又は４ｍｍ／ｍｉｎ以上４０ｍｍ／ｍｉｎ以下の流速である。また平均流量から換算して送液条件を設定してもよい。算出方法としては、単位時間あたりのろ過廃液出口の流量（全孔合算平均流量）又は単位量あたりの濾過時間を測定して平均流量を求め、これを孔数で割ることで、各孔あたりの平均流量が得られる。またその平均流量を孔面積で割ることで平均流速を求めることができる。そして前述した孔あたりの平均流速、又は平均流量の範囲に収まるように送液すればよい。一又は複数の実施形態において、ろ過廃液出口の流量（全孔合算平均流量）を全孔面積で割って算出してもよい。
［血液検体中の稀少細胞の分離又は検出方法］
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理を行うことにより、血液検体をろ過した後のフィルター上に、稀少細胞（もし存在すれば）が残ることとなり、稀少細胞が分離又は検出できる。したがって、本開示は、その他の態様において、本開示にかかる処理方法で血液検体を処理して稀少細胞を分離又は検出することを含む、血液検体中の稀少細胞を分離又は検出する方法に関する。
［血液中の稀少細胞に対する標識処理］
本開示にかかる処理方法において、血液中の稀少細胞に対する標識処理を行ってもよい。標識処理は、一又は複数の実施形態において、フィルター分離前や分離に並行して行ってもよいし、分離後に行ってもよい。稀少細胞の標識は、上述した本開示にかかる分離又は検出方法、及び、後述するＣＴＣ数測定方法に有用であり、また、分離後の稀少細胞の分析に有用となりうる。したがって、本開示にかかる処理方法は、一又は複数の実施形態において、標識処理を含む。また、稀少細胞の標識は、後述するＣＴＣ数測定方法に有用であり、また、分離後の稀少細胞の分析に有用となりうる。したがって、本開示にかかる分離又は検出方法は、一又は複数の実施形態において、標識処理を含む。
標識処理は、一又は複数の実施形態において、公知の標識試薬を稀少細胞に接触することにより行うことができ、典型的には、前記標識試薬を血液検体と混合することにより行うことができる。標識としては、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、放射性標識、蛍光色素標識、色素染色又は標識、磁気的標識、電荷的標識、及びこれらの組み合わせが挙げられ、それぞれに適した標識試薬により行うことができる。
すなわち、標識処理は、稀少細胞について、放射性物質を利用した検出方法、発光現象を利用した検出方法、色素を用いた検出方法、磁性を利用した検出方法、電気的検出方法、光学的検出方法、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される検出方法に使用可能な標識方法を用いて行うことができる。
本開示における処理方法において、稀少細胞の分離又は検出は、また、前記フィルターの変化を電気的、重量的、光学的に検出することでも達成できる。
［血液検体中の稀少細胞の分析方法］
本開示は、その他の態様において、本開示にかかる分離又は検出方法で稀少細胞を分離又は検出した後、該細胞の動態の観察若しくは活性測定を含む方法で分析すること又は該細胞の遺伝子分析することを含む、血液検体中の稀少細胞の分析方法に関しうる。すなわち、本開示によれば、細胞を生きたまま捕捉できるため、本開示にかかる分離又は検出方法で稀少細胞を分離又は検出した後、該細胞の動態の観察若しくは活性測定を含む方法で分析すること又は該細胞の遺伝子分析することが可能である。また分離後に回収し、培養も可能である。これら以外に目的の細胞に対し、フィルター上で遺伝子を分析してもよいし、又はフィルターから目的の細胞を回収して遺伝子を分析してもよい。たとえば染色体の解析や一塩基変異の解析などがあり、公知の技術を利用して遺伝子を分析できる。
［ＣＴＣ数測定方法］
血液中のＣＴＣ数と、がんの転移や予後に関係することが報告されており、がんの診断、予後診断、及び治療効果の予測又は判定の指標とするために研究が進められ、血中ＣＴＣ数を測定することが知られている。本開示にかかる処理方法及び／又は本開示にかかる分離又は検出方法によれば、稀少細胞であるＣＴＣへのダメージを抑制して分離することができる。したがって、本開示はその他の態様において、血液検体を本開示にかかる処理方法で処理して稀少細胞を分離又は検出すること、及び／又は、本開示にかかる分離又は検出方法により前記血液検体からＣＴＣを分離することを含む、前記血液検体中のＣＴＣ数の測定方法に関する。なお、ＣＴＣ数の計測又はＣＴＣの核酸の測定は、例えば、がん細胞の形態学的観点からの測定や、適切な標識処理をした後にフローサイトメトリーにより分離と同時に行ってもよし、分離した細胞を顕微鏡下で観察して測定してもよい。
［フィルター］
本開示は、さらにその他の態様において、本開示にかかる処理方法、本開示にかかる分離又は検出方法、及び／又は本開示にかかるＣＴＣ数測定方法に用いるフィルターであって、短軸径が５μｍ以上８μｍ以下であり、長軸径が４０μｍ以上である孔を、孔密度が４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下で、かつ長軸径ｗ（μｍ）と短軸径側の孔間の余白ｚ（μｍ）との比（ｗ／ｚ）が７．０以上１３０以下で含むフィルターに関する。本開示にかかるフィルターの孔の形状等は、上述した本開示にかかる処理方法に用いられるフィルターと同様である。
［稀少細胞捕捉装置］
本開示は、さらにその他の態様において、検体中に含まれる稀少細胞を捕捉するための稀少細胞捕捉装置に関する。本開示にかかる稀少細胞捕捉装置は、一又は複数の実施形態において、供給口と、排出口と、前記供給口と前記排出口を連通する流路と、分離部とを有し、前記分離部は、前記流路の一部に相当する位置に配置され、かつ本開示のフィルターとフィルター保持部を含む。本開示にかかる稀少細胞捕捉装置によれば、本開示にかかるフィルターを用いて本開示にかかる血液検体の処理方法を行うことができる。
本開示にかかる稀少細胞捕捉装置の一例を図２に示す。図２に示す稀少細胞捕捉装置は、検体や洗浄液、染色液等をフィルターに供給するための供給口１、排出口２、供給口１と排出口２とを連通する流路３、及び流路３の一部に相当する位置に配置された分離部を有する。分離部は、フィルター４とフィルター４を保持するフィルターホルダー５を含む。フィルターホルダー５は、フィルター４を設置可能な支持部（ベース）６、フィルター４を固定するＯリング７及びカバー８により構成される。支持部（ベース）６にフィルター４を設置し、フィルター４の上面にＯリング７及びカバー８を載せ、フィルター４を固定することにより、孔を有するフィルターを備える分離部（フィルターデバイス）が形成される。供給口１と分離部及び分離部と排出口２をつなぐ流路３は、分離部の両端にサフィードチューブ（テルモ社製）を接続することにより形成される。供給口１と分離部とをつなぐ流路３には、分離部の上部に接続部（図示せず）及び液の切り替えが可能な三方活栓（図示せず）を配置してもよい。また、供給口１と分離部とを接続する流路３には（一定の圧で送液可能な機構又は一定流量で送液可能な機構としての）加圧手段９を配置してろ過にかかる圧力が一定になるようにしてもよいし、又はシリンジポンプで引いて濾過にかかる圧力が一定以上にならように送液してもよい。
本開示にかかる稀少細胞の分離キット又は分離デバイスは、本開示のフィルターと、前記フィルターを保持する保持部とを含み、流路に対して着脱可能に構成されている。一又は複数の実施形態において、本開示にかかる稀少細胞の分離キット又は分離デバイスは、稀少細胞捕捉装置に用いられる稀少細胞の分離キット又は分離デバイスであって、本開示のフィルターと、前記フィルターを保持する保持部と、接続部とを備え、前記接続部は、前記保持部と前記稀少細胞捕捉装置の流路とを接続可能であり、前記稀少細胞捕捉装置からの血液検体を前記保持部及び前記フィルターに流通可能であり、前記分離キット又は分離デバイスは、前記稀少細胞捕捉装置に対して着脱可能に構成されている。よって、本開示にかかる稀少細胞捕捉装置の一又は複数の実施形態において、流路が、本開示にかかる稀少細胞の分離キット又は分離デバイスを着脱可能な接続部を備えていてもよい。図２の稀少細胞捕捉装置を例にとり説明すると、本態様の稀少細胞捕捉装置は、流路３における、加圧手段９と分離部との間、及び分離部と排出口２との間のそれぞれに接続部を備え、接続部によって分離部が流路３から着脱可能である。なお、このように流路３に対して着脱可能に形成された分離部は、本開示にかかる稀少細胞の分離キット又は分離デバイスの一例である。ただし、本開示の稀少細胞の分離キット又は分離デバイスは、このような構成に限定されない。
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕 血液検体をフィルターを用いてフィルター処理して血液検体中の稀少細胞を分離又は検出することを含み、
前記フィルターは、短軸径が５μｍ以上８μｍ以下であり、長軸径が４０μｍ以上である孔を、孔密度が４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下で、かつ、長軸径ｗ（μｍ）と短軸径側の孔間の余白ｚ（μｍ）との比（ｗ／ｚ）が７．０以上１３０以下で含む、稀少細胞の分離又は検出方法。
〔２〕 フィルターの孔１個当たりに対するフィルター処理容量が、フィルターの孔面積当たりの処理容量に換算して０．１ｎｌ／μｍ2以上３ｎｌ／μｍ2以下となるように血液検体をフィルター処理する、〔１〕記載の方法。
〔３〕 前記フィルターの開口率が、１０％以上６０％以下である、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 前記フィルター処理における濾過圧力は、０．１ｋＰａ以上２．６ｋＰａ以下である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 前記フィルター処理する際のフィルター上面と下面との圧力差が、１００Ｐａ以下である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕 前記血液検体を、前記フィルターの孔あたり１ｍｍ／ｍｉｎ以上６００ｍｍ／ｍｉｎ以下の平均流速で前記フィルターに送液することを含む、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕 前記稀少細胞が、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕 〔１〕から〔７〕いずれかに記載の方法で稀少細胞を分離又は検出した後、該細胞の動態の観察若しくは活性測定を含む方法で分析すること又は該細胞の遺伝子分析することを含む、血液検体中の稀少細胞の分析方法。
〔９〕 〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の方法に使用する、短軸径が５μｍ以上８μｍ以下であり、長軸径が４０μｍ以上である孔を、孔密度が４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下で、かつ長軸径ｗ（μｍ）と短軸径側の孔間の余白ｚ（μｍ）との比（ｗ／ｚ）が７．０以上１３０以下で含むフィルター。
〔１０〕 供給口と、排出口と、前記供給口と前記排出口を連通する流路と、分離部とを有し、前記分離部は、前記流路の一部に相当する位置に配置され、かつ〔９〕記載のフィルターと前記フィルターの保持部とを含む、検体中に含まれる稀少細胞を捕捉するための稀少細胞捕捉装置。
〔１１〕 〔９〕記載のフィルターと、前記フィルターを保持する保持部と、を含み、流路に対して着脱可能な、稀少細胞の分離キット又は分離デバイス。
〔１２〕 稀少細胞捕捉装置に用いられる稀少細胞の分離キット又は分離デバイスであって、〔９〕のフィルターと、前記フィルターを保持する保持部と、接続部とを備え、前記接続部は、前記保持部と前記稀少細胞捕捉装置の流路とを接続可能であり、前記稀少細胞捕捉装置からの血液検体を前記保持部及び前記フィルターに流通可能であり、前記分離キット又は分離デバイスは、前記稀少細胞捕捉装置に対して着脱可能に構成されている、分離キット又は分離デバイス。
〔１３〕 前記稀少細胞捕捉装置は、〔１０〕記載の稀少細胞捕捉装置である、〔１２〕記載の分離又は分離デバイス。
以下に、実施例及び比較例を用いて本開示をさらに説明するが、これらは例示的なものであって、本開示は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
（フィルターの作製）
表１に示す各種フィルターを作製した。＃３〜１４のフィルターの孔の形状は図１Ａに示すスリット状であり、＃２のフィルターの孔の形状は図１Ｂに示す形状である。表１におけるｗは孔の長軸径（μｍ）であり、ｚは短軸径側の孔間の余白（μｍ）である（図１Ａ参照）。
フィルターの長軸径（ｗ）及び短軸径は、市販のレーザー顕微鏡ＶＫ−８５１０（キーエンス）で対物レンズ１０倍〜１００倍を用いて、フィルター中央部及び端（上、下、左、右）の孔を顕微鏡用のカメラで撮影し、その撮影した画像を顕微鏡付属するソフト又は市販の画像解析ソフトを用いて各孔に外接する長方形の長辺及び短辺を計測し（孔５０個以上）、その平均を求めることにより得た。またレーザー顕微鏡以外に金属顕微鏡や倒立顕微鏡、マイクロスコープにおいても同様に測定でき、１μｍ以下も測定可能な倍率で撮影することが望ましい。
孔間の余白（ｚ）は、市販の光学顕微鏡で対物レンズ１０倍〜１００倍を用いてフィルターを撮影し、その撮影した画像から顕微鏡に付属するソフトを用いて、短軸径方向に隣接する孔の外接する長方形同士を結ぶ直線の中で最も短い長さを計測した（５０箇所）。又は、孔間の余白は実質均一であるため、長軸径の長さの中間点の短軸径の長さを計測し（５０箇所）、その平均を求めることにより得た。
総孔数は、市販の光学顕微鏡で対物レンズ１０倍〜１００倍を用いてフィルターを撮影し、フィルターに含まれる孔の数を直接カウントした。もしくは、単位面積あたりの孔密度にろ過面積を乗算して総孔数を求めた。
孔密度は、各孔の中心間のピッチの長さを計測し、その平均値から１ｍｍ2あたりの孔
数を計算により求めた。
（小型のがん細胞試料の調製）
［ＳＷ６２０試料］
常法に従い、接着細胞であるヒト結腸癌（細胞株名 ＳＷ６２０）をシャーレで培養した後、培地を除去し、ついでＰＢＳ（−）を添加し洗浄して培地成分を除去後、トリプシン（インビトロジェン社）処理（３７℃、３分）を行った。これに血清入り培地を加えて１５ｍｌ遠沈管に回収した。これを遠心機（ＣＲ２０Ｆ：日立）で遠心し、上清を除去した。再度血清入り培地に懸濁して回収した。調製したがん細胞懸濁液を培養液から回収した後、遠心機（ＣＲ２０Ｆ／日立製）で１５００ｒｐｍ、室温（２４℃）、３分間遠心した。上清を除去し、ＰＢＳ（−）を添加して細胞を懸濁する。このＰＢＳ（−）に懸濁した細胞を、染色試薬ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（インビトロジェン）を用いて蛍光染色した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒは、１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させた後、反応時の濃度が最終濃度０．５〜０．２５μＭになるように細胞懸濁液に添加した。そして反応後、細胞懸濁液を遠心して上清を除去し、再度ＰＢＳに懸濁した。この操作を繰り返し行うことにより未反応液の除去と細胞の洗浄とを行った。その後細胞の懸濁液の濃度を任意の濃度（１０3個／ｍＬ〜５ｘ１０4個／ｍＬ程度）になるように培地またはＰＢＳ（−）を用いて懸濁した。
ついで、採血管（ＥＤＴＡ−２Ｋ）に採血した血液（白血球含有数３０００〜１００００個／μｌ）の一部を濾過デバイスと連通する血液濾過用検体容器にいれた後、染色したがん細胞懸濁液１０μＬを同血液濾過用検体容器内の血液に添加し、残りの血液を加えて混合して血液検体を調製した。ＳＷ６２０は径が１３μｍ程度であるため、小さい細胞のモデルとした。
（変形能の高いがん細胞試料の調製）
［ＳＮＵ−１試料］
浮遊系であるヒト胃癌細胞株（細胞株名 ＳＮＵ−１）は、トリプシン処理を行うことなく、１５ｍｌ遠沈管に回収した。回収したがん細胞懸濁液を用いた以外は、ＳＷ６２０試料の調製と同様に、蛍光染色及び血液への添加を行い、血液検体を調製した。ＳＮＵ−１の細胞径は１６．８μｍであるが、ＳＷ６２０に比べ、直径６．５μｍの孔に対して容易に抜けやすかった。
［Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ試料］
ヒト大腸癌（細胞株名 Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ）は、浮遊細胞と一部接着している細胞があるため、浮遊している細胞は、１５ｍｌ遠沈管に回収し、接着している細胞は、ＳＷ６２０と同様にトリプシン処理後、同遠沈管に回収した。回収したがん細胞懸濁液を用いた以外は、ＳＷ６２０試料の調製と同様に、蛍光染色及び血液への添加を行い、血液検体を調製した。Ｃｏｌｏ３２０ＤＭの細胞径は１４μｍであるが、ＳＷ６２０に比べ、直径６．５μｍの孔に対して容易に抜けやすかった。
以下の実施例及び比較例では、ＳＮＵ−１及びＣｏｌｏ３２０ＤＭを変形して抜けやすい細胞（変形能の高い細胞）のモデルとして使用した。
（比較例１）
フィルター＃１（長軸径：６．５μｍ、短軸径：６．５μｍ、ｗ／ｚ：０．９）を図２に示す稀少細胞捕捉装置に配置し、ＳＷ６２０試料、ＳＮＵ−１試料及びＣｏｌｏ３２０ＤＭ試料を用い、下記濾過条件で濾過を行い、細胞の分離回収を行った。濾過終了後、ＰＢＳ（−）等のｂｕｆｆｅｒをΔＰ１＝０．４ｋＰａで送液してフィルターの洗浄を行い、分離部の上で接続されている接続部をゆっくり取りはずし、フィルター上部にガラススライドをゆっくり乗せて、観察面を作製した。これを蛍光顕微鏡に設置し、フィルター上に残っている蛍光染色されたがん細胞を計数した。また別途、血液に添加した量と同量の前記がん細胞懸濁液をマイクロプレートウェルに添加し、蛍光顕微鏡でがん細胞数をカウントした。マイクロプレートウェル内の細胞数を分母とし、フィルター上に残ったものを分子として計算し捕捉率を算出した。その結果を下記表２に示す。
＜濾過条件＞
トータル血液検体処理量：１ｍｌ、４ｍｌ、８ｍｌ
系全体のろ過圧（ΔＰ１） 検体ろ過時：１．３ｋＰａ
特許文献５（特開２０１１−１６３８３０号公報）には、１０μｍ径のサイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた場合、ＳＷ６２０の平均回収率が３８％であることが開示されている。これに対し、直径が６．５μｍの円形の孔を備えるフィルター＃１によれば、９０％を超える高い捕捉率でＳＷ６２０を捕捉できることがわかる。一方、ＳＷ６２０よりも細胞径が大きいが変形能の高いがん細胞であるＳＮＵ−１及びＣｏｌｏ３２０ＤＭは、ＳＷ６２０よりも捕捉率が低かった。そして血液量処理量が増えると特に変形能の高い細胞の捕捉率がさらに低下することがわかる。直径が６．５μｍの円形の孔を備えるフィルターでは変形能の高いがん細胞を十分に捕捉できないことが分かった。
フィルター♯１で両方の高捕捉率を維持するためにはさらに血液処理量をさらに減らすか、又はろ過面積を大きくすることが考えられる。その他にも孔密度を大きくする方法もあるが、フィルターの耐久性に影響を与えるため、望ましくない。
（実施例１）
小型のがん細胞の捕捉性能を確認するため、開口率と長軸径（ｗ）が同じで短軸径が異なるフィルター＃３、４又は５を図２に示す稀少細胞捕捉装置に配置し、ＳＷ６２０試料を用いて下記の濾過条件１又は２で濾過を行い細胞の分離回収を行い、ＳＷ６２０の捕捉率を求めた。分離回収及び捕捉率の算出は比較例１と同様にした。その結果を図３に示す。なお、フィルター上下の圧力差（ΔＰ２）は、ΔＰ2＝Ｑ／Ｎ0ｘ１２ηＬ／〔（１−０．６３）（ｈ／ｗ）〕ｘ（１／ｈ3ｗ）により、前述のとおりη＝４．５ｍＰａとして計算した。
＜フィルター＞
フィルター＃３（短軸径：５．０μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：９．８）
フィルター＃４（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：７．３）
フィルター＃５（短軸径：８．０μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：６．１）
＜濾過条件＞
図３は孔の短軸径と小型の細胞（ＳＷ６２０）の捕捉率との関係を示すグラフである。図３に示すように、径が比較的小さい細胞であるＳＷ６２０は、処理量が２ｍｌの場合、いずれのフィルターでも８０％を超える捕捉率で回収でき、中でも短軸径が６．５μｍのフィルター＃４の捕捉率が最も高かった。一方で、処理量が８ｍｌの場合、短軸径が６．５μｍのフィルター＃４の捕捉率が最も高かったが、短軸径が８μｍであるフィルター＃５において捕捉率が８０％を下ることが確認された。
変形しやすい細胞であるＳＮＵ−１を用いて同様の測定を行ったところ、短軸径５μｍのフィルター＃３の捕捉率が最も低かった（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
（実施例２）
短軸径及び開口率が同じであるフィルター＃６、４、７又は８（開口率：３１％）を使用し、下記の濾過条件とした以外は、実施例１と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。試料は、ＳＮＵ−１試料を使用した。その結果を図４に示す。
＜フィルター＞
フィルター＃６（短軸径：６．５μｍ、長軸径：４０μｍ、ｗ／ｚ：５．３）
フィルター＃４（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：７．３）
フィルター＃７（短軸径：６．５μｍ、長軸径：２００μｍ、ｗ／ｚ：１５．４）
フィルター＃８（短軸径：６．５μｍ、長軸径：５００μｍ、ｗ／ｚ：３５．７）
＜濾過条件＞
図４はｗ／ｚと捕捉率の関係を示すグラフである。図４に示す通り、ｗ／ｚが７．０以上であるフィルターはいずれも８０％を超える高い捕捉率でＳＮＵ−１を回収できた。また、同じ開口率でも、ｗ／ｚの値が大きくなるほど高い捕捉率で回収できることが確認できた。また、フィルター処理時における系全体のろ過圧（ΔＰ１）は０．４ｋＰａ（フィルター上下の圧力差（ΔＰ２）の計算値：２Ｐａ〜３Ｐａ）と低い圧力で回収できたことから、回収した稀少細胞へのダメージも低減できると考えられる。
（実施例３）
短軸径とｚ（短軸径側の孔間の余白）が同じであるフィルター＃９又は１０（短軸径：６．５μｍ、ｚ：７．５μｍ）を使用し、濾過条件を下記３又は４とした以外は、実施例２と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。その結果を図５に示す。なお、参考例として、孔の形状が円であるフィルター＃１（短軸径側の孔間の余白（ｚ）＝７．５μｍ）及び孔の形状が楕円形であるフィルター＃２（短軸径側の孔間の余白（ｚ）＝７．５μｍ）を用い、下記の参考濾過条件１又は２とした以外は同様に行った。
＜フィルター＞
フィルター＃１（短軸径：６．５μｍ、長軸径：６．５μｍ、ｗ／ｚ：０．９）
フィルター＃２（短軸径：６．５μｍ、長軸径：９．８μｍ、ｗ／ｚ：１．３）
フィルター＃９（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７）
フィルター＃１０（短軸径：６．５μｍ、長軸径：９６８μｍ、ｗ／ｚ：１２９．１）
＜濾過条件＞
図５はｗ／ｚと捕捉率の関係を示すグラフである。図５に示す通り、フィルター＃９及び１０（ｗ／ｚが７以上）はいずれも９０％を超える高い捕捉率でＳＮＵ−１を回収できた。特に、フィルター＃９（長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７）は、フィルター＃１０（長軸径：９６８μｍ、ｗ／ｚ：１２９．１）と比較してたわみやよれの発生が低減され、１００％近い捕捉率で回収できた。
（実施例４）
短軸径及び長軸径（ｗ）が同じであるフィルター＃４又は９を使用し、濾過条件を下記５〜８のいずれかとした以外は、実施例２と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。その結果を図６に示す。
＜フィルター＞
フィルター＃４（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：７．３）
フィルター＃９（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７）
＜濾過条件＞
図６はｗ／ｚと捕捉率の関係を示すグラフである。図６において白塗りのグラフがトータル血液検体処理量２ｍｌ（濾過条件５又は７）の結果を示すグラフであり、黒塗りのグラフがトータル血液検体処理量８ｍｌ（濾過条件６又は８）の結果を示すグラフである。図６に示す通り、ｗ／ｚが７．３であるフィルター＃４は、トータルの血液検体処理量を８ｍｌとした場合に捕捉率の低下がみられたものの、２ｍｌの場合は高い捕捉率が得られた。驚いたことにｗ／ｚが１１．７であるフィルター＃９は、トータルの血液検体処理量に関わらず１００％に近い高い捕捉率でＳＮＵ−１を捕捉できた。
開口率、短軸径、長軸径及びｚのうち１つ又は２つを固定し、ｗ／ｚを変動させた実施例１〜４の結果から、ｗ／ｚを７以上にすることによって、変形能の高い細胞の捕捉率を向上でき、さらには、トータル血液処理量を増加させた場合であっても捕捉率を向上できることが確認できた。
（実施例５）
フィルター＃９（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７）を使用し、トータルの血液検体処理量を変化させた以外は、実施例２と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。濾過時の圧力は以下の通りとした。その結果を表７に示す。
＜濾過条件＞
系全体のろ過圧（ΔＰ１）：０．４ｋＰａ
表７に示す通り、いずれも７０％を超える捕捉率でＳＮＵ−１を回収できた。また、孔面積当たりの処理量を０．１ｎｌ／μｍ2を超え３．１ｎｌ／μｍ2以下の範囲にすることにより、より高い捕捉率でＳＮＵ−１を回収できることが確認できた。
（実施例６）
フィルター＃９又は１０を使用し、トータル血液検体処理量を８ｍｌとし、濾過条件を下記９〜１２のいずれかとした以外は、実施例２と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。その結果を図７に示す。なお、参考例として、孔の形状が楕円形であるフィルター＃２を用い、下記の参考濾過条件３又は４で同様に行った。
＜フィルター＞
フィルター＃２（短軸径：６．５μｍ、長軸径：９．８μｍ、ｗ／ｚ：１．５）
フィルター＃９（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７）
フィルター＃１０（短軸径：６．５μｍ、長軸径：９６８μｍ、ｗ／ｚ：１２９．１）
＜濾過条件＞
図７は、各フィルターの捕捉率のばらつきを示すグラフであって、図７Ａは系全体のろ過圧が（ΔＰ１）が０．４ｋＰａ（濾過条件９及び１０並びに参考濾過条件３）の結果を示し、図７Ｂは系全体のろ過圧が（ΔＰ１）が１．３ｋＰａ（濾過条件１１及び１２並びに参考濾過条件４）の結果を示す。図７Ａ及びＢに示すように、いずれの圧力条件でもフィルター＃９及び１０は、フィルター＃２と比較して、ばらつきが小さく検体間差が小さいことが確認できた。特に、フィルター＃９は、いずれの圧力条件でも、高い捕捉率を示すともに、ばらつきが非常に小さいことが確認できた。
ＳＮＵ−１試料に代えてＳＷ６２０試料を用いて、実施例２〜６と同様の実験を行ったところ、いずれのフィルター及び条件においても９０％近い又は９０％以上の高い捕捉率でＳＷ６２０を捕捉できた（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
（実施例７）
がん細胞試料として、ＳＮＵ−１、ＳＷ６２０、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ、ヒト肺癌（細胞株名 ＮＣＩ−Ｈ１７０３）、ヒト肺癌（細胞株名 Ａ５４９）、ヒト肺癌（細胞株名 ＮＣＩ−Ｈ１９７５）、ヒト肺癌（細胞株名 ＮＣＩ−Ｈ６９）及びヒト肺癌（細胞株名 ＨＣＩ−Ｈ１６０３）を用い、細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。血液検体試料の調製は、上記の小型のがん細胞試料の調製と同様に行った。また凝集塊の多い細胞（例えば、ＮＣＩ−Ｈ６９）については、細胞の計数にバラつきが生じるため、分散試薬ＦＡＣＳｍａｘ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）とプロトコールに従い細胞を分散させた後、２０μｍ孔のナイロンメッシュフィルター（ミリポア）でろ過面積φ１３ｍｍのフィルターを用い、分散せずに残った凝集塊を除いて濾液中の細胞懸濁液を用いた。フィルターは、ろ過面積が異なる以外は、短軸径、長軸径及びｗ／ｚが同じであるフィルター＃９及び＃１１（ｗ／ｚ＝１１．７、長軸径＝８８μｍ、短軸径＝６．５μｍ）を使用した。濾過条件は以下のとおりとした。その結果を下記表１０及び１１に示す。
＜濾過条件＞
表１０はフィルター＃９（ろ過面積：２０ｍｍ2）の捕捉率を示し、表１１はフィルター＃１１（ろ過面積：７９ｍｍ2）の捕捉率を示す。上記表１０及び１１に示すように、浮遊細胞及び接着細胞に関わらず多様な細胞を効率的に捕捉できた。また、ろ過面積に関わらず、多様な細胞を効率的に捕捉できた。
（実施例８）
高Ｈｃｔ（Ｈｃｔ値が高い）検体を用いてがん細胞の捕捉を行った。
まず、高Ｈｃｔ試料の調製を行った。採血した血液を２本の１５ｍｌ遠沈管にそれぞれ分け、遠心機を用い１５００ｘｇで１０分ほど遠心した。遠心後、分離した血漿の層を別途１５ｍｌの遠沈管にわけた。血球層のみになった２本の遠沈管うち、一本の遠沈管の赤血球層をもう一方の遠沈管に加え、ついでＨｃｔ値が６０以上になるように取り分けた血漿を加え高Ｈｃｔ血液検体を調製した。ついで、血液に代えて調製した高ＨｃＴ血液検体を使用した以外は、上記のＳＮＵ−１試料と同様にして高Ｈｃｔ試料を調製した。なお、調製した高Ｈｃｔ血液試料のＨｃｔ値は、血球計数測定装置ＳＢ−１４４０（アークレイ）を用いて求めた。
調製した高Ｈｃｔ試料（３種）及びフィルター＃９又は１１を使用し、濾過条件を下記１３〜１５のいずれかとした以外は、実施例１と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。その結果を図８に示す。
図８に示すように、Ｈｃｔが６０％を超える高Ｈｃｔ試料であっても９０％を超える又は９０％に近い高い捕捉率でＳＮＵ−１を捕捉できた。
（実施例９）
高白血球数（白血球数が多い）検体を用いてがん細胞の捕捉を行った。
まず、高白血球数試料の調製を行った。ＨｅｔａＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分離回収した白血球を血液と混合し高白血球数の血液検体を調製した。ついで、血液に代えて調製した高白血球数の血液検体を使用した以外は、上記のＳＮＵ−１試料と同様にして高白血球数試料を調製した。なお、調製した高白血球数試料の白血球数は、血球計数測定装置ＳＢ−１４４０（アークレイ）を用いて求めた。
調製した高白血球数試料及びフィルター１１を使用し、濾過条件を下記条件とした以外は、実施例１と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。その結果を図９に示す。
＜濾過条件＞
図９に示すように、白血球数が１０，０００個／μＬを超える高白血球数試料であっても、８０％を超える高い捕捉率でＳＮＵ−１細胞を捕捉できた。
（比較例２）
非特許文献６に記載されたフィルターと同様の孔配置のフィルター（短径８μｍｘ長径１００μｍ、ｗ／ｚ＝６．７、ろ過面積２０ｍｍ2）を用い、ＳＷ６２０試料、ＳＮＵ−１試料及びＮＣＩ−Ｈ６９試料を用いて捕捉率の評価を行った。濾過条件は、各血液検体試料８ｍｌを０．４ｋＰａで送液し、実施例１と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。得られた捕捉率を下記表１４に示す。また、同じ濾過条件でフィルター♯９を用いて捕捉実験を行った。その結果を合わせて下記表１４に示す。
上記表１４に示すように、フィルター♯９（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７）は、９割以上の捕捉率が得られ、非特許文献６に開示されたフィルターと比較して、大腸がん細胞、胃がん細胞及び肺がん細胞のいずれの細胞についても高い捕捉率を示した。したがって、フィルター♯９のような本開示のフィルターを用いることにより、非特許文献６のフィルターと比較して小型のがん細胞及び変形しやすい細胞の捕捉率の向上を実現できるといえる。
（実施例１０）
開口率、短軸径及び長軸径（ｗ）が同じであるフィルター＃４又は１２を使用し、ＳＷ６２０試料及びＳＮＵ−１試料を用いて、下記濾過条件１６とした以外は、実施例１と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。その結果を図１０に示す。
＜フィルター＞
フィルター＃４（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：７．３）
フィルター＃１２（短軸径：６．５μｍ、長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７）
＜濾過条件＞
図１０はｗ／ｚと捕捉率の関係を示すグラフである。図１０において白塗りのグラフがＳＷ６２０試料の結果を示すグラフであり、黒塗りのグラフがＳＮＵ−１試料の結果を示すグラフである。図１０に示す通り、ｗ／ｚが７以上であればＳＷ６２０及びＳＮＵ−１を８０％以上の捕捉率で捕捉でき、特にｗ／ｚが１１以上であれば９０％を超える高い捕捉率でＳＷ６２０及びＳＮＵ−１を捕捉できた。
（実施例１１）
フィルターの厚みが異なるフィルター＃１１、１３又は１４を使用し、ＳＷ６２０試料及びＳＮＵ−１試料を用いて、下記濾過条件１７とした以外は、実施例１と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。その結果を図１１に示す。
＜フィルター＞
フィルター＃１１（長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７、厚み：５μｍ）
フィルター＃１３（長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７、厚み：３μｍ）
フィルター＃１４（長軸径：８８μｍ、ｗ／ｚ：１１．７、厚み：１５μｍ）
＜濾過条件＞
図１１はフィルターの厚みと捕捉率の関係を示すグラフである。図１１において白塗りのグラフがＳＷ６２０試料の結果を示すグラフであり、黒塗りのグラフがＳＮＵ−１試料の結果を示すグラフである。図１１に示す通り、いずれの厚みであっても９０％を超える高い捕捉率でＳＷ６２０及びＳＮＵ−１を捕捉できた。
（実施例１２）
フィルター＃９を使用し、含まれる細胞の数が異なる複数のＳＮＵ−１試料を用いて、下記濾過条件１８とした以外は、実施例１と同様にして細胞の捕捉及び捕捉率の算出を行った。その結果を図１２に示す。
＜濾過条件＞
図１２は、試料に含まれる細胞数と捕捉した細胞数との関係を示すグラフである。図１２に示す通り、試料に含まれる細胞の数に関わらず、高い捕捉率でＳＮＵ−１細胞を捕捉できた。

Claims (11)

  1. 血液検体をフィルターを用いてフィルター処理して血液検体中の稀少細胞を分離又は検出することを含み、
    前記フィルターは、短軸径が５μｍ以上８μｍ以下であり、長軸径が４０μｍ以上である孔を、孔密度が４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下で、かつ、長軸径ｗ（μｍ）と短軸径側の孔間の余白ｚ（μｍ）との比（ｗ／ｚ）が７．０以上１３０以下で含む、稀少細胞の分離又は検出方法。
  2. フィルターの孔１個当たりに対するフィルター処理容量が、フィルターの孔面積当たりの処理容量に換算して０．１ｎｌ／μｍ2以上３ｎｌ／μｍ2以下となるように血液検体をフィルター処理する、請求項１記載の方法。
  3. 前記フィルターの開口率が、１０％以上６０％以下である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記フィルター処理における濾過圧力は、０．１ｋＰａ以上２．６ｋＰａ以下である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記フィルター処理する際のフィルター上面と下面との圧力差が、１００Ｐａ以下である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記血液検体を、前記フィルターの孔あたり１ｍｍ／ｍｉｎ以上６００ｍｍ／ｍｉｎ以下の平均流速で前記フィルターに送液することを含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記稀少細胞が、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 請求項１から７のいずれかに記載の方法で稀少細胞を分離又は検出した後、該細胞の動態の観察若しくは活性測定を含む方法で分析すること又は該細胞の遺伝子分析することを含む、血液検体中の稀少細胞の分析方法。
  9. 請求項１から７のいずれかに記載の方法に使用する、短軸径が５μｍ以上８μｍ以下であり、長軸径が４０μｍ以上である孔を、孔密度が４０個／ｍｍ2以上２０００個／ｍｍ2以下で、かつ長軸径ｗ（μｍ）と短軸径側の孔間の余白ｚ（μｍ）との比（ｗ／ｚ）が７．０以上１３０以下で含むフィルター。
  10. 供給口と、排出口と、前記供給口と前記排出口を連通する流路と、分離部と有し、前記分離部は、前記流路の一部に相当する位置に配置され、かつ請求項９記載のフィルターと前記フィルターの保持部とを含む、検体中に含まれる稀少細胞を捕捉するための稀少細胞捕捉装置。
  11. 請求項９記載のフィルターと、前記フィルターを保持する保持部とを含み、流路に対して着脱可能な、稀少細胞の分離キットまたは分離デバイス。
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